利用突变和非突变的基质金属蛋白酶制备药物组合物及稳定性提高的突变的金属蛋白酶的制作方法

专利名称：利用突变和非突变的基质金属蛋白酶制备药物组合物及稳定性提高的突变的金属蛋白酶的制作方法
利用突变和非突变的基质金属蛋白酶制备药物组合物及稳定性提高的突变的金属蛋白酶发明领域本发明涉及蛋白质领域，特别是涉及利用突变和非突变的基质金属蛋白酶制备药 物组合物。同时，还涉及下文所定义的突变的基质金属蛋白酶，该突变的基质金属蛋白 酶较相应的非突变蛋白质对蛋白自溶的稳定性提高。现有技术基质金属蛋白酶是一个由20多种不同锌依赖酶组成的家族，它们负责降解细胞外基 质。在细胞生长、形态形成及组织修复过程中，细胞外基质组分具有调节细胞环境的基 本功能。因此，基质金属蛋白酶的活性在转录及激活水平进行细微调节，也可以通过如 组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)和a2-巨球蛋白等内源抑制剂进行调节。调节基质金 属蛋白酶活性的微平衡的改变，与如硬皮症、心硬化、肾硬化、肝纤维化、肺纤维化、 胰囊性纤维化等病症的发生和发展联系在一起。基质金属蛋白酶酶活性的抑制因子的许 多活性成分已为人们所知。因此，将它们用于制备治疗金属蛋白酶过表达所引起的病症 的药物组合物。相反，直到本申请人才意识到基质金属蛋白酶不能以所分离纯化的形式 作为活性成分，直接用于药物领域。尽管如此，由于其在生理与病理领域的相关性，不管在学术领域，还是在工业领域， 对这种蛋白的需求仍很大。实际上，获得提純的基质金属蛋白酶是研究这些蛋白所参加 的生物过程和开发备选抑制剂的重要基础问题。但是，由于基质金属蛋白酶有蛋白自溶的趋势和蛋白自身随后降解，因此，基质金 属蛋白酶的利用通常是困难、复杂且昂贵的。这是由于一个或更多的氨基酸序列暴露在 蛋白的表面，并与蛋白的催化位点有很好的亲和性，从而水解了自身。为了避免蛋白自溶和降解过程，使用基质金属蛋白酶需要非常苛刻的工作环境，这 就使其应用的实验环境非常的复杂，有时甚至不可能实现。同时，其运输和保藏也非常的复杂，事实上，生产企业推荐将其保存在-80。C。另一个重要的限制是为了避免蛋白自溶，研究者被迫使用低浓度基质金属蛋白酶。这是许多实验中利用基质金属蛋白酶的另 一个限制。直到今天，研究人员利用合成的抑制剂或自我抑制的蛋白即蛋白带有原结构域来减 少蛋白自溶现象。不过，这两种策略都有许多的局限性，并且都不是解决这个问题的方 法。为了克服这个困难，已经制备出了基质金属蛋白酶的突变子，将在酶活性位点参与 催化机制的氨基酸谷氨酸被丙氨酸代替(Morgunova, E. et al.， Science 1999, 284,1667)。事 实上，在水解过程中，谷氨酸侧链的羧基与水分子一起亲核攻击肽链的羰基(Babine， R.E. etal., Chem. Rev. 1197,97,1359-1472)。谷氨酸被取代后，该蛋白失去水分子，从而再也 不能进行催化作用。正如很容易理解的，由于产生的是没有活性的蛋白，因此在需要保 持催化活性的情况下这种方法是不可行的。因此，深感有必要开发另一种替代方法，该方法能消除蛋白自溶，并且既不阻碍其 催化活性，也不妨碍其与底物和天然抑制剂的亲和性。发明内容本发明的申请人惊奇地发现将基质金属蛋白酶催化结构域中的一个远离活性位点的 特定位置的氨基酸突变使蛋白自溶的稳定性比野生型、非突变蛋白高。而且本申请的申请人还发现突变基质金属蛋白酶和野生型基质金属蛋白酶都可以用 于制备药物组合物，特别是治疗基质生物多聚物积累和/或TIMPs过量有关病症的药物 组合物，如硬皮症、心硬化、肾硬化、肝纤维化、肺纤维化、胰嚢性纤维化等病症。因此，本发明的主题是人类基质金属蛋白酶的催化结构域，其特征在于将所述催化 结构域突变以使与苯丙氨酸171相应的氨基酸残基突变为亲水的和/或带电荷的氨基酸 残基，其中苯丙氨酸171是根据序列登记号为P39900 (SwissProt)的编号。本发明的另 一个研究主题是含有将上面所述突变催化结构域作为催化结构域的基 质金属蛋白酶；编码上述突变基质金属蛋白酶的DNA序列；含有上述DNA序列的重 组载体；和用上述重组载体转化或转染的离体细胞。本发明进一步的研究主题是利用人基质金属蛋白酶和其上述任意突变的催化结构域 来制备药物组合物；以及由此获得的药物组合物。本发明进一 步的研究主题是诊断基质生物多聚物积累和/或组织金属蛋白酶抑制剂 (TIMPs)过量有关病变的诊断试剂盒，包括人基质金属蛋白酶及其上述任意突变的催化结构域。本发明进一步的研究主题是根据基质金属蛋白酶的药理学性质，将上述突变的人基 质金属蛋白酶，或其突变的催化结构域，作为药学靶标。 本发明的特点和优点将在下面详细介绍。


