专利名称：：Rage融合蛋白、制剂及其使用方法RAGE融合蛋白、制剂及其使用方法发明领域本发明涉及晚期糖基化终产物受体(RAGE)的调节。更具体而言，本发明描述包含RAGE多肽的融合蛋白、制造这类融合蛋白及这类RAGE融合蛋白的制剂的方法及这类RAGE融合蛋白用于治疗基于RAGE的病症的用途。背景蛋白质或脂质与醛糖的温育导致蛋白质上非酶促糖基化及氨基氧化，从而形成安玛多立(amadori)加合物。加合物随时间经历额外重排、合物。促进AGE形成的因素包括延迟的蛋白质周转(例如在淀粉状蛋白病中)、具有高赖氨酸含量的巨分子的累积及高血糖水平(例如在糖尿病中)(Hori等人，/.A/oAC力e瓜270:25752—761，(1995))。AGE涉及于大量病症中，包括与糖尿病及正常老化相关的并发症。AGE显示特异性且饱和结合单核细胞、巨噬细胞、微脉管系统的内皮细胞、平滑肌细胞、间质细胞及神经元上的细胞表面受体。晚期糖基化终产物受体(RAGE)为分子的免疫球蛋白超基因家族的一员。RAGE的细胞外(N末端)结构域包括三个免疫球蛋白型区域一个V(可变)型结构域，继而两个C型(恒定)结构域(Neeper等人，/.A'o/,C力e瓜，267:14998—15004(1992);Schmidt等人，"rc.0w;W.,96#194(1997))。单个跨膜结构域及短的高电荷胞质尾紧随胞外域。可通过RAGE的蛋白质水解或通过分子生物学方法来分离N末端胞外域以产生包含V及C结构域的可溶性RAGE(sRAGE)。RAGE表达于多种细胞类型(包括白细胞、神经元、小胶质细胞及血管内皮)上(例如Hori等人，/."/oA270:25752-761(1995))。在老化组织(Schleicher等人，/.，99(3):12457-468(1997))及糖尿病性视网膜、维管结构及肾中(Schmidt等人，#"謡舰，1:1002-1004(1995))还发现RAGE水平增加。除AGE外，其它化合物可结合且调控RAGE。RAGE结合多个功能及结构上不同的配体，包括淀粉状蛋白卩(AP)、血清淀粉状蛋白A(SAA)、晚期糖基化终产物(AGE)、S100(钙粒蛋白家族的促炎成员)、羧甲基赖氨酸(CML)、两性蛋白及CDllb/CD18(Bucciarelli等人，Ce//Z/尸e5W'.，59:1117-128(2002);Chavakis等人，#/cro6es//Lfe".，6:1219-1225(2004);Kokkola等人，Scs/^/./.T/zz迈Mo/,，61:1-9(2005);Schmidt等人，/.//7re".，108:949-955(2001);Rocken等人，j瓜/.户"力o/.，162:1213-1220(2003))。显示配体(如AGE、S100/钩粒蛋白、P-淀粉状蛋白、CML(N^-羧甲基赖氨酸)及两性蛋白)与RAGE的结合改变多种基因的表达。接着，这些相互作用可引发信号传导机制，包括p38活化、p21ras、MAP激酶、Erkl-2磷酸化及炎症信号转导的转录介体NF-kB的活化(Yeh等人，50:1495-1504(2001))。例如在多种细胞类型中，RAGE与其配体之间的相互作用可产生氧化应激，其进而导致自由基敏感转录因子NF-kB的活化及NF-kb调节的基因(如细胞因子IL-1P及TNF-a)活化。此外，RAGE表达经由NF-KB上调且显示在炎症或氧化应激位点处增加的表达(Tanaka等人，/,5/0/.C力e迈.，275:25781-25790(2000))。因此，可通过配体结合引发的正向反馈循环推动上升且通常有害的螺旋。RAGE在不同组织及器官中的活化可导致大量病理生理结果。RAGE涉及各种病症，包括急性及慢性炎症(Hofmann等人，Ce7/97:889-901(1999))、糖尿病晚期并发症的发展(如增加的血管通透性)(Wautier等人，/./扁仏，97:238-243(1995))、肾病(Tei1let等人，/.j瓜5Vc,iYe/力ro/.，11:1488—1497(2000))、动务1a更化(Vlassara等人，r力e尸/力/7/、力5^c/"y/^。"^7#，J/m.，28:419-426(1996))及浮见网膜病(Hammes等人，"/a6"o/og/s，42:603-607(1999))。RAGE还涉及阿兹海默氏病(Alzheimer'sdisease)(Yan等人，艇"re，382:685-691(1996))及肺瘤侵袭与转移(Taguchi等人，yVW"re，405:354-357(2000))。尽管RAGE广泛表达及其在多种不同疾病模型中的明显多效作用，但RAGE对正常发育而言似乎并非必要。例如，RAGE敲除小鼠无明显异常表型，这表明虽然当慢性刺激时RAGE可在疾病病理中起作用，但RAGE的抑制似乎未促进任何不需要的急性表型(Liliensiek等人，/.//^eW.，113:1641—50(2004))。拮抗生理配体与RAGE的结合可下调由过量浓度的AGE及其它RAGE配体引起的病理生理变化。通过减少内源性配体与RAGE的结合可减少与RAGE介导的病症相关的症状。可溶性RAGE(sRAGE)能有效拮抗RAGE配体与RAGE结合。然而，sRAGE在活体内施用时半衰期可能太短而不适于治疗一或多种病症。因此，需要研制拮抗AGE及其它生理配体结合RAGE受体的化合物，其中该化合物具有所期望的药代动力学概况。概述本发明的实施方案包含RAGE融合蛋白及使用这类蛋白的方法。本发明可以各种方式具体化。本发明的实施方案可包含一种RAGE融合蛋白，其包含连接于第二非RAGE多肽的RAGE多肽。在一实施方案中，RAGE融合蛋白包含RAGE配体结合位点。RAGE融合蛋白可进一步包含RAGE多肽。在某些实施方案中，RAGE融合蛋白包含如SEQIDNO:56或SEQIDNO:57中所述的氨基酸序列或与其至少70%、75%、80%、85%、90°/。、95°/。、96%、97%、98°/。或99%—致的序列。例如，在某些实施方案中，与SEQIDNO:56或SEQIDNO:57至少90%—致的序列包含无C末端赖氨酸的SEQIDNO:56或SEQIDNO:57序列。本发明还包含一种制备RAGE融合蛋白的方法。在一实施方案中，该方法包含将RAGE多肽连接于第二非RAGE多肽。在一实施方案中，RAGE多肽包含RAGE配体结合位点。该方法可包含将RAGE多肽直接连接于包含免疫球蛋白的CH2结构域或CH2结构域的部分的多肽。在某些实施方案中，RAGE融合蛋白包含如SEQIDNO:56或SEQIDNO:57中所述的氨基酸序列或与其至少70%、75%、80%、85%、90°/。、95°/。、96%、97%、98°/。或99°/。一致的序列。例如，在某些实施方案中，与SEQIDNO:56或SEQIDNO:57至少90%—致的序列包含无C末端赖氨酸的SEQIDNO:56或SEQIDNO:57序列。在其它实施方案中，本发明可包含用于治疗受试者中RAGE介导的病症的方法及组合物。该方法可包含将本发明的RAGE融合蛋白施用给受试者。该组合物可包含药学上可接受的载体中的本发明的RAGE融合蛋白。在其它实施方案中，本发明还提供包含冻干保护剂、RAGE融合蛋白与緩冲剂的冻干混合物的制剂。例如，在某些实施方案中，本发明可包含稳定重构制剂，其包含至少50mg/mL的量的RAGE融合蛋白及稀释剂，其中重构制剂由RAGE融合蛋白与冻干保护剂的冻干混合物制备。本发明的实施方案还可包含制造的物品。在某些实施方案中，制造的物品可包含保存包含冻干RAGE融合蛋白的制剂的容器。制造的物品还可包含用于以稀释剂重构冻干制剂的说明。在其它实施方案中，本发明还可包含制备RAGE融合蛋白的稳定重构制剂的方法。在某些实施方案中，该方法可包含在稀释剂中重构RAGE融合蛋白与冻干保护剂的冻干混合物使得重构制剂中RAGE融合蛋白浓度至少为50mg/mL。例如，在一实施方案中，该方法可包含冻干包含RAGE融合蛋白与冻干保护量的冻干保护剂的混合物且在稀释剂中重构冻干混合物的步骤。存在可与本发明的特定实施方案相关的各种优势。在一实施方案中，当施用给受试者时，本发明的RAGE融合蛋白可为代谢稳定的。本发明的RAGE融合蛋白还可显示结合RAGE配体的高亲和力。在某些实施方案中，本发明的RAGE融合蛋白以高纳摩尔至低微摩尔范围的亲和力结合RAGE配体。本发明的RAGE融合蛋白可通过以高亲和力结合生理RAGE配体而用于抑制内源性配体与RAGE结合，从而提供一种改善RAGE介导的疾病的方式。本发明的RAGE融合蛋白还可以蛋白质或核酸形式提供。在一实例实施方案中，RAGE融合蛋白可全身施用且保留在维管结构中以有效治疗部分由RAGE介导的血管疾病。