专利名称：：(s)-(+)-s-腺嘌呤核苷-l-甲硫氨酸高含量的干燥和/或微囊化酿酒酵母...的制作方法
技术领域：
：本发明涉;^cs)-(+)-s-腺噤呤核苷-L"曱石;i濃酸高^:的干^v或微嚢化酿酒酵母菌(5Vicc/mmj;cMcwev/wVie)细胞、其制^^方法及包^^斤述细胞的组^7。^^地讲，本发明涉;sj良酒酵母菌细胞，其中非对映异构^^离4^RH+)-s-腺噤呤核苷-L-曱减氨酸(在下文中称为(R)-(+)-SAMe)的含量小于或等于非对映异构体游离喊S)-(+)"S-腺噤呤核苷-L"甲石,儀斷在下文中称为(SM+)-SAMe)^4的10%。
背景技术：
：;0t^斤周知，(S)-(+)-SAMe离子一M它的产生细胞中提取出来，将非常不稳定并接着'tfel降解。事实上，从发现SAMe(Cantoni等人，"#^浙，，Baltimore19522，129;Cantoni等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem)，1953，204，403)到将其市场4化间经过了许多年。稳定性问JII^初是通狄盐的方法解决的，特别是形^^^L。但是，由于SAMe為MUL本身的酸性，所以它们有时会引起副作用，尤其是对胃粘膜。;0^斤周知，(R^S)SAMe是狗Sl^^^甲lJ^的甲基基团的生理供沐，它在所有的活有才琳中^5#在，而Jbt慢'^Jt疾病、月￡^#、月旨jfc^脉粥样硬化有治疗作用。以下事实也M所周知的(j.W.Cornforth，美国化学^志01人€.8.)，1977，99，7292-7300;Stolowitz等人，美国化学^^志，1981，103，6015-6019)，即含有(R^S)SAMe的产物包括两种非对映异构体的';^^物(R)"(+>SAMe和(SM+)-SAMe,它们的W结构如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>肌还已证明(DeLaHaba等人，美国化学^^志，1959，81，3975-3980)，两个非对映异构体中只有一个，即(S)-(+)"SAMe，通过自发的曱差^#和夕卜消旋作用，从而是有酶活性的，并进而导致总计约20%的无活性的非对映异构体(R)-(+)-SAMe生成(Wu等人生物化学(Biochemistry),1983，22，2828-2832)。e^JL^到，市场上可以获得的含有SAMe的所有产品中，无活性的非对映异构#<1^(+)-8崖6的量至少有20%;另夕I^L^显示，由于自发外消旋^MMt用，上述百分比随着时间推移可以增加到40%甚至更高。细胞中(S)-(+)-SAMe的天然^J:近似于100%，但是工业提#纯化方法得到部分降解的产物，即包含^20。/。(R)-(+)-SAMe和^80%(SX+)~SAMe的混合物。这些事实清晰地证实这种非对映异构体的^^随时间^N多是不稳定的，已经知道这种现象与产品在溶液中有关(G.L.Creason等人，植物化学(Phytochemistry),第24巻，第6期，1151-1155，1985;H.C.Uzar，LiebigsAnn.Chem.1989，607-610)。而ili^Ji^到，(R^S)SAMe;5L^f皮糸匕准药用的成盐形式，除了制备和纯化方法的复杂'l"^t，还存在不稳定的问题。已知的纯化方法涉及使用强酸性树脂(JP13680/1971)、螯合树脂(JP20998/1978)或昂贵的特殊试剂，如苦p未酸或吡咬甲酸(US3707536和US3954726);但是，它们导致SAMe的硫部^卜消旋化，从而使得到的终产物中无活性的非对映异构体的^*超过20%。然而，涉及使用弱酸性树脂的纯化方法(JP14299/1981、FR-A-2531714、EP-A-0141914)仅能使活性非对映异构体部分分离，因此纯度不足以满足药用目的。虽然上述钝化方法中的一些可以获得更好的化复，但是*部^卜消旋化的隐患，无^h可，至少存在20%的无活性的非对映异构体；jH^卜，在某些情况下(FR2531714)，用碳^E钾iM^细胞中提取产物，进而用高氯酸钾^U定，这可能引起产物的分离和随后的消除困难。