专利名称：：能够生产γ-氨基丁酸的乳酸菌的制作方法
技术领域：
：本发明涉及属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)的乳酸菌，它们即使在培养开始时培养基中存在乳酸的情况下也能够生产Y-氨基丁酸(在后文称为"GABA")，并还涉及了使用它们生产含有Y-氨基丁酸的培养混合物的方法。
背景技术：
：GABA是一种目前受到关注的氨基酸，因为它具有生理学效应例如降血压效应、利尿效应和镇定效应。由于含有GABA的食物仅限于一些蔬菜、茶、稻米等，并且其含量也低，因此提出了一些使用GABA发酵乳酸菌生产GABA的方法(例如参见专利参考文献1到3)。作为这样产生GABA的乳酸菌来说，已知的有希氏乳酸杆菌(Lactobacillushilgardii)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcuslactissubspeciescremoris)、乳酸孚L球菌乳酸亚禾中(Lactococcuslactissubspecieslactis)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短孚L酸杆菌(Lactobacillusbrevis)、植物乳酸杆菌(Lactobacillusplantamm)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)等，它们具有从L-谷氨酸或L-谷氨酸盐通过脱羧反应生产GABA的能力。但是，因为这些乳酸菌在培养基中需要昂贵的成分例如乳清粉、脱脂奶、酪蛋白和蛋白胨，因此从成本的角度来说生产力不好(例如参见专利参考文献1或4)。此外，当用酸降解或用酶或酒曲降解廉价的原料酱油曲或麦麸、并用谷氨酰胺酶将洗脱的谷氨酰胺转化为用作培养基的谷氨酸时，通过中和产生的食盐或在酶法降解时作为抗污染对策加入的食盐抑制了乳酸菌生产GABA。尽管已经报道了几种生产GABA的耐盐乳酸菌，但GABA发酵的最适食盐浓度非常高，从12.5%到18%的盐度(例如参见专利参考文献5)。当考虑到提倡有意低氯饮食的饮食生活以避免与生活方式有关的疾病时，食盐含量高的食品和调味剂是不合乎需要的。此外，由于GABA有预期降血压的活性方面，将它与高的食盐浓度相组合就失去了原本的意义。根据上面的描述，对于使用乳酸菌生产GABA来说，尽管使用廉价的原料例如酒曲和麦麸、通过在低食盐浓度下将其降解是理想的，但低食盐浓度引起了由野生菌株造成污染的问题。污染发生在培养的早期阶段，并且当由此引起了乙醇的产生或pH的降低时，生产GABA的乳酸菌的生长受到了抑制。从而不能获得足够量的目的GABA。作为在低食盐浓度下防止被这些野生菌株污染的手段，使用一般经常用作食品防腐剂的乙醇、乙酸和乳酸是一种方法。但是，尽管乙醇和乙酸抑制了污染物，但它们也抑制了生产GABA的乳酸菌。另一方面，因为乳酸菌自身产生乳酸，它们比其它细菌对乳酸具有更高的抗性。因此，尽管本发明的发明人已经考虑到了使用乳酸作为防腐剂，但又出现了新的问题，即当乳酸在存在食盐的情况下在培养开始时加入的话，生产GABA的乳酸菌不能够生长，或是能够生长但不产生GABA。专利参考文献1专利参考文献2专利参考文献3专利参考文献4专利参考文献5JP-A-2000-210075JP-A-2004-215529JP-A-2005-102559曰本专利No.3426157日本专利No.2704493发明公开内容本发明要解决的问题本发明的问题是提供能够在培养开始时在培养基中共同存在乳酸和食盐的条件下生产GABA的乳酸菌，以及提供生产含有GABA的培养混合物的方法。解决问题的手段为了解决上面提出的问题，本发明的发明人进行了广泛的研究，结果发现可以通过从未精制的酱油中分离乳酸菌来解决问题，该乳酸菌即使是在培养开始时共同存在乳酸和食盐的条件下也能够产生GABA，并使用它实现了本发明。