野生型甲肝病毒在细胞培养物中的生长的制作方法

专利名称：野生型甲肝病毒在细胞培养物中的生长的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组甲肝病毒(HAV)。本发明包含重组HAV基因 组和装配的病毒颗粒，这些可用作疫苗，也可用作将它们所含有的 重组HAV基因组出于多种目的导入细胞中去的载体。本发明还涉及 可用于在培养物中出于多种目的培养野生型和改造的HAV病毒的细 胞和细胞系，所述多种目的包括诊断和环境监测目的。
背景技术：
甲肝病毒(HAV)是一种小RNA病毒(Picornavirus ),其在人 体中造成急性肝炎， 一种可预防但是仍然在世界范围内流行的传染 病。在美国，每年报道大约25,000例HAV，但是当针对未报道的和 无症状的感染进4于^修正之后，每年估计平均发生263,000例HAV (16)。
HAV是无包膜病毒，其含有7.5 kb的单链正义基因组RNA,其 包裹在二十面体的27-32纳米(nm)直径的颗粒中。 一种小的病毒 编码蛋白(VPg)共价连接到所述基因组的5，端。病毒RNA在5， 端含有大约750个碱基的非翻译区("5，-NTR"或"5，-NC")，其带 有内部核糖体ii^位点(internal ribosome entry site, IRES ) (42 )， 并且在3，端含有短的非翻译区，其后是多聚(A)尾。有两个读码框 一致(in-frame)的起始(AUG)密码子， 一个在735-737位核苷酸， 另 一个在741-743位核香酸；两个均位于所述IRES的下游。编码约 250 kDa多蛋白质的大开放读码框翻译通常起始自第二个AUG (37)。病毒编码的蛋白酶3Cpro将HAV多蛋白质切割成较小的结 构蛋白(VP0、 VP3、 VP1-2A)和非结构蛋白(2B、 2C、 3A、 3B、 3C、和3D)(22、 25、 31和参考文献31中所引用的文章)。与其它 小RNA病毒不同，细胞蛋白酶切割VP1-2A前体(21 )。
来自非结构3C基因的HAV编码蛋白酶切割病毒蛋白，其过程 是与翻译同时发生的，并具有翻译后影响(2,36)。 VP4蛋白是首先 翻译的21-23个氨基酸的最大分子质量为2.5 kD的多肽，其尚未在 HAV病毒衣壳中发现。在其它小RNA病毒中，VP4蛋白的尺寸稍 大(约7 kD),其净皮肉豆蔻酰化(myristylated )并且可参与颗粒的 装配、稳定或存活，也参与病毒结合细胞和iiA细胞(27,37,38)。


图1. HAV载体构建物的示意图。多连接子(polylinker)包括 Sall、 SnaBI、和Kpnl限制性位点，其两侧是HAV蛋白酶3Cpro 切割位点和Gly铰链序列，该多连接子^皮克隆到pHAV8Y ( SEQ ID NO: 10)中HAV cDNA的2A/2B连接处。所得质粒被命名为 pHAV8Y-MCS。不含翻译和起始密码子的杀稻瘟菌素抗性(6 /)基 因净皮克隆到pHAV8Y-MCS的Sail和Kpnl位点中。所得的构建物被 称为pHAV8Y-Bsd，其编码与多蛋白质读码框一致的bsd基因，它 的基因产物Bsd可通过3C拜切割从多蛋白质中被释放出来。
图2.从转染的Huh7细胞中拯救的野生型(wt) HAV的免疫荧 光(IF)分析。模拟转染(mock-transfected )的Huh7细胞(A和 D)和用HAV8Y-Bsd (B和E )或HAV.WT-Bsd ( C和F)体外合成 RNA转染并4吏用lng/ml杀稻瘟菌素选择的杀稻瘟菌素抗性Huh7 细胞在8孔片中培养。4吏用冷丙酮固定细胞，并用抗-HAV单抗 K2-4F2 和 K3-4C8 ( Commonwealth Serum Laboratories ， Melbourne, Australia)和FITC-缀合的山羊抗小鼠抗体染色。使用 来自模拟-、HAV8Y-Bsd-、和HAV.WT-Bsd-转染的Huh7细胞的病 毒保存物感染FRhK-4细胞两周，使用冷丙酮固定，然后使用抗-HAV 单抗K2-4F2和K3-4C8以及FITC-缀合的山羊抗小鼠抗体染色。使 用Zeiss Axioscope显微镜以400倍放大倍率并使用油镜拍摄免疫荧 光显孩t照片。
图3. Huh7细胞中wt HAV的稳定性。在Huh7和FRhK-4细胞 中使用杀稻瘟菌素抗性终点滴定分析法评价生长在Huh7细胞中的 HAV8Y-Bsd和HAV.WT-Bsd的滴度。在含有亚汇合态(subeonfluent) 单层Huh7或FRhK-4细胞的96孔板中滴定病毒保存物的十倍稀释 物，在过夜培#^后，将杀稻痙菌素加到每个孔内至2 jig/ml。 8个
孑L/稀释物用于滴定检测。感染之后在显微镜下观察培养板7天，含 有存活细胞的孔被作为阳性计算以测定滴度。值表示为按照Reed和 Muench法(34)测定的HAV滴度的loglO，其标准偏差用线表示。
图4.对Huh7细胞消除(cure) HAV8Y國Bsd感染。
A) IF分析。未感染的Huh7细胞(模拟)，HAV8Y-Bsd感染的Huh7 细胞(HAV8Y-Bsd)，和通过使用250 U/ml IFN-ocA/D治愈的被 HAV8Y-Bsd感染的细胞(治愈(cure))，生长在8孔培养室玻片
(chamber slide)中，并使用抗-HAV单克隆抗体K2-4F2和K3-2F2 染色以进行IF分析。B) HAV8Y-Bsd和HAV.WT-Bsd在未感染
(naive ) Huh7细胞和干扰素治愈的Huh7-A-I细胞中的生长。使用 杀稻瘟菌素抗性终点滴定检测评价Huh7-A-I细胞中的病毒滴度(见 图3的图例)。C )来源于人粪便的wt HM-175 HAV在未感染Huh7 细胞和干扰素治愈的Huh7-A-I细胞中的生长。使用ELISA终点滴 定检测评价Huh7-A-I细胞中的病毒滴度。值表示为按照Reed和 Muench法(34)测定的HAV滴度的loglO，其标准偏差用线表示。
图5.wtHAV在不同细胞系中的生长。多林HAV生长的一步生 长曲线分析在三个不同的细胞系FRhK4、 Huh7和Huh7-A-I (在用 HAV8Y-Bsd感染之后被选择然后通过干扰素处理而治愈的Huh7细 胞)细胞中进行。使用含有Bsd选择标记的野生型HAV重组病毒 (HAV8Y-Bsd和HAV.WT-Bsd )、分离自人粪便的wt HAV ( wt HM-175HAV)、或者适应细胞培养的HAV (HAV/7)感染细胞，并 且在不同时间点检测病毒生长。使用ELISA终点滴定检测评估 Huh7-A-I细胞中的病毒滴度。在每个时间点，从被感染的FrhK-4、 Huh7、和Huh7-A-I细胞中取样，并通过ELISA在Huh7-A-I细胞 中滴定。值表示为按照Reed和Muench法(34 )测定的HAV滴度 的log10,其标准偏差用线表示。
图6.提取自生长曲线最末点的HAV基因组RNA的核苦酸序列 分^f的示意图。对在一步生长曲线的最后时间点获得的病毒的部分 核苷酸序列进行了分析。获得了 HAV8Y-Bsd、 HAV.WT-Bsd 、 wt HM-175 HAV、和HAV/7的5'NTR和2B-2C区热点(黑色条)的 核苷*列。在每个病毒基因组的示意图上使用核苷酸位点指示出 与wt HM-175 HAV不同的核苷酸。在3889位核苷酸的主要细胞培养适应的突变以粗体显示。指出了病毒基因、内部核糖体i^位点 (IRES)、和3，端多聚(A)尾。以灰色框显示HAV8Y-Bsd和 HAV.WT-Bsd中的bsd基因克隆。

发明内容
在小RNA病毒中间，HAV在细胞培养物中的复制效率很差。 通过在培养物中传代，HAV已经适应于在多种灵长类细胞系中生长， 并且建立了持久性感染。但是它不在培养物中造成细胞病变效应。 尽管HAV适应了 一些细胞，但是一般而言它难以适应组织培养条件 并在该条件下生长。连续传代将提供可在细胞培养物中生长的HAV 变体，但是所述生长趋向于限制在特定的HAV毒林和细胞类型的組 合。已有文献记载， 一些原代和连续灵长类细胞系(如恒河猴胎肾 细胞(FRhK4)、非洲绿猴肾细胞(AGMK)、人二倍体肺细胞 (MRC5)、和BSC-1细胞)支持HAV在细胞培养物中生长(10、 43-45 )。细胞培养适应的HAV通常需要许多天以达到106-107的病毒 滴度(23)。但是，根据HAV基因组中所存在突变与所使用宿主细 胞的组合，病毒生长的速率是不同的。
