调节免疫应答的方法和试剂的制作方法

专利名称：调节免疫应答的方法和试剂的制作方法
调节免疫应答的方法和试剂
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本申请案主张于2006年2月21日提交的美国临时专利申请案No. 60/774,614的优先权， 其全文以参考的形式并入本文。
联邦政府资助研究声明
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)基金No. CA108609的资
助下，得到美国政府支持而完成的。美国政府拥有本发明的某些应得权利。
背景技术：
适应性免疫系统T细胞监测在所有体内细胞中是否存在致病蛋白。因为这个因素，由蛋 白酶体生成的肽被呈递到MHCI类分子上，其可通过CD8+T细胞识别，而溶酶体降解 产物被呈递到MHCII类分子上，其可通过CD4+T细胞识别。被呈递到MHCII类分子 上的抗原一般是外源性蛋白，其被位于分泌系统中的抗原呈递细胞(APC)或内源性蛋 白吞噬。但是，分析从MHCII类分子洗脱下来的肽，人们得知大部分的天然MHCII类 配体(多达20%)是来自胞质蛋白和核蛋白。另外，有证据表明。04+ T细胞可识别内 源性处理之后的胞质抗原和核抗原，例如，胞质麻疹病毒和A型流感病毒可内源性处理 用于MHCII类呈递。相应地，内源性MHCII类呈递已被描述为可用于其他病毒性抗原、 自体抗原、模式抗原以及肿瘤抗原。所以，拓扑结构上隔离于内体系统的抗原可进入MHC II类抗原呈递途径并拓宽MHC II类配体谱。
已经讨论了内源性MHCII类抗原呈递的不同处理途径。最近，已经证明自体吞噬能将胞 质抗原和核抗原传递到MHC II类分子上。其中，在生理水平上发现，EB病毒(EBV) 核抗原l (EBNA1)，在巨自噬降解之后，作为第一病原性抗原，在EBV转化的B细胞 系的MHC II类分子上呈递。
自噬由真核细胞中普遍分布的至少三种细胞内蛋白降解途径构成，巨自噬、微自噬和分 子伴侣介导的自噬。有关内源性MHCII类抗原处理的大量证据已经暗示了巨自噬途径。 在巨自噬降解过程中，将包括细胞器在内的胞浆物质包裹在双膜包覆的自噬体内，其随 后与核内体和溶酶体融合。然后，自噬体包裹的内容物被溶酶体水解酶分解，降解产物 由细胞回收。
这个途径的运行在理论上，使得进入MHC II类呈递途径的手段被当作提高免疫应答的手 段，尽管目前这一手段还是未知的。

发明内容
在一个实施例中，提供一种核酸，其编码相关肽或蛋白，该核酸在编码框内与另一种核 酸融合，后者编码自噬体LC3蛋白，或其功能性片段，其中所述相关肽或蛋白在主要组 织相容性复合体(MHC) II类分子上的呈递不够理想或根本未予有效呈递。
在另一实施例中，该核酸拥有一个与SEQIDNO: 1同源或对应的序列。在另一个实施例中，相关肽或蛋白经病毒编码，并且在一个实施例中，相关肽或蛋白经流感病毒编码， 而在另一个实施例中，是基质蛋白，在另一个实施例中，该核酸拥有一个与SEQIDNO: 2同源或对应的序列。
在另一个实施例中，提供一种载体或细胞，其包含本文描述的核酸。在另一个实施例中， 提供一种细胞，其包括本文描述的载体。
在一个实施例中，提供一种方法，该方法用于剌激或增强相关肽或蛋白在主要组织相容 性复合体(MHC)II类分子上的呈递，该方法包括将能表达主要组织相容性复合体(MHC) II类分子的细胞与编码相关肽或蛋白的核酸接触，该核酸在编码框内与另一种核酸融合， 后者编码自噬体靶向蛋白，或其功能性片段，所述自噬体靶向蛋白或其功能性片段从而 能令所述相关肽或蛋白靶向导向到自噬体，并且相关所述肽或所述蛋白的片段通过主要 组织相容性复合体(MHC) II类分子被展示到所述细胞的表面上。
在一个实施例中，该自噬体靶向蛋白是LC3蛋白。在一个实施例中，该核酸包括一个与 SEQIDNO: 1同源或对应的序列。在一个实施例中，该细胞患病。在另一个实施例中， 该细胞被感染，其中一个实施例中，该细胞感染病毒，该病毒在一个实施例中是流感病 毒，或者在另一个实施例中是HIV病毒。根据此方面，并且在一个实施例中，相关肽或 蛋白经病毒编码，在一个实施例中，是经牛痘病毒编码或慢病毒编码。在一个实施例中， 相关肽或蛋白是基质蛋白，而在一个实施例中，根据此方面的核酸拥有一个与SEQ ID NO: 2同源或对应的序列。 -
在一个实施例中，该细胞感染细菌，该细菌在一个实施例中是分枝杆菌。在另一个实施 例中，该细胞是肿瘤细胞或前期肿瘤细胞。
在一个实施例中，该细胞与细胞因子接触，该细胞因子在一个实施例中是干扰素-Y。
在一个实施例中，提供一种方法来刺激或增强机体的免疫应答，该方法包括将能表达所 述机体中的主要组织相容性复合体(MHC) II类分子的细胞与编码相关肽或蛋白的核酸 接触，该核酸在编码框内与另一种核酸融合，后者编码自噬体靶向蛋白，或其功能性片 段，所述自噬体靶向蛋白或其功能性片段从而能令所述相关肽或蛋白靶向导向到自噬体， 并且相关所述肽或所述蛋白的片段通过主要组织相容性复合体(MHC) II类分子被展示 到所述细胞的表面上。
根据此方面，并且在一个实施例中，该细胞与核酸或包含相同核酸的载体间接接触。在 一个实施例中，将核酸或包含相同核酸的载体经静脉投予至所述机体，且在另一个实施 例中，向所述机体投予包括所述核酸或包含相同核酸的载体的组合物。在一个实施例中， 一段时间内重复投予该组合物。在一个实施例中，该组合物包括从机体分离出的的肿瘤 细胞，其在一个实施例中，是在体外与核酸或包含相同核酸的载体相接触的。在一个实 施例中，所述机体具有前期肿瘤或增生细胞或组织，或者在另一个实施例中，所述机体 有形成肿瘤的倾向。
在一个实施例中，提供一种组合物，该组合物包括能表达主要组织相容性复合体(MHC)II类分子的细胞，和编码相关肽或蛋白的核酸，该核酸在编码框内与另一种核酸融合， 后者编码自噬体LC3蛋白，或其功能性片段，或包含相同核酸的载体。
在另一个实施例中，提供一种方法下调、抑制或耐受对象机体内针对相关肽或蛋白的免 疫应答，该方法包括将未成熟树突状细胞与编码相关肽或蛋白的核酸接触，该核酸在编 码框内与另一种核酸融合，后者编码自噬体靶向蛋白，或其功能性片段，所述自噬体靶 向蛋白或其功能性片段从而能令所述相关肽或蛋白靶向导向到自噬体，并且相关所述肽 或所述蛋白的片段通过主要组织相容性复合体(MHC) II类分子被展示到在所述未成熟
树突状细胞的表面上。在一个实施例中，该细胞在体内或体外与包括该核酸的载体接触。
在另一个实施例中，该自噬体靶向蛋白是LC3蛋白。在另外一个实施例中，该核酸包括 一个与SEQIDNO: 1同源或对应的序列。
根据此方面，及在一个实施例中，下调、抑制或耐受免疫应答是为了防止或消除机体的 移植排斥反应。在另一个实施例中，相关肽或蛋白是移植抗原或宿主抗原。在另外一个 实施例中，下调、抑制或耐受免疫应答是为了治疗机体的自体免疫疾病。在另一个实施 例中，相关的肽或蛋白是自体抗原。


图1 A-G显示自噬体在人上皮细胞系中的形成。(a)组成型自噬体在人上皮细胞系中的 形成。人上皮细胞系HaCat (角质形成细胞)、HeLa (宫颈癌)、MDAMC (乳癌)和 293 (肾脏)被稳定转染GFP-LC3报告基因。为了在核内体、溶酶体内稳定GFP-LC3， 细胞用50nM氯喹处理IO小时(+CQ，右栏)。将细胞固定、用DAPI染色，并用共聚 焦显微镜分析。比例条20pm。来自三个实验中一个的代表区域如图所示。(b)巨自 噬是包括树突状细胞在内的专职抗原呈递细胞(APC)中的组成型过程。为了评价专职 APC中GFP-LC3的溶酶体周转情况，用50mM氯喹处理稳定表达GFP-LC3和GFP-LC3 表达的未成熟及成熟DC (iDC和mDC)的由EBV转化的B淋巴细胞系(B-LCL) 10 小时(+CQ)，或不进行处理(无CQ)。将细胞固定、用DAPI染色，并用共聚焦显微 镜分析。比例条代表20mm。来自两个实验中一个的代表区域如图所示。(c) GFP-LC3 在树突状细胞的MHC II类负荷室中降解。上部图块用50mM氯喹处理GFP-LC3表达 的未成熟DC达10小时(+CQ)。细胞用MHC II类特异性抗体和DAPI染色，然后GFP-LC3 与MHC II类的共存物用共聚焦显微镜分析。比例条10pm。来自三个实验中一个的代 表区域如图所示。下部图块用成熟DC进行如同上部图块一样的实验。大多数的成熟 DC中，MHCII类主要位于细胞表面，但是一部分细胞拥有细胞内MHCII类室(白色箭 头)。比例条代表lOpm。来自三个实验中一个的代表细胞如图所示。(d)需要巨自噬 体将MP1-LC3传递到MHC II类负荷室。稳定表达MP1-LC3的MDAMC细胞用对照 siRNA (虫萤光素酶特异的)或atgl2特异的siRNA转染。36小时后，用200U/ml IFNy 处理细胞，向上调节MHC II类表达，并再培养36小时。为了防止溶酶体溶解酶降解 MP1-LC3，在培养的最后6个小时中用50pM氯喹(CQ)处理细胞，记为(+CQ)。将 细胞固定、用MP1-和MHC II类特异性抗体和DAPI染色，并用共聚焦显微镜分析。比 例条10pm。来自两个实验中一个的代表区域如图所示。对照siRNA处理过的细胞中， 可以观察到相当大部分的含MP1-LC3囊泡，与MHC II类室共存，不过此共存在atg12 之后就完全消除了。
(e-f)氯喹处理引起自溶酶体中GFP-LC3逐渐累积，且与营养饥饿 有重大区别。(e)用GFP-LC3报告基因稳定转染的293细胞没有处理(无CQ)，或者用50pM氯喹(CQ)处理2小时或10小时。将细胞固定、用DAPI染色，并用荧光显微 镜分析。用CQ抑制溶酶体酸化导致用GFP-LC3标记的自噬体逐渐累积。来自两个实验 中一个的代表区域如图所示。(f) MDAMC细胞没有处理(-)，用Hanks平衡盐溶液 (饥饿)培养，用50nM氯喹(+CQ)或用蛋白酶抑制剂E64 (28pM)、亮肽素(40pM) 和胃酶抑素A (15nM) (+蛋白酶抑制剂)处理10小时。全细胞裂解液在12% SDS-PAGE 凝胶上电泳，且通过LC3抗体Western印迹法可观察到LC3-I和II。肌动蛋白印迹说明 蛋白质负荷相等。尽管营养饥饿使LC3-II变弱，但通过用CQ或溶酶体抑制剂E64来抑 制溶酶体蛋白酶，亮肽素和胃酶抑素A造成LC3-II大量累积。两个实验中的一个如图所 示。(g)用核纤层蛋白A/C或ATG12特异的双链siRNA模拟转染或转染稳定表达 GFP-LC3的MDAMC细胞。2天后，用50mM CQ处理细胞6小时(+CQ)或不处理(无 CQ)，用DAPI染色，再用落射荧光显微镜检査。两个实验中的一个如图所示。
图2A-C说明了人上皮细胞系和专职APC (包括原始单核细胞/树突状细胞)中的组成型 自吞噬作用。(a)人上皮细胞系[HaCat (角质形成细胞)、HeLa (宫颈癌)、MDAMC (乳癌)和293 (肾脏)]和B细胞系[MS-LCL (EBV转化的B淋巴细胞系)、RPMI6666 和L591 (霍奇金淋巴瘤细胞系)]和(b)原始CD14+单核细胞和单核细胞源性树突状细 胞，不论是未成熟或以LPS促其成熟，用50pM氯喹(+)处理10小时，或者不处理(-)。 全细胞裂解液在12% SDS-PAGE凝胶上电泳，且用LC3抗体Western印迹法可观察到 LC3-I和I1。肌动蛋白印迹说明用CQ处理并不影响一般蛋白含量。三个实验中的一个如 图所示。(c)用50pM氯喹处理HaCat角质形成细胞系0、 1、 2、 10或24小时，再用 LC3抗体Western印迹法分析LC3-II的累积。肌动蛋白控制样本负荷。两个实验中的一 个如图所示。
图3 A-D说明了自噬体标记GFP-LC3与MHC II类负荷室的标记共存。(a)再用200U/ml IFNy处理人上皮细胞系48小时之后，上调表面MHC II类。用抗MHC II类抗体为细胞 染色，并用流式细胞计分析。两个实验中的一个如图所示。(b) MDAMC乳癌细胞系用 200U/mlIFNY处理，并用pEGFP-LC3报告基因瞬时转染，36小时后，对DNA内容物再 用MHCII类、HLA-DM、 LAMP-2和DAPI的抗体染色。用共聚焦显微镜分析GFP-LC3 与MIIC标记的共存。(c)与(b)相同，但50pM氯喹在培养的最后10小时才用到。 比例条10pm。来自三个实验中一个实验的代表性的细胞如图所示。(d)重组IFN不 影响人上皮细胞的巨自噬作用。用1000U/ml重组人干扰素a或干扰素Y处理人上皮细胞 系(293 T、 HaCat和MDAMC) 24小时，或者不处理(—)。制备全细胞裂解液，等量 蛋白在12% SDS-PAGE凝胶上电泳。通过LC3抗体Western印迹法可观察到LC3-I和II。 用星号(*)标记的高分子量条带是蛋白质，其与LC3抗血清交叉反应，说明蛋白质负荷 相等。LC3-II水平以及相应巨自噬反应不受IFN处理的影响。
图4 A-C说明了自噬体反应标记GFP-LC3不与早期/循环核内体或MHC I类负荷室的标 记共存。MDAMC乳癌细胞系用pEGFP-LC3报告基因瞬时转染，24小时后再用50pM CQ 处理10小时。细胞用(a)早期核内体抗原(EEA1)或转铁蛋白受体(TR)和(b) MHC I类的抗体染色。另外，细胞用DAPI为DNA内容物染色，并用共聚焦显微镜分析。比 例条10pm。来自两个实验中一个实验的代表细胞如图所示。(c)定量分析未处理过或 用CQ处理过的MDAMC细胞中GFP-LC3与MHC II类、HLA-DM和EEA1的共存情况。 数据表示两个代表性实验中的一个的平均值始自10-15个细胞。误差条表示标准偏差。同方差统计的p值、单侧学生t-检验(One-tailed student's test)统计结果如图所示。
图5 A-F说明GFP-LC3和MHC II类分子在电子密度高的多囊室中共存。(a-d)未处理 的(a、 b)或CQ处理过的(c、 d) MDAMC上皮细胞因为IFNy诱导，能稳定地表达 GFP-LC3和MHC II类为阳性，将这些细胞固定在4%的多聚甲酸中，并切成80nm薄的 冷冻切片。用HLA-DR特异性抗血清和10nm蛋白A胶体金(PAG10)标记切片，并且 抗体-PAG复合体用戊二醛不可逆地固定。随后，用GFP-特异性抗体和15nrn蛋白A胶 体金(PAG15)标记切片，并用电子显微镜分析。作为对照，PAG10和PAG15互换，显 示有相同的标记形式(a、 b与c、 d)。图块a和c上的嵌入图在图块b和d中分别变大 了。来自三个实验中一个的代表区域如图所示。(e-f) MHC II类/GFP-LC3标记的冷冻 切片的免疫电子显微镜法(e) PFA固定的MDAMC-GFP-LC3细胞的超薄冷冻切片用抗 HLA-DR的抗血清/15nm胶体金颗粒和抗GFP抗血清/10nm胶体金颗粒双重标记，然后 用电子显微镜分析。MHCII类标记可在GFP-LC3阳离子密度高的多囊室和质膜上见到。 来自三个实验中一个的代表区域如图所示。比例条lpm。 (f) MDAMC-GFP-LC3细胞 用50pm CQ处理10小时，超薄冷冻切片用MHC II类(10nm胶体金)和GFP (15nm胶 体金)双重标记，再用电子显微镜分析。双重标记的多囊室经常出现膨胀、扩大，直径 大于lpm，及出现空间。来自三个实验中一个的三个代表区域如图所示。比例条lpm。
