专利名称：双鼠李糖脂的产生菌筛选及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种具有药用价值的生物表面活性剂的制备方法，具体的说是一种双 鼠李糖脂的产生菌筛选及制备方法。
二背景技术：
鼠李糖脂是一类由微生物代谢产生的表面活性物质。除具有化学合成表面活性剂 的一般功能外，鼠李糖脂产品本身无毒，环境友好，能够被微生物100%降解，可广泛
应用于工业、农业及日常生活的很多领域。近年的研究发现，鼠李糖脂具有抗生素活
性，尤其是其中的双鼠李糖脂可以抑制乳腺癌细胞生长(BioresourceTechnology2007， 98:1149 1153),及辅助银屑病、神经性皮炎等皮肤病(Journal of Dermatological Science 2005， 40: 141 143)和自身免疫病(U. S. Patent5， 466， 675， 1999)的治疗。这些发现 为双鼠李糖脂在医药领域的应用奠定了基础，同时也受到人们广泛关注。
微生物代谢产生的鼠李糖脂是混合物，其中能够用于医药领域的活性成分是双鼠 李糖脂，而双鼠李糖脂的含量因菌种的不同产生很大差别。因此，获得双鼠李糖脂产 量较多的菌种是关键。目前油平板筛选方法的使用较为普遍，生物表面活性剂可以促 进微生物对油类等非极性难溶底物的利用，采用油作为单一碳源筛选容易得到生物表 面活性剂产生菌。上文提到的(BioresourceTechnology2007， 98:1149 1153)(文献1) 和(Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 1997， 19， 232 238)(文献2) 中提供了双鼠李糖脂制备的方法。前者使用的菌种为自筛选菌种，后者采用了上海有 机所提供的菌种。他们都是以植物油为单一碳源的培养基发酵，有机溶剂萃取后采用 柱层析、TLC和高效液相色谱等方法分离得双鼠李糖脂。
上述制备双鼠李糖脂的方法存在有以下不足:(l)无论筛选菌种还是采用现有菌种 都是以鼠李糖脂产量作为挑选依据，不能保证双鼠李糖脂产量，而且结果表明双鼠李 糖脂产量确实很低。文献2中鼠李糖脂产量为17g/L_24g/L，其中双鼠李糖脂(主要成 分Rh2Cu)Cu))和单鼠李糖脂(主要成分RhCK)CK))的质量比为1:4，文献1中虽未提供产 量的具体信息，但其中具有抗乳腺癌功能的双鼠李糖脂Rh2Cu)CH)仅占萃取得粗提取物 的0.1%。 (2)采用油平板筛选可以将能够利用植物油作单一碳源的微生物全部筛选出
来，即使选择长势好的产生物表面活性剂的菌种也很难保证所产生物表面活性剂是鼠 李糖脂。因此，该方法选择性较差，工作量大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种选择性强、得鼠李糖脂产量高尤其是双鼠李糖脂产量 高的菌种筛选方法。
本发明的另一目的是提供一种利用微生物发酵法生产制备双鼠李糖脂的方法。 实现本发明目的的技术解决方案为 一种双鼠李糖脂的产生菌筛选方法，包括以 下步骤
a、 选取被油脂污染的现场采集土壤样品作为菌种筛选源；
b、 样品浸泡处理后接种植物油作碳源的富集培养基，培养24 72h后得富集培养
液；
c、 把富集培养液梯度稀释涂布于十六烷基三甲基溴化铵平板培养基培养24 96h， 挑取长势好且数量多的单菌落斜面保种；