在另一实例实施方案中，RAGE融合蛋白可局部施用以治疗其中RAGE配体促进疾病病理的疾病。可选择地，可通过使用适当栽体(如病毒或棵露DNA)将编码RAGE融合蛋白的核酸构建体传递至位点，其中短暂局部表达可局部抑制RAGE配体与受体之间的相互作用。因此，施用药物本质上可为短暂的(例如在施用RAGE融合蛋白的情况下)或更持久(例如在以重组DNA形式施用RAGE融合蛋白的情况下)。存在将于下文描述的本发明的额外特征。应了解本发明的应用不限于以下申请专利范围、实施方式及附图所说明的细节。本发明允许其它实施方案且以各种方式实施或进行。详述除非说明相反，否则以下说明书中所说明的数字参数为近似值，其可视本发明寻求获得的所期望的性质而变。丝毫不试图使等价原则的应用限于申请专利范围的范畴，各数字参数应至少根据所报导的有效数字的数及通过应用一般四舍五入技术来解释。虽然本发明广泛范围所陈述的数字范围及参数为近似值，但尽可能精确报导特定实施例中说明的数值。然而，任何数值必定先天含有源自在其各自测试测量中发现的标准差的某些误差。此外，应了解本文公开的所有范围涵盖其所包含的任何及所有子范围。例如，应认为所述范围"l至IO"包括在最小值1与最大值10之间(及包括最小值1及最大值IO)的任何及所有子范围；还即以最小值1或1以上(例如1至6.l)开始且以10或10以下(例如5.5至10)结束的所有子范围。此外，任何称为"并入本文"的参考文献均理解为全文并入。进一步注意除非清楚及明确限于一个指示物，否则如本说明书中所用的单数形式"一"及"该"包括复数指示物。除非上下文另外明确说明，否则术语"或"与术语"和/或"可交换使用。术语"部分"及"片段"还可交换使用地指代多肽、核酸或其它分子构建体的部分。"多肽"及"蛋白质"在本文可交换用以描述可包含部分或全长蛋白的蛋白分子。如本
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中已知，"蛋白质"、"肽"、"多肽"及"寡肽"为氨基酸(通常L-氨基酸)链，其oc碳经由肽键连接，该肽键通过一氨基酸的a碳的羧基与另一氨基酸的a碳的氨基之间的缩合反应而形成。组成蛋白质的氨基酸通常依次计数，以氨基末端残基开始且朝蛋白质的羧基末端残基方向增加。如本文所用的，术语"上游"指对第二残基而言为N末端的残基(其中分子为蛋白质)或对第二残基而言为5"其中分子为核酸)。如本文所用的，术语"下游"指对第二残基而言为C末端的残基(其中分子为蛋白质)或对第二残基而言为3'(其中分子为核酸)。除非另外定义，否则本文所用的所有科技术语具有与本领域一般技术人员通常理解的含义相同的含义。对本
技术领域：
的定义及术语而言，实施者尤其针对CurrentProtocolsinMolecularBiology(例如参见Ausubel，F.M.等人，i^orf户rc^cco/s//#o/ecw/<2r第4版，第2章，JohnWiley&Sons,N.Y.)。氨基酸残基的缩写为本
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中用于指代20个普通L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母密码。"核酸"为多聚核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。该术语用于包括单链核酸、双链核酸及从核普酸或核苷酸类似物制成的RNA及DNA。术语"栽体"指可用于将第二核酸分子转运至细胞中的核酸分子。在一实施方案中，载体允许插入载体中的DNA序列复制。载体可包含启动子以增强核酸分子在至少某些宿主细胞中的表达。栽体可自主复制(在染色体外)或可整合至宿主细胞染色体内。在一实施方案中，载体可包含能够产生来源于插入栽体中的至少一部分核酸序列的蛋白质的表达载体。如本领域中已知，用于核酸序列彼此杂交的条件可描述为从低严格度至高严格度范围。一般而言，高严格度杂交条件指在低盐緩冲剂中于高温下洗涤杂交物。杂交可通过在65X:下使用本
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中标准的杂交溶液(如0.5MNaHP04、7%十二烷基硫酸钠(SDS))且在0.25MNaHP04、3.5%SDS中洗涤接着在室温至68°C范围的温度下(视探针长度而定)在0.1xSSC/0.1%SDS中洗涤来过滤结合的DNA。例如，高严格度洗涤包括在6xSSC/0.05%焦磷酸钠中对14个碱基寡核苷酸探针而言于37'C下洗涤或对17个碱基寡核苷酸探针而言于48X:下洗涤或对20个碱基寡核苦酸探针而言于55'C下洗涤或对25个碱基寡核苷酸探针而言于60'C下洗涤或对长约250个核苷酸的核苷酸探针而言于65。C下洗涂。核酸探针可通过用(例如)[Y-"P]ATP末端标记或通过随机引物标记来并入放射性标记的核苷酸(如[cc-32P]dCTP)从而用放射性核苷酸标记。可选择地，可通过并入生物素标记或焚光素标记的核苷酸来标记探针，且使用链霉抗生物素或抗荧光素抗体检测探针。如本文所用的"小有机分子"为分子量小于2，000道耳顿(Dalton)的含有至少一个碳原子的分子。术语"融合蛋白"指具有来源于两个或两个以上蛋白质的氨基酸序列的蛋白质或多肽。融合蛋白还可包括在来源于独立蛋白质的氨基酸部分之间的氨基酸连接区。如本文所用的"非RAGE多肽"为非来自RAGE或其片段的任何多肽。这类非RAGE多肽包括免疫球蛋白肽、二聚体多肽、稳定多肽、两亲性肽或包含为靶向或纯化蛋白质提供"标记"的氨基酸序列的多肽。如本文所用的"免疫球蛋白肽"可包含免疫球蛋白重链或其部分。在一实施方案中，重链部分可为Fc片段或其部分。如本文所用的Fc片段包含单聚体或二聚体形式的重链铰链多肽及免疫球蛋白的重链的"2及"3结构域。或Ch1及Fc片段可用作免疫球蛋白多肽。重链(或其部分)可来源于任一已知重链同种型IgG(y)、IgM(ja)、IgD(5)、IgE(e)或IgA(ot)。此外，重链(或其部分)可来源于任一已知重链亚型IgGl(yl)、IgG2(y2)、IgG3(y3)、IgG4(y4)、IgAl(al)、IgA2(ct2)或这些同种型或亚型改变生物活性的突变。可改变的生物活性的实例包括如(例如)通过修饰铰链区减少同种型结合某些Fc受体的能力。术语"一致性"或"一致性％"指两个氨基酸序列或两个核酸序列之间的序列一致性。一致性％可通过比对两序列来测定且指在比较序列共有位置处一致残基(即，氨基酸或核苷酸)的数量。可使用本
技术领域：
中的算法标准(例如Smith及Waterman,1981，J/7/7/.他".2:482;Needleman及W廳ch，1970，/.脂.肠/.48:443;Pearson及Lipman，1988，/Voc,Ais〃.Sc/.，USA,85:2444)或通过作为BLAST及FASTA公开可得的这些算法的计算机化版本(WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0，GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,WI)来进4亍序歹'J比对及比较。可将自NationalInstitutesofHealth,BethesdaMD购得的ENTREZ用于序列比较。在一实施方案中，可使用间隙权重为1的GCG来测定两序列的一致性％使得如同其为两序列之间的单个氨基酸错配来衡量各氨基酸间隙。如本文所用的术语"保守残基"指在具有相同结构和/或功能的多个蛋白质中相同的氨基酸。保守残基区域对蛋白质结构或功能而言可能是重要的。因此，在三维蛋白质中所鉴别的连续保守残基对蛋白质结构或功能而言可能是重要的。为找到保守残基或3D结构的保守区列。口々"5、5"'-如本文所用的术语"同系物"意指具有与野生型氨基酸序列一定程度同源性或一致性的多肽。同源性比较可通过眼睛或更通常在易得的序列比较程序帮助下进行。这些市售计算机程序可计算两个或两个以上序列之间的同源性°/。(例如Wilbur,W.J,及Lipman，D.J.,1983，Ais〃.Sc/.USA,80:726-730)。例如，可采用的同源序列包括在替代实施方案中彼此至少70%—致、75%—致、85%—致、90%—致、95%—致、96%—致、97%—致、98%—致或99%—致的氨基酸序列。如本文所用的术语与其至少90°/。一致包括与指定序列的一致性从90%至99.99%的范围的序列且包括所有在其间的范围。