专利名称：花生四烯酸油脂的制备方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵生产方法，具体涉及利用微生物生产花生四烯酸油脂的制备方法。
背景技术：
花生四烯酸(Arachidonic Acid，简称AA，即5，8，11，14-二十碳四烯酸)属于ω-6系列长链多不饱和脂肪酸。AA是一种重要的人体必需脂肪酸，是许多二十碳酸衍生物如前列腺素E2(PGE2)、前列环素(PGI2)、血栓烷A2(TXA2)、白三烯Leukotirene B4(LTB4)和C4(LT C4)的直接前体，这些生物活性物质对脂蛋白的代谢、血液流变学、血管弹性、白细胞功能和血小板激活等具有重要的调节作用。AA还具有调节体内多种离子通道作用，维持细胞膜功能，控制细胞膜的通透性，维持机体保水性等许多重要的生理功能。同时，AA是构成神经组织的重要结构脂类，它对婴幼儿的脑发育和视力功能至关重要。它能帮助神经系统的信息正常传递，增强记忆，对人体视力、大脑功能和协调能力起着极为重要的作用。鉴于AA对婴幼儿生长的重要作用，世界卫生组织(WHO)及联合国粮农组织(FAO)权威推荐婴幼儿每日应摄取40毫克AA(以每千克体重计算)，而欧洲和美国已经强制要求只有添加AA的婴儿奶粉方可进入市场进行销售。
AA广泛存在于动物体中，过去商业AA主要来源于鱼油、猪肝和蛋黄，但含量极低且不稳定、开发费用昂贵，难以满足社会的需求，且鱼油中含有大量二十碳五烯酸(EPA)。EPA在婴儿体内抑制AA合成，所以最好提供的AA油脂中不含EPA。八十年代初期，人们相继发现某些丝状真菌及微藻类含有花生四烯酸。由于微生物具有生长速度快、油脂及AA含量高、发酵制备工艺比较简单且不受原料限制等优点，利用微生物法生产花生四烯酸成为各国研究的热点。国内在含有花生四烯酸的菌种培养与选育方面与国外相比具有一定的优势，而且部分菌种已实现了工业化生产，但由于菌种中的花生四烯酸含量相比于其它多不饱和脂肪酸优势并不明显，使AA的富集难度加大，增加了花生四烯酸的市场推广难度。如何改进花生四烯酸的培养工艺、降低其生产成本是当前花生四烯酸的研究热点之一。
发明内容
本发明目的是提出一种花生四烯酸油脂的微生物制备方法。
本发明的目的是通过以下方法实现的 一种花生四烯酸油脂的制备方法，该方法采用保藏编号为CCTCC NOM 207067的高山被孢霉Mortierella alpina菌种ME-AA01生产花生四烯酸油脂。
所述的制备方法，包括下列步骤将保藏编号为CCTCC NOM 207067的高山被孢霉Mortierella alpina菌种ME-AA01活化培养，种子活化培养，摇瓶或发酵罐发酵培养，菌体的老化处理，收集湿菌体，烘干提取油脂。
所述的制备方法，其中菌种及种子活化培养过程为将保藏编号为CCTCC NOM207067的高山被孢霉Mortierella alpina菌种ME-AA01在PDA培养基上培养活化，每L PDA培养基含土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，121℃灭菌20分钟，倒入试管制成斜面，冷却后接入ME-AA01菌株，28℃培养5天，将菌丝接入摇瓶进行种子活化培养；摇瓶活化培养条件为培养基包含质量体积比的下列物质葡萄糖2％～6％、酵母膏0.3％～0.6％、KH2PO4 0.2～0.5％、NaNO3 0.2％～0.5％、MgSO4·7H2O0.03～0.1％，其余为水，pH6.0～8.5，转速100～180rpm，温度20～28℃，活化2～5天。
所述的制备方法，其中发酵培养过程为活化后的菌种接入装有发酵培养基的摇瓶或发酵罐中，接种量5％～20％v/v，发酵5～8天，温度20～28℃，pH6.0～8.5，摇瓶发酵转速100～180rpm.发酵罐发酵时搅拌转速150～260rpm，压缩空气通气量0.2～2VVM。