图6A-D说明了通过与Atg8/LC3融合，A型流感基质蛋白1耙向导向到自噬体。将A型 流感基质蛋白1 (MP1)编码序列与LC3序列的N-末端融合，在MP1的3'端可具有或 不具有终止密码子。(a)分别编码MP1和MP1-LC3的两个基因的示意图。(b) HaCat 和MDAMC细胞系用MP1和MP1-LC3慢病毒基因稳定转染，蛋白表达用抗MP1抗血 清的Western印迹法进行分析。肌动蛋白印迹显示蛋白负荷相等。(c)未处理或用氯喹 处理过的(+CQ) HaCat细胞稳定表达MP1或MP1-LC3，用抗MP1抗血清和DAPI为细 胞的DNA内容物染色，并用共聚焦显微镜分析。比例条10pm。来自一个实验的代表 区域如图所示。(d)稳定表达GFP-LC3的MDAMC细胞用编码MP1或MP1-LC3的慢 病毒转染。为了抑制GFP-LC3和MP1蛋白在溶酶体中降解，用50pm CQ处理细胞10 小时，然后用抗MP1抗血清染色，再用共聚焦显微镜分析。比例条10pm。来自一个实 验的代表区域如图所示。
图7 A-C说明了流感MP1特异性CD4+和CD8+ T细胞克隆的表征。(a) CD4和CD8 克隆的表达用流式细胞仪分析。克隆9.26、 11.46和10.9是同质化CD4+CD8-，而克隆 9.2是同质化CD8+CD4-。 (b)流感MP1肽的识别用干扰素y酶联免疫斑点测定法来测 验。MP1肽文库被分为六个亚文库，包括MP1氨基酸位1-51 (文库I) 、 41-88 (文库II)、 78-128 (文库III) 、 118-163 (文库IV) 、 152-203 (文库V)和193-252 (文库VI)。 克隆9.2、 9.26和10.9特异性响应文库II，克隆11.46特异性响应文库III。另外，CD8+T 细胞克隆9.2，而非CD4+ T细胞克隆，识别出HLAA2限制的MP1抗原决定簇58-66。 误差条表示标准偏差。(c) MP1特异性CD4+T细胞克隆被单独肽的识别，所述的单独 肽包括MP1氨基酸序列29-128，包括MP1文库II和文库III中所有的肽。克隆9.26和 10.9特异性识别肽抗原决定簇MP162-72，克隆11.46是标为MP1 103-113特异的。误差 条表示标准偏差。
图8 A-C说明了 MP1和LC3的融合提高了 CD4+ T细胞识别，而CD8+ T细胞识别不受影响。(a) IFNy处理过的耙向细胞(同源肽冲击的HaCat、 HaCat或表达GFP-LC3、 MP1或MP1-LC3的HaCat)或未处理过的对照细胞用MP1特异性CD4+ T细胞克隆9.26 (上部图块)、10.9 (中部图块)的效靶比(E:T)为2、 5及12.5，或用克隆11.46 (下 部图块)的效靶比为10、 20及40。为了排除MP1的外源性途径，IFNy处理过HaCat细 胞与T细胞克隆在HLA错配的MP1或MP-LC3表达MDAMC细胞的存在下培养。24 小时的共同培养后，用ELISA测量1: 2稀释上清液中的IFNy。误差条表示标准偏差， 对所有效靶比(E:T)的成对学生T-检验统计数据的P值如图所示。两个实验中的一个如 图所示。(b)靶向细胞上染色的表面MHCII类用于(a)中的CD4+T细胞检测。两个 实验中的一个如图所示。(c)IFNY处理过或未处理过的靶向细胞(同源肽冲击的MDAMC、 MDAMC或表达GFP-LC3、 MP1或MP1-LC3的MDAMC)与MP1特异性CD8+ T细胞 克隆9.26 (上部图块)共培养至效耙比(E:T)比2、 5及12.5，用克隆10.9 (中部图块) 至效靶比(E:T) 2、 5及10，或用克隆11.46 (下部图块)至效靶比5、 10及20。用ELISA 测量l: 20稀释上清液中的IFNY。误差条表示标准偏差。两个实验中的一个如图所示。
具体实施例方式
在下文的详细说明中，为了让人更彻底地理解本发明，提供了许多特殊细节。但是，熟 悉本项技术的人应该理解，本发明并不仅限于这些细节。在其他例子中，其他广为人知 的方法、程序和组成部分没有详细描述，以免错误理解本发明。
尽管自噬途径已经被认为参与了内源性MHC II类抗原处理，但自噬作用在MHC II类阳 性抗原呈递细胞(APC)中的组成活性程度还不为人所知，人们也不知道这些途径对抗 原呈递至MHC II类负荷室的效率有多高，也不知道这种途径可否用于特异性抗原呈递至 自噬体室，供MHCII类呈递。
如本文所举例，发现自噬体在上皮细胞上通过相关蛋白或肽同自噬体标记LC3的融合， 与MHC II类负荷室组成性融合并靶向此途径，导致MHC II类呈递和CD4+ T细胞的肽 识别大大上升，例如，本文中流感MP1融合基因的例子。
这种融合蛋白可以通过引入编码融合蛋白的核酸或包含相同核酸的载体载体来制备。
在一个实施例中，提供一种核酸，其编码相关肽或蛋白，该核酸在编码框内与另一种核 酸融合，后者编码自噬体靶向蛋白，或其功能性片段，其中所述相关肽或蛋白在主要组 织相容性复合体(MHC) II类分子上的呈递不够理想或根本未予有效呈递。
微-
在一个实施例中，术语"核酸"分子可包括但不限于原核序列、真核mRNA、源自真核 mRNA的cDNA、源自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列，以及甚至合成 DNA序列。该术语还指包括DNA和RNA的任何已知碱基对的序列。
任何熟悉本项技术的人都会明白，编码蛋白或肽的核酸序列或基因的衍生片段能起与完 整野生型基因或序列相同的作用。同样地，核酸序列的形式比起野生型序列或其片段来 说可以有很多变体，只要编码蛋白质或肽，保留着野生型功能相同的生理作用，尽管是 它们的变体。这些变体中的任何一个都代表本文的一个实施例。
12本文包括的核酸可通过任何合成或重组方法制得，例如本项技术中广为人知的方法。根 据本文教示的核酸可通过本项技术中的己知技术来进一步改性或变更其生物物理或生理 学属性。例如，可以改性核酸以增加其对核酸酶的稳定性(例如"封端")，或改性其 对互补序列的亲脂性、溶解度或结合亲和力。
根据本文教示的DNA也可通过本项技术中的己知技术化学合成。例如，DNA可以通过 本项技术中的已知技术用四种核苷以完整或部分的形式化学合成。这类方法包括 Caruthers (1985)中描述的方法。DNA也可以通过制备重叠双链寡核苷酸、填补裂隙、 将末端连接起来的方式合成(一般参见Sambrook等人(1989)和Glover等人(1995))。 表达该蛋白的功能性同系物的DNA可以通过定点突变技术从野生型DNA制备(参见例 如Zoller等人(1982) ; Zoller (1983) ; Zoller (1984) ; McPherson (1991))。所获 得的DNA可以用本项技术中的已知技术来扩增。 一种合适的方法是Saiki等人(1998)、 Mullis等人美国专利No. 4,683,195和Sambrook等人(1989)中描述的聚合酶链式反应 (PCR)方法。
本文涉及的核酸分子包括相关肽或蛋白，该核酸在编码框内与另一种核酸融合，后者编 码自噬体靶向蛋白，或其功能性片段。
在一个实施例中，该自噬体靶向蛋白是LC3蛋白。
在一个实施例中，该LC3蛋白用具有对应于或同源于NCBI的Entrez核酸数据库中披露 的序列的核酸来编码，这些披露的序列的登录号是NM_025735、 NM一142392、 NM-—167245、 BC018634、 AY619720、 BC086389、 BC045759、 BC067797、 BC010596、 BC018634、 BC083556、 AF303888、 AF183417或其同源序列。
在另一个实施例中，该LC3蛋白具有对应于或同源于NCBI的Entrez核酸数据库中披露 的氨基酸序列，这些披露的序列的登录号是Q9GZQ8、Q62625、 AAU04437、NP_852610、 NP—073729、 NP—955794、 AAM10499、 NP 080011、 AAH18634、 AAH86389、 AAH83556、 AAH58144、 AAP36120、 AAO39708或其j^I源序列。
哺乳动物微管结合蛋白轻链3(LC3)和其同源物，例如酵母Atg8，是自噬体的必要成分。 在大鼠中，合成之后，用半胱氨酸蛋白酶-Atg4切割LC3的C-末端，得到位于胞浆部分 的LC3陽I。 LC3-I可经Atg7 (El式酶)禾口 Atg3 (E2式酶)处理变成LC3-I1。 LC3-II经磷 脂酰乙醇胺在其C-末端改性，并紧密相连于自噬体膜。还发现大鼠LC3的剪接变异体， 例如LC3A和LC3B，且亚细胞定位研究表明LC3A和LC3B与LC3共存，并且与自噬 膜结合。这类剪接变异体或结合蛋白可最终用于本文涉及的方法、核酸、基因、细胞和 组合物，如同本文所述的自噬体靶向蛋白，为了将交联蛋白靶向导向到II类处理和呈递 机制。要理解任何与自噬体相关的已经发现的蛋白，并且当它与相关蛋白或肽制成融合 基因，用作靶向该基因到自噬体，和/或帮助相关蛋白或肽或蛋白片段在MHC II类中的 呈递，都属于本文范畴。这类蛋白可能是之前已经发现的自噬体结合蛋白的同源物。
某些实施例中的术语"同源物"或"同源性"表示候选序列中氨基酸或核苷残基与对应原始序列相同的百分比，这在一个实施例中，可能是在对比序列和引入裂隙后，若有必 要，取得最大的同源性百分比，而在某些实施例中，则不考虑保守取代作为序列相似性 的部分。在某些实施例中，N-末端或C-末端的延伸或序列的插入都不会理解为降低相似 性或同源性。进行对比的方法和电脑程序在本项技术中广为人知。
在某些实施例中，借助本项技术中广为人知的方法，同源性可通过序列对比的计算机运 算法则来测定。例如，计算机运算法则分析核酸序列同源性可包括利用任何数量可用的 软件包，例如BLAST、 DOMAIN、 BEAUTY (BLAST增强比较功能)、GENPEPT和 TREMBL软件包。
在其他实施例中，测定同源性是通过测定候选序列的杂交，测定方法在本项技术中广为 人知(参见例如"Nucleic Acid Hydridization""核酸杂交"Hames, B.D.，及Higgins S.J., Eds.(1985); Sambrook等人，1989， Molecular Cloning,分子克隆，A Laboratory Manual, 一个实验手册(1 -3巻)Cold Spring Harbor Press,冷泉港出版社，纽约；禾Q Ausubel等人， 1989， Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience，纽约)。例如杂交的方法可在适合的严格的条件下开展，补充编码自噬体 耙向蛋白的DNA。例如杂交条件包括在42°C下在一种溶液中过夜培养，溶液包括10-20% 甲酰胺、5x SSC (150mM NaCl， 15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6) 、 5xDenhardt 溶液、10%硫酸葡聚糖，和20pg/ml变性的剪切鲑鱼精子DNA。
本文所采用术语"同源性"、"同源物"或"同源"在任何情况下都表示所指序列，无 论是氨基酸序列或核酸序列，在一个实施例中显示出与指示序列至少70%的对应性。在 另一个实施例中，该氨基酸或核酸序列显示出与指示序列至少72%的对应性。在另一个 实施例中，该氨基酸或核酸序列显示出与指示序列至少75%的对应性。该氨基酸或核酸 序列显示出与指示序列至少80%的对应性。该氨基酸或核酸序列显示出与指示序列至少 82%的对应性。该氨基酸或核酸序列显示出与指示序列至少85%的对应性。该氨基酸或 核酸序列显示出与指示序列至少87%的对应性。该氨基酸或核酸序列显示出与指示序列 至少卯％的对应性。该氨基酸或核酸序列显示出与指示序列至少92%的对应性。该氨基 酸或核酸序列显示出与指示序列至少95%的对应性。该氨基酸或核酸序列显示出与指示 序列至少97%的对应性。该氨基酸或核酸序列显示出与指示序列至少99%的对应性。该 氨基酸或核酸序列显示出与指示序列至少95-100%的对应性。相似地，如本文所采用的， 所谓与特定序列的对应包括直接对应，以及符合该序列根据本文定义的同源性。
本文所采用的同源性可指序列相似性，或者可指结构相似性，或者功能相似性。通过使 用"同源性"术语和其他类似形式，应理解任何分子，无论是核酸还是肽，如果功能相 似，及/或具有序列相似性，及/或结构上保守，其就是与参考序列相似，则在本文范围之 内。
因此，在一个实施例中，该编码自噬体靶向蛋白的核酸具有与SEQIDNO:l同源或对应 的序列。
在另一个实施例中，自噬体靶向蛋白是Y-氨基丁酸A型受体结合蛋白(GABARAP)、 16kDa的高尔基结合ATP酶增强子(GATE16)，或其同源物。在一个实施例中，？氨基丁酸A型受体结合蛋白(GABARAP)用核酸编码，该核酸具有 对应于或同源于NCBI的Entrcz核苷数据库披露序列的序列，这些披露的序列的登录号 是NM_174874、 NM_007278、 BC106478、 NM_172036、 NM_019749、 BC058441、 BC002126、 AF161588、 AF161587、, NM—177408， i其同源物。
在另一个实施例中，Y-氨基丁酸A型受体结合蛋白(GABARAP)具有对应于或同源于 NCBI的Entrez蛋白数据库披露序列的序列，这些披露的序列的登录号是CAG47031、 CAG33324、 NP—062723、 AAD47643、 Q9GJW7、 AAI06479、 CAI35162、 AAH30350或
其同源物。
在一个实施例中，16kDa的高尔基结合ATP酶增强子蛋白(GATE16)用核酸编码，该 核酸具有对应于或同源于NCBI的Entrez蛋白数据库披露序列的氨基酸序列，这些披露 的序列的登录号是AY117147、 NM_026693、 NM_031412、 BC081436或其同源物。
在另一个实施例中，16kDa的高尔基结合ATP酶增强子蛋白(GATE16)用核酸编码， 该核酸具有对应于或同源于NCBI的Entrez蛋白数据库披露序列的氨基酸序列，这些披 露的序列的登录号是AAM77036、 P60519、 BAB21549、 BAB21548、 P60520、 NP—080969、 NP—495277，或其同源物。
在另一个实施例中，自噬体靶向蛋白是分子伴侣介导的自噬作用的核糖核酸酶A的 KFERQ信号序列，且具有对应于或同源于NCBI的Entrez核苷数据库披露序列的核酸序 列5'aaattcgagcggcag3'，该序列的登录号是NM_D26129，或其同源物。
在另一个实施例中，KFERQ信号序列具有对应于或同源于NCBI的Entrez蛋白数据库披 露序列的氨基酸序列KFERQ，该序列的登录号是NM一D26129，或其同源物。
在另一个实施例中，该自噬体靶向蛋白是源自EpsteinBarr病毒核抗原l (EBNA1)序列 (aa268-984)的GA重复域，且具有对应于或同源于EMBL核苷数据库披露序列的核酸 序列，该序列的登录号是EMBL-EBI—CAA24816，或其同源物。
在另一个实施例中，EBNA1的GA重复域具有对应于或同源于EMBL蛋白数据库披露的 EBNA1氨基酸序列的aa268-984的氨基酸序列，该序列的登录号是 EMBL-EBI—CAA24816，或其同源物。
本文涉及的核酸包括编码自噬体靶向蛋白的序列，该核酸在编码框内与编码相关蛋白或 肽的核酸融合，其中该相关蛋白或肽在主要组织相容性复合体(MHC) II类分子上的呈 递不够理想或根本未予呈递。緣.