在野生型(wt) HAV毒林HM175和它的细胞培养适应的变体 HAV/7之间的序列比较，以及许多有关它们嵌合体的研究确定可通 过HAV基因组中的获得性突变获得高效复制的能力(6、 11、 12、 14、 15、 46)。细胞培养适应的HAV分离林在病毒基因组中包含一 些突变，其明显参与了 HAV在细胞培养物中的高效生长(11、 12、 14、 15、 19、 20、 40、 46-49)。发现了培养适应性突变的两个主要热 点 一个位于5，-NTRIRES中，另一个位于非结构性2B和2C基因 中，其编码病毒RNA复制蛋白。这两个热点突变是与细胞培养物中 的高效HAV复制相关的(3、 24)。从HAV/7嵌合体中鉴定的突变 提示，HAV非结构性2B和2C编码区是病毒在细胞培养物中生长所 必需的(12)。 2B和2C之外区域的突变不具有独立效应；但是其它 部分的突变与2B和2C编码区的结合增强了复制(13)。相似地， 5'-NTR区中与2B和2C编码区中一起突变使得在细胞培养物中的 复制增强，而5，-NTR区中的单独突变没有独立作用(3、 20、 40)。
已经显示，HAV基因组的2B和2C基因区域中3889位、4087 位和4222位核苷酸的突变是提供在"允许"细胞系中生长(例如
FRhK4和AGMK细胞)所需的最小组合。这些突变足以提供在培 养物中的生长。这些突变任意两个的组合都是有效的，但是只有3889 位突变看来是单独有效的(14 )。
病毒基因组5，NTR区中的突变拓宽了宿主细胞的范围，允许在 不太允许的细胞系中生长。5，NTR在124位、131-134位、152位和 203位核苷酸的一组突变^JL现增加了病毒在BS-C-1细胞中的生长 速率。这些突变不影响HAV在允许细胞中的生长速率。在591位、 646位、669位、687位核普酸处发现了第二組突变，其独立地提高 了在MRC5细胞中的复制速率(50)。已经显示，热点核苦酸3889 位将2B蛋白216位M酸从Ala (野生型)改变为Val (8Y)特异 性突变,对细胞培养物中的病毒复制有重要影响，其提供了在FrHK4 亚细胞系11-1细胞中复制效率10-20倍的提高。但是，带有野生型 Ala或突变Val的HAV在黑猩猩和小绢猴(tamarin )动物体内以相 似的效率复制(18)。
尽管已经开发了 HAV表达载体(1、 41)，但是携带抗生素抗性 基因而能允许选择感染细胞的HAV林还未见有描述。本文的实施例 提供了具有杀稻痘菌素抗性基因的重组HAV基因组，所述抗性基因 被克隆进HAV的2A-2B连接中，其可用于鉴定和选择能够支持人 wt HAV在细胞培养物中高效生长的细胞。这些细胞系的可用性4吏得 可以从环境中分离wt HAV毒林。这允许监测食物和水中是否存在 感染性wt HAV。培养来自患者样品的野生型HAV的能力将有助于 对wtHAV感染的诊断。另夕卜，本发明可用于鉴定wtHAV生长所需 的细胞因子以及HAV肝毒性和致病性的决定因素，以及开发可用作 人减毒疫苗的HAV毒株。
目前可用的细胞培养适应的HAV林对于人类来说是过度减毒 的，其不能用作HAV疫苗，这是由于所述病毒在疫苗接种者体内不 发生复制。细胞培养适应的HAV在细胞培养物中充分生长，并且可 用作用于灭活疫苗的HAV抗原的来源。因为在本发明之前，野生型 人HAV不可能在细胞培养物中生长，在所述病毒中导入适当的减毒 突变特别困难，这种减毒突变可导致开发出具有正确减毒水平的 HAV林以用作候选疫苗。 一种制^^免疫原性减毒HAV变体的方法 可以从野生型或者其它高免疫原性HAV分离林出发。接着导入减轻 所述病毒体内致病性的突变，例如通过降低在动物组织中的复制速
率或者将病毒向性改变到另一种器官或组织。不幸地是，目前没有 关于这样的减毒突变的确切知识，所以需要一些用来鉴定它们的方
法。也就是说，期望开发一种用于培养野生型HAV的系统，使得可 以引入和研究减弱致病性的突变，同时保持免疫原性。本发明提供 了这样的系统。
另外， 一般情况下，更"允许"减毒较小的毒林生长的细胞系 使得减毒较大的毒株更快的生长。例如，MRC5细胞，其是被许可 用来生产目前HAV疫苗的细胞系，被认为是具有中等允许性的细胞 系。另一方面，BS-C-1细胞被认为是更具允许性的细胞系。可获得 的减毒HAV病毒的滴度通常在BS-C-1细胞中比在MRC5细胞中高 0.5到1个log单位(50 )。因此，我们认为支持野生型HAV生长的 细胞系作为通过允许疫苗林生长到特别高的滴度来生产H AV疫苗的 细胞系将具有巨大价值，所述细胞系应构成最具允许性的细胞系。 确实，本文描述的治愈的细胞系支持减毒HAV滴度至少高达107每 TCID5o/ml (图5 )。最重要的是，本发明的细胞系支持HAV生长， 而不在培养过程中积累突变。wtHAV的滴度在本发明的治愈细胞系 中培养16天之后通常达到至少105TCID5。，并且达到这些滴度的同 时不在病毒基因组中积累突变。在培养中积累突变对于当前用于生 长HAV的细胞来说是常见的，这可能过分减弱病毒在人体中的复制， 使得所述病毒无法用作活疫苗。
另夕卜，野生型HAV在本发明典型细胞系中生长的速率几乎和培 养适应性毒林(例如HAV8Y)的生长速率一样快。在本发明的典型 细胞中， 一旦感染建立，野生型HAV的病毒滴度将每四天提高0.5 到1.25个log单位TCID5。。本发明的细胞系优选支持野生型HAV 经过四天至少0.9,更优选1个log单位TCID5Q的生长速率。病毒的 生长速率通常保持稳定至少16天，更优选保持无卩MI定。应注意用 于培养HAV的细胞通过定期传代培养物保持在增殖状态，通常以1: 5或1: IO的比例每周一次。
细胞培养适应的HAV毒株的生长速率通常比野生型病毒的生长 速率更高。因此，培养适应的HAV毒林的病毒滴度可以高达1,5个 log单位TCIDs。/四天，或者甚至更高。并且，这样的滴度是在HAV 基因组中没有另外的减毒突变(也就是说，除了提供原始培养适应 性的突变之外)积累的情况下获得的。
尽管我们对于细胞培养适应的HAV复制的认识已经有重大的进 展，在作出本发明之前，野生型人HAV在细胞培养物中的增殖性生 长未见才艮道。细胞培养适应的HAV易于感染细胞并在一到两周内复 制。野生型HAV只在大细胞幹沐的一小部分细胞中感染并复制，而 不传播到培养物中的其它细胞，并且在一个长的时期内保持潜伏， 在此期间它积累允许所得病毒(其不再是野生型毒林)在细胞培养 物中传播的细胞培养适应的突变。没有可行的系统来选择支持野生 型HAV生长的细胞。
有些HAV基因组带有选择标记基因的标签，其允许细胞复制这 种带标签HAV基因组以表达该标记基因，并因此病毒复制的细胞可 从大的不支持病毒复制的背景细胞群体中被选择出来。因此，本发 明允许适当的HAV病毒的生长,其足以允许合理开发出减毒疫苗林。 一旦开发出好的HAV候选疫苗林，本发明的方法可应用于此毒抹以 选"^合适于疫苗林生长的细胞系，用于生产疫苗。
HAV基因组能够容纳加入的核苷酸或基因。在2A/2B连接处的 主要多蛋白质切割位点将允许插入外源核苷酸；我们已经证明细胞 培养适应的变异HAV能够允许在此连接处插入60个核苷酸外源序 列，并且在至少6次连续传代中保持稳定(1， 41 )。含有插入在2A/2B 连接处的博来霉素抗性基因的重组HAV在细胞培养物中不进行选择 的情况下保持稳定至少5代，这只是由于本实验的限制(1)。
从转染了传染性体外合成全长RNA转录物的细胞中拯救wt HAV是非常低效率的(11)。从直接RNA转染的狨猴肝脏中拯救 wtHAV (14)是可能的，但是此过程麻烦且昂贵。另外，所回收的 wt HAV在细胞培养物中的生长存在许多问题，这是因为所述病毒是 不稳定的，并且可积累细胞培养适应的突变，这将导致减毒(ll、 12、 13、 15、 19)。因此，使用wtHAV的实验是非常困难的，这也 阻碍了进一步iL^j"HAV病原性的了解。为了克服这一问题，我们 探索了许多替代方案以增强wt HAV cDNA在细胞培养物中的很低 的感染性。
在本发明中，编码选择标记的重组wt HAV可被用于选择表达宿 主因子的细胞，所述宿主因子是它在细胞培养物中高效且稳定生长 所需的。相似地，减毒的但非细胞培养适应的HAV可用于选择允许 它用于疫苗目的的高效生长的细胞系。选择标记净皮插入到wt HAV 基因组内，保持与多蛋白质的读码框一致。首先，在pHAV8Y中 HAV cDNA的2A/2B连接处导入多连接子，其编码单一的5V //、 S/wlBJ、和7T;;wJ位点，侧翼是Gly铰链和3C"蛋白酶位点；此构 建物被称为pHAV8Y-MCS (图1 )。使用HAV8Y背景是因为此病毒 含有细胞培养适应的2B-A216V突变，其增强了在细胞培养物中的 生长(15 )，但是并不影响HAV毒力(14 )。缺少翻译起始和终止密 码子的杀稻瘟菌素抗性基因Zw/被插入到pHAV8Y-MCS的5Vi/J和 JT/m/位点(图1 )。所得的构建物，称为pHAV8Y-Bsd,含有与HAV 多蛋白质读码框一致的&rf基因。因此，通过病毒编码的3C戸对多 蛋白质的加工被认为导致释放出6^/编码的脱氨酶(Bsd)。
