专利名称：半定量表达序列标签扩增多态性的分子标记及其分析方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种半定量表达序列标签扩增多 态性的分子标记及其分析方法。
技术背景DNA分子标记是新兴的分子生物学技术，能够从DNA水平直接反映生物的 遗传本质，具有数量多、多态性高、不受季节、环境影响、检测手段简单迅 速等多种优点。分子标记已经成为生命科学的前沿领域，广泛应用于生物遗 传多态性分析、遗传连锁图谱构建、种质资源鉴定、基因定位、亲缘关系分 析、性别鉴定、基因组作图、基因克隆、文库构建和分子标记辅助选择育种 等等多个方面，促进了农业、林业、牧业，以及医学包括法医学等方面的快 速发展。1980年，分子标记RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism, 限制片段长度多态性，Botstein D， White R L， Skolnick M， Davis R W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. American Journal of Human Gene-tics, 1980， 32:314 331)以文献报道形式出现。由于核苷酸序列的改变 遍及整个基因组，遗传标记的数量已不再成为限制因素，其优点明显超过经典 的蛋白质多态性，从此开创了利用DNA多态性进行分子标记的新阶段。但是 RFLP的缺点也很明显必须经过酶切和DNA杂交，因此，DNA需要量大，检 测技术繁杂，难以大范围推广使用，开发新的分子标记技术势在必行。1990 年，美国杜邦公司的科学家Williams (Williams J G K， Kubelik A R， Livak K J， et al. DNA Polymorphisms Amplified by Arbitrary Primers Are Useful as Genetic Markers [J]. Nucl Acid Res. 1990， 18: 6531-6535 )和加利 福尼亚生物研究所Welsh (Welsh J, McClelland M， Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Research, 1990, 18(24) :7213 7218 )分别领导的两个小组几乎同时将PCR 技术应用于分子标记，发展出一种新型的分子标记技术RAPD( random amplified polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)。 RAPD技术快速、简便， 成本低廉。但随着研究的深入，人们发现该技术存在一定的缺陷RAPD为显 性标记，不能提供完整的信息；易受实验条件影响；稳定性差；结果不能区 分纯合体和杂合体。1989年，Tautz提出了SSR (Simple Sequence R印eat，简单序列重复，Tautz D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers [J]. N ucleic Aci ds Research ，1989 ，17 :6463 647U)，又称微卫星DNA (Microsatelite 腿(Litt and Luty 1989， LittM， LutyJA. A hypervariable microsatellite revealed by in vit2ro amplification of dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. A merican Journal of Human Genetics ， 1989 ， 44 :397 40U)。 SSR标记是利用其两端特定的DNA序列设计一对引物进行 PCR扩增，然后凝胶电泳，数据分析。该技术具有很好的稳定性和多态性，DNA 用量少，重复性高。但她的开发和合成新的SSR引物投入高、难度大，必须 有大量的前期工作。1991年Moore等(Moore SS, Sargeant LL， King TJ， et al. The conservation of dinucleotide microsatellites among mammalian genomes allows the use of heterologous PCR primer pairs in closely related species [J]. Genomics, 1991,10: 654 660 )创立了 SSR即微卫 星DNA分子标记。SSR分布广、多态性丰富，但前期开发及合成SSR引物投入 高、难度大。SSR标记往往远离功能基因，对研究功能基因不利。由于SSR突 变率高，开发出来的引物不能通用。