在一个实施例中，相关蛋白或肽或其片段，包括一个抗原决定簇，需要其在MHCII类上 的特异性呈递。在一个实施例中，术语"抗原决定簇"表示一个免疫原性氨基酸序列。 抗原决定簇可能是指6-8个氨基酸的最小氨基酸序列(即为肽)，其最小序列当从天然背景下去除时是免疫原性的。抗原决定簇在其他实施例中也可指免疫原性的部分天然多 肽，其中具有抗原决定簇的天然多肽是作为抗原。在某些实施例中，多肽或抗原可能具 有一个或多个不同的抗原决定簇。抗原决定簇在某些实施例中可能指免疫原性的部分多 链多肽，即，其通过不同的开放阅读框架编码。术语抗原决定簇、肽和多肽都指一系列
氨基酸，通过临近氨基酸的a-氨基酸和a-羧基之间的肽键将一个氨基酸连接到其他，且 可能经过或未经过修饰，例如糖基化、侧链氧化或磷酸化，倘若有这类修饰处理，或者 没有，都不会损伤其免疫原性。如本文所采用的术语"肽"是指肽和多肽或蛋白。
在某些实施例中，抗原决定簇(肽、多肽、抗原)尽可能地小，同时仍保持免疫原性。 免疫原性是指引起本文所述的免疫应答的能力，例如，结合MHCII类分子和诱发T细胞 应答的能力，例如，通过测量T细胞的细胞因子的生成。
在某些实施例中，术语"抗原"或"免疫原"是指免疫原性的肽、蛋白、多肽，其能够 引起哺乳动物免疫应答，并因此具有至少一个也可能是多个抗原决定簇。如本文所涉及 的"病原"、有机体、"试剂"可能引起疾病或紊乱，本发明涉及的方法、细胞、核酸、 载体及/或组合物可以用于治疗。在某些实施例中，提到病原或有机体是指病毒、细菌、 真菌或寄生虫。术语"试剂"也可能指抗原，例如肿瘤抗原，或者与自体免疫或移植物 相关的抗原，例如自体(宿主)抗原或移植抗原。
在一个实施例中，相关肽或蛋白经病毒编码，例如，经牛痘病毒编码或慢病毒编码。在 另一个实施例中，相关肽或蛋白经流感病毒编码，其在另一个实施例中，是基质蛋白， 而在另一个实施例中，该编码自噬体靶向蛋白的核酸在编码框内与流感基质蛋白融合， 并具有同源于或对应于SEQ ID NO: 2的序列。
在一个实施例中，相关肽或蛋白是源自病毒，其为下列病毒家族的成员逆转录病毒科 (例如，人免疫缺乏病毒，例如HIV-1 (也指HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV，或HIV-III); 及其他分离物，例如HIV-LP);小核糖核酸病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒、甲肝病毒； 肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；嵌杯样病毒科(例如，引起肠胃炎的 菌株)；披膜病毒科(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(例如，登革热病毒、 脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科(例如，冠状病毒)；弹状病毒科(例如，水泡 性口炎病毒、狂犬病病毒)；丝状病毒科(例如，埃博拉病毒)；副黏病毒科(例如， 副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸融合病毒)；正黏液病毒科(例如，流行性 感冒病毒)；布尼亚病毒科(例如，汉坦病毒、bunga病毒、白蛉和内罗病毒)；砂粒病 毒科(例如，出血热病毒、病毒)；呼肠孤病毒科(例如，呼肠孤病毒、环状病毒、轮 状病毒)；双核糖核酸病毒科；肝病毒科(例如，乙肝病毒)；细小病毒科(细小病毒)； 乳多空病毒科(例如，乳突病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(大多数腺病毒)；疱疹病毒 科(单纯疱疹病毒(HSV) l和2、带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒)； 痘病毒科(天花病毒、牛痘苗病毒、痘病毒)；X肝炎、EB病毒、单纯疱疹病毒和虹 彩病毒科(例如，非洲猪瘟病毒)；和各种未分类病毒(例如，海绵样脑病的病原体、 丁型肝炎致病原(被认为是乙肝病毒的缺损卫星)、非甲肝、非乙肝致病原(第1类= 肠道内传播、第2类=肠道外传播(例如，丙型肝炎)；诺瓦克病毒和相关病毒以及星状 病毒)。在一个实施例中，相关肽或蛋白是源自细菌，其为细胞内细菌，可包括志贺氏菌、沙 门氏菌、弗郎西斯氏菌、螺旋杆菌，包括幽门螺旋杆菌、博氏疏螺旋体、军团菌，包括 嗜肺军团菌、分枝杆菌(例如，结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分 枝杆菌、戈登分枝杆菌)、葡萄球菌，包括金葡菌，奈瑟氏菌，包括淋病奈瑟菌、脑膜 炎奈瑟菌，李斯特菌，包括单核细胞增生李斯特菌，链球菌，尤其包括化脓链球菌(A 族链球菌)、无乳链球菌(B族链球菌)、草绿色链球菌族、粪链球菌、牛链球菌、厌 氧菌、肺炎链球菌、弯曲杆菌病原、肠球菌、披衣菌、流感嗜血杆菌、炭疽杆菌、棒杆 菌、白喉棒杆、红斑丹毒丝菌、产气荚膜杆菌、破伤风梭菌、产气肠杆菌、克雷伯氏肺 炎杆菌、多杀巴斯德菌、拟杆菌、梭杆菌、链杆菌、苍白密螺旋体、细弱密螺旋体、钩
端螺旋体、以色裂放线菌、土拉弗朗西斯菌或文章(请见(W.B.Saunders Co. 1996年)希 氏内科学1556-7中"细菌病介绍" 一文)中已知的其他种类。
在一个实施例中，相关肽或蛋白是源自原生动物，尤其可能包括疟原虫(例如，恶性疟 原虫、间日疟、卵圆疟和三日疟)、锥虫、弓形虫、利什曼原虫、隐孢子虫和上文中已 知的其他种类。
在一个实施例中，相关肽或蛋白是源自真菌，尤其可能包括新型隐球酵母、荚膜组织胞 浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌、沙眼衣原体、白假丝酵母。
在一个实施例中，相关肽或蛋白是源自肿瘤或癌细胞或组织，或前期肿瘤细胞或组织。 在一个实施例中，癌细胞可为恶性癌症，或者在其他实施例中，可为非恶性癌症。癌症 或肿瘤可包括但不限于胆管癌；脑癌；乳腺癌；子宫颈癌；子宫绒毛膜癌；直肠癌；子 宫内膜癌；食管癌；肝癌；上皮内瘤变；淋巴癌；肝癌；肺癌(例如，小细胞和非小细 胞)；黑素瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；恶性毒 瘤；皮肤癌；睪丸癌；甲状腺癌；和肾癌，以及癌科和恶性毒瘤。在一个实施例中，癌 症是指多毛细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、皮肤性T细胞白血病、多发性骨髓瘤、 滤泡性淋巴瘤、恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌、肾细胞癌、前列腺癌、膀胱细胞癌或结肠 癌°
在一个实施例中，抗原源自于下列各部位的癌细胞和其他此类细胞，各部位是指肾上 腺；膀胱；骨头；乳房；子宫颈；内分泌腺(包括甲状腺、垂体腺和胰腺)；结肠；直 肠；心脏；成血组织；肾脏；肝脏；肺；肌肉；神经系统；大脑；眼睛；口腔；咽；喉； 卵巢；阴茎；前列腺；皮肤(包括黑素瘤)；睾丸；胸腺；和子宫。这类肿瘤中包括APUD 瘤、迷离瘤、鳃原瘤、恶性类癌综合征、类癌性心脏病、癌科(例如Walker、基底细胞、 基底鳞癌、布朗一皮西二氏上皮癌、导管癌、艾氏腹水瘤、原位、Krebs2癌、Merkel细 胞癌、粘液、非小细胞肺、燕麦细胞、乳突、硬癌、细支气管、支气管、鳞状细胞和移 行细胞)、浆细胞瘤、黑色素瘤、软骨母细胞瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、纤维瘤、纤维肉 瘤、巨细胞瘤、组织细胞瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、间皮瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、骨瘤、 骨肉瘤、尤文瘤、滑膜瘤、腺纤维瘤、腺淋巴瘤、癌肉瘤、脊索瘤、叶间瘤、中肾瘤、 肌肉瘤、成釉细胞瘤、牙骨质瘤、牙瘤、畸胎瘤、胸腺瘤、滋养细胞肿瘤、腺癌、腺瘤、 胆管瘤、胆脂瘤、圆柱瘤、囊腺癌、囊腺瘤、颗粒细胞瘤、半阴阳胚细胞瘤、肝细胞瘤、 汗腺腺瘤、胰岛细胞瘤、间质细胞瘤、乳头状瘤、赛托利细胞瘤、卵泡膜细胞瘤、平滑肌瘤、子宫肌肉瘤、肌母细胞瘤、肌瘤、肌肉瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、室管膜瘤、 节细胞神经瘤、胶质瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经上皮瘤、 神经纤维瘤、神经瘤、副神经节瘤、非嗜铬性副神经节细胞瘤、血管角皮瘤、血管淋巴 样增生伴嗜酸性白细胞增多、硬化性血管瘤、血管瘤病、血管球瘤、血管内皮瘤、血管 瘤、血管外皮瘤、血管肉瘤、淋巴管瘤'、淋巴管肌瘤、淋巴管肉瘤、松果体瘤、肺母细 胞瘤、软骨肉瘤、叶状囊肉瘤、纤维肉瘤、血管肉瘤、子宫平滑肌肉瘤、白血病性肉瘤、 脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、肌肉瘤、黏液肉瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、恶性毒瘤(例如尤 因氏实验性肥大细胞、卡波氏实验肥大细胞和肥大细胞)、肿瘤。
在一个实施例中，癌症结合抗原可指肿瘤抗原，其在一个实施例中，是与肿瘤或癌症细 胞表面结合的肽或蛋白。癌症抗原可代表肿瘤或癌症的免疫原性部分。
癌症抗原在某些实施例中包括正常细胞中通常不活跃(即未表达)的抗原，或在其他实 施例中包括只会在某些分化阶段才表达的抗原，或在其他实施例中包括临时表达的抗原， 例如胚胎和胎儿抗原。其他癌症抗原由突变异种细胞基因进行编码，例如致癌基因(例 如激活ras癌基因)、抑制基因(例如突变p53)、由中间缺失或染色体易位造成的融合 蛋白。另外还有一些癌症抗原可以通过病毒载体进行编码，例如RNA和DNA肿瘤病毒 上携带的病毒载体。
肿瘤载体的实例包括MAGE、 MART-1/Melan-A、 gp100、 二肽基肽酶IV (DPPIV)、腺 苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环素b、大肠癌相关抗原(CRC) -C017-1A/GA733、 癌胚抗原(CEA)和其抗原决定簇CAP-1和CAP-2，etv6， amll、前列腺特异抗原(PSA) 和其抗原决定簇PSA-1、 PSA-2和PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA) 、 T细胞受体 /CD3-;链、肿瘤抗原中的MAGE-家族(例如MAGE-A1、 MAGE-A2、 MAGE-A3、 MAGE-A4、 MAGE-A5、 MAGE-A6、 MAGE-A7、 MAGE-A8、 MAGE國A9、 MAGE-AIO、 MAGE-A11 、 MAGE-A12、 MAGE-Xp2(MAGE-B2) 、 MAGE-Xp3 (MAGE-B3 ) 、 MAGE-Xp4
(MAGE-B4) 、 MAGE-C1、 MAGE國C2、 MAGE-C3、 MAGE-C4、 MAGE-C5)、肿瘤抗 原中的GAGE-家族(例如GAGE-1、 GAGE-2、 GAGE-3、 GAGE-4、 GAGE-5、 GAGE-6、 GAGE-7、 GAGE-8、 GAGE-9) 、 BAGE、 RAGE、 LAGE-1、 NAG、 GnT-V、 MUM-1、 CDK4、酪氨酸酶、p53、 MUC家族、HER2/neu、 p21ms、 RCAS1、 a-胎蛋白、E-钙粘 蛋白、a-连接素、e-连接素和Y-连接素、pl20ctn、gpl00Pmelll7、PRAME、NY-ESO-l、 cdc27、结肠腺瘤性息肉病蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37、 Ig独特型、p15、 gp75、 GM2和GD神经节苷脂、病毒产物，例如人类乳突病毒蛋白、肿瘤抗原中的Smad家族、 lmp-l、 P1A、 EBV-编码的核抗原(EBNA) -1、糖原磷酸化酶、SSX-1 、 SSX-2
(HOM-MEL-40) 、 SSX國1、 SSX國4、 SSX-5、 SCP-1和CT墨7、和c陽e舰-2。
应理解本文描述的任何细胞癌症抗原可用于本文涉及的方法及/或组合物，并代表其实施 例。
本文涉及的用于核酸的癌症抗原、方法和组合物尤其包括急性淋巴细胞白血病(etv6;
amll;亲环蛋白b) 、 B细胞淋巴瘤(Ig-独特型)、神经胶质瘤(E-钙粘蛋白；a-连接 素；e-连接素；Y-连接素；pl20ctn)、膀胱癌(p21ms)、胆管癌(p21ras)、乳房癌 (MUC家族；HER2/neu; c-erbB-2)、宫颈癌(p53; p21ras)、结肠癌(p21ras; HER2/neu; c-erbB-2; MUC家族)、直肠癌(直肠相关抗原(CRC) -C017-1A/GA733; APC)、绒毛膜癌(CEA)、上皮细胞癌(亲环素b)、胃癌(HER2/neu; c-erbB-2; ga733糖蛋白)、 肝细胞癌(a-胎蛋白)、霍奇金淋巴瘤(Imp-1; EBNA-1)、肺癌(CEA; MAGE陽3; NY-ESO-l)、淋巴细胞白血病(亲环素b)、黑素瘤(p15蛋白、gp75、癌胚抗原、GM2 禾口GD2神经节苷酯)、骨髓瘤(MUC家族；p21ras)、非小细胞肺癌、(HER2/neu; c-erbB隱2)、鼻咽癌(lmp-l; EBNA二1)、卵巢癌(MUC家族;'HER2/neu; c-erbB-2)、 前列腺癌(前列腺特异性抗原(PSA)和其抗原抗原决定簇PSA-1， PSA-2和PSA-3; PSMA; HER2/neu; c-erbB-2)、胰腺癌(p21ras; MUC家族；HER2/neu; c-erbB-2; ga 733糖蛋白)、肾脏(HER2/neu; c-erbB-2)、子宫颈和食道的皮肤鳞状细胞癌(病毒产 物，例如人类乳突病毒蛋白)、睾丸癌(NY-ESO-l) 、 T细胞白血病(HTLV-1抗原决 定簇)和黑素瘤(Melan-A/MART-1; cdc27; MAGE-3; p21ras; gp100 Pmell 17)。增生 细胞、癌前期细胞或癌细胞只要能表达这些肿瘤抗原，都可以被用在本文涉及的方法和/ 或组合物中。
本文涉及的核酸和载体编码的抗原是内源性合成的，而且抗原决定簇与自噬体靶向蛋白 相融f ，其靶向导向到MHCII类负荷室，最终因此该抗原决定簇与II类MHC分子共同
被展示。
MHC II类分子通常结合12-20个氨基酸的肽。这些配体的肽侧残基(PFR)从由九个氨 基酸构成的中央结合核心处延伸。PFR可改变T细胞抗原决定簇的免疫原性。某些基序 已经与增强过的MHC II类结合肽相连，例如，MHC II类配体中存在C-末端碱基和N-末端脯氨酸的呈递。在本文的某些实施例中，这类基序考虑到本文涉及的基因和核酸的 设计和制备，用于根据本文涉及方法、分子和组合物来定制靶向至自噬体的肽及/或蛋白 的类型。
在某些实施例中，抗原肽通过编码Ii蛋白的Ii-Key片段的C-末端区域而生成，C-末端在 编码框内与MHC II类呈递肽的N-末端融合，其最终可增强MHC II类抗原决定簇的呈递 效力。
在某些实施例中，本文涉及核酸的设计中运用了计算机抗原决定簇预测程序，用于构建 编码抗原决定簇的基因和/或核酸，抗原决定簇与MHC II类分子良好地结合在一起，为 的是一旦靶向导向到自噬体，可以在分子上更好的呈递。这种预测算法在本项技术中广 为人知，还包括例如在下面网站中找到的内容
(http:〃svfpeithi,bmiheidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.html) (http:〃www.imtech.res.in/raghava/propred/index.html) <>
在另一个实施例中，抗原可以是任何被机体的免疫系统识别出的体外分子。在另一个实 施例中，抗原可能是源自哺乳动物细胞、传染性病毒、细菌、真菌或其他有机体(例如 原生动物)。这些传染性有机体可能在一个实施例中具有活性，在另一个实施例中不具 活性，其可通过例如暴露在热量之下或去除有机体复制需要的至少一个蛋白或基因来完 成。在一个实施例中，编码抗原蛋白或肽的核酸是被分离出的，或在另一个实施例中是 合成的。在另一个实施例中，本文采用了编码跨越抗原蛋白的肽的核酸文库。在一个实施例中， 核酸编码15个氨基酸的肽，而在另一个实施例中，核酸可能构建成编码每4个氨基酸沿 着抗原蛋白的长度方向交错的肽。在另一个实施例中，通过重组两种或多种形式的核酸 获得抗原，该核酸编码抗原的多肽，例如是源于有关别种疾病或病症的病原体或抗原。 这些重组方法在一个实施例中被称为"DNA改组"，用作核酸底物，其在两个或多个核 苷中彼此不同，所以得到重组核酸的文库。筛选该文库，识别至少一种优化重组核酸， 其编码优化重组抗原，抗原提高了针对病原体或其他病症诱发免疫应答的能力。两种所 得重组抗原通常是嵌合抗原，其通过与多重病原体菌株反应的抗体(Ab)来识别，并且 一般也可引发大范围的免疫应答。
在其他实施例中，不同形式编码抗原多肽的核酸获得自相关因子的家族成员，例如，病 原体。执行DNA改组的方案采用源自相关有机体的核酸，被称为"家族改组"，在Crameri 等人((1998) Nature 391:288-291)中有述。不同菌株的多肽和病原体的血清型一般在 60-98%之间变动，这可获得有效的家族DNA改组。所以，家族DNA改组提供一种有效 的方法，生成多价、交叉保护的抗原。然后通过熟悉本项技术的人熟知的技术，生成如 本文所述和要求权利的重组融合蛋白，将其用于本文涉及的组合物或方法。
载沐
在一个实施例中，提供包括本文'涉及核酸的载体。