一般来说，野生型(wt) HAV不在细胞培养物中生长，但是当 它生长时，它倾向于积累导致它减毒的细胞培养适应的突变。例如， HAV原型wt HM-175毒林需要数月以在非洲绿猴肾原代培养物中生 长(10 )，并且积累了在绒猴和黑猩猩体内使病毒减毒的23个突变。 另一方面，本发明提供允许wtHAV生长的细胞，例如Huh7细胞和 从其来源的细胞系。当允许野生型HAV生长的细胞被wtHAV感染 或者被野生型HAV基因组核酸转染时，可在感染后几天通过IF分 析检测到HAV抗原(图2 )。
可检测到HAV抗原的时间取决于感染复数(multiplicity of infection, MOI)。在高MOI下，或者例如约IO或更高，HAV抗原 在一天内可被检测到。MOI的降低延迟了可检测HAV抗原的出现； 可能需要培养长达一周。在MOI为0.1到10时，HAV抗原通常可 在一周内通过IF检测。在本发明细胞的一个典型实施方案中，当培 养物以0.1-1的感染复lt^始时，通过免疫荧光评估，超过20%的细 胞将在一周内表ilA HAV抗原。
本文的实施例也证明了 Huh7-A-I细胞(选择的Huh7细胞亚系) 对wt HAV生长是非常敏感的(图5A)。有趣的是，wt HAV在 Huh7-A-I细胞中比在亲本Huh7细胞中生长好过10倍。野生型HAV 在Huh7和Huh7-A-I细胞中是稳定的，并且不积累细胞培养适应的 突变。这些发现被wtHAV不在FRhK-4细胞中生长(图5A)以及 从培养Huh7和Huh7-A-I细胞中回收的病毒的核苦酸序列分析(图 5B )所确认。wt HAV在Huh7-A-I细胞中高效且稳定的生长清楚地
显示，这些细胞不具有在大部分其它细胞系中发现的引起细胞培养
适应的突变积累的强的选择压力。确实，Huh7-A-I细胞很可能含有 类似于允许wt HAV生长的人肝脏细胞中所发现的细胞因子。
从全长cDNA中拯救wt HAV以前是困难的，因为在现有技术 使用的细胞系的细胞培养物中，体外转录物只具有很低的感染性。 转染了来自wt HM-175全长cDNA的体外RNA转录物的FRhK-4 细胞需要132天才在只有5%的细胞中表现出HAV持异性IF(15 )。 wt HAV的低效率生长很可能推动了对使得在细胞培养物中更高效 率复制的突变体的选择。含有关鍵的细胞培养适应的突变2B-A216V 的wt HAV构建物的转录物在被转染的FRhK-4细胞中略微更具传 染性，使得一些单个细胞被感染；所述感染并不传播到整个培养物 (11)。为了拯救wtHAV， Emerson等将含有带有2B-A216V突变 的wt HAV cDNA和全长基因组RNA转录物的混合物直捲接种到绒 猴肝脏(14 )。用来自肝脏转染的绒猴的排泄物混悬液接种的FRhK-4 细胞在短时间内被感染(14)，其显示出2B-A216V突变增强了 wt HAV在细胞培养物中的感染性。这些实施例的结果与HAV8Y-Bsd 不能从被转染的FRhK-4细胞中拯救的发现一致，但是我们能够4吏 用来自Huh7细胞的HAV8Y-Bsd的保存物感染这些细胞(图2 )。把 这些数据综^来，在建立FRhK-4细胞中的感染方面，显然体外 转录物相比于病毒颗粒更低效。尽管在拯救wt HAV上是有效的， 绒猴肝脏的直接转染是复杂且昂贵的技术，与其相反，如本文所举 例的，从被转染的Huh7或Huh7-A-I细胞中得到wtHAV是简单的。
一些有关控制实验的考虑因素在Emerson等(1993 )(参考文献 13，见esp. pp. 478-479 )中有所描述，所述实验应用了在培养物中 使用HAV转录物转染哺乳动物细胞。
wt和减毒HAV的分子克隆可供使用已经大约20年了 ( 6-8 )。 但是，缺乏稳健的细胞培养系统限制了反向遗传学应用于认识HAV 的致病性以及开发低成本的减毒疫苗，所述细胞培养系统可允许wt 病毒的拯救和高效生长。wt HAV生长的高允许性Huh7-A-I细胞的 可用性允许反向遗传学应用于研究HAV的致病性以及开发高效的用 于HAV的活性减毒疫苗。
大多数细胞培养适应的HAV毒林不造成细胞病变效应
(cytopathic effect, CPE )，但是已经显示出一些毒林在HAV快速 复制的细胞系中(28、 32、 40)可触发CPE引起凋亡(4、 17、 26)。 在本文的实施例中，wt HAV在Huh7 (图2 )和Huh7-A-I (数据未 显示)细胞中建立了持久性感染，并且不造成CPE。构建含有杀稻 痙菌素选择标记的wt HAV允许筛选可支持病毒复制的细胞系，其 导致鉴定出人肝细胞瘤Huh7细胞系可允许wt HAV生长。相似的含 有博来霉素(一种DNA嵌入剂)抗性基因的构建物之前被报道过
(1),但是不适于选择允许性细胞，这是因为博来霉素选择的緩慢 特性。确实，当我们用含有博来霉素选择标记而不是杀稻瘟菌素标 记的HAV构建物转染Huh7细胞和其它细胞系细胞并且在转染后24 小时用相应抗生素处理细胞，我们无法选择出存活的抗生素抗性的 细胞(Konduru和Kaplan,草稿在准备中)。因此，6W用作快速有 效的选择标记使得HAV构建物赋予支持最低水平病毒复制的被转染 细胞以抗生素抗性，对于其它选择标记(例如博来霉素抗性基因) 并非如此。
一般而言，用于本发明的选择标记基因是允许在一周内选择被 转染细胞的选择标记基因。这是相对于"緩慢"选择而言的，例如 zeocin或新霉素抗性，其通常需要两周到一个月。
可用于本发明的抗性包括对翻译抑制剂的抗性，例如嘌呤霉素 及其衍生物，当然也包括如实施例中所示的杀稻瘟菌素。Bcl-2基因 提供对于几种已知癌症治疗的抗性，表达Bcl-2基因的载体将提供对 诱导凋亡的药物的抗性。
编码6 /的HAV构建物是极好的遗传工具，其将允许鉴定HAV 生长所需的基因，开发用于研究和诊断的快速滴定和中和测试，以 及开发支持HAV疫苗毒林更快速生长和/或生长到更高滴度的宿主 细胞。 一般而言，通过增加杀稻瘟菌素(或其它选择试剂)浓度， 有可能选择支持更高水平HAV复制的细胞。也就是说，使用本发明 重组病毒和一定水平的杀稻痙菌素首先选择细胞系，然后可4吏用培 养基中更高水平的杀稻瘟菌素对其进行培养。或者，可制备来自第 一轮所选择细胞的病毒保存物，接着此病毒保存物用于感染未感染 细胞的二次培养物，其接着在较高杀稻瘟菌素浓度下进行杀稻瘟菌 素抗性选择。例如，对于第一轮转染和选择，可使用ljig/ml的杀稻 瘟菌素，接着在一种或多种如2、 5、 10、 20和最高50fig/ml的杀稻
瘟菌素浓度下继续培养。当然，所使用的步骤可根据适合于所使用 的特定病毒和细胞而有所不同。在较高水平杀稻瘟菌素(或其它选
择)下存活的细胞可表达支持人HAV更快生长或产生更高HAV最 终滴度的表型。相似地，从在较高杀稻瘟菌素浓度下培养的细胞获 得的病毒可含有允许在培养物中更快复制和/或生长到更高滴度的突 变。
本文举例的干扰素治愈的Huh7-A-I细^目比于亲本Huh7细胞 对wt HAV的感染更敏感(图4， B和C ),并支持更高水平的wt HAV 生长(图5)。 Huh7细胞已经用于高效培养含新霉素(Neo)抗性基 因的丙型肝炎病毒(HCV)重组体(29)。已经证明在IFN治愈之 后，感染的Huh7细胞克隆能够支持更高水平的HCV复制(51 )。
因为wt HAV和HCV都是肝炎病毒并且都在Huh7细胞的亚系 中高效复制，所以有可能此人肝细胞瘤来源的细胞系表达肝细胞特 异性细胞因子，所述细胞因子是这些病毒的体内生长所需的。但是， 使用包含杀稻瘟菌素选择标记的野生型HAV重组病毒选择的Huh7 细胞的亚系具有与亲本Huh7细粉目似的对于HCV复制子的敏感 性。il^明，使用HAV载体选择的Huh7细胞亚系不同于使用HCV 复制子选择的Huh7细胞亚系。编码功能性且有效的选择标记的 HAV载体，以及鉴定能够支持有毒力的和致病的wt HAV高效生长 的细胞系，提供了研究HAV复制和致病性的工具，同时也允许开发 低成本的减毒活病毒疫苗。
本发明的一个方面是重组甲肝病毒核酸，其包含野生型HAV基 因组的核苷酸序列(SEQ ID NO:l )或者其中密码子在2B蛋白质216 位氨基酸处编码缬氨酸的HAV基因组核苷酸序列。在2B蛋白质216 位氨基酸处编码缬氨酸的HAV基因组的例子中，所述序列是 HAV8Y，其在3889位残基带有突变，其将胞嘧啶残基改变为胸腺嘧 啶残基(52 )。本发明也涵盖在4087和/或4222位突变的重组HAV 基因组，所述突变可作为3889位核苷酸突变的补充或替代(13 )。
本发明实施方案的重组HAV核酸还包含"克隆位点"或"多克
隆位点"，其是代表位于编码蛋白酶3C，切割位点的核苷酸之间的 至少一个单一限制性酶切位点的核苷酸序列，该核苷酸序列进而位
于重组甲肝病毒2A和2B基因的连接处。在一些实施方案中，所述
克隆位点侧翼是编码"甘氨酸铰链"氨基酸的核苷酸。甘氨酸铰链
