专利名称：一种米糠多糖的分离纯化方法
技术领域：
一种米糠多糖的分离纯化方法，本发明涉及生物分离纯化技术领域，具体的说是关于米糠多糖分离纯化的工艺。
背景技术：
米糠多糖存在于稻谷颖果皮层里，是目前尚未被开发和广泛应用的主要营养成分之一。水溶性米糠多糖与一般均聚糖不同，是一种结构复杂的杂聚糖，由木糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖等组成。采用不同的米糠多糖提取工艺可以得到多种米糠多糖，它们都有着显著的生物活性和保健功能，不仅具有一般多糖所具有的生理功能，而且还具有抗肿瘤、降血糖、降胆固醇和增强免疫等多种功能。
目前，世界上越来越多的国家开始重视米糠多糖的研究与开发，并已取得不少成功的经验。据悉，美国稻谷创新公司和利普曼公司在米糠稳定化技术及米糠营养素、米糠营养纤维、米糠蛋白、米糠多糖等方面的提取、分离、纯化技术已有重大突破，在世界上处于领先水平，多项技术可被推广应用。
近些年来，我国也十分重视对米糠及其副产品包括米糠多糖、米糠纤维等产品的研究与开发工作。2002年3月15日，由国家计委、国家经贸委和农业部联合颁布的全国食品工业“十五”发展规划中明确指出了食品工业发展的重点及主要方向，合理利用米糠资源，提高综合利用水平，积极开发米糖蛋白、米糠营养油、米糠多糖、膳食纤维以及γ-谷维醇等功能食品。
通过微波辅助提取，提高米糠多糖的提取率，并采用Q-Sepharose Big Beads阴离子交换柱层析和Sepharose CL-4B凝胶过滤柱层析来提高米糠多糖的纯度，未见相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种米糠多糖的分离纯化方法，通过微波辅助提取，提高米糠多糖的提取率，并采用Q-Sepharose Big Beads阴离子交换柱层析和Sepharose CL-6B凝胶过滤柱层析来提高米糠多糖的纯度，使其能用于药品、化工、保健营养品及化妆品的原料或添加剂。
本发明的技术方案一种米糠多糖的分离纯化方法，是以米糠为原料，用米糠质量/体积比10倍量的去离子水微波辅助提取，取离心后上清液经酶解除淀粉和蛋白，离心后取上清，浓缩，干燥得到米糠多糖粗品；将米糠多糖粗品在磷酸盐缓冲溶液中复溶，依次经过阴离子交换柱和凝胶过滤柱进行分离纯化，最终得到米糠多糖精品，其纯度达到90％；1.微波辅助水提取将米糠与10倍质量/体积比的去离子水混合，微波功率100-400W，提取2-10分钟，离心分离取上清液。
2.酶解取上清液依次用淀粉酶和蛋白酶水解，去除淀粉和蛋白。
3.浓缩、醇沉、冻干将酶解后上清液浓缩至原体积的1/10，在浓缩液中加入95％浓度的乙醇搅拌，静置，收集乙醇终浓度60％-90％的醇沉物，冷冻干燥得米糠多糖粗品。
4.阴离子交换柱纯化米糠多糖粗品溶于磷酸盐缓冲液，然后用Q-Sepharose Big Beads阴离子交换柱对米糠多糖粗品进行纯化，采用磷酸盐缓冲液进行平衡，分别用0，0.3，0.5和0.7mol/L NaCl溶液、各浓度溶液分别用1个柱体积、以1.5mL/min的流速进行阶段洗脱，0.5mol/L NaCl溶液洗脱得2个峰，其余浓度NaCl溶液洗脱各得一个峰，通过测定各个峰糖含量，0.3mol/L NaCl溶液洗脱峰P2组分具有较高的糖含量和较低的蛋白含量。
5.凝胶过滤柱纯化将收集的P2组分采用Sepharose CL-4B凝胶过滤柱进行进一步的纯化，用0.05mol/L磷酸盐缓冲液、3倍柱体积进行洗脱，流速为0.5mL/min，得到一个多糖峰P21组分，经过高效液相检测为单一峰，纯度达90％。
6.冷冻干燥P21组分进行冷冻干燥，制备得白色疏松絮状米糠多糖精品。其易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂，无甜味，无挥发性，水溶液为淡黄色透明澄清溶液。
本发明的有益效果本发明采用微波辅助提取、酶解去淀粉和蛋白、醇沉和冷冻干燥提取方法得到米糠多糖粗品，再采用Q-Sepharose Big Beads阴离子交换柱层析和Sepharose CL-4B凝胶过滤柱层析对米糠多糖粗品逐步分级纯化，其获取的米糠多糖精品为单一多糖，纯度达90％。本发明所提出的工艺科学、合理、具有快速、简便、成本低、收率高的优点，既可节能又保持米糠多糖中的诸多活性物质，最大限度的提高了米糠多糖的得率，并有利于进一步研究米糠多糖活性和构效关系。