所述的制备方法，其中发酵培养基包含质量体积比的下列物质葡萄糖7％～15％、酵母膏0.6％～1.2％、KH2PO4 0.2％～0.6％、NaNO3 0.2％～0.6％、MgSO4·7H2O 0.05％～0.1％、泛酸钙0.01％～0.2％以及维生素0.02％～0.1％，其余为水。
所述的制备方法，其中发酵培养过后菌体的老化处理过程将发酵5～8天结束的含有大量菌体的发酵液在一定温度下进行老化处理，老化处理过程中摇瓶或发酵罐停止搅拌或维持低搅拌速率，发酵罐不通气或维持通气，老化时加入碳源、氮源、无机盐；其中，碳源选自淀粉水解糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、糊精、乳糖、半乳糖、木糖、脂肪酸、乙醇、乙酸、丙酮酸、富马酸、苹果酸和甘油的一种或多种，氮源选自豆饼粉、花生饼粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、鱼粉、玉米浆、硝酸钾、硝酸钠、硫酸氨中的一种或多种，无机盐选自磷酸二氢钾、泛酸钙、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸钠中的一种或多种。
所述的制备方法，其中老化处理过程为老化温度5～25℃，老化周期2～10天，pH范围6.0～8.0，摇瓶转速0～80rpm，发酵罐搅拌转速0～80rpm，发酵罐老化时压缩空气通气量0～3VVM。
所述的制备方法，其中老化时培养液中一次性或分批加入占培养液总体积的质量体积比的下列物质乙醇1～8％；硝酸钾0.1～0.6％；泛酸钙0.01～0.2％；氯化钙0.01～0.1％。
所述的制备方法，其中油脂提取方法将老化后的菌体收集、60℃烘干、磨碎，用石油醚和乙醇(比例为3∶1)萃取12小时，再将石油醚和乙醇通过减压蒸馏除去即得到花生四烯酸油脂；其中，1体积的菌体用5～8体积的石油醚和乙醇进行萃取。
本发明的有益效果 本发明提供了利用保藏编号为CCTCC NOM 207067的高山被孢霉ME-AA01制备花生四烯酸油脂的方法，利用该方法所得的花生四烯酸油脂具有有效成分高，含有70％～83.1％的花生四烯酸残基、品质好、不含EPA等特点。本发明所提供的方法的优点在于可操作性强、效率高，有效降低花生四烯酸发酵过程中副产物的产生，提高发酵过程中碳源向花生四烯酸的转化率、原料的利用率，且成本低，操作简单，易于产业化运用。
保藏信息 本发明的高山被孢霉ME-AA01已于2007年5月14日在中国典型培养物保藏中心进行了保藏，保藏中心地址为武汉，武汉大学，邮政编码430072。保藏编号为CCTCCNOM 207067。
具体实施例方式 以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1摇瓶生物法制备花生四烯酸油脂 菌种活化将保藏编号为CCTCC NOM 207067的高山被孢霉菌种ME-AA01接于PDA斜面28℃培养5天；PDA培养基土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml。
种子活化培养5天的PDA斜面用无菌水洗下菌丝，接入摇瓶活化。摇瓶活化培养基包含质量体积比的下列物质葡萄糖3％，酵母膏0.6％，KH2PO4 0.3％，NaNO30.3％，MgSO4·7H2O 0.05％，其余为水，pH7.0，装液量250ml摇瓶装入50ml培养液，120rpm，25℃，活化3天。
发酵培养将活化后的种子接入发酵摇瓶进行发酵。接种量10％v/v，装液量250ml摇瓶装入50ml培养液，温度25℃，pH7.0，转速120rpm，周期7天。发酵培养基包含质量体积比的下列物质葡萄糖9％、酵母膏0.8％、KH2PO4 0.4％、NaNO3 0.3％、MgSO4·7H2O 0.05％、泛酸钙0.05％以及维生素C 0.02％，其余为水。