是由3-5个小疏7JC氨基酸(例如甘氨酸和/或丙氨酸)的短序列组成 的。所述铰链可包含丝氨酸。因此，例如，"甘氨酸铰链，，可以M 列-gly-gly-gly-或-gly-ala-gly,或者-gly-ser-gly-或-ala-gly-gly或者 其任意其它的组合。
本发明的重组HAV核酸可含有异源核酸，其位于编码蛋白酶 3Cpn)切割位点的核苷酸之间，所述异源核酸进而位于重组甲肝病毒 2A和2B基因的连接处。在这样的实施方案中，还优选所述克隆位 点的侧翼是编码"甘氨酸铰链"氨基酸的核苷酸。所述异源核苷酸 序列可以是使用常规限制性酶消化和连接所需核酸片段的方法插入 到所述克隆位点的序列。或者，可以没有所述克隆位点，而异源核 酸可以通过本领域已知的方法(例如重叠PCR)插入。
所述插入的异源核酸没有特别的限制，它可以是编码任何期望 M酸序列或功能性RNA的核酸。可以插入代^Ji过一个表达产物 的异源序列。
在一个优选实施方案中，发现对野生型HAV生长非常具有允"^午 性的细胞可用于拯救，异源核酸编码的蛋白质赋予表达所述蛋白质 的细胞以可选择或可筛选表型。这样的可选择或可筛选表型可以由 荧光蛋白或产生显色反应产物的蛋白所赋予，或者更优选的，所述 表型是一种对抗生素的抗性。在这样的情况下，所述抗生素优选是 一种干扰哺乳动物细胞中蛋白质翻译的抗生素(例如杀稻瘟菌素、 噤呤霉素或嘌呤霉素衍生物)。另一个优选的选择是诱导凋亡的化合 物，以及相应的抗性基因(例如BCL-2)。所述抗生素抗性或其它选 择标记允许选择含有摄入重组HAV基因组的细胞，并且所述细胞能 够将其复制以使得重组HAV基因组增殖。
本发明的另一个实施方案是包含如上所述的DNA重组甲肝病毒 核酸的DNA表达载体，所述核酸可操作地连接到用于重组甲肝病毒 基因组RNA转录的启动子。在本发明的此实施方案中，所述启动子 优选适于病毒基因组RNA的体外转录。这样的启动子是本领域7^ 的，例如SP6启动子或T7启动子，它们中的每个都可与它们各自相 应的纯化的RNA聚合酶共同于体外应用。
重组HAV核酸的形式没有特别的限制。也就是说，它可作为分
离的核酸、所培养细胞与其产物的混合物形式的核酸、或者装配病
毒颗粒的一部分而存在。例如，当重组HAV核酸编码作为疫苗抗原 的来源于肝炎或其它病毒、或者来源于任何其它生物异源蛋白时， 包含所述重组HAV基因组的病毒颗粒可作为疫苗使用。
本发明的重组HAV基因组可用于疫苗开发。重组HAV基因组 还可通过导入单突变或突变组合进行修饰以研究这样的突变对于感 染性病毒复制速率和生产上的作用。选作允许HAV生长的细胞可用 于支持带有已导入候选减毒突变的野生型HAV生长，从而实现足够 用于临床前试验的病毒的生长，所述临床前试验是在动物模型中候 选活疫苗毒林体内减毒和免疫原性试验。本发明的细胞系具有超出 之前用于培养HAV的细胞的优点，即它们不选择具有培养适应性突 变的病毒，因此候选疫苗林可在其中生长而不同时发生另外的突变 积累。或者，本发明所鉴定的允许性细胞系可以被研究以鉴定出HAV 毒力和致病性的宿主细胞决定因子，例如通过比较这样的允许性细 胞与非允许性细胞系(例如FRhK-4细胞)的蛋白表达镨。完成这 样的表达镨分析的材料和方法(例如2-D蛋白质电泳)被认为是本 领域公知的。
本发明也可用于分子克隆和鉴定允许野生型HAV或者允许 HAV疫苗毒林在细胞中生长的细胞因子。可用于达到这些目的的一 个方法是制备来自肝细胞瘤细胞系(例如Huh7细胞)或者来自任 何其它故义现允许野生型HAV生长的细胞的文库。这样的细胞是， 例如，原代肝脏组织培养细胞或者肝脏组织本身的细胞，或者单核 细胞或粘膜上皮细胞。所述文库也可从用于培养疫苗林的细胞(例 如MRC-5细胞或Vero细胞)制备。所述文库应制备于允许被插入 核酸在转染了所述文库的哺乳动物宿主细胞中表达的载体中。 一些 这样的载体是本领域已知的。附加型载体的例子有基于EBV-P1的 载体，例如pDR2 ( Clontech),或pEAK8或pEAK12载体。附加 型载体提供如下优点，被插入的DNA易于从质粒DNA制备物中分 离出来。
整合型载体也是已知的。如果4吏用整合载体，那么插入核酸可 通过，例如，使用来自载体臂序列的引物进行的聚合酶链式反应回 收。
所述文库接着被转染进不允许野生型HAV复制的细胞系，然后 选"^存在文库DNA的转化细胞，例如通过文库载体上存在的标记基 因。接着使用带有野生型背景并带有插入的选择或筛选标记基因的 重组HAV以本文所述的形式转染所述文库。参见例如图1中表示的 构建物。选择或筛选重组HAV所携带的标记基因可鉴定所述文库中 表达细胞因子编码基因的成员，所述细胞因子支持野生型HAV生长。
可对此方法进行修改，例如，通过在使用包含本发明重组HAV 的病毒颗粒感染非允许性细胞的同时使用所述文库转化它们，接着 同时使用两个选择标记选择允许性细胞。
本发明也提供选择允许甲肝病毒生长复制的细胞的方法，尤其 是允许野生型HAV生长的细胞。这样的方法包括用本发明重组甲肝 病毒核酸转染培养细胞，以及接着针对转染细胞选择或筛选由所述 重组曱肝病毒赋予的表型。表达所选择或筛选表型的细胞被^人为允 许甲肝病毒的生长和复制。
所选择细胞可进一步培养以提供用于保存该细胞系以及用于克 隆细胞以提供纯细胞系的保存物。用于建立单克隆细胞系的细胞克 隆技术,皮认为是本领域公知的。用于建立允许性细胞初始保存物目 的对细胞的进一步培养可在实施最初选择的试剂存在下进行，以维 持重组HAV基因组存在于初始细胞系中。
或者，所述细胞的进一步培养可在没有选择试剂的情况下进行， 任选地在干扰素存在下进行，以便促进从细胞系基因组中消除 (cure)重组HAV基因组。这种"消除或治愈(cure )，，的细胞系提 供可用于培养减毒肝炎病毒林(尤其是HAV)的宿主，以生产疫苗 和检测获得自环境(包含食物样品)和病人的样品，以及通过培养 方法确定这种样品的复制型HAV的含量。
在建立允许野生型HAV生长和复制的细胞系中，理想的是进一 步检测治愈的细胞系再次支持野生型HAV或突变HAV生长的能力。 这样的突变HAV可以是HAV8Y毒林，其只含有2B蛋白中的A261V 突变，这被认为是HAV适应于细胞培养所需的最小突变。突变HAV 可以包含任何其它突变，所述其它突变赋予其在所培养细胞中良好 生长和复制的能力。或者，突变HAV可以是减毒林，其可用作人体 应用的疫苗。
在本发明的所有实施例中，可以通过使用包含所需HAV核酸的 病毒颗粒感染，或者通过使用纯化或部分纯化形式的HAV核酸以本 领域公知的方法(例如脂质体转染或电穿孔)转染细胞，将不论何 种形式的HAV核酸导入到细胞中。HAV核酸可以以RNA形式或 DNA形式被导入到细胞中，这取决于所4吏用载体的性质。RNA形式 的HAV基因组核酸可如上所述通过体外转录产生。或者，如果在 DNA载体内部HAV基因组序列可操作地连接到在哺乳动物细胞中 有效的启动子，这可用于转染哺乳动物细胞，其接着将在培养物中 或在体内转录HAV基因组核酸。
本发明也提供选择允许甲肝病毒生长和复制的细胞的方法。这 样的方法包括用本发明重组甲肝病毒核酸转染所培养细胞，以及针 对转染细胞选择或筛选由所述重组甲肝病毒赋予的表型。表达所选 择或筛选表型的细胞被认为允许甲肝病毒的生长和复制。
可通过使细胞与包含本发明重组HAV核酸的病毒颗粒相接触并 且确定所述病毒是否在所述细胞中复制来评估细胞被野生型或减毒 肝炎病毒(尤其是甲肝病毒)感染的能力。例如，可通过对所接触 细胞培养物中的肝炎病毒(尤其是HAV )抗原的IF测定，或者通过 测定培养物中随时间积累的病毒滴度作出这样的判断。
所选择细胞可进一步在使得从所选择细胞消除所述曱肝病毒核 酸的条件下培养。
在治愈之前或之后，可检测所选择细胞被野生型HAV和/或带有 减毒突变或细胞培养适应的突变的HAV感染和对其进行复制的能 力。
本发明也包含允许野生型HAV生长的细胞和细胞系。这样的细 胞可根据上述方法获得。本发明优选的细胞系来自人肝细胞瘤细胞 或来自正常人肝细胞。
本发明的一个优选实施方案是包含已转染重组甲肝病毒核酸之 Huh7细胞的哺乳动物细胞系，所述病毒核酸包含编码蛋白质的核苷 酸序列，所述蛋白质将可选择或可筛选表型赋予表达所述蛋白质的 细胞。选择标记序列位于编码蛋白酶3CpTO切割位点的核苷酸之间， 其进而位于重组甲肝病毒2A和2B基因的连接处。根据标记序列选 择所转染细胞，接着消除重组甲肝病毒。所得细胞允许甲肝病毒的
复制。
本发明的人肝细胞瘤细胞系Huh7-A-I才艮据布达佩斯条约 (Budapest treaty)的名义和条件于2005年6月7日以保藏号 PTA-6773保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, P.O. Box 1549， Manassas, Virginia 20108， USA )。