就是说，本发明涉及下列(l)到(4):(1)属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)的乳酸菌，其能够在培养开始时在培养基中共同存在乳酸和食盐的条件下产生，氨基丁酸；(2)属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)的乳酸菌，其能够在培养开始时在培养基中共同存在1%到4%乳酸和8%到12%食盐的条件下产生Y-氨基丁酸；(3)上面(1)或(2)中的乳酸菌，其中所述乳酸细菌是凝乳酶乳酸杆菌(Lactobacillusrennini);以及(4)含有"氨基丁酸的培养混合物的生产方法，其中在上面的(l)到(3)任何一个中描述的乳酸菌在接种到含有L-谷氨酸和/或其盐的培养基中之后进行培养。发明效果根据本发明，可以提供使用廉价原料、在发酵不会被野生菌株引起抑制的情况下稳定地生产GABA的方法。附图简述图1显示了凝乳酶乳酸杆菌菌株KG34、KG43、Sl、KG31、KG64、KG-18-4和KG4-14-1的分子系谱树。本发明的最佳实施方式本发明中涉及的乳酸菌是属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)的菌株，例如可以使用从未精制的酱油中分离的乳酸菌。本发明的乳酸菌具有在培养开始时在培养基中共同存在乳酸和食盐的条件下产生GABA的能力，并可以在共同存在1%到4%乳酸和8%到12%食盐的条件下生产GABA。优选乳酸菌是凝乳酶乳酸杆菌，乳酸菌的例子包括凝乳酶乳酸杆菌菌株KG34、凝乳酶乳酸杆菌菌株KG43等。凝乳酶乳酸杆菌菌株KG34于2006年2月7日保藏于国家技术与评估石开究所(NITE)(NationalInstituteofTechnologyandEvaluation)的NITE专利微生物保藏部(NPMD)(NITEPatentMicroorganismsDepositary)(邮政编码292-0818;2-5-8，KazusaKamatari,Kisarazu，Chiba,Japan))(保藏号NITEP-177)，并且已经根据布达佩斯公约于2006年9月1日转移到国际保藏单位(InternationalDepositaryAuthority)(保藏号NITEBP-177)。同样，凝乳酶乳酸杆菌菌株KG43也已经根据布达佩斯公约于2007年1月31日国际保藏于国家技术与评估研究所(NITE)(NationalInstituteofTechnologyandEvaluation)的NITE专利微生物保藏部(NPMD)(NITEPatentMicroorganismsDepositary)(邮政编码292-0818;2-5-8,KazusaKamatari,Kisarazu,Chiba，Japan))(接受号NITEABP-309)。从未精制的酱油中分离乳酸菌按照下面的方法进行。即对25克未精制的酱油进行消化处理，取适量这样获得的液体加入到装在德汉(Durham)试管中的MRS-SOYTONE培养基中(5.5%MRS肉汤，0,5%细菌大豆蛋白胨，0.5%谷氨酸钠，8%食盐，5%食品添加剂乳酸，pH5.1)，在30。C进行静置培养。将证实了在德汉试管中产生了气体的培养基用MRS-SOYTONE培养基适当稀释，铺展在MRS-SOYTONE琼月旨培养基上，然后在AnaeroPackKenki(MitsubishiGasChemicalCo.，Inc)中于30°C培养7天。将这样获得的单个菌落再次接种到装在德汉试管中的MRS-SOYTONE培养基中，并选择被证实产生了气体的菌株。通过上述方法分离到了7株菌株KG34、KG43、Sl、KG31、KG64、KG-18-4和KG4-14-1。