专利名称：表达草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白的重组杆状病毒及其构建的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒学领域，特别是一种草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白的重组杆状病毒及其构 建方法。本发明所用病毒株为草鱼呼肠孤病毒(GraMcavwov/n/5 ，縮写GCRV)湖南邵阳 株GCRV873，又称草鱼出血病病毒湖南邵阳株GCHV873，已由中国典型培养物保藏中心保 藏，保藏日期是2004年7月23日，保藏编号是CCTCCNO: V200414 。
背景技术：
草鱼(Cfewo/^a^"go(/ow We//^)是我国重要的经济类淡水水产养殖物。草鱼出血病引起 草鱼大批死亡，严重地影响我国淡水养殖业的健康发展。1983年我国首次分离出病毒病原， 鉴定其为呼肠孤病毒科新成员后，在防治技术上取得长足进展。草鱼呼肠孤病毒隶属于呼肠孤 病毒科水生动物呼肠孤病毒属，其形态结构为二十面体对称的无包膜球形颗粒，基因组由11 条(S1-S11)分段的双链RNA组成。近年来GCRV873基因组序列及三维结构与蛋白特性等 方面的研究结果，使该病毒结构蛋白的体外表达成为可能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种鉴于GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7在介导病 毒进入细胞的过程中具有良好的抗原性，而通过纯化病毒得到的VP5和VP7抗原蛋白十分有 限，故有必要运用基因工程手段对该病毒蛋白在体外进行高效重组表达，进而为制备GCRV 基因工程疫苗及开展抗病毒机理研究开辟新的有效途径。
本发明解决其技术问题采用以下的技术方案
本发明提供了高效双表达GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7的重组病毒vAcGCRV-VP5/VP7。 本发明还提供了上述重组病毒vAcGCRV-VP5/VP7的构建方法，具体是通过RT—PCR
扩增，分别得到2条编码GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7基因的特异片段；通过基因克隆筛
选获得插入了 GCRV VP5与VP7基因的重组pFastBacdual双表达载体pFbDGCRV-VP5/VP7;
将筛选得到的重组双表达载体转化DH10Bac细胞，得到转座的AcGCRV-VP5/VP7 Bacmid;
将AcGCRV-VP5/VP7 Bacmid转染Sf9昆虫细胞，在Sf9昆虫细胞中获得重组病毒vAcGCRV
-VP5/VP7。
本发明与现有技术相比，具有以下主要优点 其一.在体外同时表达2种GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7。 其二.表达的蛋白产量高，保持GCRVVP5和VP7天然蛋白活性。 其三.表达的蛋白产物为非融合蛋白，具有良好的免疫原性。
其四.本重组杆状病毒表达的VP5和VP7蛋白，可在体外自动形成异源三聚体，既适用 于病毒结构与致病机理研究，又可用于基因工程疫苗。
总之，本发明通过杆状病毒表达系统，在体外成功构建了同时表达GCRVVP5和VP7外
衣壳蛋白双表达载体，并获得在Sf9细胞中的高效表达，子代病毒的增殖培养证实其重组病 毒高效表达的稳定特性;其表达蛋白能用于研究GCRV外衣壳蛋白功能及制备基因工程疫苗。
具体实施例方式
本发明提供的表达草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白的重组杆状病毒是高效双表达GCRV外 衣壳蛋白VP5和VP7的重组病毒vAcGCRV-VP5/VP7。
本发明提供的重组病毒vAcGCRV-VP5/VP7的构建方法是通过RT — PCR扩增，分别得 到2条编码GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7基因的特异片段；通过基因克隆筛选获得插入了 GCRV VP5与VP7基因的重组pFastBacdual双表达载体pFbDGCRV-VP5/VP7;将筛选得到的 重组双表达载体转化DH10Bac细胞，得到转座的AcGCRV-VP5/VP7 Bacmid;将 AcGCRV-VP5/VP7 Bacmid转染S 昆虫细胞，在Sf9昆虫细胞中获得重组病毒vAcGCRV -VP5/VP7。