图1:实例3中的野生型和突变MMP3 (3号序列)十二烷基硫酸钠(SDS ) /聚丙 蜂酰胺凝胶电泳图。图2:实例4中的野生型和突变MMPIO ( IO号序列)SDS/聚丙烯酰胺凝胶电泳图。 图3:实例5中的野生型和突变MMP13 (10号序列)SDS/聚丙烯酰胺凝胶电泳图。本发明的详细介绍本发明中，"亲水和/或带电氨基酸残基"的表述意思是，氨基酸残基选自包括谷氨酰 胺、天冬酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的组。尤其特指天冬氨酸。本发明中，"根据序列登记号为P39900 (SwissProt)的编号，与苯丙氨酸171相应 的氨基酸残基"的表述意思是，在多序列比对结果中与上述苯丙氨酸171在相同位置的 氨基酸残基。下文相同。对各种在上述定义的相应位置没有亲水和/或带电氨基酸残基的基质金属蛋白酶(下 文中缩写为MMP)而言，例如，通过多序列比对，除MMP-l(l号序列)、MMP-8(5号 序列)、MMP-11(8号序列)外所有的MMPs,突变位于如下位点-根据序列登录号为P08253(SwissProt)的编号，人MMP-2(2号序列)及其所有通过 选择性剪接所决定的异构体，突变的氨基酸残基是甘氨酸181。-根据序列登录号为P08254(SwissProt)或Q6GRF8 (TrEMBL)的编号，人MMP-3(3 号序列)及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，突变的氨基酸残基是苯丙氨酸171。-根据序列登录号为P09237(SwissProt)的编号，人MMP-7(4号序歹'J)及其所有通过 选择性剪接所决定的异构体，突变的氨基酸残基是丝氨酸166。-根据序列登录号为P14780 (SwissProt)的编号，人MMP-9(6号序列)及其所有通过 选择性剪接所决定的异构体，突变的氨基酸残基是甘氨酸178。-根据序列登录号为P09238 (SwissProt)或Q53HH9 (TrEMBL)的编号，人 MMP-10(7号序列)及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，突变的氨基酸残基是苯丙 氨酸170。-根据序列登录号为P39900 (SwissProt)的编号，人MMP-12(9号序列)及其所有通 过选择性剪接所决定的异构体，突变的氨基酸残基是苯丙氨酸171。-根据序列登录号为P45452 (SwissProt)或Q7Z5M0、 Q7Z5M1 、Q6NWN6 (TrEMBL) 的编号，人MMP-13(10号序列)及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，突变的氨基 酸残基是苯丙氨酸175。-根据序列登录号为P50281 (SwissProt)或Q6GSF3 (TrEMBL)的编号，人 MMP-14(11号序列)及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，突变的氨基酸残基是丝 氨酸189。-根据序列登录号为P51511 (SwissProt)或Q7KZY0 (TrEMBL)的编号，人 MMP-15(12号序列)及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，突变的氨基酸残基是丝 氨酸209。-根据序列登录号为P51512 (SwissProt)或Q52H48、 Q14824 (TrEMBL)的编号，人 MMP-16(13号序列和14号序列)及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，突变的氨基 酸残基是丝氨酸196。-才艮据序列登录号为Q9ULZ9 (SwissProt)或Q5U5M0、 Q81WC3 (TrEMBL)的编号， 人MMP-17(15号序列)及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，突变的氨基酸残基是 甘氨酸200。-根据序列登录号为Q99542 (TrEMBL)的编号，人MMP-19(16号序列和17号序列) 及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，突变的氨基酸残基是酪氨酸165。-根据序列登录号为060882 (TrEMBL)的编号，人MMP-20(18号序列)及其所有通 过选择性剪接所决定的异构体，突变的氨基酸残基是丝氨酸179。-根据序列登录号为Q5VZP9和Q8N119 (TrEMBL)的编号，人MMP-21(19号序列) 及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，突变的氨基酸残基是半胱氨酸238。-根据序列登录号为075卯0 (TrEMBL)的编号，人MMP-23A(20号序歹'j)及其所有 通过选择性剪接所决定的异构体，突变的氨基酸残基是半胱氨酸152。-根据序列登录号为Q9UBR9(TrEMBL)的编号，人MMP-23B(21号序列)及其所有 通过选择性剪接所决定的异构体，突变的氨基酸残基是半胱氨酸152。-根据序列登录号为Q9Y5R2和Q9H440 (TrEMBL)的编号，人MMP-24(22号序列) 及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，突变的氨基酸残基是丝氨酸232。-根据序列登录号为Q9NPA2 (TrEMBL)的编号，人MMP-25(23号序列)及其所有通 过选择性剪接所决定的异构体，突变的氨基酸残基是丝氨酸182。-根据序列登录号为Q9NRE1 (TrEMBL)的编号，人MMP-26(24号序列)及其所有通 过选择性剪接所决定的异构体，突变的氨基酸残基是甘氨酸161。-根据序列登录号为Q9H306和Q6UWK6 (TrEMBL)的编号，人MMP-27(25号序列) 及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，突变的氨基酸残基是半胱氨酸168。