d、 挑取斜面保存的菌种接入发酵培养基培养48 120h后测定表面活性，选择活 性较高的菌种发酵液上清进行TLC分析，展开剂为氯仿:甲醇:乙酸v/v/v二65:15:2，苯 酚硫酸显色剂显色，初步判断双鼠李糖脂含量，选择Rf值为0.46的斑点颜色浓重的菌 种即双鼠李糖脂的产生菌保留，零下26'C甘油保存。
一种双鼠李糖脂的制备方法，包括以下步骤
a、 选取被油脂污染的现场采集土壤样品作为菌种筛选源；
b、 样品浸泡处理后接种植物油作碳源的富集培养基，培养24 72h后得富集培养
液；
c、 把富集培养液梯度稀释涂布于十六烷基三甲基溴化铵平板培养基培养24 96h， 挑取长势好且数量多的单菌落斜面保种；
d、 挑取斜面保存的菌种接入发酵培养基培养48 120h后测定表面活性，选择活 性较高的菌种发酵液上清进行TLC分析，展开剂为氯仿:甲醇:乙酸v/vA^65:15:2，苯 酚硫酸显色剂显色，初步判断双鼠李糖脂含量，选择Rf值为0.46的斑点颜色浓重的菌 种即双鼠李糖脂的产生菌保留，零下26T:甘油保存；
e、 将筛选所得菌种接种LB培养基，培养18 36h后转接入发酵培养基，25—38'C
培养72 120h;
f、 发酵结束后将发酵液离心除菌体；
g、 调整上清液pH4.0 5.0，加入氯仿甲醇混合物作萃取剂，搅拌、静置分液，保 留机相；
h、 用旋转蒸发仪减压蒸除溶剂，得到鼠李糖脂粗提取物；
i、 将粗提取物在硅胶柱中进行色谱分离，以洗脱剂洗脱，部分收集；
j、 TLC检测分离情况，展开剂为氯仿:甲醇:乙酸v/v/v二65:15:2，苯酚硫酸显色剂 显色，将Rf值为0.46的洗脱液合并，减压蒸干得所需双鼠李糖脂。
与现有技术相比，本发明具有如下显著优点(1)在菌种初筛过程中选用了植物 油作唯一碳源的液体培养基富集培养，使生物表面活性剂产生菌在富集过程中成为优 势菌群，之后稀释涂布于十六垸基三甲基溴化铵琼脂平板进行筛选，该培养基中革兰 氏阳性菌生长较差，大肠杆菌不能生长，而产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌在该培养基上 生长良好，而且具有以下特征:菌落呈灰白色，扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延， 表面湿润，菌落周围培养基扩散有水溶性色素，因此其选择性较强，减少了工作量。(2) 复筛过程中，除了以产量作标准外，增加了TLC分析过程。单鼠李糖脂较双鼠李糖脂 少一糖基，极性较弱，采用氯仿:甲醇:乙酸v/vA^65:15:2作展开剂时，它们的Rf值分 别为0.75和0.46，因此可通过显色斑点大致判断双鼠李糖脂所占比例，进一步提高了 筛选准确度。G)筛选得到的生物表面活性剂高产菌株中，鼠李糖脂产生菌约占挑取 菌株总量的66%，其中假单胞菌尸"t^omonfl^ sp.SC-02发酵产鼠李糖脂，最高产 量可达24g/L。目标产物双鼠李糖脂产量为16.3g/L，约占鼠李糖脂总质量的68%，而 文献2中双鼠李糖脂占鼠李糖脂总产量20%的，该结果优于文献2.该菌株所产双鼠李 糖脂中，已证实具有抑制乳腺癌细胞分裂功能的Rh2doQo约占双鼠李糖脂总质量的 90%，占总提取物质量的23%，远高于文献1报道的占总提取物的0.1%。 (4)该双鼠 李糖脂制备方法工艺流程简单，设备要求低，配合该方法中各比例乙酸乙酯和甲醇作 洗脱剂，普通的硅胶柱层析方法即可从发酵液萃取物中分离出较纯的双鼠李糖脂。