在这7株菌株中，检査了KG34和KG43这两株菌株的细菌学性质，结果显示在表1中。作为比较性的对照，作为凝乳酶乳酸杆菌标准菌株的凝乳酶乳酸杆菌DMSZ20253的数据也描述在其中。可以看出，标准菌株凝乳酶乳酸杆菌DMSZ20253不产生GABA，因为它不具有谷氨酸脱羧能力。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*w:弱但是+此外，通过下面的方法测定了本发明的凝乳酶乳酸杆菌菌株KG34、KG43、Sl、KG31、KG64、KG-18-4和KG4-14-1的乳酸菌的16SrDNA(16SrDNA基因)的完整的核苷酸序列。每种乳酸菌凝乳酶乳酸杆菌菌株KG34、KG43、Sl、KG31、KG64、KG-18-4和KG4-14-1被接种到MRS-Soytone培养基中(MRS肉汤5.5%,大豆蛋白胨0.5°/。，NaCl8%，谷氨酸钠0.5%，pH5.1)，在30°C培养4天。使用GenTorukun(用于酵母)(TakaraBio)提取基因组DNA。16SrDNA的完整区域被分成三个片段，使用所提取的基因组DNA作为模板通过PCR来扩增。通过对相应的片段进行测序并将它们连接，获得了完整区域的序列。使用Takam热循环仪MP作为热循环仪，和ABIPrism377DNA测序仪(AppliedBiosystems)被用作DNA测序仪。这样获得的相应的16SrDNA核苷酸序列被显示在SEQIDNO:l和2中。从获得的16SrDNA核苷酸序列对被认为与该细菌近缘的物种进行了同源性检索。使用16SrDNA核苷酸序列用近缘物种通过邻近连接方法(neighborhoodconnectingmethod)制备了分子系谱树。进行了近缘物种和指派分类组的研究。作为通过NCBIBLAST进行检索的结果，该细菌与凝乳酶乳酸杆菌的16SrDNA显示出最高的同源性(大约99.5%)，并在分子系谱树中形成了同样的凝乳酶乳酸杆菌簇。根据结果判断该细菌是凝乳酶乳酸杆菌。这样制备的系谱树显示在图1中。尽管本发明的乳酸菌具有在不存在食盐和乳酸的情况下从L-谷氨酸和L-谷氨酸盐生产GABA的能力，但它即使在培养开始时在培养基中共同存在1%到4%乳酸和8%到12%食盐的条件下也能够产生GABA(参见实施例2)。此外，除了在培养开始时之外，它能够在培养基中共同存在0到4%的乳酸和0到12%食盐的条件下产生GABA。本发明的生产含有GABA的培养混合物的方法是通过将具有上面提到的性质的乳酸菌接种到含有L-谷氨酸和/或其盐的培养基中、并对其进行培养以生产含有GABA的培养混合物的方法。当乳酸细菌被用于本发明时，尽管使用了从未精制的酱油中分离、培养和亚培养的物种，但未精制的酱油中包含的该同样的物种也可以直接或通过重新分离来使用。此外，可以使用冷冻干燥的细胞、低温保存的菌株和液体培养肉汤中的任何一种。为了产生GABA，在本发明使用的培养基中必需含有谷氨酸。当谷氨酸被包含在培养基中时，尽管L-谷氨酸作为一种氨基酸在化学上是优选的，但是它可以是作为具有调味剂用途的食品添加剂的谷氨酸或谷氨酸钠、其它的谷氨酸盐和通过用酸或酶水解食物蛋白而获得的谷氨酸的任何一种。此外，含有游离谷氨酸的食品例如调味品、加工过的海产品和西红柿也同样可以使用。就此而言，在获得含有更大量GABA的培养混合物时，需要使用含有更大量谷氨酸的培养基。另外，除了上面提到的谷氨酸之外，对于乳酸菌的生长来说，在本发明中使用的培养基优选还含有至少一种糖类例如葡萄糖、果糖和麦芽糖、含有维生素和矿物质的食品例如酵母提取物和肉类提取物、或酒曲和酒曲消化物。此外，食品添加剂例如乳化剂、稳定剂和pH调节剂也可以使用。可以用于培养基的酒曲和酒曲消化物的例子包括，使酒曲真菌或酒曲真菌的酶与一种或两种或多种选自谷类例如小麦、大麦、黑麦、珍珠麦、压碎的小麦或大麦、奎藜籽、粟、稗、黍、稻米和玉米以及豆类例如大豆、赤豆、芸豆、羽扇豆、玻璃豆(glassbean)、扁豆的变性处理过的原料进行反应而制备的蛋白水解产物。