-根据序列登录号为Q9H239和Q9BUG8 (TrEMBL)的编号，人MMP-28(26号序列 和27号序列)及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，突变的氨基酸残基是甘氨酸 193。-根据序列登录号为043923 (TrEMBL)的编号，类人MMP - 1(28号序列)及其所 有通过选择性剪接所决定的异构体，突变的氨基酸残基是丝氨酸106。比对程序ClustalW(L6)采用下列参数取代矩阵Gonnet250,缺口 IO,缺口关闭-I, 缺口延伸-2，缺口大小4。序列比对方法学的详细介绍见Andreini C.等，J. of Prot醒e Research, 2004， 3, 21,及其参考文献。如下面的例子所示，本发明中的突变蛋白与相应的野生型、未突变的蛋白相比，具 有非常高的稳定性。这样就使得不管是利用本发明得突变蛋白作为科学研究公具如药学 工具以检测以基质金属蛋白酶作为药学把标的新药，还是以其作为药物的有效成分，都 变的更加有效。通过下面的实例来证明，但不限于本发明。 实例1根据本发明，通过定点诱变，使氨基酸残基进行突变。根据这个目的合成了一组核 苷酸，其中该组核苷酸由35个与野生型的基因互补的碱基組成，其中不包括编码在蛋 白质中将被突变的氨基酸的三连体密码子。利用这些寡核苷酸，在含有野生型基因的质 粒上，采用比寡核香酸熔点(tm)低至少15 - 20°C的温度(tm)退火进行PCR反应，得到含有突变基因的质粒。将PCR反应混合物转化大肠杆菌(E.coli)细胞,并分离含有 突变质粒的细胞，并通过基因序列测定鉴定质粒上的突变基因。 实例2通过下面的程序，克隆、表达、纯化野生型和突变型的MMPs催化结构域。 将每个原MMP (proMMP )蛋白的cDNA克隆在pET21 (Novagen )载体上。所得的载体转化大肠杆菌BL21细胞。37。C下，在LB ( Luria - Bertani)培养基中培养转化细胞。在对数生长期加入0.5mM IPTG (异丙基-卩-D -硫代半乳糖苷)诱导蛋白表达。 诱导4小时后，收获并裂解细胞。细胞裂解后，收集包涵体，并将其溶解在6M尿素和 20mM pH = 8的Tris-HCl溶液中。然后，用Hiprep 16/10 (20ml) QFF (Ph纖acia)和含有 6M尿素和pH 8.0的20mM Tris-HCI的緩冲液纯化蛋白。然后用NaCl线性梯度洗脱到 0.35M。接着用含有50mM Tris-HCl (pH 7.2 ) , 10mM CaC12, 0.1 mM ZnC12, 0.3 M NaCl 和0.2 M AHA (醋羟胺酸)的緩冲液透析，得到复性的纯化蛋白。在复性过程中通过切断 前肽序列使每一蛋白质活化。在最后的复性透析过程中，醋羟胺酸的浓度为0.5M。用 Superdex 75 16/60 (Pharmacia)色谱柱，以最后的透析緩冲液洗脱，来分离单一的催化 结构域。通过上述制备、纯化步骤得到的MMPs,其氨基酸序列如下 l号序列MMP-1 P03956 〉gilll6852lsplP03956IMMPL人间质胶原酶前体 (基质金属蛋白酶-l) ( MMP-1)(纤維原细胞胶原酶)QPIGPQTPKACDSEVRFFKGNKYWA MDPGYPKMIAHDFPGIGHKVDAVFMKDGFFYFFHGTRQYKFDPKTKRILTLQKANSWFNCRKN 2号序列MMP-2 P08253>gi|116856|sp|P08253|MMP2—人72 kDa IV型胶原酶前体 (72 kDa明胶酶)(基质金属蛋白酶-2 ) ( MMP-2)(明胶酶A) ( TBE-l )YGCPKESCNLFVLRIIGYTPDLDPETVPGTGVGGDSHFDDDKDGKYGFCPHEALFMSTVGGNSEGAPCVHAMGLEHSQDPGALIRGE肝FKDLERGYPKPLTSLGNLDAVVDLqGGGHSY FFKGAYYLKLENQSLKSVKFGSIKSDWLGC3号序列 MMP-3 P08254 〉gilll6857lsplP082541MMP3—人基质分解素-前体 (基质金属蛋白酶-3) (MMP-3)(转换素-l) (SL-1)SGPVVKKIREMQKFDAVDSAVEKALKVDDDE，TKDTTGTPETPLVPTEPVDAAYEVTSKDWRFDEKRNSMEP4号序列MMP-7 P09237>gi|l 16861 IsplP09237IMMP7—人基质溶解因子前体(Pump-1蛋白酶) (子宫金属蛋白酶)(基质金属蛋白酶-7) (MMP-7)(基质蛋白)AKLKEMQKFFGLPIVSKALNMWGKEIRWTDGSSLGINFLYK5号序列MMP-8 P22894>gi|l 16862|sp|P22894|MMP8_人中性粒细胞胶原酶前体 (基质金属蛋白酶-8) (MMP-8)(多形核白细胞胶原酶)(PMNL-CL)GYPKSISGAFPGIESKVDAVFQGEHFFHVFSGPRYYAFDLIAQRVTRVARGNKWLNCRYG 6号序列MMP-9 P14780〉gilll6863lsplP14780IMMP9—人基质金属蛋白酶-9前体(MMP-9) (92 kDa IV型胶原酶)(92 kDa明胶酶)(明胶酶B) (GELB) [包含67kDa基质金属蛋白酶-9; 82 