因此，术语与其至少90%—致包括与指定序列91%、91.5%、92%、92.5%、93%、93.5%、94%、94.5%、95%、95.5%、96°/。、96.5°/。、97°/"97.5%、98%、98.5%、99%、99.5%—致的序列。类似地，术语"至少70%—致"包括从70%至99.99%—致的范围的序列，及其间的所有范围。一致性°/。测定通过使用本文所述的算法来测定。如本文所用的多肽或蛋白质"域"(domain)或"结构域"(domain)包含沿包含独立单元的多肽或蛋白质的区域。域可根据结构、序列和/或生物活性来定义。在一实施方案中，多肽域可包含以实质上与蛋白质的其佘部分无关的方式折叠的蛋白质区域。可使用域数据库(例如(但不限于)PFAM、PR0D0M、PR0SITE、BL0CKS、PRINTS、SBASE、ISRECPR0FILES、SAMRT及PROCLASS)来鉴定域。如本文所用的"免疫球蛋白域"为与免疫球蛋白的结构域结构上同源或一致的氨基酸序列。免疫球蛋白域的氨基酸序列长度可为任何长度。在一实施方案中，免疫球蛋白域可少于250个氨基酸。在一实例实施方案中，免疫球蛋白域可长为约80-150个氨基酸。例如，IgG的可变区及CH1、Ch2及CH3区各为免疫球蛋白域。在另一实例中，IgM的可变区、CJ、CH2、Ch3及Ch4区各为免疫球蛋白域。如本文所用的"RAGE免疫球蛋白域"为与免疫球蛋白的结构域结构上同源或一致的来自RAGE蛋白的氨基酸序列。例如，RAGE免疫球蛋白域可包含RAGEV结构域、RAGE类Ig的Cl型1结构域("C1结构域")或RAGE类Ig的C2型2结构域("C2结构域")。如本文所用的"域间连接子"包含将两个结构域接合在一起的多肽。Fc铰链区为IgG中域间连接子的实例。如本文所用的"直接连接"鉴别在两个不同群组(例如核酸序列、多肽、多肽域)之间的共价连接，在所连接的两个群组之间无任何插入原子。如本文所用的"配体结合域"指负责结合配体的蛋白质域。术语配体结合域包括配体结合域或其部分的同系物。为此，只要配体结合域的结合特异性保留，则基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性或亲水性的相似性可在配体结合位点上进行慎重氨基酸取代。如本文所用的"配体结合位点"包含直接与配体相互作用的蛋白质中的残基或涉及配体定位使其与直接与配体相互作用的那些残基紧密邻近的残基。配体结合点中残基的相互作用可通过模型或结构中残基与配体的空间接近性定义。术语配体结合位点包括配体结合位点的同系物或其部分。为此，只要配体结合位点的结合特异性保留，则基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性或亲水性的相似性可在配体结合位点上进行慎重氨基酸取代。配体结合位点可存在于蛋白质或多肽的一个或多个配体结合域中。如本文所用的术语"相互作用"指配体或化合物或其部分或片段与所关注第二分子的部分之间的接近性情况。相互作用可为非共价的，例如作为氢键、范德瓦尔斯引力(vanderWaals)相互作用或静电或疏水性相互作用的结果，或其可为共价的。如本文所用的"配体"指与配体结合位点相互作用的分子或化合物或实体，包括基质或其类似物或部分。如本文所述的术语"配体"可指结合所关注蛋白质的化合物。配体可为激动剂、拮抗剂或调节剂。或者配体可不具有生物效应。或者配体可阻断其它配体的结合，从而抑制生物效应。配体可包括(但不限于)小分子抑制剂。这些小分子可包括肽、肽模拟物、有机化合物等等。配体还可包括多肽和/或蛋白质。如本文所用的"调节剂化合物"指变化或改变所关注分子生物活性的分子。调节剂化合物可增加或减少所关注分子的活性或改变其物理或化学特征或其功能或免疫特性。对RAGE而言，调节剂化合物可增加或减少RAGE或其部分的活性或改变其特征或其功能或免疫特性。调节剂化合物可包括天然和/或化学合成或人造肽、经修饰的肽(例如磷酸肽)、抗体、碳水化合物、单醣、寡醣、多醣、糖脂、杂环化合物、核苷或核苷酸或其部分及有机或无机小分子。调节剂化合物可为内源性生理化合物或其可为天然或合成化合物。或者调节剂化合物可为有机小分子。术语"调节剂化合物"还包括经化学修饰的配体或化合物且包括异构体及外消旋形式。"激动剂"包含一种化合物，其结合受体以形成引起对所涉及的受体特异的药理反应的复合物。"拮抗剂"包含一种化合物，其结合激动剂或受体以形成不产生实质药理反应且可抑制由激动剂引起的生物反应的复合物。因此，RAGE激动剂可结合RAGE且刺激RAGE介导的细胞过程，且RAGE拮抗剂可抑制RAGE介导的过程使其不受RAGE激动剂刺激。例如在一实施方案中，由RAGE激动剂刺激的细胞过程包含TNF-ct基因转录活化。术语"肽模拟物"指在分子之间的相互作用中用作肽的取代物的结构(Morgan等人，1989，JiM.We;or〃C力e瓜，24:243-252)。肽模拟物可包括可含有或不含有氨基酸和/或肽键但保留肽或激动剂或拮抗剂的结构及功能特征的合成结构。肽模拟物还包括类肽、寡类肽(Simon等人，1972，Ais〃.」ca《ScA，M」，89:9367)及含有表示所有可能的对应于肽或本发明的激动剂或拮抗剂的氨基酸序列的指定长度的肽的肽文库。术语"治疗"指改良疾病或病症的症状且可包含治愈病症、实质上防止病症发作或改良受试者的病况。如本文所用的术语"治疗"指针对患者所罹患的既定病症的整个治疗范围，包括减轻来源于该病症的一种症状或大部分症状、治愈特定病症或防止病症发作。如本文所用的术语"ECs。"定义为导致50°/。所测量生物效应的药剂浓度。例如，具有可测量生物效应的治疗剂的ECs。可包含药剂显示50%生物效应的值。如本文所用的术语"IC5。"定义为导致50%抑制所测量效应的药剂浓度。例如，RAGE结合拮抗剂的ICs。可包含拮抗剂将配体结合RAGE的配体结合位点减少50%的值。如本文所用的"有效量"意指在受试者体内有效产生所需效应的药剂的量。术语"治疗有效量"表示引起所寻求的动物或人类的治疗效应的药物或医药剂的量。包含有效量的实际剂量可视施用途径、受试者体型及健康、所治疗的病症等等而定。如本文所用的术语"药学上可接受的载体"可指如(例如)对为治疗RAGE介导的病症或疾病而施用的治疗组合物而言适用于人类或动物受试者的化合物及组合物。本文所用的术语"药物组合物"表示可作为含有常规无毒栽体、稀释剂、佐剂、媒剂等等的单位剂量制剂形式(例如)经口、非经肠、局部、通过吸入喷雾、经鼻内或经直肠施用给哺乳动物宿主的组合物。如本文所用的术语"非经肠"包括皮下注射、静脉内、肌肉内、脑池内注射或输液^支术。如本文所用的"排斥反应"指组织上的免疫或炎症反应，其导致细胞、组织或器官破坏或导致细胞、组织或器官损伤。排斥的细胞、组织或器官可来源于具有排斥反应的相同受试者或可从不同受试者移植至显示排斥反应的受试者体内。如本文所用的术语"细胞"指各包含独立生活系统的哺乳动物生活系统的结构及功能单元。如本
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中已知，细胞包括核、细胞质、胞内细胞器及封闭细胞且使细胞独立于其它细胞的细胞壁。如本文所用的术语"组织"指具有类似结构及功能或共同起作用以执行特定功能的细胞聚集体。組织可包括类似细胞与围绕细胞的胞间物质的集合。组织包括(但不限于)肌肉组织、神经组织及骨骼。如本文所用的"器官"指专用于某些特定功能的动物体内完全分化的结构及功能单元。器官可包含执行特定功能或功能群的组织群。器官包括(但不限于)心脏、肺、脑、眼睛、胃、脾、胰脏、肾、肝、肠、皮肤、子宫、膀胱及骨骼。"稳定"制剂为储存时其中RAGE融合蛋白基本上保留其物理及化学稳定性及生物活性的制剂。测量蛋白稳定性的各种分析技术在本
技术领域：