1992年，荷兰学者Zabeau Marc和Vos Pieter (VosP， Hogers R， BleekerMetal. AFLP:a new technique for DNA finger printing .Nucleic Acids Research, 1995， 21: 4407 4414)把RAPD禾n RFLP 技术结合起来，发明了新的分子标记AFLP技术(amplified fragment length ploymorphism，扩增片段长度多态性)，1993年获欧洲专利局专利，专利号为 EP0534858A1 ( Zabeau M， Vos P. Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA finger printing[P]. European Patent Office Publication 1993， 0535858AI.)。该技术快速、高效，分辨率 高、重复性好、易于标准化，很快被推广到生物学的各个领域。但也存在明 显的缺点技术繁琐；过程时间长；检测的不是等位片段；费用昂贵；AFLP 标记是显性标记，不能提供完整信息。另外，它常常使用放射性同位素，假 阳性频繁。1995年，Umethara等(Umethara Y， Inagaki A， Tanou H， Yasukochi Y， Nagamura Y, Saji S， 0tsuki Y， Fujimura T， Kurata N， Minobe Y， Construction and characterization of rice YAC library for physical mapping. Molecular Breeding, 1995,1， 79 - 89)用cDNA作为探针构建水 稻染色体的物理图谱，该标记是一种EST标记(Expressed Sequence Tag, 即表达序列标签)。2001年，Schubert等(Schubert R， Starck GM， Riegel R (2001) Development of EST-PCR markers and monitoring their intra populational genetic variation in Picea abies ) Karst. Theoretical and Applied Genetics, 103， 1223 - 1231)应用EST-PCR分子标记进行了欧洲云杉基因变异的研究。但EST的高度的保守性造成其多态性极低，难以大 量应用。1996年，美国MIT的科学家Lander (Lander ES. The new genomics: Global views of biology. Science, 1996,274:536 539)提出了 SNP (single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性)。SNP数量极多，其遗 传稳定性远高于SSR，可以进行快速、规模化筛查，易于基因分型。和SSR — 样，SNP也需要前期工作基础，制作一个SNP图需要多个SNP，且难以确定哪 个SNP出错，并对数据进行有效分析。2001年，美国加州大学的Li与Quiros <Xi G， Quiros C F. Sequence—related amplified polymorphism (SRAP) ， A new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica. Theor Appl Genet, 2001， 103:455 461 )发表了 一种新型分子标记SRAP (sequence-related amplified polymorphism,相关序列扩增多态性)，又叫SBAPsequence-based amplified polymorphism,基于序列扩增多态性)。2003年，美国农部北方作物科学实验 室Hu与Vick (Hu J， Vick BA. Target region amplification polymorphism, a novel marker technique for plant genotyping. Plant Mol Biol Rep. 2003， 21， 289-294)在SRAP的基础上又提出了 TRAP分子标记，TRAP的一个引物直 接应用SRAP，另一个根据EST设计。TRAP和SRAP的优点是操作简便、产量 中等、条带易于分离及可测序，操作过程简单，不须使用同位素。但这二种 技术存在一个共同缺陷PCR的起始退火温度过低，假阳性率太高。从上述情况可以看到，分子标记的研究不断有文献报道，特别是90年代 以来，发展十分迅速。 一般来说，后来的研究都吸收了前者的优点而克服了 他们的不足，使之不断优化，但现有的分子标记技术缺陷仍然十分明显。除第一个分子标记RFLP是基于DNA Southern杂交技术外，后来发展的 分子标记基于PCR技术，他们的技术核心是引物的设计。