高通量电穿孔装置的制作方法

专利名称：高通量电穿孔装置的制作方法
高通量电穿孔装置
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年1月25日提交的美国临时专利申请第11/627,235的优 先权，将该申请的内容参考包括在此。
背景技术：
1. 发明领域
本发明涉及电穿孔领域，涉及一种通过将膜结构悬浮在外源性物质的液体 溶液中并对悬浮液施加电场、以将外源性分子物质插入该结构的方法。具体地 说，本发明涉及用于高通量电穿孔的装置，高通量电穿孔的定义是同时或快速 连续地进行大量细胞悬浮液的电穿孔。
2. 现有技术的描述
电穿孔是一种采用电场使外源性分子浸渍到膜结构如活体生物学细胞、脂 质体和运载体中的技术。高通量电穿孔允许使用者同时或自动连续地对多个样 品施加电场，即"电击"。高通量电穿孔适用于许多过程，特别是涉及siRNA 的试验和涉及使用cDNA文库的研究。
使用高导电率缓冲液作为介质，其中溶解有外源性物质，并且在电穿孔期 间膜结构悬浮于其中，通常使用生理盐水，除了其相对较低的电流阻抗外，还 因为它能为大多数细胞提高最适合的环境。然而， 一般电穿孔受到其电能阻抗 的限制。因此，多孔板，例如标准的96-孔阵列板通常部分受电击，例如一次 每列8孔直到12列都受到电击。
生产商美国马塞诸塞州豪利斯顿的哈佛设备有限公司BXT器械部(BTX
Instrument Division, Harvard Apparatus, Inc., Holliston, Massachusetts, USA)提供 了一种高通量电穿孔仪，其设计为电击8X12阵列的96-孔板。该电穿孔仪在 国际专利申请PCT公开第WO 2004/050866 Al中描述，其内容参考结合于此。 WO 2004/050866 Al中描述的微孔板被构造成带有矩形孔，具有镀在各个孔壁
上的电极。 一列8孔一侧上的所有电极共同连接于沿各列通过导线连接的镀敷
迹线，同一列中孔的另一侧上的电极类似地共同连接。相应的电极连接存在于
所有12歹iJ。然而，由于8个平行孔的低电阻，以及由于可获得的最大电容器 的电容约为3200mfd，同时电击8个孔将最大时间常数限制为约20msec、电阻 负载约为6.25 ohms。在许多方案中，电击所有96个孔需要IO分钟。通过将 板降低到板支架内，使支架中的电导线与板中各个电极之间形成电接触，并使 连接于12列各列的内部驱动器或继电器按顺序连通外部电源，从而实现向板 的电能供应。然后按顺序向电极传递电脉冲。96-孔板和25-孔板使用相同大小 和间隔的矩形孔，所有电导线和连接件位于形成板基部的"固体底板"中。这 限制了孔的使用并剥夺了电穿孔仪的多功能性。
发明概述
本发明涉及一种争对现有技术进行改良的电穿孔板，该装置仅需通过与盖 子中、而不是在板本身中或支持板的底板中的电导线相接触即能形成电连接。 虽然电极位于孔内部，作为孔壁上的衬垫或作为浸渍在孔内部容积中的板或挡 板，但是与盖子中电导线的连接通过向孔外区域延伸的电极延伸件来实现。在 某些实施方式中，这些延伸件是侧向接触区域，如上边框或边缘或各孔中的垫 片、垫肩或平台，而在其他实施方式中，这些延伸件是从各孔垂直向上凸起的 电极上边缘。在所有情况下，使延伸件暴露以用于接触盖子下面的相对导线， 盖子通过盖子中的电连接件连接电源。在一组实施方式中，孔内部的电极是在 孔相对壁上的镀敷区域，而在另一组实施方式中，电极是从孔壁凸出而深入孔 内部空间的挡板。在优选的实施方式中，釆用三个或更多个挡板，虽然优选四 个或五个挡板，交替的挡板连接不同电极，即奇数挡板连接负电极，偶数挡板 连接正电极。在又一组实施方式中，电极是横跨整个孔宽度的薄板。这种薄板 优选三个或更多个，最优选为偶数，例如四个或更多个。在具有垂直向上延伸 件的薄板的例子中，盖子优选包含用于各个板的独立接触片。当电极是长度小 于孔宽度的挡板，或使用横跨孔宽度的薄板时，相邻的电极紧密间隔而只形成 狭窄间隙，因而在相对电极间提供高电压梯度而不增加板的总电压。在某些实 施方式中，无论电极被构造成壁衬垫、挡板或是薄板形式，它都能在各孔底部