kDa基质金属蛋白酶-9〗MSLWQPLVLVLLVLGCCFAAPRQRQSTLVLFPGDLRTNLTDRQLAEEYLYRYGYTR VAEMRGESKSLGPAFGFCPSERLYTRD14MGGNSAGELCVFPLGLDHSSVPEALMYRPTAGPTGPPSRPQGPFLIADKWRSGRGKMLLFSGRSELNQVDQVGYVTYD ILQCPED7号序列MMP-10 P09238>gi|l 16869|sp|P09238|MMP10—人基质分解素-2前体 (基质金属蛋白酶-lO) (MMP-10)(转换素-2) (SL-2)NLIVKKIQGMQKFLDAVDSAIEKALKVWDEKWTEDASGTNTEEPLVPTKSVPLDAAYEVNSRDTRFDENSQSMEQG8号序列MMP-11 P24347>gi|l 16871 |sp|P24347|MMPl 1_人基质分解素-3前体 (基质金属蛋白酶-11) (MMP-11) (ST3) (SL-3)SSPAPAPA，APRQTMAEALKVWSDVTWTIGDDQGTDIXRTPALGPQAGIDTNGLPSPVDAAFEDADYWRFHPSTRRVDSFFGCAEPANTFL 9号序列MMP-12 P39900>gi|729179|sp|P39900|MMP 12—人巨噬细胞金属弹性蛋白酶前体(HME)(基质金属弹性蛋白酶-12) (MMP-12)(巨噬细胞弹性蛋白酶)(ME)LMKEKIQEMQHFNREDVDYAIRKAFQVDEDEFWTTHSGGTQRLPNPDNSEPA ARNQVFLFKDD MMDPGYPKLITKNFGGIGPKIDAVFYSKNKYYYFFQGSN,YDFLL,TKTLKSNSWFGC IO号序列MMP-13 P45452>gi|1168998|sp|P45452|MMP13—人胶原蛋白酶-3前体 (基质金属蛋白酶-13) (MMP-13))TNLAGILKENAASSMTERLRETPDMTHSEVEKAFKKAHFDDDETWTSSPGDEDPNPKHPKTEHPSHDLIFIFRTNHIMDKDYPRLIll号序列MMP-14 P50281〉gil60392771lsplP50281IMMPl七人基质金属蛋白酶-14前体(MMP-14)(细胞膜型基质金属蛋白酶1) (MT-MMP 1) (MTMMP1) (1型细胞膜基质金属 蛋白酶)(MT1-MMP) (MTIMMP) (MMP-X1)QSLSAAIAAMQKFCIQNYTPKVGEYATIAHAYFPGPNIGENFVLPDDDRRGIQERWFWRVRNNQVMRGLPTDKIDAALFYKGNKYWKFNNQKLIXLVLAVGLAVF FFRRHGTPRRLLYCQRSLLDKV 12号序列MMP-15 P51511:^ill705988lsplP51511IMMP15—人基质金属蛋白酶-15前体(MMP-15)(细胞膜型基质金属蛋白酶2) (MT - MMP2) (MTMMP2) (2型细胞膜基质金属 蛋白酶)(MT2-MMP) (MT2MMP) (SMCP-2)LRLYGYLPQPSRHMRRRKRYALTGRKWNMVLFASGFHGDSSLEHSSNPNAIMAPF PPGGKPERPPKP MPIGHFWRGLPGDIS TFFFQEDRYWRFN GYPKSILRDFMGCQ ,EEVARTVNVVMVLVPLLLLLCVLGLTYALVQMQRKGAPRVLLYCKRSLQEWV13号序列MMP-16 P51512异构体l>gi|3041669|splP51512|MMP16—人基质金属蛋白酶-16前体 (MMP-16)(细胞膜型基质金属蛋白酶3) (MT-MMP 3)(MTMMP3) (3型细胞膜基质金属蛋白酶)(MT3-MMP) (MT3MMP) (MMP-X2) PRMSVLRSAETMQ WQHKHITYS腦VT DGEGGFLAHAY YQYMETDNFKLPN NICDGNFNTLKGNKYWVFKDTTLQDVDIVIKLDNTASTVKAIAIVIPCILALCLLVLVYTVFQFKRKGTPRHILYCKRSMQEWV14号序列异构体2>gi|13027800|ref]NP_072086.1|基质金属蛋白酶-16异构体2 [人]KVKGDTLSVIQDGWLYKYHWKWILEQRqSVPVLSRGTEKHKTYEELSSITY 15号序列MMP-17 Q9ULZ9〉gil21264469lsplQ9ULZ9IMMP17—人基质金属蛋白酶-17前体 (MMP-17)(细胞膜型基质金属蛋白酶4) (MT-MMP 4) (4型细胞膜基质金属蛋白酶)(MT4-MMP)LSRFGYLPPADP GAPAPTK職KRN NDGYPFDGPGGTV HSIMRPYYQGPVGDP FDAVAQIRGEAF RYWVFKDNNVEEGY GVPSTLDDAMRWSD RAPPGQHDQSRSEDGYEVCSCTSGASSPPGAPGPUVAATMIXIXPPLSPGALWTAAQALTX 16号序列MMP-19 Q99542 异构体类风湿关节炎滑膜炎症因子-1 (rasi-l) 〉gill2643345lsplQ99542IMMP19—人基质金属蛋白酶-19前体 (MMP-19)(基质金属蛋白酶类风湿关节炎滑膜炎症因子)(MMP-18)LRAFQEASELPVSGALRQAFQDWSNVAGTYRGVNLRIIAEEETELPTVPPVPTLDAAVYSPRTQWIHLARTDFSSYPKPIKGTIDTTPSGGNTTPSGTGITLDTTLSATETTFEY17号序列异构体类风湿关节炎滑膜炎症因子-6 (msi-6)>gi|13027792|reflNP—073628.11基质金属蛋白酶-19异构体类风湿关节炎滑膜炎症因子 一 6[人]SNVAPLTFQEVQARIIAAHEVGHALGVPTEPSPMPDPCSSELDAMMLGEAPPLQAVGRRWGQPADPEAWTNGSDMGLQHEQWRAPWEDLCFQGGLCVDCIRFRTGPLVPSVCPLGGAPRKPGCCCLLASNTMDSLL18号序列 MMP-20 060882〉gil564053031splO60882IMMP20一人基质金属蛋白酶-20前体 (MMP-20)(釉质金属蛋白酶)(釉质溶解素)IGEMVARGSNSMIRKYTPSMSSVEVDKGLGGDTHFDNAEKWTMGTNGFNLFTVAAHEFGHALGLAHSTDPSALMYPTYKY認PYGFHLPKDDVKGI QALYGPRKVFLGKPPQLMSNVDAA FFVGDEYYSYDER SSWIGC19号序列MMP-21 Q8N119〉gil50401068lsplQ8N119IMMP2L人基质金属蛋白酶-21前体(MMP-21) RYGWSGVWAAWG SAPPSPPGPPPRA VALAFRMWSEVTP PPTSDTGISLLKV WIRKE認QYGEV RYFFQGNQYWRYDRVLNSYPKRITPKKHSEKWFDVC DVHISTLNM20号序列MMP-23 A 075900>gi|4758730|reflNP—004650.11基质金属蛋白酶23A [人]EPLEFSYPGYLALGEAHLSIIANAVNEGTYTCVVRR②RVLTTYSWRVRVRG 21号序列MMP-23B Q9UBR9 >gi|4468604|emb|CAB38176.1| MMP-23 [人]EPLEFSYPGYLALGEAHLSIIANAVNEGTYTCVVRRQQRVLTTYSWRVRVRG 22号序列 MMP-24 Q9Y5R2>gi|12585280|splQ9Y5R2|MMP24—人基质金属蛋白酶-24前体 (MMP-24)(细胞膜型基质金属蛋白酶5) (MT-MMP 5) (5型细胞膜基质金属蛋白酶)(MT5-MMP)DQTTIEWMKKPRCGNRVQEGYPMQ正QVYTIFQFKNKTG PQPVTYYKRPVQEWV 23号序列 MMP-25 Q9NPA2〉gill2585274jsplQ9NPA2IMMP25—人基质金属蛋白酶-25前体 (MMP-25)(细胞膜型基质金属蛋白酶6) (MT-MMP 6) (6型细胞膜基质金属蛋白酶)(MT6-MMP)(白细胞溶素)LRDAIKVMQRFAGSFPQSSQLSQETVRVPGEHPISGDTHFDLSQDDRDGLQQLYGRLQPSGQLVSELGLPPGEEVDAVFYFFKGAHYWRFPKNSL1XLPLXVGGVA SR24号序列 MMP-26 Q9NREI>gi| 136294931splQ9NREllMMP26—人基质金属蛋白酶-26前体 (MMP-26)(基质溶解因子-2)(子宫内膜基质金属蛋白酶Endometase)LQQFHRNGTDLLDVSIWSNVTPLIFQSDTGYNLFLVATHEI25号序列 MMP-27 Q9H306>gi|11066090|gb|AAG28453.1|AF 195192—1基质金属蛋白酶MMP-27 [人] IDDKIREMQAFF VDEAIQEGLEVWSK ENWTKDGAGFNL KPKEPTIPHACD KILVFKDENFWM KGFPQRWKHFPG EKAHSGGIKILYHKSLSLFIFGIVHLLKNTSIYQ 26号序列 MMP-28 Q9H239 异构体1>gi|37538314|sp|Q9H2391MMP28—人基质金属蛋白酶-28前体 (MMP-28) (Epilysin) (UNQ1893/PR04339)TRFSDAIRAFQWVSQLPVSGVLDRATLRQMTRPRCGVTDTNSYAAWAERISDLFARHRTKMRRKKRFAKQ GNKWYKQHLSYRLVAFDGPGGALAHAFLDALLSWDDVLAVG QLYIFKGSHFWEV QLCRAGGLPRHPDA FRDDRYWRLDQAKLQATTSGRWATELPWMGCWHANSGSALF27号序列异构体2>gi|14589912|reflNP—116568.11基质金属蛋白酶28前蛋白原异构体2 [人] TRFSDAIRAFQWVS GNKWYKQHLSYRLV AFDGPGGALAHAFL DAIXSWDDVLAVQ GLYIFKGSHFWEVAADGNVSEPRPLQE證VGLPPN正AAAVSLNDGDFYFFKVQSV 28号序列类MMP-l 043923>gi|4758728|reflNP—004133.11类基质金属蛋白酶1 [人] LSQETVRVLMSYALGDTHFDDEETWTFGSKASQGLE卿AGGSPVDEELGFSRG豐VNPLGPGSPERLS 实例3突变的MMP-3稳定性评估(3号序列)对野生型人金属蛋白酶3(MMP-3) (3号序列)催化结构域和苯丙氨酸突变为天冬氨酸 的突变的人金属蛋白酶3(MMP-3) (3号序列)催化结构域进行了稳定性评估研究。