中可得且评论于PeptideandProteinDrugDelivery,247-301:VincentLeeEd.，MarcelDekker，Inc.,NewYork,N.Y.，Pubs.(1991)及Jones,A.Adv.DrugDeliveryRev.10:29-90(1993)中。可在选定温度下测量稳定性，历时选定时间。为快速筛选，可将制剂保持在40。C下历时1周至1个月，在此时间下测量稳定性。例如，冻干及储存后的聚集程度可用作RAGE融合蛋白稳定性的指示物(参见本文实施例)。例如，"稳定"制剂可为其中少于约10%及优选少于约5%的RAGE融合蛋白以聚集体形式存在于制剂中的制剂。在其它实施方案中，可测定在冻干制剂冻干及储存后聚集体形成的增加。例如，"稳定''冻干制剂可为当冻干制剂在40°C下温育至少一周时其中冻干制剂中聚集体增加少于约5%或少于约3%的制剂。在其它实施方案中，可使用生物活性试验(如本文所述的结合试验)测量RAGE融合蛋白制剂的稳定性。"重构"制剂为通过将冻干的RAGE融合蛋白制剂溶于稀释剂中使得RAGE融合蛋白分散和/或溶于重构制剂中制得的制剂。重构制剂可适于施用给(例如非经肠施用)待以融合蛋白治疗的患者且在本发明的某些实施方案中可为适于皮下施用的制剂。"等渗"意指所关注制剂具有约240至约340mOsm/kg的渗透压。在一实施方案中，等渗制剂为具有与人类血液(285-310mOsm/kg)基本相同渗透压的制剂。可使用蒸气压或凝固点下降型渗压计来测量等渗性。"冻干保护剂"为当与RAGE融合蛋白组合时在冻干及随后储存时显著预防或减少蛋白的化学和/或物理不稳定性的分子。例示性冻干保护剂包括糖(如蔗糖或海藻糖)、多元醇(如糖醇，例如赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇)或其组合。在一实施方案中，冻干保护剂可包含糖。在另一实施方案中，冻干保护剂可包含非还原性糖。在另一实施方案中，冻干保护剂可包含如蔗糖的非还原性糖。可将冻干保护剂以"冻千保护量"添加至预冻干的制剂中，"冻干保护量"意指蛋白在冻干保护量的冻干保护剂存在下冻干后，RAGE融合蛋白在冻干及储存时基本上保留其物理及化学稳定性及生物活性。用于本文冻干制剂的"稀释剂"为药学上可接受(对施用给人类而言安全且无毒)且适用于制备重构制剂的稀释剂。例示性稀释剂包括无菌水、用于注射的抑菌水(BWFI)、pH緩冲溶液(例如磷酸盐緩沖生理食盐水)、无菌生理盐7K溶液、林格氏溶液(Ringedssolution)或右旋糖溶液。在一实施方案中，稀释剂提供适于注射的重构制剂。在另一实施方案中，在稀释剂提供适于注射的重构制剂的情况下，稀释剂可包含用于注射的水(WFI)。重构制剂的"防腐剂"为可添加至稀释剂或重构制剂中以基本上减少重构制剂中细菌作用的化合物。在一实施方案中，防腐剂的量可以适于促进多用途重构制剂产生的量添加。有效防腐剂的实例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、六甲氯铵、氯化苯曱烃铵(其中烷基为长链化合物的烷基千基二甲基氯化铵的混合物)及苄索氯铵(benzethoniumchloride)。其它类型防腐剂包括芳醇，如酚、丁基及千基醇、对羟基笨甲酸烯丙酯(如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇及间曱酚。冻千制剂的"膨化剂"为将块状物添加至冻干混合物中且促进冻干饼块的物理结构(例如促进基本上均匀的保留开孔结构的冻干饼块的产生)的化合物。例示性膨化剂包括(但不限于)甘露糖醇、甘氨酸及山梨糖醇(Xorbital)。RAGE融合蛋白本发明的实施方案包含RAGE融合蛋白、制备这类融合蛋白的方法及使用这类融合蛋白的方法。本发明可以各种方式具体化。例如，本发明的实施方案提供包含连接于第二非RAGE多肽的RAGE多肽的RAGE融合蛋白。在一实施方案中，RAGE融合蛋白可包含RAGE配体结合位点。在一实施方案中，配体结合位点包含RAGE融合蛋白的大部分N末端结构域。RAGE配体结合位点可包含RAGE的V结构域或其部分。在一实施方案中，RAGE配体结合位点包含SEQIDNO:9或与其至少90°/。一致的序列或SEQIDNO:IO或与其至少90%—致的序列或SEQIDNO:47或与其至少90%—致的序列(图1)。在一实施方案中，RAGE多肽可连接于包含免疫球蛋白域或免疫球蛋白域的部分(例如其片段)的多肽。在一实施方案中，包含免疫球蛋白域的多肽包含人类IgG的CH2或CH3结构域中至少一个的至少一部分。在某些实施方案中，RAGE融合蛋白包含如SEQIDNO:56或SEQIDNO:57中所述的氨基酸序列或与其至少70°/。、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99°/。一致的序列。例如，在某些实施方案中，与SEQIDNO:56或SEQIDNO:57至少90%—致的序列包含无C末端赖氨酸的SEQIDNO:56或SEQIDNO:57的序列。RAGE蛋白或多肽可包含全长人类RAGE蛋白(例如SEQIDNO:1)或人类RAGE的片段。如本文所用的RAGE多肽片段为至少5个氨基酸长，可超过30个氨基酸长，但少于全长氨基酸序列。在本发明的融合蛋白、组合物及方法的替代实施方案中，RAGE多肽可包含与人类RAGE或其片段至少约70%、75%、80%、85%、90°/。、95%、96%、97%、98%或99%—致的序列。例如，在一实施方案中，RAGE多肽可包含人类RAGE或其片段，其中甘氨酸而非甲硫氨酸作为第一残基(例如参见Neeper等人，(1992))。或者人类RAGE可包含移除信号序列的全长RAGE(例如SEQIDNO:2或SEQIDNO:3)(图1A及IB)或该氨基酸序列的部分。本发明的RAGE融合蛋白还可包含sRAGE(例如SEQIDNO:4)、与sRAGE至少90°/。一致的多肽或sRAGE的片段。如本文所用的sRAGE为不包括跨膜区或胞质尾的RAGE蛋白(Park等人，vVaf"re,4:1025-1031(1998))。例如，RAGE多肽可包含人类sRAGE或其片段，其中甘氨酸而非甲硫氨酸作为第一残基(例如参见Neeper等人，(1992))。或者RAGE多肽可包含移除信号序列的人类sRAGE(例如参见图1中SEQIDNO:5或SEQIDNO:6或SEQIDNO:45)或该氨基酸序列的部分。在其它实施方案中，RAGE蛋白可包含RAGEV结构域(例如参见图1中SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:46)(Neeper等人，(1992);Schmidt等人(1997))。或者可使用与RAGEV结构域或其片段至少90%—致的序列。或者RAGE蛋白可包含RAGEV结构域片段(例如图1中SEQIDNO:9、SEQIDNO:10或SEQIDNO:47)。在一实施方案中，RAGE蛋白可包含配体结合位点。在一实施方案中，配体结合位点可包含SEQIDNO:9或与其至少90%—致的序列或SEQIDNO:10或与其至少90°/。一致的序列或SEQIDNO:47或与其至少90%—致的序列。在另一实施方案中，RAGE片段为合成肽。在另一实施方案中，配体结合位点可包含SEQIDNO.1的氨基酸23-53(图1)。在另一实施方案中，配体结合位点可包含SEQIDNO:1的氨基酸24-52。在另一实施方案中，配体结合位点可包含SEQIDNO:1的氨基酸31-52。在另一实施方案中，配体结合位点可包含SEQIDNO:l的氨基酸31-116。在另一实施方案中，配体结合位点可包含SEQIDNO:l的氨基酸19-52。例如，配体结合位点可包含RAGEV结构域或其部分，如RAGE配体结合域(例如SEQIDNO:1的氨基酸1-118、23-118、24-118、31-118、1-116、23-116、24-116、31-116、1-54、23-54、24-54、31-54、1-53、23-53、24-53或31-53或其片段)。或可使用功能性结合RAGE配体的多肽片段。或可使用与RAGEV结构域或其片段(例如如上所述)至少70%、75%、80°/。、85%、90%、95°/。、97%、98°/。或99%—致的序列。此外，如本
技术领域：
中已知，在其中融合蛋白的N末端为谷氨酰胺的实施方案中，如(例如)在移除包含SEQIDNO:1的残基1-23的信号序列(例如多肽的Q24包含氨基酸24-118或SEQIDNO:l)后，谷氨酰胺可环化以形成焦谷氨酸(pE)。因此，用于本发明的RAGE融合蛋白中的RAGE多肽可包含全长RAGE的片段。如本
技术领域：
中已知，RAGE包含三个类免疫球蛋白多肽域、V结构域及CI及C2结构域，各通过域间连接子彼此连接。全长RAGE还包括跨膜多肽及C2结构域的胞质尾下游(C末端)，且连接于C2结构域。在一实施方案中，RAGE多肽不包括任何信号序列残基。RAGE信号序列可包含全长RAGE的残基1-22或残基1-23。此外如本
技术领域：
中已知，在其中融合蛋白的N末端为谷氨酰胺(例如信号序列包含残基l-23)的实施方案中，N末端谷氨酰胺(Q24)可环化以形成焦谷氨酸(pE)。这类分子的实例构建体为具有如SEQIDN0:45、46、47、48、49、50及51(图1)中所述的氨基酸序列的多肽以及具有如SEQIDN0:56及57(图4)中所述的氨基酸序列的RAGE融合蛋白。如本
技术领域：