本发明也包括生产曱肝病毒的方法，其包括使用甲肝病毒颗粒 感染细胞，或者使用代表甲肝病毒基因组的核酸转染细胞，培养被 感染或被转染的细胞以提供甲肝病毒的复制，以及从所培养的细胞 中分离曱肝病毒颗粒。所应用的细胞允许野生型HAV的生长和复制 和/或提供减毒HAV毒林滴度为107TCID5。/ml,优选1075、 108、或 更高滴度。
本发明还提供测定样品中感染性甲肝病毒的方法。这种方法包 括使来自本发明任一细胞系的细胞与样品接触，培养所述细胞，然 后确定样品中是否存在甲肝病毒。样品中是否存在HAV可用本领域 任何已知方法来检测，所述方法例如滴定所培养细胞中存在的病毒 滴度，这是通过使培养物的上清样品与可被甲肝病毒感染的哺乳动 物细胞相接触然后对被感染细胞计数来进行的。或者，可在培养细 胞中或来自培养细胞的上清中检测和/或定量HAV核酸，这是通过 使用曱肝病毒核酸特异性引物和来自细胞或培养物上清的核酸样品 作模板进行聚合S^涟式反应来实施的。定性和定量PCR方法被认为 是本领域已知的。可以通过使用免疫测定方法测定至少 一种甲肝病 毒特异性蛋白的存在，来检测和/或定量HAV特异性蛋白。HAV特 异性单克隆抗体和许多免疫测定方法(包括定性和定量)被认为是 本领域已知的。
实施例
下述实施例用于举例说明本发明而不是对其的限制。本发明只 被权利要求所限制。
实施例中使用的一般材料和方法
细胞和病毒.具有多次传代史的人肝细胞瘤Huh7细胞，获得自 Dr. D. Taylor和Dr. C.Hsia， FDA， Bethesda, MD.，将其培养于添
加10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS )的Dulbecco改进的Eagle 氏培养基(Dulbecco，s modified Eagle，s medium, DMEM)中。将 非洲绿猴肾细胞(AGMK)的连续克隆GL37 (39 )培养于添加10% FBS的Eagle最小必需培养基(Eagle，s minimal essential medium, EMEM)中。人HeLa细胞和AGMK Vero细胞，获得自ATCC， 其培养于含10% FBS的DMEM中。恒河猴FRhK4细胞，获得自 Dr. S.Emerson, NIH， Bethesda， MD.，其培养于含10%马血清的 DMEM。缺乏二氳叶酸还原酶(dihydrofolate reductase) ( dhfr ) 的中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary ， CHO )细胞，获得自 ATCC，其培养于含有10% FBS并添加100 fiM次黄嘌呤和16 nM 胸腺嘧啶(Sigma Chemical Co.)的Iscove，s培养基中。小鼠肝脏细 胞系MMH-D3 (53 )来源于带有截短的细胞质形式的人Met基因的 转基因小鼠，其培养于胶原蛋白包被的培养瓶上含10% FBS、 10 Hg/ml胰岛素、50ng/mlEGF、和30 ng/ml IGF2生长因子的RPMI 1640培养基中。人Jurkat细胞，获得自ATCC，生长于含10% FBS 的RPMI 1640培养基中。所有的细胞系培养于37"C的5% CO;j培养 箱中。
粪4更来源的野生型(wt) HAV的HM-175毒林获得自Dr. S. Feinstone， FDA， Bethesda， MD。在蛋白质2B的216位含有Ala 向Val改变(2B-A216V)的HAV的wt HM匪175毒林(11、 14、 18 )， 称为HAV-8Y，来源于Huh7细胞，其转染了来自pHAV的体外失控 型(run-off) SP6聚合酶转录物。
质粒和构建物.在pHAV8Y中HAV-8Y的传染性cDNA,其编 码含有2B蛋白中A216V改变的wt HM-175 HAV (11、 14 )，以及 在pHAV/7中细胞培养适应的HAV的HM-175毒林的传染性cDNA (5)，这两种传染性cDNA处于SP6RNA聚合酶的控制下。
使用PCR和标准分子生物学方法构建质粒(35)。如制造商所 推荐的4吏用Pfu Turbo Hotstart聚合酶(Stratagene)扩增PCR DNA 片段。在25个循环的95C30秒、50X:i分钟、和72"C2分钟中进行 扩增。对于重叠PCR，片段在lxpCR緩沖液中在94C变性，在 45匸退火2分钟。4吏用所述构建物转化;U^杆菌(五sc/^"/c/i/flco/Z) DH5a菌林，如制造商所建议的通过色镨(Quiagen)纯化质粒。使 用ABI Prism BigDye终止剂循环测序即用型反应试剂封ABI Prism
BigDye terminator cycle sequencing ready reaction kit. Applied Biosystems )和ABI Prism (3100型)测序仪(Applied Biosystems ) 通过自动核苷酸序列分析!Hi构建物。构建了如下质粒
pHAV8Y-MCS.使用重叠PCR将含有唯一 Sfl/J、 Swfl丑J、和I/mJ 限制性位点的多连接子引入到pHAV8Y中HAV感染性cDNA的 2A/2B连接处，所述多连接子侧翼是三残基Gly铰链和HAV蛋白酶 3C拜的切割位点(32、 38)，所述Gly铰链设计为方便加工两个相 邻的3C拜蛋白酶切割位点(图1 )。正向PCR引物A (5，-GTTTTATTTTCCCAGAGCTCCATTGAACTCAA-3，)(SEQ ID NO:2)对应于 HAV的2975-3006位核苷酸，其编码蛋白质VPl之C末端并^^有天 然5V^/限制性位点，反向PCR引物B (5，-
GGTACCTACGTAGTCGACTCCGCCACCTCTAGAATTGGCTTGTGAAAACAGTCCC TTCTTCATTTTCCTAGG-3') (SEQ ID NO: 3)编码HAV的3213-3242位核 苷酸，其对应于2A蛋白的C末端、合成的3CPr。切割位点、和如上 所述的多连接子加上三残基Gly铰链，这些引物被用于以pHAV8Y 作为模板扩增片段I。使用相同的HAVcDNA作为模板扩增另外的 PCR片段II，其中使用寡核苷酸C (5，-
GACTACGTAGGT八CCGGGGGAGGCGGATCC
CTGTTTTCACAAGCCAATATTTCTCTTTTTTATACTGAGGAG-3') (SEQ ID NO: 4) 和D
(5'-ATTTTTCCACATCTTGGATTTOCAAAATGCAAAATT-3,) (SEQ ID NO: 5)作 为PCR引物。正向PCR引物C的5，端15个核苷酸互补于寡核苷 酸B的多连接子，其后是三密码子的Gly铰链、3C拜切割位点、和 HAV的3243-3272位核苷酸。反向PCR引物D编码HAV的4183-4217 位核苷酸，并含有天然的7^Mi7艮制性位点。PCR片段I和II退火 并用作4吏用正向A和反向D PCR引物来扩增更大片段的^j^板。皿 纯化所得的PCR片段，使用SflcJ和i^MZ酶消化，然后克隆到使 用相同酶切过的pHAV8Y中。所得的构建物被称为pHAV8Y-MCS。
pHAV8Y-Bsd.杀稻痙菌素抗性基因5^/净皮克隆进 pHAV8Y-MCS的多连接子中。从pTracer-CMV/Bsd (Invitrogen) 中使用合成的寡核香酸引物5'-GTCGACGTCGACCAGGCCA AGCCTTTGTCTCAAGAA-3， ( SEQ ID NO:6 )和5，画
CGGTTAGGTACCGCCCTCCCACACATAACCAGAGGG-3'(SEQ U) NO: 7)扩增
DNA片段,其分别在基因的5，和3，端引入5Vi/J和iT/7"/限制性位点， 并且去掉6 /的翻译起始和终止密码子。凝胶纯化所得的PCR片段， 使用5WJ和iT/m/酶消化，然后克隆到使用相同酶切过的 pHAV8Y-MCS中。所得的构建物被称为pHAV8Y-Bsd，其编码插入 在2A和2B基因之间的丑W抗性蛋白，其与HAV多聚蛋白质的其 余部分的读码框一致。
pHAV.WT-Bsd. HAV8Y中的2B/A216V残基回复突变为wt HAV 天然分离株中发现的Ala残基。使用编码wt HAV 3874-3894位核苷 酸的正向引物A1 (5，-GAGTCATGAATTATSeAGATA-3，) (SEQ ID NO: 8)和编
码wt HAV 3900-3880位核苷酸的反向引物