在相同 条件下，针对蛋白自溶对这两种蛋白的稳定性进行了比较分析。利用实例1中的方法，制备了这两种蛋白质。并采用SDS/聚丙烯酰胺凝胶电泳，按 下述方法分析了其稳定性。所用的蛋白样品溶解在含有50mM羟基曱基氨基乙烷(hydroxymethylaminoethane ) (Tris ) (pH = 7.2), 5mM CaC12, 0.1 mM ZnC12, 0.3 M NaCI和0,5 M醋羟胺酸(AHA)的 緩冲溶液中，蛋白浓度0.45mM。样品维持在室温。在间隔相当于O, 4， 7, 11, 14天的时候，分别取保存在室温下的样品5|_iL,迅速 在-80°C冻存。所收集的蛋白样品具有上述所述的浓度，并进行SDS/聚丙烯酰胺凝胶 电泳(17% )分析，所得结果如图1所示并在下面进行说明。分析显示突变蛋白与野生型相比具有更高的稳定性。事实上，野生型和突变蛋白 从O时开始都有降解条带。但是，在接下来的14天中没有降解的野生型蛋白条带的浓 度显著下降。相反，没有降解的突变蛋白的相应条带在这14天中基本上不变。而且， 野生型蛋白的断裂在氨基酸残基171位点，突变蛋白在相应位点产生的断裂，两者相比 野生型蛋白断裂产生的片段比突变蛋白产生的片段的分子量小。这说明野生型和突变蛋 白具有不同的切割位点，因此突变蛋白的突变位点与野生型蛋白的相应位点相比不易作 为切割位点，这说明没有降解的突变蛋白更稳定。最后，如图l所示，来自突变蛋白降解片段的条带的强度基本维持不变。这说明突 变蛋白不易于断裂，而且断裂产生的片段也比野生型断裂的片段更稳定。 实例4突变的MMP-10 ( 7号序列)稳定性评估对野生型人金属蛋白酶10(MMP-10) (7号序列)催化结构域和苯丙氨酸突变为天冬氨酸的人金属蛋白酶IO(MMP-IO) (7号序列)催化结构域进行了稳定性评估研究。在相同条 件下，针对蛋白自溶对这两种蛋白的稳定性进行了比较分析。利用实例1中的步骤制备了这两种蛋白质。并采用SDS/聚丙烯酰胺凝胶电泳，按下述方法分析了其稳定性。所用的蛋白样品溶解在含有10mM Tris(pH = 7.2) , 10mM CaC12, 0.1 mM ZnC12, 0.3 MNaCl和0.5 M醋羟胺酸(AHA)的緩冲溶液中，野生型蛋白浓度为0.3mM,突变蛋白 的浓度为0.26mM。样品维持在室温4。C。4'C条件下，野生型蛋白在O, 1, 2和3天取样5uL,突变蛋白在O， 6和30天取样 5uL,所取的样品立即在-80。C冻存。样品的浓度如上所述，通过SDS/聚丙烯酰胺凝胶 (17% )电泳分析，所得结果如图2所示。而且，上面MMP3 ( 3号序列)得到的结果 与MMP-10所得到的结果基本一样，值得注意的是突变蛋白甚至在30天后仍有高稳定 性。实例5突变MMP-13 ( 10号序列)的稳定性评估对野生型人金属蛋白酶13(MMP-13) (10号序列)催化结构域和苯丙氨酸突变为天冬氨酸 的人金属蛋白酶13(MMP-13) (10号序列)催化结构域进行了稳定性评估研究。在相同条 件下，针对蛋白自溶对这两种蛋白的稳定性进行了比较分析。利用实例1中的步骤制备了这两种蛋白质。并采用SDS/聚丙烯酰胺凝胶电泳按下述 方法分析了其稳定性。所用的蛋白样品溶解在含有50mM Tris(pH = 7.2) ， 5mM CaC12, 0.1 mM ZnC12, 0.3 M NaCl，但不含醋羟胺酸(AHA)的缓冲溶液中，蛋白浓度80uM。样品维持在室温。室温下，这两种蛋白样品分别在O、 2、 7、 14和21天取样5uL,迅速在-80。C冻 存。所收集蛋白样品的浓度如上所述，进行SDS/聚丙歸酰胺凝胶电泳分析(17% ), 所得结果如图3所示并在下面进行说明。分析显示与野生型蛋白相比突变蛋白具有更高的稳定性。事实上，从图3可以看 到非降解野生型蛋白相对应的条带强度降低的很明显，21天后检测条带几乎消失，相反， 本发明中的突变蛋白相对应的条带的强度21天后几乎没有变化。而且，图3可以看到野生型有小分子量的蛋白片段，而本发明中的突变蛋白没有这样的条带出现。 实例6 活性评估通过下述的方法测定酶的活性用于比色法的底物是硫肽(乙酰-脯-亮_甘-[2 -疏基-4 -甲基-戊酰]-亮-甘乙酯，该实际来自Biomol catalogue。在基质金属蛋白酶作用下，硫肽水解产生sulphydrilic基，产生的sulphydrilic基再与DTOB (5, 5'-二硫代双硝基苯曱酸)即Ellman试剂反应，)，产生2 -硝基-硫代笨甲酸，在412nm波长检测其吸光度。反应条件如下反应体积=500ul硫肽浓度* = lOOuM蛋白浓度* == 50nM带"*"为最终体系中的浓度。活性测定緩冲液50mM HEPES pH 75 mM CaC120.1 mMZnC120.05% Brj-351 mM DTNB ( 5, 5' - 二好u代双硝基苯甲酸) 25'C下，测定结果为25。C下，MMP3 (3号序列)(F171)的比活性为43 U/ g. An U = 100 pmol/分 25。C下,MMP7 (4号序列)(S166D)的比活性为66 U/ g. An U = 100 pmol/分 25。C下，MMP10(7号序列)(F171)的比活性为41 U/ g. AnU = 100pmol/分 25。C下，MMP12(9号序列)(F171)的比活性为:91 U/ g. AnU = 100 pmol/分 37。