上方的一个较短距离内终结，从而可以沿粘附细胞的底部来容纳粘附细胞，而 不必在粘附细胞和电极之间有直接接触。
通过将孔中电极置于板中而将电源电导线设置在盖子中实现前者与后者 的分离能以多种方式赋予电穿孔仪多功能性。对于给定的板，可选用多种盖子， 各个盖子提供不同的电击孔的方案，或者不同的盖子电击不同数量的孔，不同 组的孔，或同时实现这两种作用。盖子中的环路可被构造成以组的形式电击各 孔，各个组构成板中孔总数的一部分，并且电击可以预定顺序进行。电穿孔仪 还可包含计算机或算法，根据协议单独电击各组的孔，对于各组来说，该协议 根据波形、电压、电容、电阻、或这些参数的组合、以及诸如冲动持续时间、 幅度和频率等参数的其他参数而有所不同。对于给定的盖子，可以选用多种板， 各板具有不同的尺寸、不同排列或这两者都不同的孔，并具有不同数量和排列 的暴露接触区域。电穿孔仪还可包括没有电路或电连接件的空白盖子，用于储 存、运输和操作者操控的目的。
下面将更详细地解释这些和其他目的、特征及优点。


图1是本发明电穿孔仪的立体图。
图2是图1所示电穿孔仪的孔板的一部分的俯视图。
图3是来自图2所示孔板的一个孔的电极的立体图。
图4是图l所示电穿孔仪下侧的立体图，显示了盖子的拐角部分。
图5是从顶部穿过盖子看去，图1所示电穿孔仪盖子下侧上的电路的平面图。
图6是从顶部看去，图1所示电穿孔仪盖子顶侧上的电路的平面图。
图7是本发明电穿孔仪可选形式的孔板的立体图。
图8是图7所示孔板的一个孔的俯视图。
图9是沿线9-9得到的图8所示孔的截面图。
图IO是本发明第三种电穿孔仪的孔板的俯视图。
图ll是图IO孔板的一个孔的立体图。
图12是包括图IO所示孔板的电穿孔仪的盖子中的电路的示意图。
发明详述及优选实施方式的描述
术语"一"旨在表示"一个或多个"。术语"包括"及其变化形式、如"包 含"和"含有"，当在对步骤或元件叙述之前时，旨在表示附加其它的步骤或 元件是任选的而不是排他性的。本说明书引用的所有专利、专利申请和其他出 版的参考资料全部以参考的方式结合于此。本文所引用的任何参考资料与本说 明书明显公开之间的任何不一致旨在有利于本说明书内容的解释。这包括本领 域已知字词句与本说明书中清楚指出的相同字词句之间的任何不一致。
虽然限定本发明的特征能够实现各种结构，但通过具体实施方式
的详细说 明能更好地全面理解本发明。附图显示了一些实施方式。
图1描绘了本发明电穿孔仪的电穿孔孔板101和盖子102。板101含有标 准12X8阵列的96孑L，盖子102包含电导线104，电导线104下表面暴露以实 现与板上表面上的导线接触区域的电接触。
图2和3分别是孔板101的上表面201的一部分的放大图以及一个孔的电 极对202、 203的立体图。图2可见孔103的开口。孔为矩形，各孔具有通过 将导电金属镀敷到壁表面上而在孔的相对壁上形成的一对电极202、 203。镀敷 延伸超出壁的上边缘，而在板的上表面201上形成侧向接触区域204、 205。图 3显示除接触区域204、205之外，各个电极还分别在其每个上拐角处具有缺口 ， 即拐角切口，两个电极共具有四个缺口 301、 302、 303、 304。这些缺口使镀敷 的电极在孔顶部的宽度比孔内部的宽度要窄。顶部宽度较窄使相邻孔的接触区 域204、 205之间的间隔宽度较宽，从而防止在各孔之间形成电弧。
图4是盖子102的下表面401的放大图。虽然图4未示出盖子中的电导线， 但盖子的下表面被铸造形成向下开口的倒置矩形壳体402的阵列， 一个壳体对 应于孔板101中的各个孔(图1)。各个壳体的功能表面是壳体侧壁405、 406的 下边缘403、 404。这些下边缘403、 404上镀有导电金属，通过盖子中的连接 导线(未示出)对其提供电源，并且这些下边缘403、 404被设置成分别与孔板 101中电极的接触区域204、 205(图2和3)直接相对。当盖子102在孔板101 上方下降时，与各孔中的电极发生电接触，壳体402覆盖在孔的顶部。为了提 高与孔板上的接触区域的接触，壳体402的镀敷边缘403、 404可任选地具有