老化培养停止搅拌，将发酵7天的发酵液加入质量体积比的下列物质2％的乙醇；0.2％的硝酸钾；0.02％的泛酸钙；0.01％的氯化钙，pH7.5，在15℃下，老化3天。
老化3天后收集湿菌体，60℃烘干、磨碎，用石油醚和乙醇(比例为3∶1)萃取12小时，再将石油醚和乙醇通过减压蒸馏除去即得到含花生四烯酸的油脂；其中，1体积的菌体用5体积的石油醚和乙醇进行萃取。提取的油脂用气质联用检测油脂中各脂肪酸比例(见表1)。实验结果干重37.6g；油脂23.3g；AA 16.6g。
表1实施例1发酵后油脂组成 实施例2摇瓶生物法制备花生四烯酸油脂 菌种及种子活化同实例1。
发酵培养将活化后的种子接入发酵摇瓶进行发酵。接种量10％v/v，装液量250ml摇瓶装入50ml培养液，温度23℃，pH7.0，转速120rpm，周期6.5天。发酵培养基包含质量体积比的下列物质葡萄糖10％、酵母膏1.2％、KH2PO4 0.4％、NaNO3 0.3％、MgSO4·7H2O 0.05％、泛酸钙0.08％以及微生素B6 0.02％，其余为水。
老化培养摇床转速60rpm，将发酵6.5天的发酵液加入质量体积比的下列物质6％的乙醇；0.2％的硝酸钾；0.1％的泛酸钙；0.02％的氯化钙，pH7.5，在20℃下，老化7天。
老化7天后收集湿菌体，60℃烘干、磨碎，用石油醚和乙醇(比例为3∶1)萃取12小时，再将石油醚和乙醇通过减压蒸馏除去即得到含花生四烯酸的油脂；其中，1体积的菌体用8体积的石油醚和乙醇进行萃取。提取的油脂用气质联用检测油脂中各脂肪酸比例(见表2)。实验结果干重34.6g；油脂21.7g；AA 16.3g。
表2实施例2发酵后油脂组成 实施例3摇瓶生物法制备花生四烯酸油脂 菌种及种子活化同实例1。
发酵培养将活化后的种子接入发酵摇瓶进行发酵。接种量10％v/v，装液量250ml摇瓶装入50ml培养液，温度23℃，pH7.0，转速120rpm，周期6.5天。发酵培养基包含质量体积比的下列物质葡萄糖10％、酵母膏1.0％、KH2PO4 0.3％、NaNO3 0.3％、MgSO4·7H2O 0.05％、泛酸钙0.08％以及微生素C 0.02％，其余为水。
老化培养摇床转速40rpm，将发酵6.5天的发酵液加入质量体积比的下列物质4％的乙醇；0.4％的硝酸钾；0.03％的泛酸钙；0.01％的氯化钙，pH7.5，在10℃下，老化5天。
老化5天后收集湿菌体，60℃烘干、磨碎，用石油醚和乙醇(比例为3∶1)萃取12小时，再将石油醚和乙醇通过减压蒸馏除去即得到含花生四烯酸的油脂；其中，1体积的菌体用8体积的石油醚和乙醇进行萃取。提取的油脂用气质联用检测油脂中各脂肪酸比例(见表3)。实验结果干重38.7g；油脂23.9g；AA 19.9g。
表3实施例3发酵后油脂组成 实施例45L发酵罐生物法制备花生四烯酸油脂 菌种及种子活化同实例1。
发酵培养将活化后的种子接入5L发酵罐进行发酵。接种量10％v/v，装液量3L，温度23℃，pH7.0，搅拌转速160rpm，通气量1VVM，周期6.5天。发酵培养基包含质量体积比的下列物质葡萄糖6％、酵母膏0.6％、KH2PO4 0.3％、NaNO3 0.3％、MgSO4·7H2O 0.05％、泛酸钙0.08％以及微生素C 0.02％；在第3、4、5天补加1％的葡萄糖，0.1％的酵母膏。
老化培养停止搅拌，通气量维持在0.2VVM，将发酵6.5天的发酵液加入质量体积比的下列物质3％的乙醇；0.2％的硝酸钾；0.03％的泛酸钙；0.01％的氯化钙，pH7.5，在15℃下，老化2天，再加入2％的乙醇；0.2％的硝酸钾，老化3天。