本文描述的核酸序列可在特定载体内亚克隆，载体选择在某些实施例中是根据细胞内序 列的引入、表达、调节等需要的方法。为了在本文实施例的背景中生成核酸基因，编码 相关序列的多聚核苷酸片段可连接到适用于转移/转化哺乳动物细胞和适用于在转移/转 化过的哺乳动物细胞中诱导重组产物表达的市售表达载体系统上。应了解这种市售载体 系统很容易通过普通的重组技术改性，以便取代、复制或诱变现存的启动子或增强子序 列及/或引入任何附加的多聚核苷酸序列，例如编码附加选择标记的序列，或者编码报告 多肽的序列。
在一个实施例中，术语"载体"是指含有相关序列的核酸基因被亚克隆到载体内，在此 情况下，是指编码本文描述的融合产物的核酸序列。
本文涉及的载体可能包括合适的选择标记。载体可进一步包括复制起点，并且有可能是 穿梭载体，其既可在细菌例如大肠杆菌中增殖(其中该载体包括合适的选择标记和复制 起点)，又可在脊椎动物细胞中增殖，或者整合到所选择有机体的染色体中。根据本文 实施例的载体可为，例如质粒、杆粒、噬粒、粘粒、噬菌体，病毒或人造染色体。
在某些实施例中，本文涉及载体具有可调节的启动子。可能在一个实施例中根据其中所 表达基因产物的细胞类型选择调节基因产物表达的核苷酸序列(本文指"调节元件"， 例如，启动子和增强子序列)，或者在另一个实施例中，根据基因产物所需表达水平。
例如，可使用已知赋予连接到启动子的基因的细胞型特异性表达的启动。成肌细胞基因 表达特异性启动子可连接到赋予基因产物的肌肉特异性表达的相关基因。本项技术中广 为人知的肌肉特异性调节元件包括抗肌蒌縮蛋白的上游区(幻amut等人，(1989)Mol.Ce11Biol. 9:2396)，肌酸激酶基因(Buskin和Hauschka， (1989) Mol. Cell Biol. 9:2627)和 肌钙蛋白基因(Mar和Ordahl， (1988) Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 85:6404)。
其他细胞型的特异性调节元件在本项技术中众所周知(例如，肝特异性表达的白蛋白增 强剂；胰岛细胞特异性表达的胰岛素调节元件；各种中性细胞特异性调节元件，包括中 性抗肌萎縮蛋白、中性烯醇酶和A4淀粉样启动子)。在另一个实施例中，可使用能引导 各种不同细胞类型的基因的组成型表达的调节元件，例如病毒调节元件。 一般用于驱动 基因表达的病毒启动子的实例包括源自多瘤病毒的启动子，腺病毒2、巨细胞病毒和猴病 毒40和逆转录病毒LTR。
在另一个实施例中，可使用提供连接到其上的基因的诱导型表达的调节元件。诱导型调 节元件(例如诱导型启动子)的用途能实现调节基因产物在细胞中生成。潜在有用的用 于真核元件的诱导型调节系统的实例包括激素调节的元件(例如参见Ma^er, S.和White, J.H. (1993) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90:5603-5607)，合成配体调节元件(参见例如 Spencer, D.M.等人1993， Science 262: 1019-1024)和离子化辐射调节元件(例如参见 Manome， Y.等人(1993) Biochemistry32: 10607-10613; Datta, R.等人(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA89: 1014-10153)。可根据本文实施例开发附加的组织特异性或诱导型调 节系统使用。
在某些实施例中，将本文涉及的载体和核酸引入细胞，其在另一些实施例中包括本文涉 及的细胞。本项技术中存在大量的技术，用于将上述重组载体引入本文涉及的细胞，例 如但不限于DNA直接吸收和病毒、质粒、线性DNA或脂质体介导转导、直接注射和受 体介导吸收(详情请参见例如"Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F.M.等人编Greene Publishing Associates,
(1989)禾口 Molecular Cloning: A LaboratoryManual，第二版，Sambrook等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)，或其他标准实验手册)。用核酸包覆的微粒冲击也在 设想之中。
特定表达载体系统和向细胞引入核酸的方法的效力可通过本项技术中日常所用的标准方 法来评定。例如，引入细胞的DNA可通过滤膜杂交技术(例如Southern印迹法)检测， 而且引入的DNA转录生成的RNA可以检测到，例如通过Northern印迹法，核糖核酸酶 保护或逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)。基因产物可通过合适的检测法检测，例 如通过免疫检测生成的蛋白，例如用特异性抗体，或者通过功能性检测来检测基因产物 的功能性活动，例如酶检测。如果细胞表达的相关基因产物不容易检测，那么表达系统 可以首先用连接到所用调节元件和载体的报告基因进行优化。报告基因编码基因产物， 其很容易检测并且因此可用来评价系统的效力。用于本项技术的标准报告基因包括编码 P-半乳糖苷酶、氯霉素、乙酰基转移酶、荧光素酶和人生长激素或任何本文列举的标记 蛋白的基因。
在某些实施例中，载体是病毒载体，例如但不限于牛痘病毒或慢病毒。在其他实施例中， 构建包装系统，系统包括编码自噬体耙向蛋白和相关蛋白或肽的cDNA。
一种包装系统是一个载体，或者多个载体，其联合提供表达形式的所有基因信息，需要
21这些基因信息生成包裹核酸、将核酸从病毒粒子生成细胞传递到靶向细胞并且在靶向细 胞中帮助转基因表达的病毒粒子。在某些实施例中，包装系统实际上不能够包装其自身， 所以从病毒粒子的生成开始就提供一种衰减手段，防止随后引入靶向细胞。
在另一实施例中，本文讨论的重组载体进一歩包括编码标记多肽的外源核酸序列的插入 序列。该标记多肽可能包括例如绿色荧光蛋白(GFP) 、 DS-Red (红色荧光蛋白)、分 泌型碱性磷酸酶(SEAP) 、 (3-牛乳糖、荧光素酶或任何数量的其他本项技术中熟知的报 告蛋白。
在另一个实施例中，本文涉及的重组载体和核酸可进一步编码免疫调节蛋白。
有用的免疫调节蛋白的实例包括细胞因子或趋化因子。有用的实例包括GM-CSF、 IL-2、 IL-12、 IL-4、干扰素Y或前述各项的组合。另外其他的有用实例还包括各种白细胞介素， 例如白细胞介素1-15、 a-、 P-或Y-干扰素、肿瘤坏死因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、趋 化因子例如中性粒细胞激活蛋白(NAP)、巨噬细胞趋化和刺激因子(MCAF) 、 RANTES、 巨噬细胞炎症蛋白MIP-la和MIP-lb或前述各项的组合。
在另一个实施例中，改免疫调节蛋白可能拥有人或非人动物特异性，并且可能包括细胞 外域及/或其他片段，其具有与自然出现的蛋白可比较的结合活性。免疫调节蛋白可能在 另一实施例中是所述蛋白的变体或类似物，且可能表达包括融合蛋白表达或独立表达， 这一点熟悉本项技术的人应能理解。在某些实施例中免疫调节蛋白可与本文涉及的核酸 或载体表达同时表达。或者在另一个实施例中，在本文涉及的核酸或载体表达之前表达， 或者在另一个实施例中，是在之后表达。多重免疫调节蛋白可并入单个基因中，并且同 样代表本文的附加实施例。
在另一个实施例中，提供一种细胞，包括本文涉及的核酸。在另一个实施例中，提供一 种细胞，包括本文涉及的载体。
在一个实施例中，提供一种方法刺激或增强相关肽或蛋白在主要组织相容性复合体 (MHC) II类分子上的呈递，该方法包括将能表达在主要组织相容性复合体(MHC) II 类分子的细胞与编码相关肽或蛋白的核酸接触，该核酸在编码框内与另一种核酸融合， 后者编码自噬体LC3蛋白，或其功能性片段，所述自噬体靶向蛋白或其功能性片段能令 所述相关肽或蛋白靶向导向到自噬体，并且相关所述肽或所述蛋白的片段能通过主要组 织相容性复合体(MHC) II类分子而展示到所述细胞的表面上。
在一个实施例中，术语"能表达主要组织相容性复合体(MHC) II类分子"是指内源性 表达分子的细胞，或者在另一个实施例中，诱发表达分子的细胞，或者在另一个实施例 中，工程化的表达分子。在某些实施例中，细胞是所谓的专门的抗原呈递分子(APC)， 并且可能包括单核细胞、巨噬细胞或任何髓系细胞、树突状细胞、B细胞、M细胞或其 任何组合。在某些实施例中，细胞是上皮细胞，其在某些实施例中，暴露于细胞因子， 其最终上调主要组织相容性复合体(MHC) II类分子的表达，例如，在投予干扰素-Y之 后。一银，雄浙
在某些实施例中，细胞位于健康的机体中，或者在另一个实施例中，是从健康的机体分 离而出的。在某些实施例中，本文涉及的方法/细胞是接种手段，或者在另一个实施例中， 是预防手段，或者在另一个实施例中，是治疗疾病的手段。
在某些实施例中，细胞是染病及/或非正常的。这里的染病及/或非正常的细胞，特别是 感染细胞、肿瘤细胞、前期肿瘤细胞、炎症病灶、良性肿瘤或息肉、咖啡牛乳色斑、白 斑和其他皮肤胎块。
如本文所示例，流感MP1通过其与自噬体相关的Atg8/LC3蛋白融合，靶向增强的MHC II类呈递。尽管已经显示当通过细胞内途径(图7)传递抗原源，使MP1进入MHC II 类呈递，但Atg8/LC3的融合显著增加了 MP1的MHC II类呈递高达17倍。这一增加的 同时， 一个事实是MP1/LC3融合蛋白的表达并没有增加MP1或表面MHC II类的总表达。
所以，本文显示了通过自噬作用的靶向现象，在经历如病毒载体的细胞内传递之后，提 高MHC II类呈递和CD4+ T细胞对抗原的刺激。本研究使用的MP1的Atg8/LC3融合蛋 白也有效地处理到MHCI类之上。因为己经证实，CD4+T细胞加上上文归纳的直接抗病 毒功能，对保持保护性CD8+T细胞效应子功能和记忆是必要的，辅助T细胞的刺激在某 些实施例中有所改进，充当免疫应答的组成部分，其激发是必需的。在某些实施例中， 这类用途是更广泛的疫苗开发战略中的一部分，例如通过重组病毒性疫苗开发。
在一个实施例中，本文涉及的细胞或用于本文涉及的任何方法的细胞受到感染，而在一 个实施例中，细胞受到病毒感染，其在一个实施例中是流感，或者在另一个实施例中是 HIV，或者在另一个实施例中是任何本文描述的病原，或者是熟悉本项技术的人熟知的。
在一个实施例中，相关肽或蛋白经病毒编码，在一个实施例中，经流感病毒编码。在一 个实施例中，相关肽或蛋白是基质蛋白，而在一个实施例中，根据此方面的核酸具有同 源于或对应于SEQ ID NO: 2的序列。
在一个实施例中，细胞受到细菌感染，其在一个实施例中，是分枝杆菌，其在某些实施 例中，己知激起较小的MHCII类呈递，如果未活化的话。在某些实施例中，如细胞受到 本文所述任何细菌或者病原，或熟悉本项技术的人熟知物的感染。
在另一个实施例中，细胞是肿瘤细胞或前期肿瘤细胞。
在某些实施例中，细胞是健康的，并启动抗原呈递作为保护性疫苗策略。在另一个实施 例中，细胞是健康的，并启动抗原在MHCII类上呈递，作为疾病或病症的预防治疗，不 使健康细胞暴露于抗原处。
在一个实施例中，提供一种方法，该方法用于刺激或增强机体的免疫应答，该方法包括 将能表达主要组织相容性复合体(MHC) II类分子的细胞与编码自噬体靶向蛋白或其功 能性片段的核酸接触，所述自噬体靶向蛋白或其功能性片段能令所述相关肽或蛋白耙向导向到自噬体，并且相关所述肽或所述蛋白的片段通过主要组织相容性复合体(MHC) II类分子被展示到所述细胞的表面上。
根据此方面，并且在一个实施例中，该细胞与核酸或包含相同核酸的载体间接接触。在 一个实施例中，将核酸或包含相同核酸的载体经静脉投予至所述机体，且在另一个实施 例中，向所述机体投予包括所述核酸或包含相同核酸的载体的组合物。在一个实施例中， 一段时间内重复投予该组合物。在一个实施例中，该组合物包括从机体中分离出的肿瘤 细胞，其在一个实施例中，是在体外与核酸或包含相同核酸的载体相接触的。在一个实 施例中，所述机体具有前期肿瘤或增生细胞或组织，或者在另一个实施例中，所述机体 有形成肿瘤的倾向。
在某些实施例中，根据本文实施例的所用细胞当投予所述机体时是自体细胞，或者在另 一个实施例中，是同基因细胞，或者在另一个实施例中，是异源细胞，这是根据细胞所 投予的对象而言。在一个实施例中，细胞从患有肿瘤或易患肿瘤的机体分离而出。
在一个实施例中，本文所涉及方法可进一步采用向本文所述细胞加入细胞因子和生长因 子，或者在另一个实施例中，可能包括本文涉及的组合物。在一个实施例中，细胞因子 和/或生长因子可通过投予本文描述的组合物或细胞用来增强、活化或引导机体内被刺激 而发展中的免疫应答。在一个实施例中，细胞因子和/或生长因子进一步促进细胞成熟， 其在某些实施例中，导致在机体中的呈递更加稳健。在某些实施例中，细胞因子对应答 有偏倚，根据Th-l对Th-2或反之类型的应答。
在某些实施例中，从体内源获得细胞，例如大多数体内固体组织、外周血、淋巴结、内 脏相关淋巴组织、脾脏、胸腺、皮肤、免疫病变部位，例如滑液、胰腺、脑脊髓液、月中 瘤标本、肉芽组织或可以获得这类细胞的任何其他来源。在一个实施例中，细胞来源于 人体，而在另一个实施例中细胞可能来源于人类胎儿、新生儿、儿童或成人。在另一个 实施例中，本文涉及的方法和/或组合物中使用的细胞可以从动物身上获得，例如猪或猿 或任何其他相关动物。在另一个实施例中，本文涉及的方法和/或组合物中使用的细胞可 以从不同正常对象上，或在另一个实施例中，从患病对象上，或在另一个实施例中，从 易于患病对象上，或在另一个实施例中，在特定的基因档案(例如从已知能过度表达某 个特定基因的个体身上)上，或在另一个实施例中，通过过度表达某个特定基因，或在 另一个实施例中，从通常容易形成限定肿瘤的种群身上而获得。
在一个实施例中，术语"接触细胞"在本文中表示将细胞直接或间接地暴露于所指物体。 在一个实施例中，细胞与本文涉及的核酸或载体接触，及可选地与细胞因子、生长因子 或其组合接触是直接的，或者在另一个实施例中是间接的。在一个实施例中，接触细胞 可能包括通过本项技术中任何广为人知的手段直接注射细胞，例如微注射。也可认为， 在另一个实施例中，间接提供给细胞，例如通过在环绕细胞的培养基中提供，或通过任 何本项技术中广为人知的途径或本文描述过的途径投予对象。
在某些实施例中，本文涉及的核酸、载体和细胞特异性靶向导向到能表达MHCII类分子 的细胞。耙向传递至APC,其干细胞或其他前驱体细胞类型可使用包括下列耙向配体实 例的传递载体，通过受体介导的基因转移完成(a)对于造血干细胞来说抗CD34单克隆抗体或干细胞因子(c-Kit或CD117)，或flk-2配体(人类同源基因STK-1) ; (b) 对单核/巨噬/树状突细胞前体来说抗CD33单克隆抗体(c)对已分化巨噬/树状突细 胞来说携带甘露糖组的糖基化DNA结合肽可被用于靶向到特异性受体，例如甘露糖 受体；和(d)对MHCII类细胞来说特定适用于MHCII类蛋白恒定区的抗体，或结合 MHCII类的配体，例如可溶性CD4;例如，用可溶性CD4或用CD80、 CD19或、CD22 的抗体或配体对一个MHC类细胞的子集，即B淋巴细胞，进行靶向；对内皮细胞而言， 用Y-干扰素和血管内皮生长因子(VEGF)受体进行靶向；和(e)对共刺激分子例如 B7-l、 B7-2或CD28、 CTLA-4等的APC或T细胞配体或抗体来说。这些靶向配体可以 发挥双重作用，即加强对APC的共刺激信号；并进而既提高其靶向功能又增加其活化性。
在其他实施例中，使用DNA调节元件，导致APC表达，其干细胞或其他前驱体细胞类 型作为特异性靶向这些细胞的手段。
在一个实施例中，将本文涉及的细胞、核酸、载体和/或组合物投予患有肿瘤或易患肿瘤 的对象。在某些实施例中，这种用途是为了针对对象的肿瘤形成进行预防、缓解、治疗、 减轻、延长缓解期、抑制复发等。
在一个实施例中，术语"肿瘤形成"涵盖个体的一个或多个细胞表现出异常生长特征的 过程。在一个实施例中，这一过程可能包括发展到个体内存在大量增生细胞。在另一个 实施例中，肿瘤形成可能是指很早期的阶段，其中只出现相对少的反常细胞分裂。在一 个实施例中，考虑了个体易得肿瘤病的倾向。不从任何方面限制本发明，没有经历肿瘤 发作的个体的生物标记水平上升或表达概况可能对个体得肿瘤的倾向是起指示作用。
在一个实施例中，术语"有形成肿瘤的倾向"是得肿瘤病风险较高或可能性较大的个体， 例如，有肿瘤家族史的个体，或在另一个实施例中，表达与特定癌症相关基因的个体， 例如美国专利申请公开案No. 2004001852描述的所谓乳癌基因。
癌症是一种疾病，与不受控制的细胞生长(例如分裂)有关。某些对癌细胞不受控制的 繁殖有关的作用机制包括生长因子独立性、无法检测的染色体突变，和不合适的细胞讯 号，癌细胞能超越正常生长控制的能力导致增殖率上升。尽管导致癌症的原因仍未确定， 但是已经知道有些因素是起作用的，或者至少让对象易患癌症。这些因素包括特定的基 因突变(例如乳房癌的BRCA基因突变，结肠癌的APC)、暴露于致癌剂、致癌物质(例 如石棉、紫外线辐射)和特定癌症的家族因素例如乳房癌。在一些实例中，本文涉及的 方法和/或组合物中使用的肿瘤细胞、增生细胞或前期肿瘤细胞可以从个体或细胞系上获 得，揭示这类现象。
在一个实施例中，患有癌症的对象，是具有可检测癌细胞的对象。
有患癌风险的对象是患癌风险比正常可能性高的对象。这些对象包括，例如，拥有基因 异常的对象，其已经证实与有较高患癌概率有关，有患癌倾向的对象，暴露至引起癌症 物质的对象(即致癌物)，例如烟草、石棉或其他化学毒物，及此前治疗过癌症并明显 减轻的对象。及的方法及/或组合物的肿瘤细胞、前期肿瘤细胞或增生细 胞将表达癌症结合抗原，在一个实施例中是优选的，或者另一个实施例中浓度更高，或 者在另 一个实施例中是以一种特定的形式。
用于本文涉及的方法和组合物的肿瘤细胞可从实际上本文描述的任何类型的肿瘤制得。
在一个实施例中，提供一种组合物，该组合物包括将能表达主要组织相容性复合体 (MHC) II类分子的细胞，和编码相关肽或蛋白的核酸，该核酸在编码框内与另一种核 酸融合，后者编码自噬体LC3蛋白，或其功能性片段，或包括相同物的载体。