本发明重组病毒vAcGCRV-VP5/VP7的构建可采用包括以下步骤的方法
(1) 用于扩增GCRV-VP5/VP7蛋白基因的草鱼呼肠孤病毒毒株为GCRV873，是草鱼呼 肠孤病毒湖南邵阳株；
(2) 以GCRV873基因组dsRNA第6片段和第10片段为模板，采用RT—PCR方法扩 增GCRV VP5与VP7基因片段；第6片段和第10片段分别是编码VP5、 VP7蛋白的基因序 列；
(3) 扩增的GCRV VP5和VP7 DNA片段与pFastBacDual双表达载体连接，获得重组 VP5与VP7基因的重组质粒pFbDGCRVV-P5/VP7;
(4) 将筛选得到的重组质粒转化DH10Bac细胞，获得转座的AcGCRV-VP5/VP7 Bacmid;
(5) 采用cellfectin脂质体，将纯化的AcGCRV-VP5/VP7 Bacmid转染Sf9昆虫细胞， 获得在昆虫Sf9细胞中高效表达的GCRV重组病毒vAcGCRV-VP5/VP7。
本发明采用包括以下步骤的方法，使扩增的GCRV VP5和VP7 DNA片段与pFastBacDual 双表达载体连接
(1) 根据GCRVVP5和VP7基因的GenBank序列以及pFastBacDual供体质粒的多克隆位 点设计含酶切位点的引物，GCRV VP5和VP7基因的GenBank序列号分别为AF403392和 AF403396;
(2) 采用Superscript II逆转录酶系统与高保真Taq酶，进行VP5和VP7编码基因片段RT — PCR扩增；
(3) 将VP5基因片段插入到pFastBacDual多角体启动子下游，VP7基因插入到p10启动
子下游。
本发明可采用以下的引物扩增VP5和VP7编码基因序列
(1) 用于扩增GCRVVP5的引物序列是
正向引物VP5陽S: 5，墨GA7rZ4a4TTCGACACTTCGCACTCT陽3，； 反向引物VP5-AS: 5'-CACrC7C4GTTCACGCGGGCATGGAAG -3，；
(2) 用于扩增GCRVVP7的引物序列是 正向引物VP7-S: 5'-CT(XC(7(7GCCGATCATCACCACGATG-3，； 反向引物VP7-AS: 5'陽CAC2T&4C GATGAAACGAGAGACCC-3，。
本发明VP5编码基因与载体连接的酶切位点分别是^&a I和i)w I。 VP7基因与载体连接 的酶切位点6'wa I禾口o I。
下面结合实施例对本发明作进步说明，但不限定本发明。
一. 细胞与病毒毒株
釆用Sf9昆虫细胞的培养进行重组GCRV衣壳蛋白杆状病毒的转染。
1) Sf9细胞培养液为含10%超级胎牛血清的Grace培养基(Grace-10)， pH7.2。
2) Sf9细胞培养方法为取液氮中保存的Sffi细胞，37'C温育2 3min。直接在台式离 心机上离心(3500r/min) lmin后，加入适量的Grace-lO培养液，转移至培养瓶中进行培养。 Sf9细胞最适培养温度为28'C，细胞培养2 3天，待基本铺满培养瓶底后，进行传代培养。
3) GCRV毒株为GCRV湖南邵阳株(GCRV873)
二. 目的基因片段扩增与克隆
采用RT-PCR方法进行GCRV衣壳蛋白VP5和VP7基因片段扩增。基于GenBank序列 进行GCRV VP5和VP7基因片段引物设计。根据pFast BacDual donor plasmid提供的多克隆 位点,以及插入片段自身的序列特征设计针对其含酶切位点的引物。用于扩增GCRV VP5的 正向引物GCRV墨VP5-S(Sense)序列是5'-GArCZ404TTCGACACTTCG CACTCT-3，(力《 I); 反向引物GCRV-VP5-AS(Antisense)序列是5'-CAC7GC4GTTCACGCGGGCATGGAAG -3' (」PW I)。 用于扩增GCRV VP7的正向引物GCRV-VP7-S序列是 5'-CTCCC GGGCCGATCATCACCACGATG-3' (Swa I);反向弓l物 GCRV-VP7-AS 序列是 5'-CACrCG^GGATGAA ACGAGAGACCC- 3'(Wo I)。取纯化的病毒基因组单一基因片段 (由本实验室保存)2-5mg溶于90%DMSO中，95'C加热5min使之变性。反转录酶选用 SuperscriptII逆转录酶系统。反应条件及方法为RNA/DMSO混合物被稀释到20倍体积的反 转录混合物中(50mM Tris匿Cl,pH8.3, 75mM KC1, 3mM MgCl2, lOmM DTT, 0.5mM dNTP, 0.2U RNsin， 200U/ml Superscript 11 ) (Gibco BRL)。上述引物在10mM Tris-Cl, lmM EDTA， pH8.0的 溶液中，终浓度为200pmo1，与模板l:l (W/W)的比率加到反应混合物中，37'C保温60分 钟，进行cDNA第一链的合成，其产物直接进行PCR扩增。PCR扩增的VP5和VP7基因片 段与pFastdual载体进行连接。采用CaCl2化学法制备的感受态细胞(大肠杆菌DH5a)进行转 化。采ffl加有Ampicmin (100mg/ml)的平板筛选阳性克隆。37'C培养16 hours,按实验室常 规碱裂解法提取质粒。采用单、双酶切法鉴定重组克隆子。