网格形状、褶皱形、或交叉网纹外形的表面。各个壳体的端壁407、 408的垂 直长度比侧壁405、 406要小，以在各个壁的两端沿上缘形成小的开口。这些 开口允许电穿孔期间气体进出孔，从而平衡任何孔与其外部之间可能发生的任 何压力差。
在附图所示的实施方式中，盖子中的电导线分布在盖子下表面和顶面之 间。下表面201上电导线的排布如图5所示，而顶面上的排布如图6所示。但 两种排布都通过盖子顶部观察，以便于理解电能如何分布到孔阵列的所有孔 中。
图5显示了每列有8 L，孔一侧上的所有电极通过侧向迹线501相互连接 并沿板的中线连接至共用迹线502。中线迹线502的两端在板的外侧边缘(分 别是前侧和后侧边缘)处连接COM垫片503、 504。对于各列8孔中的4个孔， 另一侧上的电极也通过侧向迹线505相互连接，各自沿板的一侧边缘连接至接 触片506。 COM垫片503、 504允许单独激活各8孔的列，而独立接触片506 则允许单独激活它们所连接的各4孔的列。
图6代表板顶面上的电路，显示用于其余电极的配线，即在每列8孔最左 侧的4个孔中的相对电极。这里，在板下侧的电路中，给定列中剩余的最左侧 的4个孔通过迹线601连接，各组4孔各自在板的前侧和后侧边缘上连接于接 触片。最后面6列的迹线在后侧边缘终结于接触片602，而前面6列的迹线在 前侧边缘终结于接触片603。虽然盖子上与板接触的接触区域都在盖子的下表 面上，这些区域与盖子顶面上迹线之间的连通可通过镀敷通孔或其等效形式来 实现，以减少不同迹线组之间的干扰。图5和6所示排布能够按照外部控制器 所编程的顺序电击各个4孔组。
图7、 8和9显示了本发明实施中使用的电穿孔板的替换实施方式。图7 的孔板701包含24个孔702，显示为从板上表面向上凸起的柱形形式，但也可 以是在板的表面向下延伸的板中凹陷。所示孔的形状为圆柱形，但也可以是方 形或矩形或其他形状。图8是一个孔702的俯视图，显示该孔含有一系列的挡 板801，挡板801相互平行，其间隔足以允许孔中悬浮的细胞或其他膜相结构 自由通过叶片间的空间。挡板801起电极作用，各挡板在两侧镀敷有导电金属。 挡板电连接于从各孔的上轮缘向外侧向延伸的导电翼片802、 803，各翼片形成
水平平台，用作盖子中电接触片的接触区域。挡板以交替方式连接于翼片802、 803，即奇数挡板连接于一个翼片而偶数挡板连接于另一个翼片，从而实现用 交替电极电荷一个接一个地激活挡板。虽然在附图所示的实施方式中每孔包含 5个挡板，挡板数量可变化一直到孔所能容纳的数量。在优选的结构中，在边 缘处提供空间以允许吸管尖端的插入。或者，可将中央挡板设计成包括中空垂 直肋，以用于插入吸管尖端。图9的截面图显示，该具体实施方式
中的挡板801 终结于其下部末端，该下部末端离开孔的底部902上方一个较短距离901。该 距离能够确保在保持细胞不接触挡板的条件下实现对孔底部的细胞(或通常膜 相结构)的清除，包括粘附细胞。通常考虑的距离901是l-2毫米，但也可以较 大，最佳距离可由实验确定。
虽然未显示图7、 8和9所示孔板的盖子，但可设计类似于图1和4所示 盖子102的盖子，相应的接触区域符合孔板的接触区域802、 803。
图10、 11和12显示了孔板和盖子的另一实施方式。图10是孔板1001 的俯视图，其包含12个孔1002，虽然也可使用相应的24孔、96孔或任意其 他数量相同类型的孔的板。板中的孔为圆形，但如上述实施方式所示，它们也 可以是方形、矩形或其他形状，它们可以是从板表面向上延伸的圆柱形，或板 主体中的凹陷。这些孔中的电极是一系列金属薄板1003，如图11所示，这些 金属薄板超出各孔的外周上方一小段距离。沿板的凸起的上边缘而不是通过在 孔轮缘附近侧向延伸的接触区域来实现与板的电接触。板的向上凸起有利于该 接触。如图7、 8和9的实施方式中所示，板没有延伸至孔的底部1004，而是 在底部上方离开一小段距离而终结，以便于清除孔底部的细胞。图12描绘了 盖子1201，显示了轨道形式的迹线1202，该迹线将与向上凸起的电极板边缘 接触。盖子1201可被构造成印刷电路板，可通过本领域已知的任何常规镀敷 方法在该印刷电路板上镀敷迹线。还显示盖子中将轨道连接于盖子边缘处的连 接件1204的各个电导线1203。