A2 f5,-AACCAATATCTGCATAATTCA-3') ( SEQ ID NO: 9 )实施重叠PCR， 上述两个引物在2B的216位都编码Ala密码子(下划线)。分别使 用PCR引物A和A2，以及PCR引物Al和D,从pHAV8Y-Bsd中 扩增两个重叠PCRcDNA片段。对这两个PCRcDNA片段变性、退 火，然后用作模板使用引物A和D扩增更长的PCR片段，用5Vi// 和iy/M/消化，^_纯化，然后克隆进pHAV8Y-Bsd的和iy 7kT/ 位点。所得的构建物被称为pHAV.WT-Bsd。
免疫荧光分析.使用冷丙酮对在35t:生长于8孔培养室玻片的 模拟-和HAV-感染的细胞固定30分钟，空气干燥，使用含2。/。FBS 的PBS封闭，然后用鼠抗HAV中和单克隆抗体(Mabs) K2-4F2 和K3-4C8 (30)以及FITC缀合的山羊抗小鼠抗体(KPL Inc)染 色。用Zeiss Axioscope显微镜以400倍放大使用油镜拍摄荧光显微 照片。
RNA转染和HAV感染.使用SP6 RNA聚合酶(Amersham Pharmacia)和在HAV cDNA多聚(A)下游的Ha"位点线性化的质 粒模板体外合成全长HAV RNA转录物(7， 41 )。通# 1%琼脂糖 凝胶上的电泳检测体外合成RNA转录物的产量(约5-10照)和质 量。用DEAE葡聚糖作为促进剂(facilitator)将RNA转录物转染 到生长在25 cn^培养瓶中的亚汇合态细胞单层(33)。室温30分钟 之后，清洗单层，加入新鲜培养基，在35。C下孵育细胞。转染一天 之后，以l: 2的比例将细胞传代，并使其生长在含有2 ng/ml杀稻 瘟菌素(Invitrogen)的选择培养基中。每周以1: 5的比例将细胞 传代到25 cm2培养瓶和8孔Permanox培养室玻片(Nunc, Inc)中
以进行免疫荧光(immunofluorescence, IF)分析。对单层进行三次 冻融循环，经IF分析评估所述单层中80%的细胞表达HAV抗原， 然后通过低速离心沉淀细胞碎片，将含病毒的上清#^在-70"C 。
为感染细胞，50-80%汇合的细胞单层以1-2 TCIDs。/细胞的感染 复数(MOI)被接种到25 112培养瓶中。感染细胞生长于35。C的 C02培养器中。感染后24小时，将杀稻瘟菌素(2照/ml)加入培养 基中以选择被含^/抗性基因的HAV构建物感染的细胞。为制备较 大的病毒保存物，在感染后一周用胰酶处理细胞，并使其在225cm2 培养瓶中再生长两周。为进行一步生长曲线分析，使用与上勤目同 的条件感染6孔板，然后在不同时间点将板冷冻于-70'C。在收集了 最后一个时间点之后，将板解冻，按照上文所述制备病毒,物。
HAV滴度确定.通过在含20-50%汇合的细胞单层的96孔板中进 行ELISA终点稀释测定来确定HAV滴度。将100 pl制备于 DMEM-10% FBS中的10倍稀释的HAV接种到8个平行孔中。在 35。C的C02培养器中孵育所逸板。感染后两周通过ELISA确定病毒 滴度。ELISA操作如下，使用卯％曱醇固定细胞单层，使用1: 2，500 稀释的Mab K2-4F2和1: 25,000稀释的过氧化物酶标记的山羊抗小 鼠抗体(KPLInc.)染色。加入TMB单组分底物(KPLInc.) (100 ml/孑L )，所ii^在室温孵育15-30分钟，然后使用1% H2S04( 100 ml/ 孔)终止反应。显示出未感染对照吸光度至少两倍的孔祐j人为是阳 性。
或者，通过在含Huh7细胞的20-50%汇合的细胞单层的96孑L板 中进行杀稻痘菌素抗性终点稀释测定来确定HAV8Y-Bsd和 HAVwt-Bsd滴度。感染后24小时，杀稻痙菌素(2 ng/ml)加入到 96孔板的细胞培养基中，然后在35'C在C02下孵育。感染后5到7 天，在显微镜下观察96孔板，含有细胞单层或形成集落的活细胞的 孔被认为是阳性。ELISA和杀稻瘟菌素抗性终点滴定的病毒滴度使 用Reed和Muench方法确定(34 )。
使用干扰素治愈/消除细胞的HAV感染.使用人白细胞来源的干 扰素画aA/D (IFN-aA/D ) ( Sigma Chemical Co.)处理Huh7细胞以 从所述细胞中去除病毒，所述细胞是使用HAV8Y-Bsd合成转录物转 染并使用2jtg/ml杀稻瘟菌素选择的。在IFN-aA/D处理之前，在不
含杀稻痙菌素的生长培养基中将细胞传代两次。在存在100、 250、 或500 U/ml的IFN-aA/D而不存在杀稻瘟菌素的条件下，使用 HAV8Y-Bsd感染的Huh7细胞生长在12孔板中。每周在含有 IFN-aA/D的培养基中传代细胞，在IFN-aA/D存在下传代三次之后， 通过IF分析评估HAV抗原的存在，在含有0.5-10 ng/ml杀稻瘟菌 素存在下生长的细胞的96孔板中测定细胞对抗生素处理的敏感性， 以及通过IF分析细胞提取物对未感染Huh7细胞的感染来评价感染 性HAV的产生。未感染和HAV8Y-Bsd感染的Huh7细胞分别用作 杀稻瘋菌素抗性实验的阴性和阳性对照。不产生免疫荧光、对Bsd 处理敏感、且不产生感染性HAV的细胞被认为是治愈(已消除)的。 这些细胞被命名为Hiih7-A-I ，并保存在液氮中。
核苷酸序列分析.从病毒M物中使用Trizol (Invitrogen)提 取HAV RNA。如制造商所推荐的使用Supercript-II试剂盒 (Invitrogen)合成HAV cDNA，其使用HAV RNA作为才莫板和编码 4879-4卯0位或580-600位核苷酸的HAV特异性合成引物。通过PCR 使用编码1-21位和580-600位的合成引物从5，-NTR扩增HAV cDNA 片段。使用编码3781-3880位和4879-4卯0位的合成引物扩增来自 2B-2C区的HAVcDNA片段。使用与用于质粒构建物中相同的条件 和聚合酶进行PCR扩增。凝胶纯化PCR DNA片段,使用ABI Prism BigDye链终止剂循环测序试剂盒(ABI Prism BigDye terminator cycle sequencing ready reaction kit, Applied Biosystems )和上文所 述的PCR扩增引物以及编码4185-4205位核普酸的用于测序2B-2C 区的另外引物，对cDNA的两"^都进行测序。在ABI Prism (3100 型)测序仪(Applied Biosystems )中进行自动测序。
实施例1:从用体外转录物转染的细胞中回收wt HAV。
为了拯救HAV8Y-Bsd，将SP6转录物转染进Huh7、 FRhK4、 GL37、 HeLa、 Vero、 CHO、 MMH-D3、和Jurkat细胞。转染后一 天，细胞l: 6传代，并生长在含l、 2、 4、或5ng/ml杀稻瘟菌素的 培养基中。在使用lng/ml杀稻痙菌素选择14天后，少量的杀稻瘟 菌素抗性集落生长于HAV8Y-Bsd RNA转染的Huh7细胞中，但是 在模拟转染的细胞中没有生长。转染的Huh7细胞在用更高浓度(2、 4、或5照/ml)的杀稻痙菌素选择下不能存活。在杀稻瘟菌素处理的 情况下，所有其它的转染细胞系不能存活，其显示出HAV8Y-Bsd只
能从Huh7转染细胞中拯救。IF分析(图2)显示杀稻瘟菌素抗性 的Huh7细胞具有HAV感染细胞的特征性细胞质颗粒状荧光(B), 这在模拟转染的细胞中没有观察到(A)。为评估2B-A216V突变对 wt HAV在Huh7细胞中生长的作用，我们回复突变了 HAV8Y-Bsd 的3889位核普酸，将其从T变为C，以恢复所述病毒天然分离林中 观察到的序列，其命名为构建物pHAV.WT-Bsd。类似于HAV8Y-Bsd 的结果，用lng/ml杀稻瘟菌素处理14天用来源于pHAV.WT-Bsd的 RNA转录物转染的Huh7细胞，导致选择出少量含有HAV抗原的 抗性集落(C)。希望确定回收自被转染Huh7细胞的病毒是否可生 长于FRhK-4细胞中。IF分析显示，FRhK-4细胞对HAV8Y-Bsd的 感染是敏感的(E)，但是对HAV.WT-Bsd的感染是不敏感的(F)， 这与之前FRhK-4细胞不支持野生型病毒生长但是允许培养适应性 毒林HAV-8Y生长的结果相一致(11、 12、 14)。正如预期，在模拟 感染的FRhK-4细胞中没有检测到HAV抗原(D )。我们的数据表明， 可有效地从转染了体外合成转录物的Huh7细胞中拯救wtHAV，所 述转录物来源于感染性cDNA，并且此拯救与在2B蛋白中3889位 A216V的重要的HAV细胞培养适应的突变无关。
为分析IF阳性细胞是否产生可传播杀稻瘟菌素抗性的感染性 HAV，我们从HAV8Y-Bsd或HAV.WT-Bsd感染的Huh7细胞中制备 了病毒保存物并感染未感染的Huh7细胞。大约50%的HAV8Y-Bsd 或HAV.WT-Bsd感染的Huh7细胞在l照/ml杀稻痘菌素处理下存活 5天，其表明克隆进HAV基因组的功能性^rf基因被包装进了感染 性颗粒。