中公认，当在某些重组系统中表达时，本发明的RAGE融合蛋白的Ch3区可经由翻译后修饰使C末端氨基酸切除(例如参见Li等人，"/o户roce^//^/.，4:23-30(2005))。在一实施方案中，所切除的C末端氨基酸为赖氨酸(K)。因此，在替代实施方案中，本发明的RAGE融合蛋白可包含具有如SEQIDN0:32-37、56及57中所述的氨基酸序列而无C末端赖氨酸(K)的多肽。因此，在各种实施方案中，RAGE多肽可包含人类RAGE的氨基酸23-116(SEQIDNO:7)或与其至少90%—致的序列或人类RAGE的氨基酸24-116(SEQIDNO:8)或与其至少90%—致的序列或其中Q24环化以形成pE的人类RAGE的氨基酸24-116(SEQIDNO:46)或与其至少90%—致的序列，对应于RAGE的V结构域。或者RAGE多肽可包含人类RAGE的氨基酸124-221(SEQIDNO:11)或与其至少90%—致的序列，对应于RAGE的C1结构域。在另一实施方案中，RAGE多肽可包含人类RAGE的氨基酸227-317(SEQIDNO:12)或与其至少90%—致的序列，对应于RAGE的C2结构域。或者RAGE多肽可包含人类RAGE的氨基酸23-123(SEQIDNO:13)或与其至少90%—致的序列或人类RAGE的氨基酸24-123(SEQIDNO:14)或与其至少90%—致的序列，对应于RAGE的V结构域及下游域间连接子。或者，RAGE多肽可包含其中Q24环化以形成pE的人类RAGE的氨基酸24-123(SEQIDNO:48)或与其至少90°/。一致的序列。或者RAGE多肽可包含人类RAGE的氨基酸23-226(SEQIDNO:17)或与其至少90%—致的序列或人类RAGE的氨基酸24-226(SEQIDNO:18)或与其至少90%—致的序列，对应于V结构域、CI结构域及连接这两个结构域的域间连接子。或者RAGE多肽可包含其中Q24环化以形成pE的人类RAGE的氨基酸24-226(SEQIDNO:50)或与其至少90%—致的序列。或者，RAGE多肽可包含人类RAGE的氨基酸23-339(SEQIDNO:5)或与其至少90%—致的序列或人类RAGE的24-339(SEQIDNO:6)或与其至少90°/。一致的序列，对应于sRAGE(即编码V、C1及C2结构域及域间连接子)。或者，RAGE多肽可包含其中Q24环化以形成pE的人类RAGE的氨基酸24-339(SEQIDNO:45)或与其至少90%—致的序列。或可使用这些序列的每一个的片段。这些多肽的氨基酸序列参见图1。RAGE融合蛋白可包括并非来源于RAGE或其片段的数种类型的肽。RAGE融合蛋白的第二多肽可包含来源于免疫球蛋白的多肽。在一实施方案中，免疫球蛋白多肽可包含免疫球蛋白重链或其部分(即片段)。例如，重链片段可包含来源于免疫球蛋白的Fc片段的多肽，其中Fc片段包含单体形式的重链铰链多肽及免疫球蛋白重链的CH2及CH3结构域。重链(或其部分)可来源于任一已知重链同种型IgG(y)、IgM()i)、IgD(5)、IgE(e)或IgA(oc)。此外，重链(或其部分)可来源于任一已知重链亚型IgGl(yl)、IgG2(Y2)、IgG3(y3)、IgG4(y4)、IgAl(ctl)、IgA2(ct2)或这些同种型或亚型的改变生物活性的突变。第二多肽可包含人类IgGl的CH2及Ch3结构域或这些结构域的任一个或两个的部分。作为实例实施方案，包含人类IgGl的Ch2及Ch3結枸域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:40(图l)或其部分。在一实施方案中，包含人类IgGl的CH2及CH3结构域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:38或其片段。免疫球蛋白肽可通过核酸序列SEQIDNO:39或SEQIDNO:41(图1)编码。SEQIDNO:38或SEQIDNO:40中的免疫球蛋白序列还可通过SEQIDNO:52或SEQIDNO:53(图l)编码，其中在序列的C末端编码脯氨酸(CCG至CCC)及甘氨酸(GGT至GGG)的密码子的沉默碱基变化移除末端密码子附近的隐含RNA剪接位点(即SEQIDNO:39的核苷酸622-627经修饰产生SEQIDNO:52或SEQIDNO:41的核苷酸652-657经修饰产生SEQIDNO:53)。免疫球蛋白链的Fc部分的铰链区在活体内可为促炎性的。因此在一实施方案中，本发明的RAGE融合蛋白包含来源于RAGE的域间连接子而非来源于免疫球蛋白的域间铰链多肽。因此在某些实施方案中，RAGE融合蛋白可包含直接连接于包含免疫球蛋白的C2结构域或免疫球蛋白的C2结构域的片段或部分的多肽的RAGE多肽。在一实施方案中，CH2结构域或其片段包含SEQIDNO:42(图1)。在一实施方案中，SEQIDNO:42的片段包含其中前十个氨基酸包含至少一部分所移除的Fc铰链区的SEQIDNO:42。在一实施方案中，RAGE多肽可包含配体结合位点。RAGE配体结合位点可包含RAGE的V结构域或其部分。在一实施方案中，RAGE配体结合位点包含SEQIDNO:9或与其至少90%—致的序列或SEQIDNO:IO或与其至少90°/。一致的序列或SEQIDNO:47或与其至少90%—致的序列。用于本发明的RAGE融合蛋白中的RAGE多肽可包含RAGE免疫球蛋白域。另外或可选择地，RAGE的片段可包含域间连接子。或者，RAGE多肽可包含连接至上游(即更接近N末端)或下游(即更接近C末端)域间连接子的RAGE免疫球蛋白域。在另一实施方案中，RAGE多肽可包含两个(或两个以上)RAGE免疫球蛋白域，各通过域间连接子彼此连接。RAGE多肽可进一步包含通过一或多个域间连接子彼此连接且具有连接至N末端RAGE免疫球蛋白域和/或C末端免疫球蛋白域的末端域间连接子的多个RAGE免疫球蛋白域。RAGE免疫球蛋白域与域间连接子的额外组合在本发明的范围内。在一实施方案中，RAGE多肽包含连接于RAGE免疫球蛋白域的RAGE域间连接子，使得RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸连接于域间连接子的N末端氨基酸，且RAGE域间连接子的C末端氨基酸直接连接于包含免疫球蛋白的CH2结构域或其片段的多肽的N末端氨基酸。包含免疫球蛋白的CH2结构域的多肽可包含人类IgGl的CH2及CH3结构域或这些结构域的任一个或两个的部分。作为实例实施方案，包含人类IgGl的CH2及CH3结构域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:40或其部分。在一实施方案中，包含人类IgGl的Ch2及Ch3結枸域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:38或其片段。或人类IgGl可包含其中移除末端赖氨酸(K)的SEQIDNO:38或SEQIDNO:40。如上文所述，本发明的RAGE融合蛋白可包含单个或多个来自RAGE的结构域。而且，包含连接于RAGE多肽域的域间连接子的RAGE多肽可包含全长RAGE蛋白的片段。例如，RAGE多肽可包含人类RAGE的氨基酸23-136(SEQIDNO:15)或与其至少90。/。一致的序列或人类RAGE的氨基酸24-136(SEQIDNO:16)或与其至少90%—致的序列或其中Q24环化以形成pE的人类RAGE的氨基酸24-136(SEQIDNO:49)或与其至少90%—致的序列，对应于RAGE的V结构域及下游域间连接子。或者，RAGE多肽可包含人类RAGE的氨基酸23-251(SEQIDNO:19)或与其至少90%—致的序列或人类RAGE的氨基酸24-251(SEQIDNO:20)或与其至少90%—致的序列或其中Q24环化以形成pE的人类RAGE的氨基酸24-251(SEQIDNO:51)或与其至少90%—致的序列，对应于V结构域、CI结构域、连接这两个结构域的域间连接子及CI下游的第二域间连接子。例如，在一实施方案中，RAGE融合蛋白可包含两个来源于RAGE蛋白的免疫球蛋白域及两个来源于人类Fc多肽的免疫球蛋白域。RAGE融合蛋白可包含连接于第二RAGE免疫球蛋白域及第二RAGE域间连接子的第一RAGE免疫球蛋白域及第一RAGE域间连接子，以便第一域间连接子的N末端氨基酸连接于第一RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸，第二RAGE免疫球蛋白域的N末端氨基酸连接于第一域间连接子的C末端氨基酸，第二域间连接子的N末端氨基酸连接于第二RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸，且RAGE第二域间连接子的C末端氨基酸直接连接于CH2免疫球蛋白域的N末端氨基酸。