下面结合附图对本发明作进一步详细描述。 四
图1是本发明双鼠李糖脂的产生菌筛选及制备方法的流程图。
图2是本发明双鼠李糖脂的产生菌筛选及制备方法的产生菌筛选流程图。
图3是本发明双鼠李糖脂的产生菌筛选及制备方法的微生物发酵法制备双鼠李糖
脂的流程图。
五具体实施例方式
结合图l，本发明双鼠李糖脂的产生菌筛选及制备方法，包括以下步骤-
a、 选取被油脂污染的现场采集土壤样品作为菌种筛选源；
b、 样品浸泡处理后接种植物油作碳源的富集培养基，培养24 72h后得富集培养
液；
c、 把富集培养液梯度稀释涂布于十六垸基三甲基溴化铵平板培养基培养24 96h， 挑取长势好且数量多的单菌落斜面保种；
d、 挑取斜面保存的菌种接入发酵培养基培养48 120h后测定表面活性，选择活 性较高的菌种发酵液上清进行TLC分析，展开剂为氯仿:甲醇:乙酸v/v/v-65:15:2，苯 酚硫酸显色剂显色，初步判断双鼠李糖脂含量，选择Rf值为0.46的斑点颜色浓重的菌 种即双鼠李糖脂的产生菌保留，零下26'C甘油保存；
e、 将筛选所得菌种接种LB培养基，培养18 36h后转接入发酵培养基，25—38'C 培养72 120h;
f、 发酵结束后将发酵液离心除菌体；
g、 调整上清液pH4.0 5.0，加入氯仿甲醇混合物作萃取剂，搅拌、静置分液，保 留机相；
h、 用旋转蒸发仪减压蒸除溶剂，得到鼠李糖脂粗提取物；
i、 将粗提取物在硅胶柱中进行色谱分离，以洗脱剂洗脱，部分收集；
j、 TLC检测分离情况，展开剂为氯仿:甲醇:乙酸v/v/v二65:15:2，苯酚硫酸显色剂 显色，将Rf值为0.46的洗脱液合并，减压蒸干得所需双鼠李糖脂。
实施例1:结合图2，本发明双鼠李糖脂的产生菌筛选方法，即在长期被油脂污染 的厨房排污口附近采集土壤样品，称取10g土壤样品加入装有50mL去离子水的烧杯 中，搅拌混匀。浸泡lh后取20mL接入80mL富集培养基，250mL锥形瓶，置于32°C 摇床培养，转速230r/min。 36h后取出富集液，梯度稀释，分别取稀释倍数为104， 105， 106的菌悬液涂布十六垸基三甲基溴化铵琼脂培养基，置于培养箱中，30'C培养48h(环 境温度低于此温度也可，但需延长培养时间至菌落长大至便于观察形态)，观察菌落形 态，挑选同形态菌落数居多的菌种，尤其应选择具有以下特点的菌落:灰白色，扁平无 定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素。接 种环挑取目的菌落，接种于发酵培养基，250mL锥形瓶，装液量80mL， 30'C摇床培养， 220r/min。 72h后取出，10000r/min离心15min，取上清液分别用排油法和表面张力法 测试表面活性，选择排油圈大于10cm，且表面张力低于30mN/m的菌种作为高产菌保 留，上清液毛细管点样薄层层析硅胶板，为增加样品浓度可在同一位置多次点样，注 意每次点样前等待上次点样的水分挥干。配制展开剂(氯仿:甲醇:乙酸=65:15:2)于层 析缸中，将硅胶板放入，待展开剂距硅胶板顶部lcm时取出，挥干展开剂，用玻璃喷 雾器向硅胶板喷洒显色剂(显色剂3g苯酚和5mL浓硫酸溶于95mL无水乙醇)电吹 风加热显色。鼠李糖脂产生菌发酵液经展开显色后会出现两个棕黄色斑点，Rf值分别 为0.75和0.46，选择Rf值为0.46处斑点颜色浓重的菌种保留。此方法得到的29株发 酵液具表面活性的菌种中鼠李糖脂产生菌为22株，从中挑选双鼠李糖脂产量较多的菌 株。其中菌株SC-02为本次筛选得到的双鼠李糖脂产量最高的菌种，零下26"C甘油保 存菌种。