图1米糠多糖的Q-Sepharose Big Beads阴离子交换柱层析图谱。
图2米糠多糖的Sepharose CL-4B凝胶过滤柱层析图谱。
具体实施例方式
实施例1米糠粗多糖的制备按料液比1∶10将米糠与去离子水混合，采用400W微波处理2分钟，然后以3000rpm离心20min，取上清液后加入pH6.0的α-淀粉酶水解1h，再离心取上清液后加入pH4.5的蛋白酶去除蛋白，1h后继续离心30min，所得上清液加入95％的乙醇沉淀，使乙醇终浓度为60％-90％。第二天离心取沉淀，稀释后用3500分子量的透析袋透析，然后再旋转蒸发，真空冷冻干燥后得到米糠粗多糖。
实施例2柱层析分离纯化米糠多糖采用Q-Sepharose Big Beads阴离子交换柱层析阶段洗脱米糠粗多糖。
以0.1mol/L、pH8的磷酸盐缓冲液作为洗脱液，上样25～30ml粗多糖样品，然后分别用0，0.3，0.5和0.7mol/L NaCl溶液、分别用1个柱体积、以1.5mL/min的流速在Q-Sepharose Big Beads阴离子交换柱上进行阶段洗脱。0.5mol/L NaCl溶液洗脱得2个峰，其余浓度NaCl溶液洗脱各得一个峰。收集0.3mol/L NaCl溶液洗脱得到的P2组分，通过苯酚-硫酸法测定各峰糖含量，比较之下0.3mol/LNaCl溶液洗脱峰具有较高的糖含量和较低的蛋白含量。将收集的P2组分采用Sepharose CL-4B凝胶过滤柱层进行进一步的纯化，用0.05mol/L磷酸盐缓冲液，3倍柱体积进行洗脱，流速为0.5ml/min，得到一个多糖峰P21组分，经过高效液相检测为单一峰，纯度达90％。将P21组分冷冻干燥，制备得白色疏松絮状米糠多糖精品。
权利要求
1.一种米糠多糖的分离纯化方法，其特征是以米糠为原料，用米糠质量/体积比10倍量的去离子水微波辅助提取，取离心后上清液经酶解除淀粉和蛋白，离心后取上清，浓缩，干燥得到米糠多糖粗品；将米糠多糖粗品在磷酸盐缓冲溶液中复溶，依次经过阴离子交换柱和凝胶过滤柱进行分离纯化，最终得到米糠多糖精品，其纯度达到90％；(1)微波辅助水提取将米糠与10倍质量/体积比的去离子水混合，微波辅助提取，微波功率100-400W，提取2-10分钟，离心分离取上清液；(2)酶解取上清液依次用淀粉酶和蛋白酶水解，去除淀粉和蛋白；(3)浓缩、醇沉、冻干将酶解后上清液浓缩至原体积的1/10，在浓缩液中加入95％浓度的乙醇搅拌，静置，收集乙醇终浓度60％-90％的醇沉物，冷冻干燥得米糠多糖粗品；(4)阴离子交换柱纯化米糠多糖粗品溶于磷酸盐缓冲液，然后用Q-Sepharose Big Beads阴离子交换柱对米糠多糖粗品进行纯化，采用磷酸盐缓冲液进行平衡，分别用0，0.3，0.5和0.7mol/L NaCl溶液、各浓度溶液分别用1个柱体积、以1.5mL/min的流速进行阶段洗脱，0.5mol/L NaCl溶液洗脱得2个峰，其余浓度NaCl溶液洗脱各得一个峰，通过测定各个峰糖含量，0.3mol/L NaCl溶液洗脱峰P2组分具有较高的糖含量和较低的蛋白含量；(5)凝胶过滤柱纯化将收集的P2组分采用Sepharose CL-4B凝胶过滤柱进行进一步的纯化，用0.05mol/L磷酸盐缓冲液、3倍柱体积进行洗脱，流速为0.5mL/min，得到一个多糖峰P21组分，经过高效液相检测为单一峰，纯度达90％；(6)冷冻干燥P21组分进行冷冻干燥，制备得白色疏松絮状米糠多糖精品，其易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚有机溶剂，无甜味，无挥发性，水溶液为淡黄色透明澄清溶液。
全文摘要
一种米糠多糖的分离纯化方法，涉及生物分离纯化技术领域。本发明主要采用微波辅助水浸提，经过酶解除去淀粉和蛋白，浓缩、透析获得米糠多糖粗品，再采用Q－Sepharose Big Beads阴离子交换柱层析、Sepharose CL－4B凝胶过滤柱层析对米糠多糖逐步分级纯化，纯化获得的米糠多糖为单一多糖，纯度达90％以上。使获得的米糠多糖精品能用于药品、化工、保健营养品及化妆品的原料或添加剂。
文档编号C12S3/10GK1995069SQ20061016632
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月26日 优先权日2006年12月26日
发明者陈正行, 王莉, 张潇艳 申请人:江南大学