在替代实施方案中，四域RAGE融合蛋白通过SEQIDNO:30或SEQIDNO:54编码(图2)。在一实施方案中，四域RAGE融合蛋白可包含SEQIDNO:32(图4)。在替代实施方案中，四域RAGE融合蛋白包含SEQIDNO:33、SEQIDNO:34或SEQIDNO:56(图4)。可选择地，三域RAGE融合蛋白可包含一个来源于RAGE的免疫球蛋白域及两个来源于人类Fc多肽的免疫球蛋白域。例如，RAGE融合蛋白可包含经由RAGE域间连接子连接于CH2免疫球蛋白域或CH2免疫31球蛋白域的部分的N末端氨基酸的单个RAGE免疫球蛋白域。在替代实施方案中，三域RAGE融合蛋白通过SEQIDNO:31或SEQIDNO:55编码(图3)。在一实施方案中，三域RAGE融合蛋白可包含SEQIDNO:35(图5)。在替代实施方案中，三域RAGE融合蛋白可包含SEQIDNO:36、SEQIDNO:37或SEQIDNO:57(图5)。RAGE域间连接子片段可包含天然为RAGE免疫球蛋白域的下游且因此连接至RAGE免疫球蛋白域的肽序列。例如，对RAGEV结构域而言，域间连接子可包含天然为来自V结构域下游的氨基酸序列。在一实施方案中，连接子可包含SEQIDNO:21,对应于全长RAGE的氨基酸117-123。或者连接子可包含具有天然RAGE序列的额外部分的肽。例如，可使用包含SEQIDNO:21的上游及下游的数个氨基酸(例如1-3、1-5或1-10或1-15个氨基酸)的域间连接子。因此在一实施方案中，域间连接子包含SEQIDNO:23，SEQIDNO:23包含全长RAGE的氨基酸117-136。或者可使用自连接子的任一末端删除(例如)l、2或3个氨基酸的SEQIDNO:21的片段。在替代实施方案中，连接子可包含与SEQIDNO:21或SEQIDNO:23至少70%、75%、80°/。、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%—致的肽。对RAGECI结构域而言，连接子可包含天然为CI结构域下游的肽序列。在一实施方案中，连接子可包含SEQIDNO:22，对应于全长RAGE的氨基酸222-251。或者连接子可包含具有天然RAGE序列的额外部分的肽。例如，可使用包含SEQIDNO:22的上游及下游的数个氨基酸(例如1-3个、1-5个或1-10个或1-15个氨基酸)的域间连接子。或者，可使用自连接子的任一末端删除(例如)1-3个、1-5个或1-10个或1-15个氨基酸的SEQIDNO:22的片段。例如，在一实施方案中，RAGE域间连接子可包含SEQIDNO:24，对应于氨基酸222-226。在替代实施方案中，连接子可包含与SEQIDNO:22或SEQIDNO:24至少70%、75%、80%、85%、90°/。、95%、96°/。、97%、98%或99%—致的肽。或者域间连接子可包含SEQIDNO:44,对应于RAGE氨基酸318-342。在替代实施方案中，连接子可包含与SEQIDNO:44至少70%、75°/。、80°/。、85%、90%、95%、96°/。、97%、98%或99°/。一致的肽。此外，本领域技术人员认识到在编码序列中改变、添加或删除单个氨基酸或小百分比的氨基酸(通常少于约5%，更通常少于约1%)的个别取代、删除或添加为保守修饰变化，其中这类改变导致化学上类似的氨基酸取代氨基酸。提供功能上类似的氨基酸的保守取代在本
技术领域：
中熟知。以下实例组各含有彼此保守取代的氨基酸1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精胺酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。保守取代为其中取代氨基酸(天然产生或经修饰)在结构上与被取代的氨基酸相关(即具有与被取代的氨基酸相同大小及电学性质)的取代。因此，取代氨基酸在侧链中具有与原氨基酸相同或类似的官能团。"保守取代"还指利用与被取代的氨基酸相同但侧链中官能团经适合保护基团保护的取代氨基酸。如本
技术领域：
中已知，氨基酸可自其天然结构通过酶促或非酶促反应机制来进行化学修饰。例如，在一实施方案中，N末端谷氨酸或谷氨酰胺可在失去水时环化形成焦谷氨酸(pyroE或pE)(Chelius等人，J/za/.C力e/z，78:2370—2376(2006)及Burstein等人，户roc.^"'o/a7Sc/.，73:2604-2608(1976))。可选择地，可通过编码蛋白质中经由翻译后加工变成N末端的位置处的谷氨酸的核酸序列(例如在SEQIDNO:1的残基24为谷氨酸而非谷氨酰胺的情况下)潜在评估具有N末端焦谷氨酸的融合蛋白。产生RAGE融合蛋白的方法
技术领域：
：本发明还包含一种制备RAGE融合蛋白的方法。因此在一实施方案中，本发明包含一种制备RAGE融合蛋白的方法，该方法包含将连接于33第二非RAGE多肽的RAGE多肽共价连接的步骤，其中RAGE多肽包含RAGE配体结合位点。例如，经连接的RAGE多肽及第二非RAGE多肽可通过重组DNA构建体编码。该方法可进一步包含将DNA构建体并入表达载体的步骤。该方法还可包含将表达栽体插入宿主细胞中的步骤。例如，本发明的实施方案提供包含连接于第二非RAGE多肽的RAGE多肽的RAGE融合蛋白。在一实施方案中，RAGE融合蛋白可包含RAGE配体结合位点。在一实施方案中，配体结合位点包含RAGE融合蛋白的大部分N末端结构域。RAGE配体结合位点可包含RAGE的V结构域或其部分。在一实施方案中，RAGE配体结合位点包含SEQIDNO:9或与其至少90°/。一致的序列或SEQIDNO:10或与其至少90°/。一致的序列或SEQIDNO:47或与其至少90%—致的序列。在一实施方案中，RAGE多肽可连接于包含免疫球蛋白域或免疫球蛋白域的部分(例如其片段)的多肽。在一实施方案中，包含免疫球蛋白域的多肽包含人类IgG的CH2或CH3结构域中至少一个的至少一部分。因此，本发明的实施方案可包含编码本发明的RAGE融合蛋白的经分离DNA分子。在某些实施方案中，该DNA分子编码包含如SEQIDNO:56或SEQIDNO:57中所述的氨基酸序列或与其至少70%、75%、80°/。、85%、90°/。、95%、96°/。、97%、98°/。或99%—致的序列的RAGE融合蛋白。例如，在某些实施方案中，与SEQIDNO:56或SEQIDNO:57至少90%—致的序列包含无C末端赖氨酸的SEQIDNO:56或SEQIDNO:57的序列。因此在某些实施方案中，本发明可包含具有如SEQIDNO:54或SEQIDNO:55中所述的序列或与其至少90%—致的序列的DNA分子。RAGE融合蛋白可经重组DNA4支术进行工程改造。例如，在一实施方案中，本发明可包含经分离的核酸序列，该核酸序列包含编码连接于第二非RAGE多肽的RAGE多肽的多核苷酸序列、与其互补或与其具有显著一致性。在一实施方案中，RAGE多肽可包含RAGE配体结合位占,、、、oRAGE蛋白或多肽可包含全长人类RAGE(例如SEQIDNO:l)或人类RAGE的片段。在一实施方案中，RAGE多肽不包括任何信号序列残基。RAGE信号序列可包含全长RAGE(SEQIDNO:l)的残基l-22或残基1-23。在替代实施方案中，RAGE多肽可包含与人类RAGE至少70°/。、75%、80%、85%、90%、95°/。、96%、97%、98%或99%—致的序列或其片段。例如，在一实施方案中，RAGE多肽可包含人类RAGE或其片段，其中甘氨酸而非甲硫氨酸作为第一残基(例如参见Neeper等人，(1992))。或者，人类RAGE可包含移除信号序列的全长RAGE(例如SEQIDNO:2或SEQIDNO:3)(图1A及IB)或该氨基酸序列的部分。本发明的RAGE融合蛋白还可包含sRAGE(例如SEQIDNO:4)、与sRAGE至少90%—致的多肽或sRAGE的片段。例如，RAGE多肽可包含人类sRAGE或其片段，其中甘氨酸而非曱硫氨酸作为第一残基(例如参见Neeper等人,(1992))。或者人类RAGE可包含移除信号序列的sRAGE(例如参见图1中SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:45)或该氨基酸序列的部分。在其它实施方案中，RAGE蛋白可包含V结构域(例如参见图1中SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:46)。