表达序列标签(Expressed Sequence Tags, EST)是Venter (Adams MD， Dubnick M， Kerlavage AR, Moreno R, Kelley JM, Utterback TR, Nagle JW， Fields C， Venter JC. Sequence identification of 2,375 human brain genes. Nature. 1992 Feb 13;355(6361):632~634)于1991年提出的一个概念，从cDNA文库中取出一 个克隆，从5'端或3'端对其测序，所测得的约500bp的序列就称为一个EST。 每个EST代表一个表达基因的部分转录片段。EST只测定部分序列，也不需要 对克隆排序，而且具有经济、高效的特点，通过对EST分析，有助于新基因 的发现。分析EST在不同组织的表达特异性，可以建立DNA的物理图谱。目前，还没有一种半定量的表达序列标签(EST)扩增多态性的分子标记。 因此，开发一种半定量的EST扩增多态性，且经济、简便、实用的新分子标 记技术十分必要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简便、价格低廉、 重复性好半定量表达序列标签扩增多态性的分子标记及其分析方法。 本发明是通过以下技术方案来实现的
一种半定量表达序列标签扩增多态性的分子标记，其特征在于是根 据表达序列标签设计固定引物，以CACGC为核心序列设计随机引物，通过 反转录聚合酶链式反应而得到特定表达序列标签多态性。
而且，所述的固定引物的序列如下
El: 5'ATTCAGCCGATTGCAAGAGA 37 CV171606 E2: 5'TATCTTGACCAGGCGAGACCT 37 CV171904。
而且，所述的随机引物的序列如下
C1: 5 ，GACTGCGTACGCACGCTGA 3' C2: 5, GACTGCGTACGCACGCTGA 3' C3: 5 ， GACTGCGTACGCACGC AAC3 ，。
一种半定量表达序列标签扩增多态性的分子标记的分析方法，包括以下
歩骤
(1) .确定目标EST;
(2) .在基因库的EST库查询目标EST序列；
(3) .根据目标EST序列设计固定引物和随机引物；
(4) .合成引物应用DNA合成仪合成设计好的固定引物和随机引物引物；
(5) .RNA的提取；
(6) .RT-PCR扩增:应用oligod(T)做引物，对RNA进行反转录合成cDNA， 应用固定引物和随机引物，对cDNA进行PCR扩增；
(7) .扩增产物的检测PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；数据分析:
银染以显示扩增条带，应用数据分析软件进行分析。
而且，所述的随机引物和固定引物的组合为 C1/E1, Cl/E2; C2/E1; C2/E2, C3/E1, C3/E2。
本发明的有益效果和优点是
1. 本发明可以直接研究目标EST的多态性，且经济、简单、高效。
2. 本发明通过引物设计，保留了最新创立的分子标记SRAP和TRAP技术的 优点，克服了他们的缺陷，除具备操作简便、产量中等、条带易于分离及可 测序，不需使用同位素等优点之外，还具有半定量的特点。可用于研究植物、 动物、人类以及微生物的遗传多态性分析、种质资源鉴定、基因定位、亲缘 关系分析和分子标记辅助选择育种等。
具体实施例方式
本发明通过以下实施例进一步详述，下述实施例是说明性的，不是限定 性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。 不同产地丹参多态性实验研究
1. 实验材料:河南、四川、陕西和江苏丹参的叶。
2. 实验仪器低温高速离心机、超低温冰箱、水浴箱、超净工作台、752 分光光度仪、电泳仪、电泳图象分析系统、DNA扩增仪、旋涡混合器、微型高 速离心机、水平电泳仪
3. 试布J: ^t氛酸狐，SuperScript IlRnase H. Reverse Transcriptase(Invitrogen),Tris-HCL(PH 8.0),EDTA,p-巯基乙醇、NaCL、 NH4Ac (Promega Corp)、氯仿、异丙醇、无水乙醇、琼脂 糖、Tris饱和酚、RNA酶、冰乙酸，Spfu-DNA Polymerase (赛百盛公司)，dNTPS,Acrylamiole, bis, 1 OxTBE,TEMED, 10% Ammonium Pers函te
4. 实验方法 4. 1 RNA提取
a).准备工作预热恒温水浴箱、预冷低温高速离心机、超净工作台紫外
线消毒灭菌、预冷。
(2) .取丹参样品约500mg，液氮下研磨。
(3) .将上面已经研磨成面的样本倒入印pendorf管中。
(4) .加入异硫氰酸胍提取液或Trizollml，放置10分钟；用吸头反复吹打 数次，使混合均匀。
(5) .加入氯仿200ul，混匀，室温放置15分钟；然后，4°C， 12000rpm， 离心15分钟；吸取上层水相至另一 印pendorf管中。