在某些实施例中， 一个机体中所述的细胞会达到10><104到1"08范围内，或在其他实施 例中，在lx106到约25乂106之间，或在另一个实施例中，在2.5xl(^到约7.5><106之间。 在一些实施例中，细胞会悬浮在一个药用可接受的载体或稀释液中，例如但不限于Hank 溶液(HBSS)、盐水、磷酸盐缓冲液和水。在另一个实施例中，肿瘤细胞的浓度在大约 5><104到约5xl()6细胞之间，例如；5xl04、 5><105或5><106的肿瘤细胞。
在另一实施例中，放入细胞的溶液是在不含血清的培养液中，其在另一个实施例中可能 是市售的例如不含动物蛋白的培养基，例如X-VIVO 1()TM或X-VIVO 15 (BioWhittaker、 Walkersville、 Md.)、造血干细胞-无血清(SFM)培养基(GibcoBRL, Grand Island, N.Y.) 或可以促进或维持细胞活性的配方。在另一个实施例中，关于使用的无血清培养基，可 参见下列专利文件WO 95/00632;美国专利文献U.S.Pat.第5,405,772号；PCT US94/09622。而在另外一个实施例中，无血清基本培养基中可能含有临床等级牛血清白 蛋白，而这个在另一个实施例中可能只有约0.5-5%的浓度，或在另一个实施例中约1.0% (w/v)浓度。临床等级清蛋白来自于人类血清，例如Buminate (BaxterHyland、 Glendale、 Calif)，可被用在另一个实施例中。
在另一个实施例中，可用亲和分离法将细胞分离。亲和分离的技术在其他实施例中可包 括磁性分离，用抗体涂覆的磁珠，亲和层析法，结合单克隆抗体的细胞毒剂或用于与单 克隆抗体结合的用途，例如补体和细胞毒素，及用连接到固体基质的抗体"淘选"，例 如板块，或其他便利技术。在其他实施例中，分离技术也可包括使用荧光活化细胞计数 仪，其具有不同程度的精密度，例如多色彩通道，小角度和钝角光散射，阻抗通道等。 应了解可以采用任何实现细胞分离或用于本文的技术，并且任何此类技术都应考虑为本 文的一部分。
在另一个实施例中，分离方法釆用的亲和性试剂可为上文指出的细胞表面分子的特异性 受体或配体。
在另一个实施例中，本文利用的抗体可与标记共轭，其在另一个实施例中可用于分离。 在其他实施例中，标记可包括磁珠，用来实现直接分离，或生物素，其可随抗生物素蛋 白或抗生蛋白链菌素，抗生蛋白链菌素结合于例如载体，或荧光染料，其可随荧光活化 细胞计数仪一起使用，或包括类似物，实现轻松分离，或本项技术中广为人知的物体。 抗生蛋白链菌素在一个实施例中可包括藻胆蛋白，例如藻红蛋白、别藻蓝蛋白、荧光素、 得克萨斯红或其组合。
26在一个实施例中，利用抗体进行细胞分离将加入抗体到细胞悬浮液中一段时间，这段时 间足以结合有效细胞表面抗原。培养持续时间不固定，例如在一个实施例中是5分钟， 或者在另一个实施伊j中是15分钟，或者在另一个实施例中是30分钟。任何导致抗体特 异性标记以最小非特异性结合的时间长度都应在这方面考虑进来。
在另一个实施例中，细胞的染色强度可通过流式细胞术监控，而用激光器检测荧光染料 的数量水平(其与抗体结合的细胞表面抗原的数量成比例)。在另一个实施例中，也可 以用流式细胞术或者FACS根据抗体染色强度以及其他参数例如细胞大小和光散射来分 离细胞群落。
可在任何合适的能保持细胞活力的介质中收集经分离细胞，并且在另一个实施例中，在 收集管的底部包括血清垫。
在另一个实施例中，含有本文所用细胞的培养基可含有其他细胞会产生应答的细胞因子 或生长因子。在一个实施例中；细胞因子或生长因子提高存活、促进生长、促进功能或 其组合。在另一个实施例中，含有用于本文的细胞的培养基可含有多肽和非多肽因子。
在其他实施例中，用于本文的方法和/或组合物可包括已知的癌症药物，例如那些准备让 免疫系统攻击肿瘤细胞、前期肿瘤细胞或增生细胞的药物。在其他实施例中，本文涉及 的方法和/或组合物可包括已知的癌症药物，例如血管生成抑制剂，它要通过实体肿瘤供 血发作来发挥作用。由于最恶性癌症会转移(即出现在原发肿瘤部位，种下一个末梢组 织，因此产生继发肿瘤)，能阻止癌症转移的药物对治疗癌症也非常有帮助。血管生成 调节物可能包括基本的成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血 管生成素、血管抑素、内皮抑素、肿瘤坏死因子-a (TNF-a) 、 TNP-470、血小板反应蛋 白-1、血小板因子4、 CAI和蛋白整合素家族的某些成员。因此在某些实施例中，血管生 成抑制剂可以专门被靶向用于阻止此类分子的活动或适当功能。在一个实施例中，抑制 剂可以组成蛋白酶抑制剂，蛋白酶抑制剂可以抑制癌细胞出现在原发肿瘤部位和外渗到 另一个组织所用的各种酶。
在其他实施例中，本文涉及的方法适用于预防肿瘤形成，或者在其他实施例中，预防机 体出现肿瘤转移。肿瘤转移牵涉到肿瘤细胞主要通过血管扩散肿瘤到体内的偏远位置。 在一个实施例中，术语"转移"应是指位于原始肿瘤不相连位置处的肿瘤细胞，通常是 通过肿瘤细胞的淋巴和血行播散。在一个实施例中，术语转移是指肿瘤细胞从原始肿瘤 位置向别处侵袭和迁移。肿瘤转移在某些实施例中是一个区域的癌细胞，在和原始肿瘤 位置不同的地方，并且是由肿瘤细胞从原始肿瘤向身体其他部分扩散的。诊断原始肿瘤 块时，应该同时检测机体是否出现了肿瘤转移。转移最经常使用单独和组合的核磁共振 成像(MRI)扫描技术、计算机X射线断层造影术(CT)、血液和血小板计数、肝功能 研究、胸X射线和骨扫描加上监控特殊症状的方法来检测的。
本文所用与转移有关的术语"预防"是指完全抑制或部分抑制癌症或肿瘤细胞的转移， 以及抑制癌症或肿瘤细胞的转移能力的上升。癌症的侵袭和转移是一个复杂的过程，涉及到细胞黏附属性的变化，它能使变形细胞通 过细胞外基质(ECM)侵入和迁移并获得非锚定依赖性能力。Liotta， L A.，等人Cell 64:327-336 (1991)。某些变化出现在粘着斑，粘着斑是细胞/细胞外基质(ECM)接触 点，含有膜结合、细胞骨架和细胞内信号分子。肿瘤细胞的播散病灶播下支持其生长和 繁殖的组织时，发生转移，肿瘤细胞的刺激扩散与大量癌症的发病率和死亡率有关。
在某些实施例中，本文涉及方法和/或组合物特地在转移之初利用了细胞作为治疗的手 段，或者在另一个实施例中，作为预防的手段，或者在另一个实施例中，作为延迟发作 的手段，或者在另一个实施例中，作为阻止转移发展的手段。
在某些实施例中，本文涉及的方法和/或组合物提供长期的全身性免疫应答，从而不仅对 原始肿瘤，也对与原始肿瘤共享肿瘤抗原的转移细胞有效。在某些实施例中，本文涉及 的方法和/或组合物对于多种类型肿瘤有效，其可能在某种程度上例如与这些肿瘤中抗原 表达或下调有关，并代表本文的实施例。
在一个实施例中，本文涉及的方法和/或组合物是用于治疗癌症。在一个实施例中，术语 "治疗"是指尝试介入治疗，改变正在治疗的个体或细胞的自然病程，而且这么做也可 用于预防或在临床病理阶段。合意的效果包括预防疾病发生或复发、缓解症状、减少任 何直接或间接的疾病病理后果、预防肿瘤转移、降低疾病发展速率、改善或缓和疾病状 态，并缓解或提高预后。 '
在某些实施例中，提供一种方法，下调、抑制或耐受对象对相关肽或蛋白的免疫应答。 这些方法通过非限制性实施例对预防或减轻移植排斥和自体免疫疾病。对于移植排斥(移 植物抗宿主病)，免疫应答向下调节针对的抗原包括移植物的肽或蛋白。对于移植物抗 宿主病，其中移植物中的免疫细胞攻击宿主，免疫应答向下调节针对的抗原包括移植物 受体或宿主的肽或蛋白。在其他实施例中，可用本文一般性描述的方法来治疗自体免疫， 其中相关肽或蛋白是自身或宿主或抗原。在此方面的实践中，将未成熟树突状细胞与编 码相关肽或蛋白的核酸接触，该核酸在编码框内与另一种核酸融合，后者编码自噬体LC3 蛋白，或其功能性片段。接触可以是在体外或者在体内，后者一般是通过将载体靶向导 向至免疫树突状细胞。自噬体靶向蛋白或其功能性片段将所述相关肽或蛋白靶向导向至 自噬体，而所述肽或相关所述蛋白的片段通过主要组织相容性复合体(MHC) II类分子 被展示到所述未成熟树突状细胞的表面上。这导致通过T细胞缺失或无反应性的过程对 相关肽或蛋白的免疫应答下调。在平稳状态下，树突状细胞处于未成熟状态，并且没有 完全分化以执行其已知的作为免疫诱导物的功能。不管怎么说，未成熟树突状细胞在组 织里连续循环，并进入淋巴器官，捕获自身抗原以及无害环境蛋白。最近的实验(Steinman 和Nussenziweig所评述，2002， Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 99， 351-358)提供直接证据， 抗原负荷未成熟树突状细胞通过删除或扩张调节性T细胞来沉默T细胞。
在一个实施例中，自噬体靶向蛋白是LC3蛋白。在另一个实施例中，核酸包括同源于或 对应于SEQIDNO: 1的序列。如上所述，其中该方法用于预防或降低移植排斥或移植物 抗宿主病，相关肽或蛋白是移植物抗原，源自移植的组织或器官；或者宿主(自体)抗 原。该方法用于治疗机体的自体免疫，而相关肽或蛋白是自体抗原。服从治疗的自体免 疫疾病的非限制性实例包括I型糖尿病(IDDM)、全身性红斑狼疮(SLE)、舍格伦综合症、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病和风湿性关节炎(RA)。
疾病相关的"病理学"是指有损患病个体的幸福度、正常生理功能或生活质量的任何情 况。这包括(但不限于)破坏性的侵袭从患病组织到此前未患病的区域，以消耗正常组 织功能为代价的生长，不规则或压抑的生理功能，炎症或免疫应答的恶化或抑制，其他 致病生物体或媒介增加易感性，以及不合意的临床症状，例如疼痛、发热、恶心、疲倦、 情绪变动或其他由主治医生决定的病情。
在某些实施例中，本文涉及的核酸、载体、细胞、方法和/或组合物提供针对本文描述的 任何感染的预防、抑制、治疗、症状缓解等。在某些实施例中，抗原是疾患，或者在另 一个实施例中来自多重感染/疾病的多重抗原用做泛疫苗策略，这应当为熟悉本项技术的 人了解。
在某些实施例中，提供有效量的本文涉及的核酸、载体、细胞给对象，其在一个实施例 中，是指足以产生有益的或合意的临床结果的量，特别是指引起免疫应答，或临床病症 得到引人注意的改善。免疫量是足以让受治疗对象(无论患病与否)引起合意的免疫应 答的量。关于患病对象的临床应答，有效量是足以减轻、缓和、稳定、逆转或减缓疾病 发展的量，或者降低疾病的病理后果的量。有效量可以按照单剂量或均分剂量来给。应 了解本文涉及的方法和/或组合物可提供免疫或治疗有效量，这两者本文都要考虑到。
在某些实施例中，治疗可经由监控疾病发展的标准协议来确认，例如，如果是患有肿瘤 的患者，这种监控可通过例如使用核磁共振(MRI)、用适当显像剂的放射性闪烁照相
法、监控循环肿瘤标记抗原、对象的临床应答，或其组合来发挥作用。例如，并且在一
个实施例中，合适的临床标记是用于监控高级卵巢癌的血清CA-125。 Helmpling等人 (1993) J. Surg. Oncol. 54:38-44。
根据本文涉及的方法投予组合物和/或细胞在一个实施例中，可以根据月、双月来进行， 或者在另一个实施例中，根据星期为基础，直到取得合意的效果。然后，并且特别当免 疫或临床益处开始降低，这时可执行并以适当方式设计另外的强化方案或维持方案，这 应为熟悉本项技术的人了解。
当多重剂量的细胞疫苗给予相同患者，应当特别注意异源的淋巴球在疫苗中产生抗异型 应答的可能性。使用来自多个供体的异源细胞混合物，并且在每一剂中用不同异源细胞 种群，都是帮助尽可能降低出现抗异型应答的策略。
在治疗过程中，在常规基础上评价对象在注射部位的副作用，或者一般性副作用，例如 发热反应。副作用通过合适的支持性临床护理来处理。
在某些实施例中，提供基因传递系统，其在某些实施例中，利用病毒性载体，其含有自 噬体靶向蛋白，其在一个实施例中是与病毒性、细菌性或肿瘤抗原耦合的LC3。这些系 统的疫苗在某些实施例中，推动CD4+ T细胞针对靶向抗原的免疫，而不需融合蛋白在 每个感染细胞或肿瘤细胞中表达。在某些实施例中，提供采用载体投予的方法用于主动免疫，采用体外感染例如树突状细 胞过继转移用于主动免疫，采用体外刺激CD4+ T细胞用于被动免疫，或其组合，通过 靶向抗原用于本文所述的MHCII类呈递。在一个实施例中，根据本文涉及的方法使用未 患病抗原呈递细胞用于用LC-3抗原融合蛋白的间接体内转染。在某些实施例中，根据文 本涉及的这些方面，使用了单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞核上皮细胞。
在另一个实施例中，组合物可迸一步包括佐剂，例如来自革兰氏阴性细菌的技术酸
(technic acid)，例如LTA、 RTA、 GTA和他们的合成对应物、血蓝蛋白和血赤藓素， 例如KLH、角素或壳聚糖。在另一个实施例中，佐剂可能包括胞壁酰二肽(MDP)、三 胜肽聚醣和他们的衍生物，例如苏氨酸-NDP、脂肪酸衍生物，例如MTPPE，和U.S.Pat 第4,950,645号中描述的且作为参考而纳入本文的衍生物。BCG、BCG-细胞壁骨架(CWS) 和海藻糖单霉菌酸酯和二霉菌酸酯(U.S. Pat.第4,579,945号和第4,520,019号，皆作为参 考而纳入本文)也可被用作本文里的佐剂，可以单独使用或与两种或三种试剂结合使用， 或与单磷酰脂质A (MPL)结合使用(请见Johnson等人(1990) ， Grabarek等人(1990)、 Baker等人(1992; 1994) 、 Tanamoto等人(1994a; b; 1995) 、 Brade等人(1993)和 U.S.Pat.第4987237号。两性分子和表面活性剂，例如QS21，和非离子嵌段共聚物表面 活性剂能组成另一组择优佐剂。尽管这些佐剂在本文中涉及的所有方面都很有帮助，但 是它们在组合物中具有特殊效用，能生成或提高针对细胞内抗原的免疫响应度，包括细 胞内肿瘤抗原。
在另一个实施例中，本文涉及的组合物包括可用于制造药用组合物的原料药组合物(例 如不纯的或未消毒组合物)和药用组合物(即，适用于投予对象或患者的组合物)，其 可用于制备单位剂型。这类组合物包括预防性或治疗性有效量的本文披露的预防性和/或 治疗性试剂或这些试剂的组合和药学上可接受的载体。
在一个实施例中，术语"药学上可接受"表示联邦管理机构或州政府批准的药物，或美 国药典上列举的或其他公认用于动物特别是人的药典上列举的药物。术语"载体"在另 一个实施例中是指稀释剂、佐剂(例如福氏佐剂(完全的或不完全的))、赋形剂或媒 剂，治疗剂随载体一起投予。这类药学载体可为无菌液体，例如水或油，包括石油、动 物油、植物油或合成油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油和类似物。水是另一种 载体，在另一个实施例中，当经静脉投予药物组合物时用到了水。盐溶液和葡萄糖水和 甘油溶液也可在其他实施例中用作液体载体，包括可注射溶液。合适的药学赋形剂在其 他实施例中可包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、凝胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、 硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、干脱脂乳、丙三醇、丙烯、乙二醇、水、 乙醇等。如果愿意的话，组合物中还可以含有少量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些 组合物的形状多种多样，有溶液、悬浮液、乳状液、药片、药丸、胶囊、粉末、持续释 放剂型配方等。
本文涉及的组合物可配置成中性或盐的形式。药学上可接受的盐包括但不限于用阴离子 形成的盐，例如来自氢氯酸盐、磷盐、乙酸盐、草酸盐、酒石酸盐等，以及用阳离子形 成的盐，例如来自钠盐、钾盐、铵盐、钙盐、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙胺醇、 组氨酸、普鲁卡因等。根据这些方面，且在一个实施例中，本文涉及的组合物和/或本文涉及的方法所用组合物 可的剂量和时间表，可根据投药对象的年龄、健康情况、性别、体格和体重来确定。这 些参数可为每个系统用成熟程序和分析法分别测定，例如I期、II期、III期临床试验， 或其他手段，熟悉本技术的人应该能了解。
为了投药，本文涉及的细胞、核酸和/或载体可与药学上可接受的载剂结合，例如合适的 液体媒剂或赋形剂和可选助剂或添加剂。液体媒剂和赋形剂是传统商用的。其中的例子 是蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液和类似物。
适当的非经肠、经表面、经粘膜例如经口、经鼻等，或经腹膜投药的配方包括活性化合 物在水溶性或水分散形式中的水溶液。另外，可投予活性化合物悬浮液作为合适的油性 注射悬浮液。合适的亲油溶剂或媒剂包括脂肪酸，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如 油酸乙酯或甘油三酸酯。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液黏性的物质，例如羧酸甲基 钠纤维素、山梨糖醇和/或葡聚糖，可选地，悬浮液也可包括稳定剂。在其他实施例中， 细胞可混合本项技术中为人熟知的免疫佐剂，例如福氏完全佐剂，无机盐，例如氯化锌、 磷酸钙、氢氧化铝、磷酸铝、皂角苷、聚合物、脂质或脂质组分(脂质A、单磷酰基脂 质A)、构建的寡核苷酸等。
制备和投予药学组合物的一般程序在Remington's Pharmaceutical Sciences第18版 (1990) ， E. W.Martin编辑，Mack Publishing Co., PA中介绍，并代表本文的实施例。
除了与常规载剂一起投药，细胞、核酸、载体和/或其他活性成分可用许多种熟悉此项技 术的人已知的不同的专门投递药物技术来投予。下列实施例仅作为示范，并非要限制本 发明。