在上述所有实施方式中，盖子可被构造成牢固匹配在孔板上，从而保持盖 子与板之间的适当接触对齐，并防止盖子滑脱。例如这可通过在盖子外周周围 形成裙边，或者形成与板上凸起的外周脊相匹配的凹槽，或者任何类似构型来 实现。其他构型是本领域技术人员容易明白的。盖子中的迹线可被制造成插入盖子的模块模式。
作为图11所示构型的变化形式，金属薄板1003凸起的上缘可被逐渐变细 的延伸件所代替，例如终结于一点的梯形延伸件或部分，图12的导轨1202可 被郁金香型接触片或类似的弹性抓持接触片所代替。然后通过将盖子1201压 制到孔板1001上来制备电连接。
虽然上述内容描述了附图所示部分的各种可选方式，但其他可选方式也是 本领域技术人员所明白的，并且包括在本发明的范围内。
权利要求
1. 一种对多个样品进行电穿孔的电穿孔仪，所述电穿孔仪包括包括多个孔的板，所述孔具有向上导向的开口和附连于所述孔内部的电极，所述电极具有超出所述开口的延伸件以提供接触区域；和具有电路的盖子，所述电路终结于暴露导线，所述导线被排布成使得当所述盖子闭合到所述板上时与所述接触区域形成电连接。
2. 如权利要求1所述的电穿孔仪，其特征在于，所述电路被构造成独立地并以预定的顺序激活各组孔中的所述电极，每一组构成所述多个孔的一部分。
3. 如权利要求1所述的电穿孔仪，其特征在于，所述电路被构造成激 活所述各组孔中的电极，每一组构成所述多个孔的一部分，所述电穿孔仪 还包括编程装置，以根据协议单独激活各组孔，所述协议在所述各组之间 根据从波形、电压、电容和电阻中选取的至少一个参数而各不相同。
4. 如权利要求1所述的电穿孔仪，其特征在于，所述电穿孔仪还包括 没有电路的空白盖子，所述空白盖子和所述具电路的盖子是可以互换的。
5. 如权利要求1所述的电穿孔仪，其特征在于，所述电极沿所述各个 孔的相对侧排列，所述延伸件是沿所述上缘的水平接触区域。
6. 如权利要求5所述的电穿孔仪，其特征在于，所述电极沿所述上缘 的宽度比所述孔的内部窄，以防止相邻电极间形成电弧。
7. 如权利要求5所述的电穿孔仪，其特征在于，所述盖子的下表面形 成向下开口的壳体，所述壳体具有侧壁和端壁，所述侧壁的边缘面与所述 接触区域互补，所述边缘面为导电材料。
8. 如权利要求7所述的电穿孔仪，其特征在于，所述端壁比所述侧壁短。
9. 如权利要求1所述的电穿孔仪，其特征在于，所述电极包括多个延 伸到所述各个孔内部的挡板，连续的挡板形成为奇数和偶数叶片，所有奇 数挡板连接于从所述孔的上缘向外延伸的共用第一水平平台，所有偶数挡 板连接于与所述第一水平平台相对地从所述孔的上缘向外延伸的共用第二 水平平台。
10. 如权利要求9所述的电穿孔仪，其特征在于，所述孔具有底板，所述挡板下缘在所述底板上方终结。
11. 如权利要求9所述的电穿孔仪，其特征在于，所述板具有上表面， 所述孔是从所述上表面向上延伸的柱形。
12. 如权利要求1所述的电穿孔仪，其特征在于，所述电极是安装在 所述孔内部的平行板，所述延伸件是在所述开口上方垂直延伸的所述板的 一部分。
13. 如权利要求12所述的电穿孔仪，其特征在于，所述电穿孔仪中每 孔至少包括三个所述电极。
14. 如权利要求12所述的电穿孔仪，其特征在于，所述电穿孔仪中每 孔至少包括四个所述电极。
15. 如权利要求12所述的电穿孔仪，所述暴露导线是与所述延伸件数 量相等且长度基本上相等的轨道。
16. 如权利要求12所述的电穿孔仪，其特征在于，所述孔具有底板， 所述电极的下缘在所述底板上方终结。
全文摘要
一种高通量电穿孔的电穿孔仪，它被构造成具有孔板，孔板中每个孔具有内部电极，电极延伸超出孔的开口以形成接触区域，或者为从孔脊侧向延伸的水平平台，或者是电极薄板的延伸高度形式。电穿孔仪还包括盖子，盖子包括与孔板中的暴露接触区域相匹配的电路和电接触片。盖子的可互换性能实现根据不同协议电击各孔。
文档编号C12M1/42GK101384697SQ200780005145
公开日2009年3月11日 申请日期2007年1月26日 优先权日2006年2月10日
发明者C·W·拉格斯戴尔, J·M·福勒, N·R·斯蒂芬斯 申请人:生物辐射实验室股份有限公司