三. 重组Bacmid的鉴定
通过双酶切鉴定与PCR扩增得到VP5和VP7基因片段，鉴定正确的重组克隆子 pFbDGCRV-VP5/VP7转化DHlOBac感受态细胞。在含有50吗/ml Kanamycin; 7吗/ml Gentamicin; 10(_ig/ml Tetracycline; 200|ag/ml X-gel; 40)ig/ml, IPTG的LB平板上挑选白斑，然后 接种于5ml含同样浓度的Gent， Amp和Tet的LB液体培养基中进行小量培养。按碱裂解法 提取重组VP5和VP7 Bacmid DNA。重组AcGCRV-VP5/VP7 Bacmid的阳性克隆鉴定采用M13
正反向引物序列进行扩增。
四.Sf9细胞转染与重组病毒鉴定
1. 选用Sf9细胞与阳离子Cellfectin (Invitrogen， Carlsbad， CA)转染试剂，将碱裂解法提 取的重组VP5和VP7 Bacmid DNA转染Sf9昆虫细胞，获得能在Sf9昆虫细胞中高效表达的 VP5和VP7重组病毒vAcGCRV-VP5/VP7。具体转染和细胞培养方法按试剂盒提供的操作步 骤进行。转染3天后在光学显微镜下初步观察转染细胞的变化，通过与Sf9正常细胞相比较， 确定转染重组病毒的Sf9细胞有出芽病毒的产生，将第一代P1重组病毒进行传代培养获得高 效价病毒悬液。P1子代病毒的增殖培养证实重组病毒vAcGCRV -VP5/VP7具有稳定高效表达 GCRV VP5和VP7蛋白的特性。
2. 滴价测定将传代的待测病毒悬液(P3)进行一系列10倍稀释(10(-1) 10(—15))，按上 述病毒增殖方法感染Sf9细胞。在病毒感染48 72h，观察细胞病变情况。按Reed-Muech法 计算50%重组病毒滴价。测定病毒培养液的滴价为10(9) TCID(50)/ml 。
3. 将扩大培养的重组病毒细胞裂解液进行SDS—PAGE蛋白电泳，鉴定所得到的重组病 毒含有目的蛋白的表达，其分子量分别为68 kDa与34kDa，与VP5和VP7蛋白预期值相吻<110〉 <120> <140> <141> <160〉 <170>
中国科学院武汉病毒研究所
表达草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白的重组杆状病毒及其构建
<210〉 1
<211> 26
<212〉 DNA <213〉 人工序列 <220> <221>
<222> (1)…(26)
<223> 正向弓1物VP5-S
<400> 1 5，-GA7TZ4G/4TTCGACACTTCGCACTCT -3，
<210〉 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列 <220〉 <221>
<222> (1)...(26)
<223〉 反向引物VP5-AS
<400> 2
5，誦CACrGC4GTTCACGCGGGCATGGAAG墨3' <210> 3
<211> 26
<212> dna
<213> 人工序列 <220> <221>
<222> (1)...(26)
<223〉 正向引物vp7-s
<400> 3
5,-ctcctg^( ccgatcatcaccacgatg -3，
<210> 4 <211> 25 <212〉 dna <213> 人工序列 <220> <221>
<222> (1)…(25)
<223> 反向引物vp7-as
<400> 4
5,-cac:t<:gl4c gatgaaacgagagaccc- 3，
权利要求
1.一种表达草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白的重组杆状病毒，其特征是高效双表达GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7的重组病毒vAcGCRV-VP5/VP7，GCRV是草鱼呼肠孤病毒的英文缩写。