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一银赢
HaCat (人角化细胞系)由Rajiv Khanna赠予，布里斯班，澳大利亚。MDAMC (人乳癌 细胞系)由Irene Joab赠予，巴黎，法国。从ATCC购买Hela和293。 EBV改造的B淋 巴球细胞系MS-LCL通过RPMI-1640 + 20% FCS + 2mM谷酰胺+ 2吗/ml庆大霉素+ lpg/ml环孢霉素A，用狨的细胞系B95-8的上清液培养健康供体PBMC来生成[Miller, G., 等人，IARC SciPbul, 11,395-408. (1975)]。两个EBV阳性霍奇金淋巴瘤细胞系RPMI6666 和L591分别是从ATCC购得，及由Martina Vockerodt和Dieter Kube赠予，哥廷根，德 国。小鼠杂交瘤IVA12 (抗-人MHCII类)和w6/32 (抗-人MHCI类)是购自ATCC。 上皮细胞系通常是在DMEM中用10%FCS、 2mM谷酰胺、1 lO^g/ml丙酮酸钠和2pg/ml 庆大霉素。B细胞系和杂交瘤在RPMI-1640中用10%FCS+谷酰胺+庆大霉素维持。
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白细胞收集自(血沉棕黄层)自纽约血液中心或来自被当作PBMC之源的健康实验提供 者的捐献，白细胞用密度梯度离心法在Ficoll-Paque上分离(Amersham-PharmaciaBiotech) 。 CD14-阳性单核细胞/巨噬细胞的阳性选择釆用来自Miltenyi Biotec， Bergisch-Gladbach，德国的抗-CD14微珠。树突状细胞(DC)自CD-14阳性的细胞生成， 通过用RPMI-1640 + 1%单供体血浆+谷酰胺+庆大霉素将6.6><105€014+细胞/ml置 于六孔培养板上。在第0、2和4天加入重组人白细胞介素4(rhlL-4，500U/ml)和rhGMCSF (1000U/ml)。在第5天，将漂浮着的未成熟DC以3.3xl(^细胞/ml被转移到新的培养 板上，并且加入一半含有LPS (100ng/ml， Sigma，圣路易斯，密苏里)或白细胞介素l卩 IL-1卩(10ng/ml)、白细胞介素6IL-6 (1000U/ml)、肿瘤坏死因子aTNF-a (10ng/ml) 和PEG2 (lpg/ml)的新鲜培养液来替代旧培养液，使树突状细胞成熟。所有的细胞因子 获得自R&D Systems (明尼阿波利斯，明尼苏达州)、Peprotech (Rocky Hill，新泽西州)、 Berlex (里士满、加利福尼亚州)或Sigma (圣路易斯，密苏里州)。
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流感病毒A基质蛋白1 (MP1)特异性T细胞克隆9.2、 9.26和10.9是根据前述生成的 [Fonteneau， J.F.等人，J Immunol Methods 258， 111-26. (2001)]。简而言之，分离自实 验供体全血的CD14-阴性PBMC (HLA-A*0201， -A*6801， -B*4402， -B*0702， -C*0501， -C*0702， -DRB1 *1501 ， -DRB1 *0401 ， -DRB5*01 ， -DRB4*01 ， -DQBI*0602和-DQBl *0301 ) 用自体成熟DC刺激，DC用体外转染流感A MPl-RNA进行电穿孔，这是来自Irina Tcherepanova of Argos Therapeutics, Durham, NC的赠品(PBMC:DC比=30:1，介质 RPMI，含5%人血清+谷酰胺+庆大霉素)。DC用10吗RNA在Opti-MEM中于300V 和150pF下，用BioRad Gene Pulser加上Capacitance Extender进行电穿孔(BioRad， Hercules,加利福尼亚州)。在PBMC/DC共同培养的第8天，重复刺激并加入10U/ml白 细胞介素2 IL-2增强T细胞的存活率。在第21天，通过以10、 1或0.3细胞/孔有限稀释 克隆存活细胞，并在RPMI-1640 + 8% PHS + 150U/mlrhIL-2 (Chiron, Emeryvill，加利福 尼亚州)十l吗/mlPHA-L (Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州)+谷酰胺+庆大霉素 中扩增。加入1()S辐射的PBMC/孔和1(^辐射的LCL/孔作为饲养细胞。在第40天，扩增 细胞在单独的孔中用干扰素Y酶联免疫斑点法检测中测试MP1肽混合的识别情况(用10 个氨基酸与64 15-mer肽重叠)和HLA-A2免疫显性抗原决定簇MP158.66 (GILGFVFTL)。 通过用抗-CD4-PE和抗-CD8-PE (BD Biosciences Pharmingen，圣地亚哥，加利福尼亚州) 染色测试特异性MP1克隆的CD4/CD8表达，及用流式细胞术进行后续分析。特异性MP1 ， 同源性CD4+或CD8+克隆如上所述扩增，并冰冻为5xl(^细胞/冷冻管的等分试样。所有 的肽都是购自洛克菲勒大学的Proteomics Resource Center。
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氯喹(CQ)是购自Sigma，圣路易斯，密苏里州，并按50pM使用。重组人干扰素Y (正Ny) 是购自ProSpec-TanyTechnoGeneLTD，以色列，并按200U/ml使用。
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人MAP1LC3B (NM一022818)的cDNA序列通过RT-PCR用基因特异性引物从人B-LCL 克隆到哺乳动物表达载体pEGFP-C2 (Clontech， Mountain View，加利福尼亚州)。为了 生成稳定表达GFP-LC3的HeLa和293细胞系，EGFP-LC3基因用脂质体Lipofectamine 2000(Invitrogen， Carlsbad，加利福尼亚州)瞬时转染入细胞系中，而随后在500吗/ml G418 存在下培养细胞。流感A/WSN/33基质蛋白1 ( MP1 )的cDNA是自 pCAGGS/MCS-PCRMPl载体的扩增，来自Peter Palese， Mount Sinai School of Medicine,
32纽约的赠品，其具有或不具有3'末端的终止密码子。然后将PCR产物插入pEGFP-LC3 载体中EGFP序列的位置，以获得MP1-LC3融合基因。对于慢病毒基因来说，将 EGFP-LC3、 MP1-LC3或MPlStop-LC3序列亚克隆到慢病毒载体pHR-SIN-CSGWANotI, 这是来自Jeremy Luban，哥伦比亚大学，纽约的赠品。为了生成慢病毒颗粒，慢病毒载 体通过硫酸钙转染法，用辅助质粒pCMVAR8.91和pMDG共同转染到293 T细胞。含有 重组病毒颗粒的培养上清液在转染后第1、2和3天收获，经0.45pm过滤器过滤并在-80。C 冰冻。稳定表达GFP-LC3、 MPI-LC3或MP1的HaCat和MDAMC细胞系用10-40的 MOI通过慢病毒转染来生成。
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LC3抗血清通过用共轭到KLH载剂蛋白(CocalicoBiologicals， Reamstown，宾夕法尼亚 州)的N-末端肽LC3w5 (MPSEKTFKQRRTFEQR; SEQ ID NO: 4)免疫两只兔子来生 成。使动物增强5次(初次接种后2、 3、 7、 11和15周后)然后杀死获得终端血。收集 自一只兔子的抗血清通过酶联免疫反应ELISA和Western印迹法显示出优良的LC3反应 活性，并在稀释比1:2000时用于Western印迹法。流感特异性MP1兔子抗血清是来自 AriHelenius，苏黎世，瑞士的赠品。
2游基厉浙劍rW胁W " 用了下列的21-nt siRNA寡核苷酸
Atgl2的正义链5，-UCAACUUGCUACUACAUGAUdT (SEQ ID NO: 5)
Atgl2的反义链5，-UCAUGUAGUAGCAAGUUGAUdT (SEQ ID NO: 6; NM—004707的 nt. 687-705)。作为对照，使用了来自Dharmacon核纤层蛋白A/C特异性siRNA (核纤层 蛋白的正义链5，-CUGGACUUCCAGAAGAACAdTdT (SEQ ID NO: 7);核纤层蛋白的反 义链5，-UGUUCUUCUGGAAGUCCAGdTdT (SEQ ID NO: 8)或萤火虫荧光素酶特异性 siRNA (GL2的正义链5，-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT; SEQ ID NO: 9; GL2的反 义链5，-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT; SEQIDNO: 10))。在24孔板中加入30 pmol siRNA + 1.5ml月旨质体lipofectamine/孑L ，用月旨质体Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 转染来输送双链siRNA，在2-3天之后，分析基因抑制效应。
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在冰上的冰冷溶解缓冲液中溶解细胞(50mMTris-HClpH8.0， 140mMNaCl， lmMDTT， 1.5mMMgCl2， 0.5%NP-40以及完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒，Roche,印第安纳波利斯， 印第安那州)5分钟(大约106细胞/10(^1)。全细胞和细胞碎片被低速离心处理为颗粒 (400g， 3分钟)，而将清除的上清液转移到新的管中。蛋白浓度通过BCA蛋白检测 (Pierce, Rockford，伊利诺州)来确定。在4xSDS-PAGE上样缓冲液(250mM Tris-HCl pH6.8， 40%甘油，8%SDS, 0.57Mp-巯基乙醇，0.12%溴苯酚蓝)中煮沸样品5分钟。 将等量蛋白在11%或12% SDS-PAGE凝胶上电泳，并转移到PVDF膜上(Hybond-P， Amersham， Biosciences,英国)。用HRP共轭的山羊抗-兔IgG (Biorad， Hercules;力口 利福尼亚州)和ECLplus检测系统(Amersham, Biosciences,英国)可观察到第一抗体。 作为上样对照，用抗p-肌动蛋白抗体(克隆AC-40, Sigma，圣路易斯，密苏里州)和 HRP共轭的山羊抗小鼠IgG (Biorad， Hercules,加利福尼亚州)重新探测印记。^i^:银應众学^^f^^屋潋鏡i^桥
将上皮细胞置于24孔板上覆盖的显微镜盖玻片上，并在37°C下过夜培养。在PBS中洗 涤细胞1次，并在室温下(RT)的PBS中的3%多聚甲醛中固定15分钟。在PBS中洗 涤细胞1次，并在室温下(RT)的PBS中的0.1% Triton X-100中渗透5分钟。用PBS 又一次冲洗后，用封闭液(来自PerkinElmer的TSA试剂盒)+ 0.1%皂角苷封闭细胞30 分钟。室温下(RT)将第一抗体加入封闭液+0.1%皂角苷+5%正常血清(山羊或驴， 取决于第二抗体)30分钟(第一抗体抗MHC I类和II类抗体(杂交瘤上清液IVA12 和w6/32杂交瘤，ATCC)，抗-HLA-DM (克隆MaP-DMl， BD， Biosciences Ph腿ingen， 圣地亚哥，加利福尼亚州)，抗-LAMP-2 (克隆H4B4， Southern Biotechnology Associates, Birmingham,阿拉巴马州)，抗-EEAl (Santa Cruz Biotech,圣克鲁兹，加利福尼亚州) 和抗铁传递蛋白受体(克隆DF1513， Sigma，圣路易斯，密苏里州))。fflPBS + 0.1% 皂角苷洗涤细胞3x5分钟，并用封闭液中的第二抗体+0.1%皂角苷+5%山羊或驴的正 常血清在黑暗中培养30分钟(第二抗体Rhodamine-RedTM-X-(RRX)-共轭驴抗小鼠IgG 和RRX-共轭驴抗山羊IgG( Jackson ImmunResearch， West Pine，宾夕法尼亚州)和Alexa546 共轭的山羊抗兔子IgG (Invitrogen-Molecular Probes, Carlsbad,加利福尼亚州))。随 后用DAPI核酸染料(0.5pg/ml，分子探针Molecular Probes)将细胞培养1分钟，然后 用PBS + 0.1%皂角苷洗涤细胞3x5分钟，以及用PBS洗涤lx分钟。最后，用Prolong Gold 抗荧光试剂(Invitrogen-Molecular Probes, Carlsbad,加利福尼亚州)将盖玻片装在显微 镜载片上，并在黑暗中干燥载片。用逆LSM 510激光器扫描共聚焦显微镜(Zeiss Axiovert 200)分析细胞，其具有采用405nm 二极管激光器和氩气激光器(488nm和543nm激光 线)和lAiry单位的针孔直径的63x/1.4N.A.油浸没透镜。用LSM 510共聚焦软件(Zeiss) 拍摄照片。标记的共存用LSM510软件的剖面图和柱状图工具量化处理。在剖面图分析 中，双阳性囊泡的数量与红色囊泡的总数量的比较是在10-15双阳性细胞/条件测定的。 在柱状图分析中，共存像素的数量比起以上背景红色通道像素的总数量是在10-15双阳 性细胞/条件(通过LSM510算法测定每个细胞的背景阈值)中测定。
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用GFP-LC3稳定转染的MDAMC细胞在室温下用4。/。多聚甲醛(PFA， Electron Microscopy Sciences)在0.25M Hepes， pH 7.4中固定1小时，然后在4。C下的8% PFA/Hepes中过 夜固定。用PBS洗涤细胞1次，用PBS中的0.1M NH4C1淬灭10分钟，在PBS中刮去 1%凝胶并嵌入在PBS中的5%凝胶中。小片凝胶颗粒在4°C下用PBS中的2.3M蔗糖过 夜过滤，安装到冷冻样本针脚上，并在液氮中冷冻。用具有FCS冷冻附件的Leica超薄 超微切片机在-108。C下切割超薄切片(80nm)，并在Formvar和碳涂覆的镍网上用1:1 的2%甲基纤维素(25厘泊；Sigma-Aldrich)和PBS中的2.3M蔗糖混合物收集。用PBS 中的0.1MNH4C1淬灭10分钟，将网在PBS中的1%鱼皮凝胶(FSG， Sigma-Aldrich)溶 液中培育20分钟。室温下将其用PBS-FSH中的兔子抗-HLA-DR抗血清C6861(来自Peter Cresswell，耶鲁大学，纽黑文，康涅狄格州)标记30分钟，在PBS中洗涤4次，并用 10或15nm蛋白A胶体金培育(购自荷兰乌德勒支大学细胞生物学系)。在PBS中洗涤 4次以上后，室温下网在PBS中的1%戊二醛中固定5分钟，在PBS中洗涤5次，再用 PBS中的0.1M NH4C1淬灭10分钟。用兔子抗-GFP抗体(Invitrogen-Molecular Probes, Carlsbad,加利福尼亚州)重复相同的标记程序，在最后在1%戊二醛中的固定之后，将 网在HPLC级的水中洗涤8次。切片在冰上用1.8%甲基纤维素和0.5%乙酸铀酰(ElectronMicroscopy Sciences, Hatfield, PA)渗透10分钟，在0.5%乙酸铀酰/1.8%甲基纤维素中 洗涤3遍并风干。用Tecnai 12 Biotwin (FEI)显微镜分析样本，用柯达Kodak 4489底片
拍摄照片。
用200u/ml干扰素y (IFN-y)处理MP1和MP-lc3表达耙向细胞24小时，以便上调 mhc II类表达。在dmem中洗涤细胞3遍，除去干扰素y，用胰岛素-edta (Trypsin-EDTA)将之分开，并与5% 1 +谷酰胺+庆大霉素(5。/。PHS介质) 一起 悬浮在RPMI-1640中。在5% PHS介质中洗涤T细胞克隆1次，并置于圆底的96孔培 养板上，105丁细胞/孔。按照效靶比(E:T比)2、 5和12.5的比例加入靶向细胞，即5xl04、 2xl。4和8xl()4耙/孔。
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培养上清液中的干扰素y用来自Mabtech Inc. Mariemont, OH的人干扰素Y的酶联免疫反 应测量。简而言之，96孔的Nunc-Immuno MaxiSoup培养板(Nalge Nunc Intl., Rochester, NY)上涂以干扰素y第一抗体1-D1K (Mabtech)过夜并用PBS中的1% BSA封闭1小 时。源自CD4+ T细胞克隆的培养上清液稀释成1:2，而源自CD8+ T细胞克隆的培养上 清液在PBS/0.1% BSA、 0.05% Tween-20中稀释成1:20。将稀释上清液加到板上2小时， 然后用生物素化的干扰素y抗体7-B6-l (Mabtech)禾tl Streptavidin-HRP (Mabtech)各自 培育1小时。干扰素Y用过氧化物酶底物TMB (Sigma，圣路易斯，密苏里州)检测。 采用在PBS/0.1% BSA/0.05% Tween-20 (2000至30pg/ml)中稀释的重组人干扰素y (Mabtech)作为标准。
魔式微术