C下，我们采用相同的底物测定了 Biomol MMP的活性值，结果如下 37。C下，MMP3 (3号序列)的比活性为50 U/ g. AnU = 100 pmol/分 37。C下，MMP7 (4号序列)的比活性为34.5 U/ g. AnU = 100 pmoI/分 37'C下,MMP10 (7号序列)的比活性为42.5 U/ g. An U = 100 pmol/分37。C下，MMP12 (SEQIDNo. 9号序列)的比活性为86 U/ g. An U = 100 pmol/分 实例7将每个MMP的催化结构域的cDNA克隆到pET21 (Novagen )载体内(Novagen)。 然后，将所得栽体用于转化大肠杆菌BL21-DE3细胞中。在37。C下，用LB培养基培养 转化的细胞。在对数期加入0.5mMIPTG诱导蛋白表达。诱导5小时后，收集并裂解诱 导细胞。包涵体溶解在含有20mM pH8.0 Tris和6M尿素的緩冲液中。通过阴离子交换柱(H汀rap QHP - Pharmacia)纯化蛋白，緩冲液含有20mM pH8.0 Tris和6M尿素，再用NaCl进行线性洗脱知道浓度为0.5M。纯化后的蛋白用在含有50mMpH7.2Tris, 10mMCaC12, 0.1 M ZnC12, NaCl 0.3 M和0.2M醋羟胺酸(AHA)的緩冲液中复性，随后透析。醋羟胺酸复性透析的终浓 度为0.5M。用色谱柱Superdex 75 16/60 (Pharmacia)分离催化结构域，洗脱液用最后 的透析液。用上面的方法，制备并純化了 MMP-l(l号序列)、MMP-3(3号序列)、MMP-7(4号 序列)、MMP-8(8号序列)、MMP-10(7号序列)和MMP-12(9号序列)的催化结构域。
权利要求
1. 人基质金属蛋白酶的催化结构域，其特征在于，使所述的催化结构域发生突变以使与苯丙氨酸171相应的氨基酸残基是亲水的和/或带电荷的氨基酸残基，其中苯丙氨酸171是根据序列登录号为P39900(SwissProt)的编号。
2. 根据权利要求1所述的催化结构域，其特征在于，所述的与苯丙氨酸171相对应的氨 基酸残基从下面进行选择-根据序列登录号为P08253(SwissProt)的编号，人MMP-2即2号序列及其所有通过 选择性剪接所决定的异构体，被突变的氨基酸残基是甘氨酸181;-根据序列登录号为P08254(SwissProt)或Q6GRF8 (TrEMBL)的编号，人MMP-3即3 号序列及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，被突变的氨基酸残基是苯丙氨酸 171;-根据序列登录号为P09237(SwissProt)的编号，人MMP-7即4号序列及其所有通过选 择性剪接所决定的异构体，被突变的氨基酸残基是丝氨酸166;-根据序列登录号为P14780 (SwissProt)的编号，人MMP-9即6号序列及其所有通过 选择性剪接所决定的异构体，被突变的氨基酸残基是甘氨酸178; -根据序列登录号为P09238 (SwissProt)或Q53HH9 (TrEMBL)的编号，人MMP-10 即7号序列及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，被突变的氨基酸残基是苯丙氨 酸170;-根据序列登录号为P39卯0 (SwissProt)的编号，人MMP-12即9号序列及其所有通过 选择性剪接所决定的异构体，被突变的氨基酸残基是苯丙氨酸171; -根据序列登录号为P45452 (SwissProt)或Q7Z5M0、 Q7Z5M1 、 Q6NWN6 (TrEMBL) 的编号，人MMP-13即10号序列及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，被突变 的氨基酸残基是苯丙氨酸175;-根据序列登录号为P50281 (SwissProt)或Q6GSF3 (TrEMBL)的编号，人MMP-14即 11号序列及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，被突变的氨基酸残基是丝氨酸 189;-根据序列登录号为P51511 (SwissProt)或Q7KZY0 (TrEMBL)的编号，人MMP-15即 12号序列及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，被突变的氨基酸残基是丝氨酸 209;-根据序列登录号为P51512 (SwissProt)或Q52H48和Q14824 (TrEMBL)的编号，人 MMP-16即13号序列和14号序列及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，被突变 的氨基酸残基是丝氨酸196;-根据序列登录号为Q9ULZ9 (SwissProt)或Q5U5M0和Q81WC3 (TrEMBL)的编号， 人MMP-17即15号序列及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，被突变的氨基酸 残基是甘氨酸200;-根据序列登录号为Q99542 (TrEMBL)的编号，人MMP-19即16号序列和17号序列 