(6) .加入异丙醇0.5ml，混匀，室温放置10分钟；4°C， 12000rpm，离心 IO分钟；弃上清，RNA沉淀于管底。
(7) .加入75。/。乙醇lml，温和震荡悬浮沉淀；4°C， 8000rpm,离心5分钟， 弃上清，用吸水纸吸干多余乙醇，凉干15-20分钟。
(8) .加入经过DEPC处理的去离子水50ul， 60°C， 10分钟，取出检测其完
整性及纯度。
DnaseI消化总RNA中残留的DNA:
(1) .取20pg总RNA，加入5xDnase缓冲液4ial， Dnase I (1U/nl)5)nl，力口DEPC 水至总体积为20pl， 37'C温浴10min。
(2) .反应结束，加入180iulDEPC水，200pl水饱和酚氯仿异戊醇(50: 49: 1)抽提一次。
(3) .取上清液加入3M的醋酸钠(pH5.2)至终浓度为0.3M，并加2. 5倍的无 水乙醇，-80。Clh。(4) . 12000rpm， 4。C离心15min，弃上清。
(5) .沉淀物用75%的乙醇洗两次，空气干燥后加入20^dDEPC处理水，调 RNA浓度为1(ag/W， -80°。保存备用。
4.2引物设计
(1) .固定引物的设计a.在丹参的EST数据库査找到丹参素生物合成相关 的苯丙醇(phenylpropanol)代谢途径目标序列为CV171606和CV171904; b.将 这2个序列调入PCR引物设计软件oligo6.0; c.根据软件提示，分别设置参数;d. 从软件产生的引物中，每个EST选1个引物作为固定引物，2个EST选2个引物， 其序列及NCBI登陆号如下
E1: 5 ， ATTCAGCCGATTGCAAGAGA 3 V CV171606 E2: 5'TATCTTGACCAGGCGAGACCT 37 CV171904
(2) .随机引物的设计随机引物包括3部分核心序列，前置序列和后前置 序列，核心序列为一段内含子保守序列"CACGC"。前置序列和后前置序列 来自SRAP和TRAP。其序列如下
C1: 5 ，GACTGCGTACGCACGCTGA 3' C2: 5 ， GACTGCGTACGCACGCTGA 3 ，
(3) .随机引物和固定引物的组合如下 C1/E1， C2/E2。
4. 3反转录反应
引物应用oligod(T) 18，转录时为保证各组之间的可比性，每个反应均加 入RNA2ul，其浓度为0. lug/ul，具体步骤如下
(1) .在微量离心管中加入下列物品 RNA 2ul oligod(T)18 lul
(2) .混匀，70°C， 10min，冰浴2min。
(3) .再向体系中加入
去离子水 8.8ul
5 XRT-Buffer 4ul dNTP mix 2ul DTT 2ul Superscript II RT enzyme 0. 2ul 整个反应体系为20ul。
(4) .将反应管置于PCR仪上，按如下温度操作；
25°C， 5min; 50°C， 50min ; 70。C， 15min， _^ 4°C。
(5) .反应结束后，储存于-2X:C备用。ii 35cycle:
iii
IV
4. 4. PCR扩增
(1) .反应体系
cDNA 2ul 10XPCR Buffer 2ul dNTPS(10mMeach) 0.5ul 随机和固定引物(30pmo1) 各lul s-pfuDNA聚合酶(2.5U) 0.5ul 去离子水加至 20 ul
加各种试剂后，盖紧薄壁管盖，短暂离心混匀。向需要滴加石蜡油的PCR 薄壁管中滴加石蜡油30ul，放进PCR扩增仪中。
(2) .将反应管置于PCR仪上，按下面温度操作
i 94 。C 4mi
94°C 45sec 52 。C 1 min
72°C lmin30sec 72 °C 10min 4°C 终止 取出扩增的样品，4。C保存。 4. 5变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 4. 5.1准备制胶玻板
(1) .洗洁精清洗大小玻璃板，自来水冲洗数遍，蒸馏水冲洗3遍，凉干。 大小玻璃板清洗必须洁净，否则影响后面灌胶。洗前用彩色透明胶布做好标 记以区分未经处理的一面。
(2) . 95。/。乙醇清洗大小玻璃板。
(3) .处理小玻板喷洒适量"雨敌"于小玻板，卫生纸将其均匀涂抹在整 个表面。室温干燥10分钟，轻轻擦去多余的"雨敌"。
(4) .处理大玻板:在通风橱中准备Bind-Silane，将150 u 1 Bind Silane， 150ul冰醋酸加于1.2ml的95。/。乙醇中，充分混合，全部加到大玻板上，卫生 纸均匀涂抹整个表面。室温10分钟，轻轻擦去多余的Bind-Silane。
(5) .清洗间隔条、加样梳，将处理好的大玻板置于水平制胶模具上，放置 间隔条，压上小玻板对齐，夹好长尾夹子，准备制胶。