或者，可使用与V结构域或其片段至少90%—致的序列。或者，RAGE蛋白可包含RAGE片段，该RAGE片段包含V结构域的部分(例如参见图1中SEQIDNO:9、SEQIDNO:10或SEQIDNO:47)。在一实施方案中，配体结合位点可包含SEQIDNO:9或与其至少90%—致的序列或SEQIDNO:10或与其至少90%—致的序列或SEQIDNO:47或与其至少90%—致的序列。在另一实施方案中，RAGE片段为合成肽。在一实施方案中，核酸序列包含SEQIDNO:25以编码人类RAGE的氨基酸1-118或其片段。例如，包含SEQIDNO:25的核苷酸1-348的序列可用于编码人类RAGE的氨基酸1-116。或者，核酸可包含SEQIDNO:26以编码人类RAGE的氨基酸l-123。或者，核酸可包含SEQIDNO:27以编码人类RAGE的氨基酸1-136。或者，核酸可包含SEQIDNO:28以编码人类RAGE的氨基酸1-230。或者，核酸可包含SEQIDNO:29以编码人类RAGE的氨基酸1-251。或这些核酸序列的片段可用于编码RAGE多肽片段。RAGE融合蛋白可包括并非来源于RAGE或其片段的数种类型的肽。RAGE融合蛋白的第二多肽可包含来源于免疫球蛋白的多肽。重链(或其部分)可来源于任一已知重链同种型IgG(y)、IgM(M)、IgD(5)、IgE(s)或IgA(a)。此外，重链(或其部分)可来源于任一已知的重链亚型IgGl(yl)、IgG2(y2)、IgG3(y3)、IgG4(y4)、IgAl(al)、IgA2(cc2)或这些同种型或亚型的改变生物活性的突变。第二多肽可包含人类IgGl的(:2及(:3结构域或这些结构域中的任一个或两个的部分。作为实例实施方案，包含人类IgGl的&2及"3结构域或其部分的多肽可包含SEQIDN0:38或SEQIDNO:40。在一实施方案中，包含人类IgGl的CH2及CH3结构域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:38或其片段。免疫球蛋白肽可通过核酸序列SEQIDNO:39或SEQIDNO:41编码。在替代实施方案中，SEQIDNO:38或SEQIDNO:40中的免疫球蛋白序列还可分别通过SEQIDNO:52或SEQIDNO:53编码。免疫球蛋白链的Fc部分的铰链区在活体内可能是促炎性的。因此，本发明的RAGE融合蛋白可包含来源于RAGE的域间连接子而非来源于免疫球蛋白的域间铰链多肽。因此在一实施方案中，本发明包含一种制备RAGE融合蛋白的方法，该方法包含将RAGE多肽共价连接于包含免疫球蛋白的CH2结构域或免疫球蛋白的CH2结构域的部分的多肽的步骤。在一实施方案中，RAGE融合蛋白可包含RAGE配体结合位点。RAGE配体结合位点可包含RAGE的V结构域或其部分。在一实施方案中，RAGE配体结合位点包含SEQIDNO:9或与其至少90%—致的序列或SEQIDNO:IO或与其至少90。/。一致的序列或SEQIDNO:47或与其至少90%—致的序列。在一实施方案中，RAGE融合蛋白可由重组DNA构建体编码。该方法可包含将DNA构建体并入表达载体的步骤。该方法还可包含将表达栽体转染至宿主细胞中。因此，本发明的实施方案还包含编码DNA分子的表达载体，该DNA分子编码本发明的RAGE融合蛋白。在某些实施方案中，DNA分子编码包含如SEQIDNO:56或SEQIDNO:57中所述的氨基酸序列或与其至少70%、75%、80%、85°/。、90%、95%、96%、97%、98%或99°/。一致的序列的RAGE融合蛋白。例如，在某些实施方案中，与SEQIDNO:56或SEQIDNO:57至少90°/。一致的序列包含无C末端赖氨酸的SEQIDNO:56或SEQIDNO:57的序列。本发明的其它实施方案还包含经编码DNA分子(编码本发明的RAGE融合蛋白)的表达栽体转染的细胞。在某些实施方案中，DNA分子编码包含如SEQIDNO:56或SEQIDNO:57中所述的氨基酸序列或与其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96°/。、97%、98%或99%—致的序列的RAGE融合蛋白。例如，在某些实施方案中，与SEQIDNO:56或SEQIDNO:57至少90%—致的序列包含无C末端赖氨酸的SEQIDNO:56或SEQIDNO:57的序列。例如，在一实施方案中，本发明包含编码直接连接于包含免疫球蛋白的CH2结构域的多肽的RAGE多肽或其片段的核酸。在一实施方案中，CH2结构域或其片段包含SEQIDNO:42。在一实施方案中，SEQIDNO:42的片段包含移除前十个氨基酸的SEQIDNO:42。第二多肽可包含人类IgGl的(:2及"3结构域。作为实例实施方案，包含人类IgGl的CH2及CH3结构域的多肽可包含SEQIDNO:38或SEQIDNO:40。在一实施方案中，包含人类IgGl的(:2及"3结构域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:38或其片段。免疫球蛋白肽可通过核酸序列SEQIDNO:39或SEQIDNO:41编码。SEQIDNO:38或SEQIDNO:40中的免疫球蛋白序列还可通过SEQIDNO:52或SEQIDNO:53编码，其中在序列的C末端编码脯氨酸(CCG至CCC)及甘氨酸(GGT至GGG)的密码子的沉默碱基变化移除末端密码子附近的隐含RNA剪接位点(即SEQIDNO:39的核苷酸622-627经修饰产生SEQIDNO:52或SEQIDNO:41的核普酸652-657经修饰产生SEQIDNO:53)。在一实施方案中，RAGE多肽可包含连接于RAGE免疫球蛋白域的RAGE域间连接子，以便RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸连接于域间连接子的N末端氨基酸，且RAGE域间连接子的C末端氨基酸直接连接于包含免疫球蛋白的CH2结构域或其片段的多肽的N末端氨基酸。包含免疫球蛋白的CH2结构域或其部分的多肽可包含一多肽，该多肽包含人类IgGl的CH2及Ch3结构域或这些结构域两个或任一个的部分。作为实例实施方案，包含人类IgGl的Ch2及Ch3結枸域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:38或SEQIDNO:40。在一实施方案中，包含人类IgGl的CH2及CH3结构域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:38或其片段。在某些实施方案中，包含人类IgGl的CH2及CJ结构域或其部分的多肽可包含移除C末端赖氨酸(K)的SEQIDNO:38或SEQIDNO:40。本发明的RAGE融合蛋白可包含单个或多个来自RAGE的结构域。包含连接于RAGE免疫球蛋白域的域间连接子的RAGE多肽还可包含全长RAGE蛋白的片段。例如，在一实施方案中，RAGE融合蛋白可包含两个来源于RAGE蛋白的免疫球蛋白域及两个来源于人类Fc多肽的免疫球蛋白域。RAGE融合蛋白可包含连接于第二RAGE免疫球蛋白域及第二RAGE域间连接子的第一RAGE免疫球蛋白域及第一域间连接子，以便第一域间连接子的N末端氨基酸连接于第一RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸，第二RAGE免疫球蛋白域的N末端氨基酸连接第一域间连接子的C末端氨基酸，第二域间连接子的N末端氨基酸连接于RAGE第二免疫球蛋白域的C末端氨基酸，且RAGE第二域间连接子的C末端氨基酸直接连接于包含CH2免疫球蛋白域或其片段的多肽的N末端氨基酸。例如，RAGE多肽可包含人类RAGE的氨基酸23-251(SEQIDNO:19)或与其至少90。/。一致的序列或人类RAGE的氨基酸24-251(SEQIDNO:20)或与其至少90°/。一致的序列，或其中Q24环化以形成pE的人类RAGE的氨基酸24-251(SEQIDNO:51)或与其至少90%—致的序列，对应于V结构域、CI结构域、连接这两个结构域的域间连接子及CI下游的第二域间连接子。在一实施方案中，包含SEQIDNO:30或其片段的核酸构建体可编码四域RAGE融合蛋白(图2A)。在另一实施方案中，包含SEQIDNO:54(图2B)的核酸构建体可编码四域RAGE融合蛋白，其中加入在序列的C末端编码脯氨酸(CCG至CCC)及甘氨酸(GGT至GGG)38的密码子的沉默碱基变化以移除末端密码子附近的隐含RNA剪接位点(即SEQIDNO:30的核苷酸1375-1380经修饰产生SEQIDNO:54)。