实施例2:本发明双鼠李糖脂的产生菌筛选方法，即在油烟机排气管附近采集土壤 样品，称取10g土壤样品加入装有50mL去离子水的烧杯中，搅拌混匀。浸泡lh后取 10mL接入40mL富集培养基，150mL锥形瓶，置于不高于4(TC摇床培养，转速230r/min。 在24-72h后取出富集液，梯度稀释，分别取稀释倍数为103， 104， 105的菌悬液涂布十 六烷基三甲基溴化铵琼脂培养基，置于培养箱中，4(TC培养24-96h，观察菌落形态， 挑选同形态菌落数居多的菌种，尤其应选择具有以下特点的菌落:灰白色，扁平无定型， 向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素。接种环挑 取目的菌落，接种于发酵培养基，150mL锥形瓶，装液量40mL， 38'C摇床培养，220r/min。 在48-120h后取出，10000r/min离心15min，取上清液分别用排油法和表面张力法测试 表面活性，选择排油圈大于8cm，且表面张力低于30mN/m的菌种作为高产菌保留， 上清液毛细管点样薄层层析硅胶板，为增加样品浓度可在同一位置多次点样，注意每 次点样前等待上次点样的水分挥干。配制展开剂(氯仿:甲醇:乙酸v/v/v二65:15:2)于 层析缸中，将硅胶板放入，待展开剂距硅胶板顶部lcm时取出，挥干展开剂，用玻璃
喷雾器向硅胶板喷洒显色剂(显色剂3g苯酚和5mL浓硫酸溶于95mL无水乙醇)电 吹风加热显色。鼠李糖脂产生菌发酵液经展开显色后会出现两个棕黄色斑点，Rf值分 别为0.75和0.46，选择Rf值为0.46处斑点颜色浓重的菌种保留。
上述排油活性法方法如下取直径为16cm的培养皿经洗涤剂清洗，去离子水冲洗 两次后，加入60mL去离子水水，水面上加入0.5mL正十六垸形成一薄层油膜，在油 膜中心慢慢加入30nL的经离心的发酵液上清液，中心油膜被挤向四周形成一圆圈，圆 圈直径与表面活性剂含量大约成正比。排油圈越大，说明表面活性剂产量越高。表面 张力法方法如下:采用表面张力仪测试。表面张力越小，说明表面活性越高。
上述各培养基的配制方法如下
基础离子培养基(g/L):NaN03 1.0， KH2PO42.0， K2HPO41.0， MgS04-7H20 0.50， KC1 0.1， CaCl2*2H20 0.01 ， FeS04'7H20 0.012，酵母提取物0.01，微量元素液0.05ml/L。 制法:上述成分混合加热溶解，Imo/LNaOH溶液调pH为7.2 7.4， 12rC保持20min 灭菌后冷却至室温备用。
微量元素液(g/L):H3B03 0.26， CuS04'5H20 0.5， MnS04'H20 0.5， MoNa204'2H20 0.06， ZnSO4.7H2O0.7。制法:依次将以上各组分按比例溶于水中，摇匀，备用。
十六垸基三甲基溴化铵平板培养基(g/L):牛肉膏3，蛋白胨10， NaC15，十六垸基 三甲基溴化铵0.3，琼脂20。制法:除琼脂外，将上述成分混合加热溶解，调pH为7.4 7.6，加入琼脂，12rC20min灭菌后，制成平板备用。
富集培养基:基础离子培养基中加入25g/L大豆油(其他植物油也可)。制法:基础 离子培养基和大豆油分别12rC20min灭菌后按比例混合，备用。