实施例2: wt HAV在Huh7细胞中的稳定生长。
感兴趣的是，确定在大多数细胞系中观察到的对细胞培养适应 的和减毒性突变的强选择压力是否也存在于Huh7细胞中。为研究 含Bsd选择标记的wt HAV是否可稳定地在Huh7细胞中生长，而 不积累细胞培养适应的突变并且保留选择标记，我们进行了在1 pg/ml杀稻痘菌素存在下的HAV8Y-Bsd和HAV.WT-Bsd在Huh7细 胞中的九次连续传代。对提取自九次连续传代的HAV RNA的 RT-PCR扩增和核普酸序列分析表明所插入的基因在两种病毒 中都是稳定的。第9次传代HAV8Y-Bsd和HAV.WT-Bsd的2B-2C 和5，-NTR区的核苷^列与亲本cDNA —致，这显示出这些病毒 不在这两个热点积累细胞培养适应的突变。为了进一步评估wtHAV 在Huh7细胞中的稳定性，我们研究了 wt HAV在FRhK-4细胞中的 生长，其依赖于3889位核苷酸主要细胞培养适应的突变的存在。在 96孔板中使用杀稻瘟菌素抗性终点稀释测定在Huh7细胞和 FRhK-4细胞中平行滴定第9代HAV8Y-Bsd和HAV.WT-Bsd的滴度 (图3)。在两个细胞系中获得相似的HAV8Y-Bsd滴度，而 HAV.WT-Bsd的滴度在Huh7细胞中大约是104 TCID5()/ml，但是在 FRhK-4细胞中检测不到。HAV.WT-Bsd在FRhK-4细胞中缺乏生长 进一步确认了此病毒在Huh7细胞的9次连续传代中没有积累细胞 培养适应的突变。Huh7细胞支持wt HAV的稳定生长，其与3889 位核苷酸主要细胞培养适应的突变的存在无关。
实施例3:经IFN- a A/D治愈/消除HAV8Y-Bsd-感染的Huh7细胞对 wt HAV感染是敏感的。
使用干扰素治愈实施例1中被HAV.WT-Bsd感染的杀稻瘟菌素 抗性细胞(9)。为了达到上述目的，在缺乏杀稻痙菌素的培养基中， 在100、 250、或500 IU/ml IFN-a A/D存在下数次传4&培养 HAV8Y-Bsd感染的杀稻痙菌素抗性的Huh7细胞。7次传代之后， IF分析显示出用250 (图4A)或500 U/ml (数据未显示)的IFN-aA/D处理的细胞失去了 HAV抗原，而未处理的对照细胞(图4A) 和一些在100 IU/ml IFN- a A/D存在下培养的细胞具有HAV感染细 胞的特征性细胞质荧光(数据未显示)。为了确定失去了 HAV抗原 的经干扰素治疗的细胞是否也变为对杀稻痙菌素敏感，所述干扰素 处理的细胞在0.5-10pg/ml杀稻痙菌素存在的情况下被培养10天， 并且通过显微镜观察培养物。
对照HAV8Y-Bsd感染的细胞在最高8 pig/ml杀稻痘菌素存在的 情况下生长，而失去了 HAV抗原的细胞和对照Huh7细胞在用1|J g/ml杀稻瘟菌素处理后死亡。另外，在接受IFN-aA/D处理而失去 HAV抗原的细胞中，通过RT-PCR分析检测不到HAV RNA (数据 未显示)。这些数据清楚地表明在缺少杀稻瘟菌素的情况下， HAV8Y-Bsd感染的Huh7细胞在用IFN- a A/D处理之后消除了 HAV 感染。为了证实没有残余的感染性HAV留在培养物中，所述治愈的 细胞在缺少IFN-aA/D的情况下传代两次，进行IF和杀稻痙菌素处 理敏感性分析，其显示所述治愈的细胞不带有HAV抗原且对杀稻瘟
菌素敏感。从HAV8Y-Bsd感染中被使用250 IU/ml IFN-oc A/D治愈 的Huh7细胞被命名为Huh7-A-I并保存在液氮中。
为确定Huh7-A-I治愈细胞是否对wt HAV感染敏感，在 Huh7-A-I和未感染细胞中使用杀稻痕菌素抗性终点稀释测定来滴 定HAV8Y-Bsd和HAV.WT-Bsd的滴度(图4B )。两种病毒在 Huh7-A-I细胞中都产生比未感染Huh7细胞高10倍的滴度，这确认 了 Huh7-A-I亚系对wtHAV感染比亲本细胞系更敏感。我们也分析 了两个细胞系对分离自人粪便的wt HM-175毒林(wt HM-175 HAV) 感染的敏感性。96孔板中的ELISA终点稀释测定显示，Huh7-A-I 细胞对wt HM-175 HAV感染的敏感性也是亲本Huh7细胞的十倍 (图4C )。 Huh7-A-I对wt HAV感染敏感性的增加与3889位细胞培 养适应的突变和Bsd选择标记的存在无关。另外，这是首次净艮ilxt 天然分离抹wtHAV的感染有高敏感性的细胞系。
实施例4:治愈的Huh7-A-l亚系对wt HAV生长有高允许性
在Huh7、 Huh7-A-I、和对照FRhK-4细胞中进行wt HM175 HAV、 HAV8Y-Bsd、和HAV.WT-Bsd、以及细胞适应性HAV/7的一 步生长曲线分析。在含有Huh7-A-I细胞的96孔板中通过ELISA 终点稀释测定来滴定时间点(图5A)。细胞培养适应的HAV/7在所 有三种细胞系中以大约106-107 TCID5。/ml的类似水平高效生长。正 如预期，对照FRhK-4细胞支持低水平的HAV8Y-Bsd生长，但是不 支持wt HM175 HAV和HAV.WT-Bsd生长，它们不含细胞培养适应 的突变。HAV.WT-Bsd和wt HM175 HAV几乎不在亲本Huh7细胞 中生长，而HAV8Y-Bsd以大约1个1og^)生长，这显示了 ，相比于 FRhK-4细胞，在3889位的主要细胞培养适应的突变在这些细胞中 具有边际效应。wt HAV病毒在Huh7-A-I细胞中比在亲本Huh7细 胞中的生长好十倍，it4明治愈的细胞对于wt HAV生长具有高允 许性。HAV8Y-Bsd在Huh7-A-I细胞中的生长也比两种不含3889位 突变的wt HAV高1个log1((。因此，相比于在FRhK-4细胞的易感 性中起主要作用，其在FRhK-4细胞中对于病毒生长是绝对必需的， 2B/A216V改变在Huh7和Huh7-A-I细胞中对wt HAV感染的易感 性起次JHt用。有趣的是，将AW基因插入到wtHAV基因组在病毒 生长中不起主要作用，因为HAV.WT-Bsd和wt HM175 HAV于Huh7 和Huh7-A-I细胞中相似地生长。进行5，NCR和2B-2C基因的核苷絲列分析(图5B)，以证实在不同细胞系中产生的病毒基因型类 似于所输入病毒。从提取自病毒粒子的基因组RNA扩增的RT-PCR 片段确认，wt HM-175 HAV和HAV.WT-Bsd不含有细胞培养适应的 突变，HAV8Y-Bsd在3889位核苷酸处含有细胞培养适应的突变， 并且HAV/7在2B-2C基因中具有一蔟6个细胞培养适应的突变，以 及在5，NTR中有另一簇突变。因此，这些病毒的基因型与它们在 FRhK-4细胞中的表型相关联。
本文引用了多项专利和科技期刊文献。其中每一项都通过引用 以整体并入本文并且通过这种引用用于所有目的。
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权利要求
1.重组甲肝病毒核酸，其包含i)选自下组的核苷酸序列a)SEQ ID NO1，b)SEQ ID NO1的核苷酸序列，其在3889位核苷酸处，密码子编码2B蛋白质216位氨基酸的缬氨酸，和c)在4087位核苷酸和4222位核苷酸处有突变的SEQ IDNO1，在所述4087位核苷酸处密码子编码甲硫氨酸，在所述4222位核苷酸处密码子编码丝氨酸，d)在3889位核苷酸和4087位核苷酸处有突变的SEQ IDNO1，在所述3889位核苷酸处密码子编码2B蛋白质216位氨基酸的缬氨酸，在所述4087位核苷酸处密码子编码甲硫氨酸，和e)在3889位核苷酸和4222位核苷酸处有突变的SEQ IDNO1，在所述3889位核苷酸处密码子编码2B蛋白质216位氨基酸的缬氨酸，在所述4222位核苷酸处密码子编码丝氨酸；ii)代表位于甲肝病毒基因组中编码3Cpro切割位点的核苷酸之间的至少一个单一限制性酶切位点的核苷酸序列。
2. 权利要求l的重组甲肝病毒核酸，其中3C拜切割位点进而位于重 组甲肝病毒的2A和2B基因连接处。
3. DNA表达载体，其包含权利要求l的DNA重组甲肝病毒核酸，其 可操作地连接至转录该重组曱肝病毒的基因组RNA的启动子。
4. 权利要求3的表达栽体，其中所述启动子是适合体外转录病毒基因 组RNA的启动子。
5. 重组甲肝病毒核酸，其包含 i) 选自下组的核苷酸序列a) SEQ ID NO:l，b) SEQIDNO:l的核苷酸序列，其在3889位核苷酸处，密 码子编码2B蛋白质216位氨基酸的缬氨酸，和c) 在4087位核苷酸和4222位核苷酸处有突变的SEQ ID NO:l，在所述4087位核苷酸处密码子编码甲石危氨酸，在所 述4222位核苷酸处密码子编码丝氨酸，d) 在3889位核苷酸和4087位核苷酸处有突变的SEQ ID NO:l,在所述3889位核普酸处密码子编码2B蛋白质216 位氨基酸的缬氨酸，在所述4087位核苷酸处密码子编码甲 硫氨酸，和e) 在3889位核苷酸和4222位核普酸处有突变的SEQ ID NO:l，在所述3889位核苷酸处密码子编码2B蛋白质216 位氨基酸的缬氨酸，在所述4222位核苷酸处密码子编码丝氨酸；ii) 编码蛋白的核酸，所述蛋白赋予表达该蛋白的细胞以可选择或 可筛选表型。