在EP-A-0141914中，M^l^剂(如乙酸乙酯、丙酮，等)#在时，对含有SAMe的酵母细^ii行雄，还^JU色镨柱，所述色谱柱需^f^I粒度为100-200目的树脂，树脂的再生和清洗需要大量的投资和维护费用。^^I溶剂ilt^取SAMe必^fM防火的厂房、溶剂回#蒸馏系统、以及对衰竭(depleted)的生物质进行分离和必要的干燥以避免它与残留的溶剂"-fe被去除。所有这些因素很明显与开支和辦费用增加有关。Morana等人，生物化学与生物物理学学^(Biochimica扱叩hysicaActa),1573(2002),105-108，揭示SAMe在冻干的酵母提，以;5L^冻干的酵母细胞中(在较〗M呈JUi)可以用海藻糖^^急定。但^a冻干法是有缺点的，它使细舰于应激糾(在-20C冷冻，然后再在37C解冻)下，而且推测无^(w可，务藻糖对稳定细胞内SAMe是必不可少的。jJ^卜，加yNJ^藻糖條涉m济^l控问题。因此，需要下述SAMe的衍生物或剂型，其中活'lt(S)-(+)-SAMe非对映异构体的百分+^明显高于无活性(RM+)-SAMe异构体的，而且其中所述百分率随时间4^f多是稳定的。另夕卜还有一个重要目标是制辦为游离碱的(S)-(+)-SAMe的稳定的给药剂型，不再需絲其^^jL和/或加入稳定剂，并且不^f吏酵母细舰于应激糾。
发明内容目前已^^现，即使不添;Hi^f稳定剂，SAMe游离絲产生它的细胞内是稳定的。酵母细胞完整的细胞壁的旨作用Hyl;U44^SAMe游离碱在室温下随时间4財多有更高的稳定性。因此，本t明涉;^(SX+;hS-腺噪呤核苷-L^甲碗氨酸高含量的干燥和/或微嚢化酿酒酵母菌细胞，(sM+)"S-腺噤呤核苷-L"曱石;t^酸以可得自酵母细胞的游离碱形i^4在，将所iii^母细胞在20到40"C温度下、任选^*下简单干燥，所it^母细,别是具有(SM+)-SAMe高产率特征的酉M湾酵母菌菌抹。才娥本发明的细胞可以以适当的药物剂型给药，尤其皿嚢、片剂、肠溶片剂等。适当的酿酒酵母菌菌林可如下选掩对得自平板，在YM琼脂的培养肉汤样品的菌^ii行筛选，所述肉汤样品取自前"^止期(pr^stationarystage)的工业发酵物，at^检查篩选的菌落产生(SM+)"SAMe的能力。如》kii遞的称为GNL24/497的菌抹的SAMe产生能力(productivity)在发酵期末期为2.0%-6.0%重量/干重，尤其为3%>4%重量/干重，在富集期末期为7%-20%重^:/干重，尤其为10%-16%重1:/干重。酵母酿酒酵母菌GNL24/497是由佩鲁贾大学"工业酵母保藏DBVPG(IndustrialYeastCollectionDBVPG)"基于它的形态生理学特征和DNA-DNA重新组合技术分类的。菌糊lb'西酵母菌GNL24/497已经按照2005年4月27日签定的布达,条约保絲DBVPG保藏中心(用于专利目的)，保藏号为DBVPG8P，其构成了本发明的另一线。酵母按照已知的技^HHt在工业7K平下生长，并,iUD作制备面包制造的生物质(biomass)，其中将DL曱石M^^口A^基于糖蜜的^if培养l^F.Schlenk和R.E.DePalma，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)1957229，1051;F.Schlenk，J.L.Dainko和S.M.Stanford,生物化学和生物物理学档案(ArchivesofBiochemistryandBiophysics)1959，83，28~34)中，DL甲石X^酸的量为0.5%40%w/v，更特别是1.0%-3.0%\￥。通过离心收M物质，将其洗涤、重悬并在一种培养^在下文中称为"活化培养基")中进fr活4tii程，该培养基含有磷酸钾；石i^铵；柠_钠；镁、锰、#^钓盐；葡萄齡L^甲石JL^酸或DL^甲石i^酸(F.Schlenk和RJE.DePalma，生物化学杂志，1957,229,1051-F.Schlenk等人，Enzymologia29，283，1965)。