将共老化5天的湿菌体收集，60℃烘干、磨碎，用石油醚和乙醇(比例为3∶1)萃取12小时，再将石油醚和乙醇通过减压蒸馏除去即得到含花生四烯酸的油脂；其中，1体积的菌体用7体积的石油醚和乙醇进行萃取。提取的油脂用气质联用检测油脂中各脂肪酸比例(见表4)。实验结果干重35.7g；油脂22.3g；AA 17.8g。
表4实施例4发酵后油脂组成 实施例55L发酵罐生物法制备花生四烯酸油脂 菌种及种子活化同实例1。
发酵培养将活化后的种子接入5L发酵罐进行发酵。接种量10％v/v，装液量3L，温度23℃，pH7.0，搅拌转速150rpm，通气量1.5VVM，周期6天。发酵培养基包含质量体积比的下列物质葡萄糖7％、酵母膏0.8％、KH2PO4 0.3％、NaNO3 0.3％、MgSO4·7H2O 0.05％、泛酸钙0.08％以及微生素C 0.02％；在第4天补加1％的葡萄糖，0.1％的酵母膏。
老化培养将发酵6天的发酵液加入质量体积比的下列物质5％的乙醇；0.4％的硝酸钾；0.1％的泛酸钙；0.02％的氯化钙，pH7.5。老化第一天搅拌转速80rpm，第二天至第五天搅拌转速维持在50rpm，通气量维持在0.3VVM，15℃下，老化5天。
将老化5天的湿菌体收集，60℃烘干、磨碎，用石油醚和乙醇(比例为3∶1)萃取12小时，再将石油醚和乙醇通过减压蒸馏除去即得到含花生四烯酸的油脂；其中，1体积的菌体用7体积的石油醚和乙醇进行萃取。提取的油脂用气质联用检测油脂中各脂肪酸比例(见表5)。实验结果干重33.1g；油脂21.1g；AA 17.2g。
表5实施例5发酵后油脂组成 实施例65L发酵罐生物法制备花生四烯酸油脂 菌种及种子活化同实例1。
发酵培养将活化后的种子接入5L发酵罐进行发酵。接种量10％v/v，装液量3L，温度23℃，pH7.0，搅拌转速150rpm，通气量1.5VVM，周期6天。发酵培养基包含质量体积比的下列物质葡萄糖7％、酵母膏1％、KH2PO4 0.3％、NaNO3 0.3％、MgSO4·7H2O 0.05％、泛酸钙0.08％以及微生素C 0.02％。
老化培养停止搅拌，通气量维持在0.5VVM，将发酵6天的发酵液加入质量体积比的下列物质6％的乙醇；0.6％的硝酸钾；0.07％的泛酸钙；0.02％的氯化钙，pH7.5，在20℃下，老化3天。
将老化3天的湿菌体收集，60℃烘干、磨碎，用石油醚和乙醇(比例为3∶1)萃取12小时，再将石油醚和乙醇通过减压蒸馏除去即得到含花生四烯酸的油脂；其中，1体积的菌体用7体积的石油醚和乙醇进行萃取。提取的油脂用气质联用检测油脂中各脂肪酸比例(见表6)。实验结果干重35.1g；油脂20.7g；AA 15.2g。
表6实施例6发酵后油脂组成
权利要求
1.一种花生四烯酸油脂的制备方法，其特征在于该方法采用保藏编号为CCTCC NOM 207067的高山被孢霉Mortierella alpina菌种ME-AA01生产花生四烯酸油脂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的方法包括下列步骤将保藏编号为CCTCC NOM 207067的高山被孢霉Mortierella alpina菌种ME-AA01活化培养，种子活化培养，摇瓶或发酵罐发酵培养，菌体的老化处理，收集湿菌体，烘干提取油脂。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的菌种及种子活化培养过程为将保藏编号为CCTCC NOM 207067的高山被孢霉Mortierella alpina菌种ME-AA01在PDA培养基上培养活化，每L PDA培养基含土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，121℃灭菌20分钟，倒入试管制成斜面，冷却后接入ME-AA01菌株，28℃培养5天，将菌丝接入摇瓶进行种子活化培养；摇瓶活化培养条件为培养基包含质量体积比的下列物质葡萄糖2％～6％、酵母膏0.3％～0.6％、KH2PO4 0.2～0.5％、NaNO3 0.2％～0.5％、MgSO4·7H2O 0.03～0.1％，其余为水，pH 6.0～8.5，转速100～180rpm，温度20～28℃，活化2～5天。