酱油、未精制的酱油、味噌、豆类等的蛋白水解产物等是优选的。使用含有谷氨酸源、食盐和碳源、起始pH为4.0到7.0的培养基，将上面提到的能够产生GABA的凝乳酶乳酸杆菌在25到35°C下培养48到96小时，并将获得的乳酸菌种子培养物以主培养基体积的大约1/1,000到1/10的体积进行接种，由此进行了本发明的乳酸菌的接种。尽管对于可以用于本发明培养的装置的大小和材料的质量没有限制，只要它可以清洗和热灭菌并能够用于生产食物就行，但是优选它具有卫生的结构，使得它难以被各种病菌污染。对于培养条件来说，基于乳酸菌的细菌学性质(参见表l)，培养温度从20到40。C，优选从25到35。C，起始pH优选从4.0到7.0。对于培养时间来说，必需进行足够长的时间，使得谷氨酸源例如L-谷氨酸和/或其盐可以被转化成所需浓度的GABA。例如从1到4周的时间是优选的。通过这种方式，可以获得含有GABA的培养混合物，它作为被加工的食品等的原材料具有广泛的应用。例如，使用通过本发明的方法获得的含有GABA的培养混合物作为GABA强化原料直接添加到各种不同调味品和食品和饮料中，也是可能的。此外，也可以通过处理步骤例如压縮、过滤、浓縮和干燥以增加GABA的含量来使用它。对于上面提到的过滤步骤来说，可以使用用于食品加工用途的一般压滤装置来进行，所述装置使用了滤器、滤布等，并可以使用用于食品用的助滤剂例如硅藻土、纤维素和活性炭。对于浓縮步骤来说，可以使用装置例如真空浓縮器、减压浓縮器、蒸馏釜和冷冻浓縮器，也可以使用培养混合物中的水分通过简单加热而蒸发的方法。另外，对于干燥步骤来说，优选通过有效和卫生的方法进行喷雾干燥或冷冻干燥。此外，为了获得其中GABA含量进一步增加的培养混合物，除了上面提到的步骤之外还可以使用液相层析或方法。通过这样处理含有GABA的培养混合物，可以获得含有GABA的液体和粉末食品。通过将它们配制成各种不同的食物中或对它们进行二次加工，可以容易地获得其中强化了GABA的调味剂或食品和饮料。在二次加工中，可以包含通常用于食品中的成分，例如赋形剂、甜味剂、增稠剂、蛋白、肽、脂类、多糖、糖和盐。就此而言，在这样获得的培养混合物和补充了培养混合物的调味品和食品和饮料中测定GABA的含量，可以使用用于分析的仪器例如高效液相色谱和氨基酸分析仪、使用酶的分析试剂等来进行。尽管下面将参考实施例对本发明进行进一步详细的描述，但本发明不限于此。实施例实施例1<乳酸菌的获得>从各种种类的发酵食品收集适当量的待测样品，并将适量的每种样品加入到装在德汉试管中的MRS-SOYTONE培养基中(5.5%MRS肉汤，0.5%细菌大豆蛋白胨，0.5%谷氨酸钠，8%食盐，5%食品添加剂乳酸，pH5.1)，在30。C进行静置培养。将被证实在德汉试管中产生了气体的培养基用MRS-SOYTONE培养基适当稀释，铺展在MRS-SOYTONE琼脂培养基上，然后在AnaeroPackKenki(MitsubishiGasChemicalCo.，Inc)中于30°C培养7天。将这样获得的单个菌落再次接种到装在德汉试管中的MRS-SOYTONE培养基中，测量被证实产生了气体的样品中的GABA。就此而论，从同样的分离源分离到的菌株进行分别的鉴定，以避免选择两个或多个同样的菌株。GABA通过Hitachi,Ltd.制造的高效氨基酸分析仪L-8800进行测量。结果表明菌株KG34、KG43、Sl、KG31、KG64、KG-18-4和KG4-14-1都产生GABA。就此而论，菌株KG34和菌株KG43的生理学性质被显示在表1中，菌株KG34和菌株KG43的16SrDNA序列被显示在SEQIDNO:l和2中。菌株KG34和菌株KG43的16SrDNA序列彼此之间100%—致。