(6) .变性聚丙烯酰胺凝胶60ml，迅速加入 TEMED 60ul 10% Ammonium persulfate 240ul 轻轻混匀(7) .用20ml注射器小心吸取凝胶混合液，加入两块玻板间，让液体自顶 端向下流动直到液面到达玻板底部，注入过程可以根据具体情况，用拳头轻 轻捶打震动玻板，以便凝胶混合液流动。注入过程应该连续，避免气泡产生。 一旦有边缘处产生气泡，立即用细丝插入将其引出。如果中间产生大量气泡， 只能废弃再从新灌胶。(8) .灌胶成功后，迅速插入加样梳(齿向上)于顶端两玻板间，并用长尾 夹固定顶端。(9) .室温聚合l小时以上。 4. 5. 2.预电泳a).凝胶聚合好后，去掉长尾夹，放置凝胶板于垂直电泳槽上，对齐后拧 紧固定螺丝。(2) .在垂直电泳槽的上下槽中分别加入约500ml 1XTBE缓冲液。(3) .小心去掉加样梳，用小吸管冲洗加样槽。(4) .接通电源，调节电压，恒压85v预电泳0. 5小时。 4. 5. 3.电泳(1) .扩增产物lOul，加入5ul上样缓冲液。(2) .95'C变性10分钟，立即取出置于冰上冷却。(3) .凝胶预电泳结束后，切断电源。再次冲洗加样槽，吹去气泡。(4) .小心插入梳子(齿向下)，冲洗二遍。然后自左向右依次将样本和DNA marker加入凝胶加样槽。(5) .恒电压lOOv电泳1. 5小时。 4. 5. 4.银染(1) .电泳结束后，打开固定螺丝，从电泳槽上取下凝胶玻板置于水平制胶 模具上。拔掉梳子，松动间隔条，小心去掉小玻璃板，凝胶粘附在大玻板上。(2) .将大玻板轻轻放入2000ml固定液盒中，打开旋转摇床缓慢摇动固定 20min。(3) .蒸馏水水洗2次，每次5min。(4) .转入2000ml银染液盒中，旋转摇床缓慢摇动银染30min。(5) .水洗10s。(6) .迅速转入2000ml显影液盒中，旋转摇床缓慢摇动直至谱带显出，再 显影片刻。(7) .在显影液中，待条带稍稍清晰时，直接转入固定液中，定影5min。(8) .水洗5min。(9) .取出凝胶，自然干燥。 4.5.5数据采集与分析4.5.5.数据采集与分析数码相机照相，Pharmacia hnagemaster凝胶电泳图像分析系统分析不同 产地丹参的差异、多态性。4. 5. 6.结果应用2对引物扩增四个产地的丹参共8个样品得到82条扩增 条带，其中多态性条带12条，占14.6%。扩增片断大小在144 卯0bp之间，平 均每对引物可以产生41个条带，6个多态性条带。
权利要求
1.一种半定量表达序列标签扩增多态性的分子标记，其特征在于是根据目标表达序列标签设计固定引物，以CACGC为核心序列设计随机引物，通过反转录聚合酶链式反应而得到特定表达序列标签多态性。
2. 根据权利要求1所述的半定量表达序列标签扩增多态性的分子标记，其特征在于所述的固定引物的序列如下El: 5'ATTCAGCCGATTGCAAGAGA 37 CV171606 E2: 5 ，TATCTTGACCAGGCGAGACCT 3 7 CV171904 。
3. 根据权利要求1所述的半定量表达序列标签扩增多态性的分子标记， 其特征在于所述的随机引物的序列如下C1: 5 ，GACTGCGTACGCACGCTGA 3' C2: 5' GACTGCGTACGCACGCTGA 3' C3: 5 ， GACTGCGTACGCACGC AAC3'。
4. 一种如权利要求l所述的半定量表达序列标签扩增多态性的分子标记的分析方法，其特征在于分析方法包括以下步骤(1) .确定目标EST;(2) .在基因库的EST库査询目标EST序列；(3) .根据目标EST序列设计固定引物和随机引物；(4) .合成引物应用DNA合成仪合成设计好的固定引物和随机引物引物；(5) .RNA的提取；(6) .RT-PCR扩增应用oligod(T)做引物，对RNA进行反转录合成cDNA， 应用固定引物和随机引物，对cDNA进行PCR扩增；(7) .扩增产物的检测PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；数据分析: 银染以显示扩增条带，应用数据分析软件进行分析。
5. 根据权利要求4所述的半定量表达序列标签扩增多态性的分子标记的分 析方法，其特征在于所述的随机引物和固定引物的组合为C1/E1, Cl/E2; C2/E1; C2/E2, C3/E1， C3/E2。
全文摘要
本发明涉及一种半定量表达序列标签扩增多态性的分子标记及其分析方法，是根据目标表达序列标签设计固定引物，以CACGC为核心序列设计随机引物，通过RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)而得到特定表达序列标签多态性。本发明通过引物设计，保留了最新创立的分子标记SRAP和TRAP技术的优点，克服了他们的缺陷，除具备操作简便、产量中等、条带易于分离及可测序，不需使用同位素等优点之外，还具有半定量的特点。可用于研究植物、动物、人类以及微生物的遗传多态性分析、种质资源鉴定、基因定位、亲缘关系分析和分子标记辅助选择育种等。
文档编号C12Q1/68GK101225438SQ200710150328
公开日2008年7月23日 申请日期2007年11月22日 优先权日2007年11月22日
发明者卢全生, 康立源, 萌 张, 张伯礼, 王庆浩, 陈爱华 申请人:天津中医药大学