活^it程可以重复2^5次，更特别为2-3次，该过程可以在下列条件下进行:在无菌或非无菌的*下；在大^￡或孩仏下；在控制pH或自由pH下；通气i^JL^0.1-0.5v/v/m,或更特别为0.2-1.0v/v/m;温度在25X:-35X:，或更特别为28°C-32°C;活4匕6^24h,或更特别为8-18h。活^^养基中的生物质^1可以在2.5%到18%干重/#^的范围内变化，更特别为5%-15%干重/#^、。富集之后，用离心或微孑Lit滤的方法收g物质，用无菌水或pH5.2(±0.2)的>#^緩冲液洗涤几次，然后才N^常Mi支术干^^樣繊粒化。才^一^N^的方面，孩繊粒化的方法可以包^:a)*养肉汤中离心或微孑U^虑酵母细胞；b)用水洗^i^母细胞然后重混悬在无菌水中；c)如果可能，在b)获得的悬浮液中加^v急粘土、白陶土、硅土、微晶纤维素(microcellulose)、lecithinated钠和/或天然或氩4t的植^物或动物油；d)在20C到4(TC温度下低压干燥c)中得到的混^，至含水量为0.5到5%;e)加AJ^形剂到干^it的物质中，将^^直接压片；f)将e)中得到的片制粒；g)用融化的蜡对f)中得到的颗粒包衣。这一方法公布在由申请人于2005年2月18日提交的申请号为05425084.0的欧洲专利申请中。用干g的孩繊粒化酵母的生物质制备片剂，片剂的重量在1.0到2.5g之间，更特别为1.3-1.8g，活寸生组^(SH+)"SAMe的含量在100到400mg之间，更特别为150到300mg。片剂可以按照公知的技术，用高(SH+)"SAMe舍量的干燥酵母或加入赋形剂进行制备，所i^形剂为如微晶纤维素、硅土、山脊酸甘油酯(glycerolbehenate)、^tJf旨酸钩等等)。由》將到的片剂还可以用赋形剂包衣，所述赋形剂如BIOGAPRESSVEGETAL、LabrafacCC、EUDRAGITL30D-55、二氧4战、滑石粉、二氧^^_体、柠^乙酯、FD&C黄色5号(FD&Cyellow5)等，以符合肠'i^gastricresist肌ce)标准。M实施方式用下面的例子^碎细;tlki^例说明本发明。实施例1酵制良酒酵母菌GH24/497(DBVPG8P)在一种基于糖蜜(制作面包的酵母所用的)的工*养基中生长，该培养基中已加入30g/l的DL^曱石i^^酸，在28。C生长24h。用离心的方法，收絲物质，用自来水洗涤两次得到20%±2g/干重/^、的膏状物和3%(±0.5%)重量/干重的总SAMe。在10升发酵罐中制备培养基，该培养基包舍.葡萄糖82g/l、DL^曱A樣酸12g/l、Na2N0310g/l、KH2P043.5g/l、KOH0.385g/I、(NH4)2S047.0g/!、MgSO40.5g/l、止泡剂0.03g/l。加热培养JJij28X:，加入膏状物，直到^j^'Jl00g/l干重。活化条降200rpm振荡，气;M;变0.25v/v/min。葡萄糖消耗完的时候，即大约12h后，通过离心收集细胞，回收100-102g/l干重生物质，其包^J:为11.5。/。的总SAMe，其中(R)-(+)-SAMe异构体为4.5%，(S)画(+)-SAMe异构体为95.5%。将生物质在28。C干辭iJ含7jC量《0.5%w/w。分析证实(R)-(+)-SAMe异构^^^J:小于5%，JL(S)-(+)-SAMe异构体^t大于95%。实施例2操作同实施例1，但是将生物质活化两次。得到14.2%重量/干重的总SAMe，其中(RH+)-SAMe异构体为4.3%w/w，(SM+)誦SAMe异构体为95.7%。实施例3操怍同实施例1和实施例2，但L^l物质ii行三次富集，得到15.1%重量/干重的总SAMe,其中(R)-(+)-SAMe异构体为4.4%,(S)-(+>SAMe异构体为95.6%重量/干重。实施例4操怍同实施例1-3，其中^"f;^it的生物质通it^入鬼粘土并在5mbars压力和32°C(土2。