实施例2<盐抗性和乳酸抗性的证实>在装在德汉试管中的MRS-Soytone培养基(5.5%MRS肉汤，0.5^大豆蛋白胨，0.5n/。谷氨酸钠，pH5.1)的基础上，使用其中食盐被改变到8%或12%、食品添加剂乳酸改变到0%、1%或4%的培养基，在食盐和乳酸在培养开始时存在于培养基中的条件下，证实了菌株KG34、KG43、Sl、KG31、KG64、KG-18-4和KG4-14-1的GABA生产力。此外，在该情况下，进行了与常规已知的产生GABA的乳酸菌的比较，结果显示在表2中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例3〈含有GABA的培养混合物(调味品)的生产方法>通过在70克小麦麦麸和IOO克酱油曲中加入160ml温水，在其中再加入通过对无名假丝酵母(Candidafamata)km-1(FERMP-8897)进行36个小时的通气搅拌培养(培养基组成葡萄糖6%,酵母提取物1%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.1%，pH5.5，培养温度30。C)获得培养液5ml作为谷氨酰胺酶，在50°C下用24小时进行麦麸的降解和将降解形成的谷氨酰胺转化为谷氨酸。在向这样获得的降解产物中加入食盐到终浓度8%并进一步加入食品添加剂乳酸到终浓度1%、接着将温度降低到30。C之后，以大约1(^个细胞/ml的密度接种凝乳酶乳酸杆菌菌株KG34或菌株KG43,在30°C下轻柔搅拌培养7天。将每个这样获得的培养混合物过滤以获得澄清的液体。接种有菌株KG34的培养液体的GABA含量是13.0mg/ml，在KG43的情况下是19.5mg/ml。作为对照，尽管使用了常规已知的产生GABA的菌株短乳酸杆菌NBRC3345进行了同样的试验，但最终获得的澄清液体中GABA的浓度是2.0mg/ml。因此，没有进行充分的GABA生产。尽管已经参考具体的实施方案对本发明进行了详细的描述，但对于本
技术领域：
的专业技术人员来说，显然可以对其进行各种不同的改变和修饰而不背离本发明的精神和范围。本申请基于2006年2月21日提交的日本专利申请(日本专利申请No.2006-043836)，其全部内容在此引为参考。所有在此引用的参考文献整体引为参考。工业实用性根据本发明，可以提供使用廉价的原料而没有野生菌株对发酵造成抑制的情况下稳定地生产GABA的方法。权利要求1.属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)的乳酸菌，其能够在培养开始时在培养基中共同存在乳酸和食盐的条件下产生γ-氨基丁酸。2.属于乳酸杆菌属的乳酸菌，其能够在培养开始时在培养基中共同存在1%到4%乳酸和8%到12%食盐的条件下产生"氨基丁酸。3.权利要求1或2中的乳酸菌，其中所述乳酸菌是凝乳酶乳酸杆菌(Lactobacillusrennini)。4.生产含有y-氨基丁酸的培养混合物的方法，其中将权利要求1到3任何一个所描述的乳酸菌在接种到含有L-谷氨酸和/或其盐的培养基中之后进行培养。全文摘要本发明提供了即使在培养开始时在培养基中共同存在乳酸和食盐的条件下仍然能够生产γ-氨基丁酸(GABA)的乳酸菌，以及生产含有GABA的培养混合物的方法。具体来说，可以通过从未精制的酱油中分离即使在培养开始时在培养基中共同存在乳酸和食盐的条件下仍然能够生产GABA的乳酸菌凝乳酶乳酸杆菌(Lactobacillusrennini)，并在将乳酸菌接种到含有L-谷氨酸和/或其盐的培养基中之后对其进行培养，来获得含有GABA的培养混合物。文档编号C12P13/00GK101389751SQ20078000622公开日2009年3月18日申请日期2007年2月21日优先权日2006年2月21日发明者下条亮,佐藤五雄,半谷吉识申请人:龟甲万株式会社