上皮细胞上的MHC II类表面水平通过染色细胞用IVA12杂交瘤上清液和AlexaFluor488 共轭兔子a-小鼠IgG (Invitrogen-Molecular Probes, Carlsbad,加利福尼亚州)。在 FACScalibur仪器上分析细胞(Becton-Dickinson)。
统f/
请应用成对或同方差、单侧学生T-检验统计结果。
实例1
人上皮细胞系中溶酶体蛋白酶组成性周转自噬体
为了测试MHC II类阳性人上皮细胞是否显示出组成型自噬作用，测定人上皮细胞系的自 噬水平。响应体外和体内炎症细胞因子，上皮细胞容易上调MHCII类分子。因此有必要 确定是否这些细胞系依赖于内源性降解途径，例如自噬作用，生成MHCII类分子的肽配 体。为了量化自噬作用，使用了特异性自噬体标记Atg8/LC3。 LC3是一种泛素类蛋白， 经过其C-末端与在新形成的内自噬体膜和外自噬体膜中的磷脂共价耦合，并且特异性结 合到自噬体中。自噬体寿命很短(t1/2 = 8min)，并且与核内体或溶酶体快速融合，形成 所谓的自噬泡(amphisomes)或自溶酶体。在这些融合室中，囊腔内LC3由溶酶体蛋白 酶快速降解。自噬体形成得越多，LC3在自溶酶体中降解得越多，因此，LC3的溶酶体周转率可很好地测量自噬活动。
为了将人上皮细胞内的LC3的溶酶体周转率通过荧光显微镜视觉化，源自不同器官的， 胞系[HaCat (皮肤)、HeLa (颈部)、MDAMC (胸部)、293 (肾脏)]用GFP-LC3融 合基因转染。GFP-LC3报告基因曾经用于观察检测转基因小鼠和培养细胞中的自噬体， 并且其已经证明GFP-LC3的过表达并不改变自噬活动。GFP-LC3转染细胞系用溶酶体酸 化抑制剂氯喹(CQ)处理，以便封闭溶酶体蛋白质水解并因此可观察自噬体中的GFP-LC3 的累积。在本项研究分析的所有细胞系中，CQ处理10小时后，GFP-LC3在胞浆囊泡中 的明显累积(图1A)，表明在10小时的，大量GFP-LC3标记的自噬体已经形成并与溶 酶体融合。可在早至CQ处理的1-2小时后，可观察到明亮的GFP-LC3标记的囊泡的累 积(数据未显示)，但在抑制剂中IO小时后变得更加醒目。虽然自噬作用与营养不足有 关系，GFP-LC3的逐渐累积证明自噬体连续传递GFP-LC3用于溶酶体降解，g卩，营养富 足的情况下，自噬作用在人上皮细胞系有组成型活性。
为了量化人B细胞和树突状细胞中的巨自噬作用，将在EBV改造的B淋巴母细胞系 (LCL)和源自单核细胞的未成熟DC和成熟DC中的慢病毒传递的GFP-LC3的周转率 进行视觉化处理。为了评价GFP-LC3在专职APC中的溶酶体周转率，稳定表达GFP-LC3 和GFP-LC3表达的未成熟DC和成熟DC的经EBV改造的B淋巴母细胞系(B-LCL)用 50mM氯喹处理10小时(+CQ)，或不作处理(无CQ)。将细胞固定，用DAPI染色， 并用共聚焦显微镜分析。比例条代表20mm。来自三个实验中一个的代表区域如图所示。 在所有三种细胞类型中，GFP-LC3标记的自噬体在用CQ处理10小时后显著累积(图 1B)，表示组成型自噬体的周转。
然后，在专职APC，特别是树突状细胞中研究自噬体与MHCII类负荷室的重叠。CD14+ 单核细胞用慢病毒GFP-LC3报告基因转染，生成未成熟DC和成熟DC，并用MHC II 类特异性抗体染色。因为DC是组成型MHC II类阳性，这些实验不需要干扰素g (IFN-g) 处理。
在用CQ处理10小时后，未成熟DC的MHC II类室通常含有自噬体标记GFP-LC3 (图 1C，上部图块)。共存分析证明41% (±7%)的MHCII类标记室对GFP-LC3是阳性的。 在大多数成熟DC中，MHCII类分子主要位于细胞表面(图1C，下部图块)，并且因此 与自噬体的重叠最小。但是，在CQ处理后，仍然拥有某些囊泡内MHCII类染色的细胞 子集中，GFP-LC3通常位于这些MIIC之内(图1C，下部图块，白色箭头)。不存在溶 酶体酸化抑制剂CQ， GFP-LC3主要存在于胞浆中，只有非常少的GFP-LC3+囊泡可在未 成熟DC和成熟DC中同时观察到(参见图1B)。因此，未处理DC不能进行共存分析。 但是，GFP-LC3在CQ处理过的未成熟DC和成熟DC的MIIC中的累积说明自噬体进入 MHCII类途径不仅仅在上皮细胞系中，也在专职APC中，即树突状细胞。
为了证明巨自噬作用是传递MP1-LC3到MHC II类负荷室所必需的，稳定表达MP1-LC3 的MDAMC细胞用对照siRNA (萤火虫荧光素酶特异的)转染或atgl2特异的siRNA。 36小时后，用200U/ml干扰素Y处理细胞，以便上调MHC II类表达，并再培养36小时。 为了预防溶酶体蛋白酶降解MP1-LC3，用50pM氯喹处理细胞(图1D; CQ)。将细胞 固定，用MPl-和MHCn类特异性抗体和DAPI染色，并用共聚焦显微镜分析。比例条-l(Him。来自两个实验中一个的代表区域如图所示。在对照siRNA处理的细胞里，可观察 到含有MP1-LC3的囊泡的实质部分与MHC II类室共存，但这一共存在atgl2后完全消 失了。
为了说明氯喹处理引起GFP-LC3在自噬体中逐渐累积，并且与营养饥饿有重大区别。用 GFP-LC3报告基因稳定转染的293细胞没有处理(图1E，无CQ)，或者用50pM氯喹 (CQ)处理2小时或0小时。将细胞固定、用DAPI染色，并用荧光显微镜分析。用 CQ抑制溶酶体酸化导致用GFP-LC3标记的自噬体逐渐累积。来自两个实验中一个的代 表区域如图所示。在图1F中，MDAMC细胞没有处理(-)，用Hanks平衡盐溶液(饥 饿)培养，用50pM氯喹(+CQ)或用蛋白酶抑制剂E64 (28pM)、亮肽素(40^M)和 胃酶抑素A (15nM) (+蛋白酶抑制剂)处理10小时。全细胞裂解液在12% SDS-PAGE 凝胶上电泳，且LC3-I和II用LC3抗体Western印迹法视觉化处理。肌动蛋白印迹说明 蛋白质负荷相等。尽管营养饥饿使LC3-II变弱，但通过用CQ或溶酶体抑制剂E64来抑 制溶酶体蛋白酶，亮肽素和胃酶抑素A造成LC3-II大量累积。两个实验中的一个如图所 示。(g)用核纤层蛋白A/C或ATG12特异的双链siRNA模拟转染或转染稳定表达 GFP-LC3的MDAMC细胞。2天后，用50mM CQ处理细胞6小时(+CQ)或不处理(无 CQ)，用DAPI染色，再用落射荧光显微镜检测。两个实验中的一个如图所示。因此， 明亮的GFP-LC3标记的囊泡的累积可在CQ处理后2小时观察到(图1E)，与这些囊泡 的快速降解动力学高度一致。经过CQ处理的GFP-LC3+囊泡的累积取决于巨自噬作用， 因为siRNA介导的ATG12的基因抑制效应，自噬体形成的必要基因完全消除了这些囊 泡的累积(图1G)。
实例2
自噬作用是人上皮细胞系和专职APC中的组成型活性过程
为了将从转染GFP-LC3获得的结果扩展到内源性自噬体，量化内源性LC3的周转率。这 也使得将该分析从上皮细胞系扩展到更难转染的MHC II类阳性细胞类型，例如B细胞 系和原始单核细胞/树突状细胞。运用了自噬体结合的LC3 (所谓LC3-II)和自由胞浆LC3 (所谓LC3-1 )可通过它们在SDS-PAGE凝胶电泳中的表观分子量(分别是16和18kD) 这一事实，因为抗LC3 Western印迹法可分别进行量化。
不同的人上皮细胞系和B细胞系，初级CD14+单核细胞和源于单核细胞树突状细胞可在 存在或不存在溶酶体蛋白酶抑制剂CQ的情况下培养10小时，然后用免疫印迹法量化 LC3-II的累积。所有检查的细胞类型中，自噬体结合的LC3-II在CQ处理后明显累积(图 2a和b)，说明LC3-II标记的自噬体在内体/溶酶体中组成性降解超过10小时。如图2c 所示，对于HaCat细胞系，细胞LC3-II水平在CQ处理后1小时己经增加，并且经过更 长时间的处理后逐渐累积，证明自噬体是持续生成。Western印迹的密度量化披露LC3-I1 在CQ处理后10小时累积了 5倍(HaCat和MDAMC细胞)和30倍(293细胞)。总 的来说，这些实验证明自噬作用是在所有分析的人细胞类型中的一种组成型活性过程。 另外，组成型自噬作用并不限于改造过的细胞系，也是初级细胞的一种特征，原始单核 细胞和树突状细胞已经证明这点。
实例3GFP-LC3与MHC II类负荷室的标记在干扰素y处理的人上皮细胞系中共存
为了测试自噬体是否与MHC II类负荷室(MIIC)融合，采用共聚焦显微镜检查是否自 噬体标记GFP-LC3与MIIC标记共存。MIIC已经被表征为传统晚期核内体室，除了晚期 核内体/溶酶体标记，例如LAMP-1和LAMP-2，还含有MHC II类负荷的组分，艮P MHC II类和肽负荷分子伴侣HLA-DM 1 。
分析上皮细胞，因为上皮细胞由于其有限的内噬可能性，可能很大程度上依赖内皮MHC II类抗原处理。大多数使用的人上皮细胞系，除了 293细胞，在干扰素y处理后表达MHC II类分子(图3a)。为了共存分析，用干扰素Y处理细胞，暂时用GFP-LC3报告基因转 染，并用MDAMC中的MIIC标记MHC II类、HLA-DM和LAMP-2 (图3b)和HaCat 细胞的特异性抗体染色(数据未显示)。我们没有观察到引发自噬作用或自噬体模式在 干扰素Y处理用于本研究的人细胞后的变化(数据未显示)，但是干扰素Y处理引发MHC II类阳性室的形成。如图3b所示，这些MHC II类阳性室通常与GFP-LC3共存。当我们 用LSM510软件的剖面图工具(其将强度剖面图与细胞截面图重叠起来)量化MHC II 类和HLA-DM与GFP-LC3的共存后，我们发现在双重阳性细胞中，58%的MHC II类+ 和52%的HLA-DM+室是GFP-LC3阳性的。相似地，用LSM510软件的柱状图工具，这 个工具量化共存像素中在某个强度阈值之上的数量，发现GFP-LC3的共存MHC 11+是 40%，而HLA-DM+室是38%。为了评价MIIC的比例，其表明因为自噬体标记蛋白的降 解，不存在GFP-LC3的共存，我们用氯喹处理过的MDAMC和HaCat细胞进行了相同 的实验。GFP-LC3与MHC II类、HLA-DM和LAMP-2的共存在这些条件下更加明显(图 3c， HaCat的数据未显示)。虽然共存分析与LSM510柱状图工具仅仅披露了适度的增 加(MHC 11类从40到44%， HLA-DM从38到45。/。)，用LSM 510剖面图工具的分析 显示在氯喹处理之后，MHC II类的共存从58增加到86%， HLA-DM+囊泡从52增加到 71%。这些结果证明大量的MHC II类负荷室从人上皮细胞系的自噬体增加。
在本研究所用的人细胞系中，干扰素Y处理并没有如免疫印迹法测定的那样导致可检测 到的巨自噬作用上调(图3D)。人上皮细胞系(293T， HaCat禾BMDAMC)用1000U/ml 重组人干扰素a或干扰素Y处理24小时，或不处理(-)。制备全细胞裂解液，等量蛋 白在12% SDS-PAGE凝胶上电泳。经过LC3抗体Western印迹法可检到LC3-I和II。用 星号(*)标记的高分子量条带是蛋白质，其与LC3抗血清交叉反应，说明蛋白质负荷相 等。LC3-II水平以及相应巨自噬反应不受干扰素处理的影响，虽然干扰素-g处理可能轻 微影响巨自噬作用，另外诱发MHCII类阳性室。
实例4
早期核内体或MHC I类负荷室极少与GFP-LC3标记的囊泡融合
为了确定自噬体是否选择性地与MIIC融合，分析GFP-LC3与其他内噬室标记，尤其是 早期核内体(早期核内体抗原阳性，EEA1)和循环核内体(铁传递蛋白受体阳性，TR)。 如图4a所示，对于MDAMC细胞系，GFP-LC3并不与EEA1或铁传递蛋白受体共存， 即便是存在氯喹。当EEA1与GFP-LC3的共存用LSM510软件量化，未处理过的MDAMC 细胞中共存不高(剖面分析是9%，柱状图分析是7%)，但在氯喹处理后略微增加(分 别到26°/。和21%)。存在和不存在CQ， GFP-LC3与MHC II类和HLA-DM共存，与和
38EEA1共存的差别在统计上很显著(同方差学生t-检验统计p<0.001)。在HaCat细胞 中，GFP-LC3与EEA1或铁传递蛋白受体的重叠也非常小(数据未显示)。此外，干扰 素Y处理的细胞中，GFP-LC3很少进入早期核内体或循环核内体(数据未显示)。定量 分析GFP-LC3与MHC II类、HLA-DM，和EEA1在未处理或经CQ处理过的MDAMC 细胞中的共存如图4C所示。数据代表来自两个实验中的一个代表实验的10-15个细胞的 平均值。误差条表示标准偏差。同方差、单侧学生t-检验统计结果的p值如图所示。
自噬作用已经在细胞内抗原在MHC II类上的呈递有所暗示，不过似乎没有影响MHC I 类呈递。为了进一步解决这个问题，分析GFP-LC3与MHCI类分子的重叠。根据预计， MHC I类主要在核周内质网/高尔基区域和质膜上发现，并不与更外周分布的GFP-LC3 阳性囊泡共存(图4b)。总的来说，数据表明自噬体主要与MIIC在MHCII类阳性细胞 中融合，只是很少地与早期核内体/循环核内体或MHC I类负荷室融合。
实例5
GFP-LC3和MHC II类在电子密度高的多囊室中共存
为了通过电子显微镜法识别GFP-LC3/MHC II类双重阳性室，我们准备了超薄的未处理 或经CQ处理、稳定地GFP-LC3转染MDAMC细胞的冷冻切片，用HLA-DR禾卩GFP特 异性抗体将其染色，并应用标记10nm和15nm蛋白A胶体金微粒的抗体。在未处理和 经CQ处理过的细胞中，两种抗体明显标记大的(l-2pm)、电子密度大、多囊室，而其 他细胞器官，例如核和线粒体大部分是胶体金阴性的(图5a和c)。在CQ处理过的细 胞中，更常发现双重标签的多囊室而不是未处理过的细胞(数据未显示)。双重标记室 的形态特征是存在电子密度大的材料，为数众多的小内囊并且有时是大内囊(图5b和d)。
PFA固定的MDAMC-GFP-LC3细胞的超薄冷冻切片用抗-HLA-DR抗血清/15nm胶体金 颗粒和抗-GFP抗血清/10nm胶体金颗粒双重标记，并用电子显微镜分析(图5E) 。 MHC 1I类标签在GFP-LC3阳性电子密度大的多囊室和质膜上均可见到。来自三个实验中的一 个实验的一个代表区域如图所示。比例尺lpm。 MDAMC-GFP-LC3细胞用50pM CQ 处理10小时，而超薄切片用MHCII类(10nm胶体金)禾卩GFP (15nm胶体金)双重标 记，并用电子显微镜分析(图5F)。双重标记的多囊室通常出现扩充和肿胀，直径Hnm， 存在一些空间。来自三个实验中的一个实验的三个代表区域如图所示。比例尺lpm。
其他细胞器官，例如核和线粒体大部分是胶体金阴性的；但是，在胞浆中观察到某些 GFP-LC3染色，而MHCII类染色可在内质网(ER)、高尔基和细胞膜上发现(图5E)。 双重标记室的形态与未处理和CQ处理过的细胞很相似，但是更多在CQ处理过的细胞 中发现它们(数据未显示)，并且其中某些在氯喹处理之下显示出特征化的溶酶体室肿 胀表型(图5F)。因此，经常发现GFP-LC3和MHCII类分子在腔内脂膜上彼此接近。 这表明自噬体通常与MHC II类室融合，在内膜上得到含有MHC II类分子和LC3多囊室。
实例6
胞浆/核抗原通过与Atg8/LC3融合靶向自噬降解 观察到自噬体与MHC II类负荷室持续融合为胞浆物质提供了一种手段，使其为MHC II类负荷以及CD4+ T细胞的抗原呈递提供肽。为了检验这种假设，就需要确定是否胞浆 抗原的自噬体靶向是否导致CD4+T细胞识别增强。出于这种目的，合成流感基质蛋白l 与自噬体标记蛋白Atg8/LC3的融合基因(图6a)，可推出该融合基因的LC3部分应当 将抗原靶向导向到自噬膜，以及MIIC随后的降解。
使用编码人LC3蛋白的核酸。人微管结合蛋白1A/1B轻链3B，利用Expasy登录号是 MLP3B_HUMAN (Q9GZQ8)。序列如下
atgccgtcgg agaagacctt caagcagcgc cgcaccttcg aacaaagagt agaagatgtc cgacttattc gagagcagca tccaaccaaa atcccggtga taatagaacg atacaagggt gagaagcagc ttcctgttct ggataaaaca aagttccttg tacctgacca tgtcaacatg agtgagctca tcaagataat tagaaggcgc ttacagctca atgctaatca ggccttcttc ctgttggtga acggacacag catggtcagc gtctccacac caatctcaga ggtgtatgag agtgagaaag atgaagatgg attcctgtac atggtctatg cctcccagga gacgttcggg atgaaattgt cagtgtaa (SEQ ID NO: 1)。
核酸编码具有EMBL数据库中如上氨基酸序列的蛋白，登录号是AAG23182。
如上所述表达MP1-LC3融合蛋白。编码MP1-LC3融合蛋白的核酸序列具有如下序列
ATTTTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGGGGACTGCAGCGTAGAC
TTAAACTGTATAGGAAGCTTAAGAGGGAGATAACATTCCATG(iJGGCCAAAGAAATAG
AGCGCCGCACCTTCGAACAAAGAGTAGAAGATGTCCGACTTATTCGAGAGCAGC
ATCCAACCAAAATCCCGGTCATAATAGAACGATACAAGGGTGAGAAGCAGCTTC
CTGTTCTGGATAAAACAAAGTTCCTTGTACCTGACCATGTCAACATGAGTGAGCT
CATCAAGATAATTAGAAGGCGCTTACAGCTCAATGCTAATCAGGCCTTCTTCCTG
TTGGTGAACGGACACAGCATGGTCAGCGTCTCCACACCAATCTCAGAGGTGTAT
G/VGAGTGAGAAAGATGAAGATGGATTCCTGTACATGGTCTATGCCTCCCAGGAG
ACGTTCGGGATGAAATTGTCAGTGTAA (SEQ ID NO: 2).