6. 权利要求5的重组曱肝病毒核酸，其中所述核酸ii)位于曱肝病毒 基因组中编码3C戶切割位点的核苷酸之间。
7. 权利要求6的重组曱肝病毒，其中3C萨切割位点进而位于重组甲 肝病毒的2A和2B基因连接处。
8. DNA表达载体，其包含权利要求5的DNA重组曱肝病毒核酸，其 可操作地连接至转录该重组甲肝病毒的基因组RNA的启动子。
9. 权利要求8的表达载体，其中所述启动子是适合体外转录病毒基因 组RNA的启动子。
10. 权利要求5的重组甲肝病毒核酸，其中所述可选择或可筛选表型 是对抗生素的抗性，所述抗生素可有效地抗培养的哺乳动物细胞并抑 制培养哺乳动物细胞中的蛋白质翻译。
11. 重组甲肝病毒核酸，其包含所述甲肝病毒基因组的核苷酸序列以 及提供对抗生素的抗性的核香酸序列，所述抗生素抑制哺乳动物细胞 中的翻译或者提供对诱导哺乳动物细胞中凋亡之药物的抗性。
12. 重组甲肝病毒核酸，其包含所述甲肝病毒基因组的核苷酸序列以 及提供可选择表型的核苷酸序列，所述可选^^表型允许在一周内选择 表达该表型的细胞。
13. 重组曱肝病毒核酸，其包含i) 代表至少一个单一限制性酶切位点的核苷酸序列，所述酶切位 点位于编码蛋白酶3C拜切割位点的核苷酸之间；和ii) 位于编码蛋白酶3CPr。切割位点的核苷酸之间的核苷酸序列， 其提供对抗生素的抗性，所述抗生素可有效地抗培养的哺乳动物 细胞并抑制培养的哺乳动物细胞中的蛋白质翻译或促进凋亡；其中可通过抗生素抗性或凋亡表型选择复制重组甲肝病毒核酸的细 胞。
14. 重组甲肝病毒核酸，其包含 i)选自下组的核苷酸序列a) SEQIDNO:l,b) SEQIDNO:l的核苦酸序列，其在3889位核普酸处，密 码子编码2B蛋白质216位^J^酸的缬氨酸，和c) 在4087位核苷酸和4222位核苷酸处有突变的SEQ ID NO:l，在所述4087位核苷酸处密码子编码曱石克氨酸，在所 述4222位核苷酸处密码子编码丝氨酸，d) 在3889位核苷酸和4087位核苷酸处有突变的SEQ ID NO:l,在所述3889位核苷酸处密码子编码2B蛋白质216 位氨基酸的缬氨酸，在所述4087位核苷酸处密码子编码曱 石危氨酸，和e)在3889位核香酸和4222位核苷酸处有突变的SEQ ID NO:l,在所述3889位核苷酸处密码子编码2B蛋白质216 位氨基酸的缬氨酸，在所述4222位核苷酸处密码子编码丝 氨酸；ii)代表至少一个异源核苷酸序列的核苷酸序列，所述异源核苷酸序列位于甲肝病毒基因组中编码蛋白酶3C戸切割位点的核苷酸之间。
15. 权利要求14的曱肝病毒核酸，其中3C戶切割位点进而位于曱肝 病毒2A和2B基因之间。
16. 包含权利要求14的核酸的曱肝病毒颗粒。
17. —种选择允许曱肝病毒复制的细胞的方法，其包括i) 用权利要求5的重组甲肝病毒核酸转染培养细胞；和ii) 针对转染细胞选择或筛选由所述重组甲肝病毒赋予的表型；iii) 其中表达所选择或筛选表型的细胞被认为是允许甲肝病毒生 长和复制的。
18. —种选择允许甲肝病毒复制的细胞的方法，其包括i) 用权利要求ll的重组甲肝病毒核酸转染培养细胞；和ii) 针对转染细胞选择或筛选由所述重组甲肝病毒赋予的表型；iii) 其中表达抗生素抗性或凋亡抗性的细胞被认为是允许甲肝病 毒生长和复制的。
19. 权利要求17的方法，其还包括从所选择的细胞中消除甲肝病毒核
20.权利要求18的方法，其还包括从所选择的细胞中消除甲肝病毒核
21. 权利要求17的方法，其还包括对细胞测试野生型甲肝病毒或减毒 曱肝病毒的生长。
22. 权利要求18的方法，其还包括对细胞测试野生型甲肝病毒或减毒 曱肝病毒的生长。
23. 权利要求19的方法，其还包括对细胞测试野生型曱肝病毒或减毒 甲肝病毒的生长。
24. 权利要求20的方法，其还包括对细胞测试野生型甲肝病毒或减毒 曱肝病毒的生长。
25. 权利要求17的方法，其中所述表型是对有效抗培养哺乳动物细胞 的抗生素的抗性。
26. —种哺乳动物细胞系，其包含已通过权利要求17的方法选择的细 胞。
27. —种哺乳动物细胞系，其包含已通过权利要求18的方法选择的细 胞。
28. —种哺乳动物细胞系，其包含已通过权利要求17的方法选择的且 允许野生型HAV生长的细胞。
29. —种哺乳动物细胞系，其包含已通过权利要求18的方法选择的且 允许野生型HAV生长的细胞。
30. —种包含Huh7细胞的哺乳动物细胞系，所述Huh7细胞已用包含 蛋白质编码核酸的重组甲肝病毒核酸转染，所述蛋白质赋予表达该蛋 白质的细胞以可选择或可筛选表型，所述蛋白质编码核酸位于所述甲 肝病毒基因组中编码3C戶切割位点的核苷酸之间，然后接着消除重组 曱肝病毒，所述细胞允许甲肝病毒复制。
31. 权利要，30的细胞系，其中重组甲肝病毒包含在2B蛋白质第216
32. 权利要求30的细胞系，其中可筛选或可选择表型是对抗生素的抗 性，所述抗生素抑制哺乳动物细胞中蛋白质翻译。
33. 权利要求32的细胞系，其中抗生素是杀稻瘟菌素、嘌呤霉素、或 嘌呤霉素衍生物。
34. 人肝细胞瘤细胞系Huh7-A-I,其保藏于美国典型培养物保藏中心， 保藏号为PTA-6773。
35. —种生产曱肝病毒的方法，其包括用所述甲肝病毒颗粒感染细胞， 或者用代表甲肝病毒基因组的核酸转染细胞，培养感染的或转染的细 胞以提供甲肝病毒的复制，然后从培养细胞中分离甲肝病毒颗粒，其中所述细胞来自权利要求26-34中任一项的细胞系。
36. —种测定样品中感染性曱肝病毒的方法，其包括将样品与来自权 利要求26-34中任一项的细胞系的细胞相接触，培养所述细胞，接着 通过选自下组的方法确定样品中甲肝病毒的存在i) 通过将培养物上清的样品与可被曱肝病毒感染的哺乳动物细胞 相接触并对细胞病变斑计数来滴定培养细胞中所存在的病毒；ii) 使用曱肝病毒核酸特异性引物和以从培养物的细胞制得的核 酸样品作为模板进行聚合sm式反应；和iii)通过免疫测定方法测定至少一种甲肝病毒特异性蛋白的存 在。
37. —种生产甲肝病毒核酸的方法，其包括用曱肝病毒颗粒感染细胞， 或者用代表甲肝病毒基因组的核酸转染细胞，培养感染或转染的细胞 以提供曱肝病毒的复制，从培养细胞中分离曱肝病毒颗粒，和从所分 离的颗粒中纯化曱肝病毒核酸，其中所述细胞来自权利要求26-34中任一项的细胞系。
38. —种生产曱肝病毒核酸的方法，其包括用甲肝病毒颗粒感染Huh7 细胞或肝细胞瘤细胞系的细胞，或者用代表甲肝病毒基因组的核酸转 染所述细胞，培养感染或转染的细胞以提供甲肝病毒的复制，从培养 细胞中分离甲肝病毒颗粒，和从所分离的颗粒中纯化甲肝病毒核酸。
39. 权利要求37的方法，其中甲肝病毒包含代表至少一种异源核苷酸序列的核苷酸序列，其位于重组甲肝病毒基因组中编码蛋白酶3Cpn>切割位点的核苷酸之间。
40. —种应用包^i^择标记基因的重组甲肝病毒以鉴定细胞因子的方 法，所述细胞因子允许野生型甲肝病毒在含有这种细胞因子的细胞中 生长，其包括I) 从不允许甲肝病毒复制和生长的细胞群中选择表达可选择或可筛 选表型的一个或多个细胞，所述细胞群已经被v^Uf细胞瘤细胞系中制得的位于表达栽体中的核酸文库所转化，所述可选择或可篩选表型是 通过用包含核酸的病毒感染所赋予的，或者是通过用核酸转染所赋予 的，所述核酸包含i) SEQ ID NO:l的核苷酸序列，和ii) 编码蛋白质的核酸，所述蛋白质赋予表达该蛋白质的细胞以可选择 或可筛选表型，该核酸位于野生型甲肝病毒基因组中编码3C拜切割位 点的核苷酸之间；II) 确定所选择细胞的表达载体中所存在的核酸的核苷酸序列。
全文摘要
本发明提供重组甲肝病毒(HAV)核酸以及允许它们生长和复制的宿主细胞。除了包含至少一个异源核酸片段之外，重组甲肝病毒核酸没有特别的限制。异源核酸可编码选择标记基因，这样的重组HAV核酸可用于选择允许野生型HAV生长和复制的细胞。或者，所述异源核酸可编码疫苗抗原或者其它期望在含有重组HAV核酸的细胞中表达的表达产物。本发明还提供了允许野生型HAV或者具有最小突变的HAV生长和复制的细胞系，所述最小突变是为了使HAV在细胞培养物中生长。
文档编号C12N15/86GK101356280SQ200680028880
公开日2009年1月28日 申请日期2006年6月26日 优先权日2005年6月28日
发明者克里希纳默西·孔杜鲁, 格拉尔多·卡普兰 申请人:美利坚合众国政府，由卫生与人类服务部部长代表