发酵培养基:基础离子培养基中加入40g/L葵花籽油、大豆油或甘油。制法:基础离 子培养基和植物油分别12rC20min灭菌后按比例混合，备用。如果选择甘油作碳源， 制法如下:基础离子培养基中加入甘油，待全部溶解，12rC20min灭菌，备用。
实施例3:结合图3，本发明双鼠李糖脂的制备方法，即将筛选得到的高产菌株 SC-02接种LB培养基，接种量2%， 32'C摇床培养，转速220r/min，培养时间18-36h (24h较好)，种子液接入甘油作碳源(也可选葵花籽油，大豆油)的发酵培养基，装 液量占摇瓶体积的25%， 25—38。C (3(TC较好)摇床培养，转速230r/min，培养时间 72-120h。取出离心处理，10000r/min， 30min，取上清液，6mol/LHCl溶液调PH值为
2.0。分两次加入两倍于上清液体积，氯仿/甲醇&"=2:1)混合溶剂，磁力搅拌20min， 静置6h，分液漏斗分液，合并有机相。旋转蒸发仪4(TC下减压蒸除溶剂，得到鼠李糖 脂粗提取物。接下来对鼠李糖脂粗提取物进行分离纯化，采用硅胶柱层析方法。使用 丙酮、甲醇或乙酸乙酯将所得产物溶解后进行重结晶，进一步纯化。
LB培养基(g/L):胰化蛋白胨10，酵母提取物5， NaCllO。制法:上述成分混合加 热溶解，lmol/LNaOH溶液调pH为7.2 7.4， 121 。C保持20min灭菌后冷却至室温备 用。
a、 装柱:湿法装柱(26x2.5cm)，首先在柱中装入1/2体积的乙酸乙酯，打开下端活 塞，然后从顶端慢慢加入乙酸乙酯浸泡的柱层析硅胶，边加入边用洗耳球轻敲柱身。 装柱完成后，继续加入约l个柱体积的乙酸乙酯平衡。
b、 上样:将糖脂粗品溶于尽量少的乙酸乙酯，待柱内乙酸乙酯距离硅胶顶部约 1.5cm时，用移液器缓慢且连续加入样品，上样过程要慢而连续，而且要使样品平铺于 硅胶顶端。关闭下端活塞，等样品慢慢渗入硅胶内部，在上端加一团脱脂棉，开始洗 脱，控制流速l滴/s。
c、 洗脱先用乙酸乙酯洗脱至黄色带展开，依次用乙酸乙酯/甲醇(vA^10:l)，乙 酸乙酯/甲醇& =4:1)，乙酸乙酯/甲醇^"=2:1)，乙酸乙酯/甲醇(v/v-l:l)各100mL洗脱。 每10mL收集一次，转入安瓿瓶编号保存。
d、 柱层析结果分析:采用排油法测试各瓶流出液的表面活性，TLC检测分离情况， 展开显色后，挑选只显示一个棕黄色斑点且Rf值为0.46的样品合并，旋转蒸发仪减压 浓縮，得较纯的双鼠李糖脂。显棕黄色斑点且Rf值为0.76的样品为单鼠李糖脂，将其 合并，减压蒸干得单鼠李糖脂。
e、 将上述各样品溶于乙酸乙酯，采用其他溶剂，如甲醇、丙酮也可，静止，重结 晶，到得较纯的的双鼠李糖脂。
采用液相色谱/质谱联用仪分析，负离子检测，SRM扫描，双鼠李糖脂约占鼠李 糖脂总质量的68%， Rh2Cn)CH)约占双鼠李糖脂总质量的90X，约占萃取得粗提取物 的23%，此外双鼠李糖脂中还含有少量Rh2C8do 、 Rh2C1()C8 、 Rh2CI()C12、 Rh2C12C10 等组分。
权利要求