对应于来自与MIJAWIL相似的流感菌株A/WSN/33的MPl序列的纯文本，斜体字代表 序列连接，粗体g苷代表LC3序列。如上所述编码MP1-LC3融合蛋白的核酸，拥有如下的氨基酸序列-MSLUreVETYVLSIVPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKJSrmLKVLMEWLKTRWLSPLTKGILGF
VFTLTVPSERGLQRRRFVQNALNGNGDPNMMDKAVKLYRKLKREITFHGAKEIALSYSAG
ALASCMGUYJNRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRSHRQMVTATNPLIRHENRMVL
ASTTAKAMEQMAGSSEQAAEAMDIASQARQMVQAMRTIGTHPSSSAGLKDDLLENLQA
YQKRMGVQMQRFKD做OTS7TMPSEKTFKQKRTr;EQRVEDVKLlREQHPTKIFV"IIEK
YKGEKQLPVLDKTKFLVPDHVNMSELIKnRRRLQLlSrANQAFFLLVNGHSMVSVSITI
SEVYESEKDEDGFLYMVYASQETFGMKLSV (SEQ ID NO: 3)
然后MP1-LC3融合蛋白或MP1对照蛋白稳定表达于人上皮细胞系HaCat和MDAMC中 (图6a) 。 Western印迹显示抗原表达在两种细胞系中并且拥有预期分子量(MP1: 28kD; MP1-LC3: 43kD)(图6b)。显著地，MP1-LC3融合蛋白在两种细胞系中以比起MP1 较低的水平存在。为了评价融合蛋白的靶向行为，研究其通过免疫化学的定位。根据预 计，野生型MP1定位在胞浆和核中，带有一些胞浆散斑和核斑，这种模式在CQ处理后 并没有改变(HaCat:图6c; MDAMC:数据未显示)。相反，MP1-LC3融合蛋白显示 点状的胞浆染色，在经过用CQ的溶酶体蛋白质水解后其进一步提高(图6c)。为了测 试MP1-LC3阳性胞浆点状物是否是自噬体，将GFP-LC3和MP1-LC3共同表达在HaCat 和MDAMC细胞系上，用共聚焦显微镜法分析其共存情况。在两个细胞系中，经CQ处 理后，GFP-LC3和MP1-LC3融合蛋白在相同的胞浆囊泡中累积，而天然MP1并不与 GFP-LC3标记室明显共存(MDAMC:图6d; HaCat:数据未显示)。这表明LC3标签 实际上将胞浆抗原靶向导向到自噬体，之后由溶酶体蛋白酶降解。
实例7
抗原靶向自噬体降解导致CD4+ T细胞识别增强
为测试胞浆抗原/核抗原经过LC3融合的自噬体降解导致MHC II类呈递增强的假设，分 析了通过MP1特异性CD4+ T细胞克隆的MP1对比MP1-LC3表达耙向细胞的识别。出 于这种目的，从匹配HaCat细胞系的HLA-DR和-DQ的供体生成MP1特异性CD4+ T细 胞克隆(图7)，所以干扰素Y处理过的HaCat细胞可用作靶向细胞。CD4+T细胞克隆 与CD4阳性细胞同源，而且在MPl肽文库中识别重叠肽的MP162-72肽序列。为了分析 LC3融合对MHC I类呈递的影响，我们也生成了来自相同供体的MP158-66特异性、 HLA-A2-限制性CD8+ T细胞克隆(图7)，然后测试其HLA-A2阳性MDAMC靶向细 胞的识别。
图7A-C证明了流感MP1特异性CD4+和CD8+T细胞克隆的表征。在图7a中，用流式 细胞术分析这些克隆的CD4和CD8表达。克隆9.26、 11.46和10.9与CD4+CD8-同源， 而克隆9.2与CD8+CD4-同源。在图7B中，流感MP1肽的识别用干扰素<y酶联免疫斑 点检测法来测试。MP1肽文库被分为6个亚文库，涵盖MP1氨基酸位置1-51 (文库I)、 41-88 (文库n) 、 78-128 (文库III) 、 118-163 (文库IV) 、 152-203 (文库V)和193-252 (文库VI)。克隆9.2、 9.26和10.9特异性应答文库II，而克隆11.46应答文库III。另 外，CD8+ T细胞克隆9.2，而不是CD4+ T细胞克隆识别HLAA2限制性MP1表位58-66。 误差条表示标准偏差。在图7c中，测试MP1特异性CD4+T细胞克隆的单独肽的识别，， 单独肽涵盖MP1氨基酸序列29-128，包括MP1文库II和文库III的所有肽。克隆9.26和10.9特异性识别肽抗原决定簇MP162-72，克隆11.46是标为MP1 103-113特异的。误 差条表示标准偏差。
为了评价两种不同形式的MP1能在MHCII类上表达得多好，我们测量了两种MP1特异 性CD4+ T细胞克隆应答MP1或MP1-LC3表达HaCat靶向细胞的干扰素y分泌。干扰 素Y酶联免疫检测说明两种CD4+T细胞克隆的应答(克隆9.26和10.9，图8a，分别是 上部两个图块)因LC3融合大增。尽管T细胞克隆和MP1-LC3细胞系靶向(效靶比或 e:t为2)的最低比例仅仅比干扰素y生成(同方差学生t-检验统计结果p<0.001)高 3-4倍，但是当靶向细胞及因此MHCII类肽复合体变得受限时，干扰素Y分泌的区别在 高的效靶比(5和12.5)时特别明显。以这些效靶比，CD4+T细胞克隆的干扰素Y分泌 对MP1-LC3的应答比起MP1 (所有效靶比的成对学生t-检验统计结果p<0.007)增加 9-17倍(同方差学生t-检验统计结果p<0.003)。在上述背景没有识别未转染和GFP-LC3 转染的HaCat细胞(图8a，第2栏、3栏)。经过肽脉冲HaCat阳性参照识别，虽然干 扰素y响应mp1转染体从没超过所分泌的量的30%，但是mp1-lc3能刺激多达95%的 肽脉冲靶向完成的最大004+ T细胞识别(图8a，两个上部图块，第l、 4、 5栏)。混 合实验证明MP1和MP1-LC3的MHC II类呈递实际上是由于内源性处理，因为HLA匹 配的HaCat细胞与表达MDAMC细胞的错配的MP1或MP1-LC3的混合并不刺激任何T 细胞应答(图8a，第6、7栏)。另外，当MHCII类没有被干扰素Y诱发，MP1禾B MP1-LC3 表达HaCat细胞不能刺激CD4+T细胞应答(图8a，两个上部图块，第8、 9栏)，证实 呈递是MHCII限制性。图8a，下部图块显示了当效靶比是IO、 20和40时未成熟/成熟 DC的克隆11.46的结果。另外，MHC II类表面染色显示MHC II类相似地上调，应答 MP1和MP1-LC3表达靶向细胞(图8b)中的干扰素Y，证明MP1-LC3识别的增强不是 因为MHC II类表达水平的提高。
为了评价LC3融合对MHC I类呈递的影响，我们分析了 MP1特异性CD8+ T细胞克隆 对MP1和MP1-LC3表达MDAMC靶向细胞的干扰素"/应答。干扰素y酶联免疫反应显 示对全部三个效靶比来说，CD8+T细胞应答于MP1和MP1-LC3表达靶向(图7c)，分 泌相似量的干扰素Y，这说明LC3融合不会影响MHCI类呈递，而两个基因可能都生成 相似量的有缺陷的核糖体产物(DRiP)，随后其进行有效的008+ T细胞识别处理。干 扰素Y处理过的靶向细胞(图8c，上部面板，第l-5栏)和未处理过的靶向细胞(图8c， 上部面板，第7-ll栏)都观察到这一点，尽管MHCI类呈递似乎由干扰素Y处理略微有 所增强，这与增强的MHCI类处理机制是一致的。总的来说，数据表明由于LC3融合， 将胞浆抗原靶向导向到自噬体降解途径可强烈增加CD4+ T细胞识别，而不会损害CD8+ T细胞识别。图8c，中部和下部的图块分别说明了 CM-LCL和未成熟/成熟DC的相应结 果。
虽然本发明的某些特征在本文中阐明描述，但熟悉本项技术的人可以作出许多修正、更 替、变化和等价形式。所以应当了解从属权利要求的目的是涵盖所有这些修正和变化， 这些都应该在本发明的精神范畴以内。
4权利要求
1. 一种编码相关肽或蛋白的核酸，其特征是，所述核酸在编码框内与一种编码自噬体LC3蛋白或其功能性片段的核酸相融合，所述相关肽或蛋白在主要组织相容性复合体(MHC)II类分子上的呈递不够理想或根本未予有效呈递。
2. 根据权利要求l所述的核酸，其中所述核酸具有同源于或对应于SEQIDNO: 1的序列。
3. 根据权利要求1所述的核酸，其中所述相关肽或蛋白经病毒编码。
4. 根据权利要求1所述的核酸，其中所述相关肽或蛋白经流感病毒编码。
5. 根据权利要求4所述的核酸，其中所述相关肽或蛋白是基质蛋白。
6. 根据权利要求5所述的核酸，其中所述核酸具有同源于或对应于SEQ,IDNO:2的序列。
7. —种包含如权利要求1所述核酸的载体或细胞。
8. —种包含如权利要求7所述载体的细胞。
9. 一种方法，该方法用于刺激或增强相关肽或蛋白在主要组织相容性复合体(MHC) II 类分子中的呈递，该方法包括将能表达主要组织相容性复合体(MHC) II类分子的细胞 与编码相关肽或蛋白的核酸相接触，所述核酸在编码框内与一种编码自噬体耙向蛋白或 其功能性片段的核酸相融合，所述自噬体靶向蛋白或其功能性片段能将所述相关肽或蛋 白靶向导向到自噬体，并且所述相关肽或所述蛋白的片段通过主要组织相容性复合体(MHC) II类分子被展示到所述细胞的表面上。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述细胞与包含所述核酸的载体相接触。
11. 根据权利要求9所述的方法，其中所述自噬体靶向蛋白是LC3蛋白。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸包括同源于或对应于SEQIDNO: 1的序列。
13. 根据权利要求9所述的方法，其中所述细胞是健康的或患病的，并且所述相关肽或蛋 白与该疾病有关。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述细胞被感染。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述细胞被病毒感染。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述病毒是流感病毒或HIV病毒。
17. 根据权利要求14的所述核酸，其中所述相关肽或蛋白经病毒编码。
18. 根据权利要求14所述的方法，其中所述相关肽或蛋白经流感病毒编码。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述相关肽或蛋白是基质蛋白。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述核酸具有同源于或对应于SEQ ID NO: 2的序列。
21. 根据权利要求14所述的方法，其中所述细胞被细菌感染。
22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述细菌是分枝杆菌。
23. 根据权利要求13所述的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞或前期肿瘤细胞。
24. 根据权利要求9所述的方法，其中所述细胞是单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B 细胞或上皮细胞。
25. 根据权利要求24所述的方法，其中将所述细胞与干扰素-Y接触。
26. —种刺激或增强机体免疫应答的方法，该方法包括将在所述机体中的能表达主要组织 相容性复合体(MHC) II类分子的细胞与编码相关肽或蛋白的核酸相接触，所述核酸在 编码框内与一种编码自噬体靶向蛋白或其功能性片段的核酸相融合，所述自噬体耙向蛋白或其功能性片段能将所述相关肽或蛋白质靶向导向到自噬体，并且所述的相关肽或蛋 白的片段通过主要组织相容性复合体(MHC) II类分子被展示到所述细胞的表面上，从 而刺激或增强免疫应答。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述细胞与包含所述核酸的载体相接触。
28. 根据权利要求26所述的方法，其中所述自噬体靶向蛋白是LC3蛋白。
29. 根据权利要求28所述的方法，其中所述核酸包括同源于或对应于SEQ ID NO: 1的序列。
30. 根据权利要求26所述的方法，其中所述细胞是患病的或健康的，并且所述相关肽或 蛋白与该疾病有关。
31. 根据权利要求30的方法，其中所述细胞被感染。
32. 根据权利要求31所述的方法，其中所述细胞被病毒感染。
33. 根据权利要求32所述的方法，其中所述病毒是流感病毒或HIV病毒。
34. 根据权利要求32所述的方法，其中所述相关肽或蛋白经病毒编码。
35. 根据权利要求34所述的方法，其中所述相关肽或蛋白经流感病毒编码。
36. 根据权利要求35所述的方法，其中所述相关肽或蛋白是基质蛋白。
37. 根据权利要求32所述的方法，其中所述核酸具有同源于或对应于SEQ ID NO: 2的序列。
38. 根据权利要求31所述的方法，其中所述细胞被细菌感染。
39. 根据权利要求38所述的方法，其中所述细菌是分枝杆菌。
40. 根据权利要求30所述的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞或前期肿瘤细胞。
41. 根据权利要求26所述的方法，其中所述细胞是单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、 B细胞或上皮细胞。
42. 根据权利要求41所述的方法，其中所述细胞与干扰素-Y相接触。
43. 根据权利要求26所述的方法，其中所述细胞与所述核酸或包含相同核酸的载体间接 接触。
44. 根据权利要求43所述的方法，其中所述核酸或包含相同核酸的载体是经静脉给予所 述机体的。
45. 根据权利要求44所述的方法，其中所述机体被给予一种组合物，所述组合物包括所 述核酸或包含相同核酸的载体。
46. 根据权利要求45所述的方法，其中所述组合物可在一段时间内被重复给予。
47. 根据权利要求44所述的方法，其中所述组合物包括从所述机体中分离出的肿瘤细胞。
48. 根据权利要求26所述的方法，其中所述细胞在体外与所述核酸或包含相同核酸的载 体相接触。
49. 根据权利要求48所述的方法，其中所述机体具有前期肿瘤或增生细胞或组织。
50. 根据权利要求48所述的方法，其中所述机体有形成肿瘤的倾向。
51. —种组合物，所述组合物包含能表达主要组织相容性复合体(MHC) II类蛋白的细 胞，和编码相关肽或蛋白的核酸，所述核酸在编码框内与一种编码自噬体LC3蛋白或其 功能性片段的核酸相融合，或和包含相同核酸的载体。
52. 根据权利要求51所述的组合物，其中所述核酸包括同源于或对应于SEQIDNO: 1的 序列。
53. 根据权利要求51所述的组合物；其中所述相关肽或蛋白经病毒编码。
54. 根据权利要求53所述的组合物，其中所述相关肽或蛋白经流感病毒编码。
55. 根据权利要求54所述的组合物，其中所述相关肽或蛋白是基质蛋白。
56. 根据权利要求55所述的组合物，其中所述核酸具有同源于或对应于SEQ ID NO: 2的 序列。
57. 根据权利要求51所述的组合物，其中所述细胞是增生细胞、前期肿瘤细胞或肿瘤细胞。 '
58. 根据权利要求51所述的组合物，其中所述细胞是健康细胞，并且所述相关肽或蛋白 与癌症或感染有关。
59. 根据权利要求51所述的组合物，其进一步包括CD4+T细胞。
60. 根据权利要求59所述的组合物，其中所述004+ T细胞与所述的能表达主要组织相 容性复合体(MHC) II类蛋白的细胞是自体、同源或异源的。
61. 根据权利要求51所述的组合物，其进一步包括细胞因子。
62. 根据权利要求51所述的组合物，其中所述细胞因子是干扰素-Y。
63. 根据权利要求51所述的组合物，其中所述组合物适于静脉内投药。
64. —种在机体内下调、抑制或耐受针对相关肽或蛋白的免疫应答的方法，所述方法包括 将未成熟树突状细胞与编码相关肽或蛋白的核酸相接触，所述核酸的编码框内与一种编 码自噬体靶向蛋白或其功能性片段的核酸相融合，所述自噬体靶向蛋白或其功能性片段 能将所述相关肽或蛋白靶向导向到自噬体，并且所述相关肽或所述蛋白的片段通过主要 组织相容性复合体(MHC) II类分子被展示到所述未成熟树突状细胞的表面上。
65. 根据权利要求64所述的方法，其中所述细胞通过体内或离体的方式与包含所述核酸 的载体相接触。
66. 根据权利要求64所述的方法，其中所述自噬体靶向蛋白是LC3蛋白。
67. 根据权利要求66所述的方法，其中所述核酸包括同源于或对应于SEQ ID NO: 1的序列。
68. 根据权利要求64所述的方法，其中下调、抑制或耐受免疫应答是为了阻止或降低机 体内的移植排斥或移植物抗宿主病。
69. 根据权利要求68所述的方法，其中相关肽或蛋白是移植抗原或宿主抗原。
70. 根据权利要求64所述的方法，其中下调、抑制或耐受免疫应答是为了治疗机体的自 体免疫疾病。 '
71. 根据权利要求70所述的方法，其中相关肽或蛋白是自体抗原。
全文摘要
本发明是针对与自噬体相关的靶向蛋白或肽，所述的蛋白或肽在主要组织相容性复合体(MHC)II类分子上的呈递，及其应用。核酸、包含相同核酸序列的载体，与自噬体相关的靶向蛋白或肽的组合物在主要组织相容性复合体(MHC)II类分子上的呈递，及其在刺激或增强机体免疫应答上的应用。
文档编号C12N15/00GK101437399SQ200780006067
公开日2009年5月20日 申请日期2007年2月20日 优先权日2006年2月21日
发明者克里斯蒂·穆兹 申请人:洛克菲勒大学