2. —种权利要求1所述的表达草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白的重组杆状病毒的构建方法， 其特征是通过RT — PCR扩增，分别得到2条编码GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7基因的特异 片段通过基因克隆筛选获得插入了 GCRV VP5与VP7基因的重组pFastBacdual双表达载休 pFbDGCRV-VP5/VP7;将筛选得到的重组双表达载体转化DH10Bac细胞，得到转座的 AcGCRV-VP5/VP7 Bacmid;并将其转染Sf9昆虫细胞，在Sf9昆虫细胞中获得重组病毒 vAcGCRV-VP5/VP7。
3. 根据权利要求2所述的重组杆状病毒的构建方法，其特征是采用包括以下步骤的方法(1) 用于扩增GCRV-VP5/VP7蛋白基因的草鱼呼肠孤病毒毒株为GCRV873，是草鱼呼 肠孤病毒湖南邵阳株；(2) 以GCRV873基因组dsRNA第6片段和第10片段为模板，采用RT—PCR方法扩 增GCRV VP5与VP7基因片段；第6片段和第10片分别是编码VP5、 VP7蛋白的基因序列；(3) 扩增的GCRV VP5和VP7 DNA片段与pFastBacDual双表达载体连接，获得重组 VP5与VP7基因的重组质粒pFbDGCRVV-P5/VP7;(4) 将筛选得到的重组质粒转化DH10Bac细胞，获得转座的AcGCRV-VP5/VP7 Bacmid;(5) 采用cellfectin脂质体，将纯化的AcGCRV-VP5/VP7 Bacmid转染Sf9昆虫细胞， 获得在昆虫Sf9细胞中高效表达的GCRV重组病毒vAcGCRV-VP5/VP7。
4. 根据权利要求3所述的的重组杆状病毒的构建方法，其特征是扩增的GCRV VP5和 VP7 DNA片段与pFastBacDual双表达载体连接包括以下步骤(1) 根据GCRVVP5和VP7基因的GenBank序列以及pFastBacDual供体质粒的多克隆位 点设计含酶切位点的引物，GCRV VP5和VP7基因的GenBank序列号分别为AF403392和 AF403396;(2) 采用SuperscriptII逆转录酶系统与高保真Taq酶，进行VP5和VP7编码基因片段RT— PCR扩增；(3) 将VP5基因片段插入到pFastBacDual多角体启动子下游，VP7基因插入到p10启动子下游。
5. 根据权利要求4所述的的重组杆状病毒的构建方法，其特征是扩增VP5和VP7编码基因 序列的引物是(1) 用于扩增GCRVVP5基因的引物序列是正向引物VP5-S: 5，-GArCZ4G4TTCGACACTTCGCACTCT墨3’； 反向引物VP5-AS: 5'-CACTG"C4GTTCACGCGGGCATGGAAG -3';(2) 用于扩增GCRVVP7基因的引物序列是 正向引物VP7-S: 5，-CTCTCGC"C"CCGATCATCACCACGATG -3，；反向引物VP7-AS: 5'-CACTCGL4GGATGAAACGAGAGACCC- 3'。
6. 根据权利要求4所述的的重组杆状病毒的构建方法，其特征是VP5编码基因与载体连 接的酶切位点分别是la I和尸W I。
7. 根据权利要求4所述的的重组杆状病毒的构建方法，其特征是VP7基因与载体连接的 酶切位点^mal和力ol。
8.将权利要求1所述的高效双表达GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7的重组病毒 vAcGCRV-VP5/VP7应用于基因工程疫苗的制备。
全文摘要
本发明提供了一种高效双表达草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP5和VP7的重组病毒vAcGCRV-VP5/VP7，其构建方法是通过RT-PCR扩增，分别得到2条编码GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7基因的特异片段；通过基因克隆筛选获得插入了GCRV VP5与VP7基因的双表达载体pFbDGCRV-VP5/VP7，然后将其转化DH10Bac细胞，再转染Sf9昆虫细胞即可。本发明通过杆状病毒表达系统，在体外成功构建了同时表达GCRVVP5和VP7外衣壳蛋白双表达载体，并获得在Sf9细胞中的高效表达，子代病毒的增殖培养证实其高效表达的稳定特性；其表达蛋白能用于研究GCRV外衣壳蛋白功能及制备基因工程疫苗。
文档编号C12N15/866GK101205545SQ20071016864
公开日2008年6月25日 申请日期2007年12月6日 优先权日2007年12月6日
发明者丁清泉, 勤 方 申请人:中国科学院武汉病毒研究所