C)条降下干燥进行微嚢化，研成细粉，再加入到用于孩i嚢4匕的颗粒中，如下所示g%酿酒酵母菌粉末10甘絲50微晶纤维素10*鄉旨酸镁3山_甘油酯8885氢化的植物月旨肪(BiogapressVegetal8M297,GATTEFOSSfe)20将所i^未与除氬化的植物脂肪"卜的其它组^it当混合。该混合物用于制Ai径20-25mm的片，然后在一台縱式颗津対几中将上述片制粒，得到300-1500孩沐的颗粒。用一种再循环式螺杆捏合^W^粒用融化的植物脂肪包衣，并^#到环嫂温度，得到包含3.0(±5%)x109CFU/g的500-1600孩沐的微嚢。实施例5如实施例1所述制4^衬^##1良酒酵母菌GNL-24/497(DBVPG8P)。干燥的生物质在棘温度(1=25±2°C,RH=60±5%)进#^、定性实验。为进行分析，将细g+4'C才/L^^胞。下^^出得到的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例6才^^^p技术，用干燥的生物质(如同实施例l、2、3、4所示的)制备含有如下组分的片剂。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>先LABRAFAC(长链甘油三酯类)^EUDRAGIT(异丁烯酸共聚物)***fd(酒石黄)实施例8采用PHARMATESTPTL>5粉碎^l^置，将实施例7中提到的片剂按照欧洲药典进行肠溶实验。1小时后片剂4^##完整。权利要求1.(S)-(+)-S-腺嘌呤核苷-L-甲硫氨酸高含量的干燥和/或微囊化的酿酒酵母菌细胞，(S)-(+)-S-腺嘌呤核苷-L-甲硫氨酸以可得自酵母细胞的游离碱形式存在，所述酵母细胞在20到40℃温度、任选减压、无稳定剂条件下干燥。2.干燥形式的^4又利要求1中所要求保护的细胞。3.微嚢形式的:W又利要求1或2中所要求保护的细胞。4.如上i^5L利要求的^f可一项中所要求保护的细胞，所述细胞可如下获得对得自平板糾在YM琼月旨的培养肉汤样品的菌^ii行筛选，所述样品取自前静止期的工业发酵物，f^检查筛选的菌落产生(S)-(+)-SAMe的能力。5.如上i^又利要求的^^T一项中所要求保护的酿酒酵母菌细胞，所iii良酒酵母菌细絲DBVPG保藏中心的保藏号为DBVPG8P。6.如上i^又禾'J^求的任何一项中所要求保护的细胞，该细胞的SAMe产生能力在发酵结束时为2.0%-6.0%重量/干重，在富集阶段结束时为7%-20%重量/干重。7.药物组合物，该药物组合物包含权利要求1-6中所要求保护的细胞，所述细胞作为活性组分并与适当赋形剂混合。8.如权利要求7中所要求保护的组合物，该组合物以片剂、肠溶片剂和胶嚢的形式存在。9.如权利要求7或8中所要求保护的组合物，该组合物中活性组分(S)-(+)-SAMe的含量为100至400mg。10.制备权利要求l-6中所要求保护的细胞的方法，所述方法包括-将DL甲石危氨酸以0.5%-4.0%w/v的量加入到基于制造面包的糖蜜的培养基中；-离心生物质，将其洗涤、重悬，并在培养基中进行活化过程，所述培养基含有磷酸钾；硫酸铵；柠檬酸钠；镁、锰、锌和钙盐；葡萄糖和L-曱石克氨酸或DL-甲硫氨酸；-活化过程可能重复2-5次，以0.1-1.5v/v/w通气和25X:-35。C条件下进行6-24小时；-在活化培养基中生物质浓度为2.5%至18%干重/体积；-将生物质离心或微孔过滤，将生物质用无菌水或卩115.2(±0.2)的磷酸盐緩冲液洗数遍，然后根据常规技术干燥或微颗粒化。11.酿酒酵母菌菌林，该菌林在DBVPG保藏中心的保藏号为DBVPG全文摘要本发明涉及干燥和/或微囊化的酿酒酵母菌细胞，所述细胞包含高含量的游离碱形式的(S)-(+)-S-腺嘌呤核苷-L-甲硫氨酸，其可从选择的高(S)-(+)-SAMe产量的菌株中获得。文档编号C12N1/18GK101194011SQ200680020271公开日2008年6月4日申请日期2006年6月9日优先权日2005年6月9日发明者A·贝内代蒂,L·西维耶里申请人:诺塞斯有限公司