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的发酵培养过程为活化后的菌种接入装有发酵培养基的摇瓶或发酵罐中，接种量5％～20％v/v，发酵5～8天，温度20～28℃，pH 6.0～8.5，摇瓶发酵转速100～180rpm，发酵罐发酵时搅拌转速150～260rpm，压缩空气通气量0.2～2VVM。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基包含质量体积比的下列物质葡萄糖7％～15％、酵母膏0.6％～1.2％、KH2PO4 0.2％～0.6％、NaNO30.2％～0.6％、MgSO4·7H2O 0.05％～0.1％、泛酸钙0.01％～0.2％以及维生素0.02％～0.1％，其余为水。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的发酵培养过后菌体的老化处理过程将发酵5～8天结束的含有大量菌体的发酵液在一定温度下进行老化处理，老化处理过程中摇瓶或发酵罐停止搅拌或维持低搅拌速率，发酵罐不通气或维持通气，老化时加入碳源、氮源、无机盐；其中，碳源选自淀粉水解糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、糊精、乳糖、半乳糖、木糖、脂肪酸、乙醇、乙酸、丙酮酸、富马酸、苹果酸和甘油的一种或多种，氮源选自豆饼粉、花生饼粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、鱼粉、玉米浆、硝酸钾、硝酸钠、硫酸氨中的一种或多种，无机盐选自磷酸二氢钾、泛酸钙、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸钠中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于老化处理过程为老化温度5～25℃，老化周期2～10天，pH范围6.0～8.0，摇瓶转速0～80rpm，发酵罐搅拌转速0～80rpm，发酵罐老化时压缩空气通气量0～3VVM。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于老化时培养液中一次性或分批加入占培养液总体积的质量体积比的下列物质乙醇1～8％；硝酸钾0.1～0.6％；泛酸钙0.01～0.2％；氯化钙0.01～0.1％。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的油脂提取方法将老化后的菌体收集、烘干、磨碎，用石油醚和乙醇萃取12小时，再将石油醚和乙醇通过减压蒸馏除去即得到花生四烯酸油脂；其中，1体积的菌体用5～8体积的石油醚和乙醇进行萃取。
全文摘要
本发明公开了花生四烯酸油脂的制备方法。该方法采用保藏编号为CCTCC NOM207067的高山被孢霉Mortierella alpina菌种ME-AA01生产花生四烯酸油脂。采用本方法所得的花生四烯酸油脂具有有效成分高，含有70％～83.1％的花生四烯酸残基、品质好、不含EPA等特点。该方法有效降低花生四烯酸发酵过程中副产物的产生，提高发酵过程中碳源向花生四烯酸的转化率、原料的利用率，且成本低，操作简单，易于产业化运用。
文档编号C12R1/645GK101109015SQ20071002500
公开日2008年1月23日 申请日期2007年7月9日 优先权日2007年7月9日
发明者和 黄, 金明杰, 任路静, 欣 刘, 霜 李, 南 胡, 超 彭 申请人:南京工业大学