1、一种双鼠李糖脂的产生菌筛选方法，包括以下步骤a、选取被油脂污染的现场采集土壤样品作为菌种筛选源；b、样品浸泡处理后接种植物油作碳源的富集培养基，培养24～72h后得富集培养液；c、把富集培养液梯度稀释涂布于十六烷基三甲基溴化铵平板培养基培养24～96h，挑取长势好且数量多的单菌落斜面保种；d、挑取斜面保存的菌种接入发酵培养基培养48～120h后测定表面活性，选择活性较高的菌种发酵液上清进行TLC分析，展开剂为氯仿∶甲醇∶乙酸v/v/v＝65∶15∶2，苯酚硫酸显色剂显色，初步判断双鼠李糖脂含量，选择Rf值为0.46的斑点颜色浓重的菌种即双鼠李糖脂的产生菌保留，零下26℃甘油保存。
2、 一种双鼠李糖脂的制备方法，包括以下步骤-a、 选取被油脂污染的现场采集土壤样品作为菌种筛选源；b、 样品浸泡处理后接种植物油作碳源的富集培养基，培养24 72h后得富集培养液；c、 把富集培养液梯度稀释涂布于十六垸基三甲基溴化铵平板培养基培养24 96h， 挑取长势好且数量多的单菌落斜面保种；d、 挑取斜面保存的菌种接入发酵培养基培养48 120h后测定表面活性，选择活 性较高的菌种发酵液上清进行TLC分析，展开剂为氯仿:甲醇:乙酸v/v/v二65:15:2，苯 酚硫酸显色剂显色，初步判断双鼠李糖脂含量，选择Rf值为0.46的斑点颜色浓重的菌 种即双鼠李糖脂的产生菌保留，零下26'C甘油保存；e、 将筛选所得菌种接种LB培养基，培养18 36h后转接入发酵培养基，25 — 38。C 培养72 120h;f、 发酵结束后将发酵液离心除菌体；g、 调整上清液pH4.0 5.0，加入氯仿甲醇混合物作萃取剂，搅拌、静置分液，保 留机相；h、 用旋转蒸发仪减压蒸除溶剂，得到鼠李糖脂粗提取物；i、将粗提取物在硅胶柱中进行色谱分离，以洗脱剂洗脱，部分收集； j、 TLC检测分离情况，展开剂为氯仿:甲醇:乙酸v/v/v二65:15:2，苯酚硫酸显色剂 显色，将Rf值为0.46的洗脱液合并，减压蒸干得所需双鼠李糖脂。
3、 根据权利要求1或2所述的双鼠李糖脂的产生菌筛选及制备方法，其特征在于: 步骤b的富集培养过程环境温度为25—4(TC。
4、 根据权利要求1或2所述的双鼠李糖脂的产生菌筛选及制备方法，其特征在于 步骤c的培养温度为25—40'C 。
5、 根据权利要求2所述的双鼠李糖脂的制备方法，其特征在于步骤i的洗脱剂 为甲醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯或者它们的混合物。
6、 根据权利要求2所述的双鼠李糖脂的产生菌筛选及制备方法，其特征在于使 用丙酮、甲醇或乙酸乙酯将所得产物溶解后进行重结晶，进一步纯化。
全文摘要
本发明公开了一种双鼠李糖脂的产生菌筛选及制备方法。即菌种筛选选择了长期被油脂污染的土壤样品作为菌源，采用了植物油作单一碳源的液体培养基富集后涂布选择性较强的十六烷基三甲基溴化铵琼脂平板，依据菌落形态、长势挑选疑似菌种。初筛所得菌种发酵培养后测试表面活性，活性高的菌种采用TLC直接分析发酵液，选取双鼠李糖脂产量高的菌种。从筛选所得菌种发酵液中萃取法提取鼠李糖脂，柱层析分离得较纯双鼠李糖脂。本发明所用筛选方法准确度高，筛选所得菌株鼠李糖脂产量高，尤其双鼠李糖脂产量较高，制备工艺简单，克服了目前筛选方法中仅依靠鼠李糖脂总产量筛选而难以获得双鼠李糖脂高产菌的缺点。
文档编号C12N1/00GK101173210SQ20071013277
公开日2008年5月7日 申请日期2007年9月30日 优先权日2007年9月30日 公开号200710132773.发明者崇 孙, 孟广荣, 孟欣欣, 杨树林, 影 王, 王永斌, 艾凤祥, 钮小松 申请人:南京理工大学