及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，被突变的氨基酸残基是酪氨酸165; -根据序列登录号为060882 (TrEMBL)的编号，人MMP-20即18号序列及其所有通过 选择性剪接所决定的异构体，被突变的氨基酸残基是丝氨酸179; -根据序列登录号为Q5VZP9和Q8N119 (TrEMBL)的编号，人MMP-21即19号序列 及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，被突变的氨基酸残基是半胱氨酸238; -根据序列登录号为075卯0 (TrEMBL)的编号，人MMP-23A即20号序列及其所有通 过选择性剪接所决定的异构体，被突变的氨基酸残基是半胱氨酸152; -根据序列登录号为Q9UBR9 (TrEMBL)的编号，人MMP-23B即21号序列及其所有 通过选择性剪接所决定的异构体，被突变的氨基酸残基是半胱氨酸152; -根据序列登录号为Q9Y5R2和Q9H440 (TrEMBL)的编号，人MMP-24即22号序列 及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，被突变的氨基酸残基是丝氨酸232; -根据序列登录号为Q9NPA2 (TrEMBL)的编号，人MMP-25即23号序列及其所有通 过选择性剪接所决定的异构体，被突变的氨基酸残基是丝氨酸182; -根据序列登录号为Q9NRE1 (TrEMBL)的编号，人MMP-26即24号序列及其所有通 过选择性剪接所决定的异构体，被突变的氨基酸残基是甘氨酸161; -根据序列登录号为Q9H306和Q6UWK6 (TrEMBL)的编号，人MMP-27即25号序列 及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，被突变的氨基酸残基是半胱氨酸168; -根据序列登录号为Q9H239和Q9BUG8 (TrEMBL)的编号，人MMP-28即26号序列 和27号序列及其所有通过选择性剪接所决定的异构体，被突变的氨基酸残基是甘氨 酸193;-根据序列登录号为043923 (TrEMBL)的编号，类人MMP - 1即28号序列及其所有 通过选择性剪接所决定的异构体，被突变的氨基酸残基是丝氨酸106。
3. 根据权利要求1所述的催化结构域，其特征在于，所述的亲水的和/或带电荷的氨基 酸残基是选自包括谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸组中的一个氨基酸残基。
4. 根据权利要求3所迷的催化结构域，其特征在于，所述的亲水的和/或带电荷的氨基 酸残基是天冬氨酸残基。
5. —种突变的人基质金属蛋白酶，所述的突变的人基质金属蛋白酶的催化结构域含有权 利要求1 - 4中任一权利要求所定义的催化结构域。
6. 人基质金属蛋白酶和其催化结构域用于制备药物组合物的用途，所述人基质金属蛋白 酶和其催化结构域可以是非突变的或为权利要求1 - 5中任一权利要求所述的突变的 人基质金属蛋白酶和其催化结构域。
7. 根据权利要求6所述的用途，用于制备用于治疗基质生物多聚物积累和/或组织抑制 金属蛋白酶TIMPs过量有关病变的药物组合物。
8. 根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的病症选自硬皮症、心硬化、肾硬化、 肝纤维化、肺纤维化、胰嚢性纤维化。
9. 一种药物组合物，所述的药物组合物的活性成分含有人基质金属蛋白酶或其催化结构 域，所述人基质金属蛋白酶或其催化结构域可以是非突变的或权利要求1-5中任一 权利要求所述的突变的人基质金属蛋白酶和其催化结构域。
10. —种诊断基质生物多聚物积累和/或组织金属蛋白酶抑制剂TIMPs过量有关病变的 诊断试剂盒，所述的诊断试剂盒含有人基质金属蛋白酶或其催化结构域，所述人基质 金属蛋白酶或其催化结构域可以是非突变的或权利要求1-5中任一权利要求所述的 突变的人基质金属蛋白酶和其催化结构域。
11. 根据权利要求10所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述的病症选自硬皮症、心硬化、 肾硬化、肝纤维化、肺纤维化、胰嚢性纤維化。
12. 权利要求5所定义的突变的基质金属蛋白酶或权利要求1 - 4中任一权利要求所定义 的基质金属蛋白酶的突变催化结构域的用途，将其作为以基质金属蛋白酶为药学靶标 的药理性质鉴定的试剂。
13. 编码权利要求5所定义的突变基质金属蛋白酶的DNA序列。
14. 含有权利要求13所定义的DNA序列的重组载体。
15. 用权利要求14所定义的重组载体转染或转化的离体细胞。
全文摘要
本发明公开了利用突变和非突变基质金属蛋白酶制备药物组合物以治疗与基质生物多聚物积累和/或组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)过量所引起的病变。本发明还公开了所述的突变基质蛋白酶蛋白中至少一个特定位置的氨基酸残基突变成亲水的和/或带电的氨基酸残基，从而使其对蛋白自溶具有高稳定性。
文档编号C12N9/50GK101238211SQ200680028904
公开日2008年8月6日 申请日期2006年8月10日 优先权日2005年8月12日
发明者丽贝卡·德尔·康提, 伊万诺·贝尔蒂尼, 克劳迪奥·鲁奇耐特, 露西娅·班西, 马可·弗莱吉 申请人:普罗泰拉有限公司