可选择地，三域RAGE融合蛋白可包含一个来源于RAGE的免疫球蛋白域及两个来源于人类Fc多肽的免疫球蛋白域。例如，RAGE融合段的多肽的N末端氨基酸的单个RAGE免疫球蛋白域。例如，RAGE多肽可包含人类RAGE的氨基酸23-136(SEQIDNO:15)或与其至少90%一致的序列或人类RAGE的氨基酸24-136(SEQIDNO:16)或与其至少90%—致的序列，或其中Q24环化以形成pE的人类RAGE的氨基酸24-136(SEQIDNO:49)或与其至少90%—致的序列，对应于RAGE的V结构域及下游域间连接子(图1)。在一实施方案中，包含SEQIDNO:31或其片段的核酸构建体可编码三域RAGE融合蛋白(图3A)。在另一实施方案中，包含SEQIDNO:55的核酸构建体可编码三域RAGE融合蛋白，其中在序列的C末端编码脯氨酸(CCG至CCC)及甘氨酸(GGT至GGG)的密码子的沉默碱基变化移除末端密码子附近的fe含RNA剪接位点(即SEQIDNO:31的核苦酸1030-1035经修饰产生SEQIDNO:55)(图3B)。RAGE域间连接子片段可包含天然为RAGE免疫球蛋白域的下游且因此连接至RAGE免疫球蛋白域的肽序列。例如，对RAGEV结构域而言，域间连接子可包含天然为V结构域下游的氨基酸序列。在一实施方案中，连接子可包含SEQIDNO:21，对应于全长RAGE的氨基酸117-123。或者连接子可包含具有天然RAGE序列的额外部分的肽。例如，可使用包含SEQIDNO:21的上游及下游的数个氨基酸(例如1-3个、1-5个或1-10个或1-15个氨基酸)的域间连接子。因此在一实施方案中，域间连接子包含SEQIDNO:23，SEQIDNO:23包含全长RAGE的氨基酸117-136。或者，可使用自连接子任一末端删除(例如)1、2或3个氨基酸的SEQIDNO:21的片段。在替代实施方案中，连接子可包含与SEQIDNO:21或SEQIDNO:23至少70%、75°/。、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98°/。或99°/。一致的序列。对RAGECl结构域而言，连接子可包含天然为CI结构域下游的肽序列。在一实施方案中，连接子可包含SEQIDNO:22，对应于全长RAGE的氨基酸222-251。或者，连接子可包含具有天然RAGE序列的额外部分的肽。例如，可〗吏用包含SEQIDNO:22上游及下游的数个氨基酸(l-3个、1-5个或1-IO个或1-15个氨基酸)的连接子。或者，可使用自连接子的任一末端删除(例如)1-3个、1-5个或1-10个或1-15个氨基酸的SEQIDNO:22的片段。例如，在一实施方案中，RAGE域间连接子可包含SEQIDNO:24，对应于氨基酸222-226。在替代实施方案中，连接子可包含与SEQIDNO:22或SEQIDNO:24至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98°/。或99°/。一致的序列。或者域间连接子可包含SEQIDNO:44，对应于RAGE氨基酸318-342。在替代实施方案中，连接子可包含与SEQIDNO:44至少70%、75%、80%、85%、90%、95°/"96%、97%、98°/。或99%—致的序列。该方法可进一步包含将DM构建体并入表达栽体的步骤。因此在一实施方案中，本发明包含编码RAGE融合蛋白的表达载体，该RAGE融合蛋白包含直接连接于包含免疫球蛋白的CH2结构域或免疫球蛋白的CH2结构域的部分的多肽的RAGE多肽。在一实施方案中，RAGE多肽包含具有连接至RAGE免疫球蛋白域的RAGE域间连接子的构建体(如本文所述的那些构建体)，以便RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸连接于域间连接子的N末端氨基酸，且RAGE域间连接子的C末端氨基酸直接连接于包含免疫球蛋白的CH2结构域或其部分的多肽的N末端氨基酸。例如，用于转染细胞的表达栽体可包含核酸序列SEQIDNO:30或其片段、SEQIDNO:54或其片段、SEQIDNO:31或其片段或SEQIDNO:55或其片段。该方法可进一步包含用本发明的表达载体转染细胞的步骤。因此在一实施方案中，本发明包含用表达本发明的RAGE融合蛋白的表达栽体转染的细胞，以便细胞表达包含直接连接于包含免疫球蛋白的CH2结构域或免疫球蛋白的CH2结构域的部分的多肽的RAGE多肽的RAGE融合蛋白。在一实施方案中，RAGE多肽包含具有连接于RAGE免疫球蛋白域的RAGE域间连接子的构建体(如本文所述的那些构建体)，以便RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸连接于域间连接子的N末端氨基酸且RAGE域间连接子的C末端氨基酸直接连接于包含免疫球蛋白的CH2结构域或其部分的多肽的N末端氨基酸。例如，表达载体可包含核酸序列SEQIDNO:30或其片段、SEQIDNO:54或其片段、SEQIDNO:31或其片段或SEQIDNO:55或其片段。例如，可通过使不同长度的人类RAGEcDNA序列与人类IgGlFc(yl)3'cDNA序列融合来构建质粒以表达RAGE-IgG融合蛋白。可通过使用标准重组技术将表达盒序列插入表达载体，如pcDNA3.1表达栽体(Invitrogen，CA)。该方法还可包含将表达载体转染至宿主细胞中。RAGE融合蛋白可在哺乳动物表达系统中表达，包括其中通过使用病毒(如反转录病毒或腺病毒)将表达构建体导入哺乳动物细胞中的系统。可用作用于表达的宿主的哺乳动物细胞系在本
技术领域：
中是熟知的且包括多种可购自AmericanTypeCultureCollection(ATCC)的永生化细胞系。这些细胞系尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、海拉细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝癌细胞(例如HepG2)、A549细胞及大量其它细胞系。可经由测定哪些细胞系具有高表达水平的RAGE融合蛋白来选择细胞系。其它可使用的细胞系为昆虫细胞系，如Sf9细胞。植物宿主细胞包括(例如)烟草属、拟南芥属、浮萍、玉米、小麦、马铃薯等。细菌宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)及链霉菌(Streptomyces)种。酵母宿主细胞包括裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)及曱醇酵母(Pichiapastoris)。当编码RAGE融合蛋白基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞持续足以使RAGE融合蛋白在宿主细胞中表达或RAGE融合蛋白分泌入宿主细胞生长所在的培养基的时间来产生RAGE融合蛋白。可通过使用标准蛋白纯化方法从培养基中重新获得RAGE融合蛋白。编码RAGE融合蛋白的核酸分子及包含这些核酸子的表达载体可41用于转染适合的哺乳动物、植物、细菌或酵母宿主细胞。可通过用于将多核苷酸导入宿主细胞的任何已知方法进行转化。用于将异种多核糖介导的转染磷酸钙沉淀:聚凝胺介导的转染、原:生质体融合、电穿孔、多核苷酸在脂质体中的封装及DNA直接显微注射入细胞核。此外，可通过病毒载体将核酸分子导入哺乳动物细胞内。转化植物细胞的方法在本
技术领域：
中是熟知的，包括(例如)农杆菌介导的转化、基因枪转化、直接注射、电穿孔及病毒转化。转化细菌及酵母细胞的方法在本
技术领域：
中也是熟知的。还可使用DNA基因枪技术将表达载体递送至表达系统中，其中质粒沉淀至微观粒子(优选为金)上，且将粒子推动至目标细胞或表达系统中。DNA基因枪技术在本
技术领域：
中是熟知的且设备(例如"基因枪")可市售购得以将孩i粒子递送至细胞(例如HeliosGeneGun,Bio-RadLabs"Hercules,CA)及皮肤(PMEDDevice,PowderMedLtd.，Oxford,UK)中。可使用大量已知技术增强RAGE融合蛋白自产生细胞系的表达。例如，在某些条件下谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)及编码血浆的抗新霉素系统为增强表达的通用方法。由不同细胞系表达的RAGE融合蛋白可具有彼此不同的糖基化模式。然而，与RAGE融合蛋白的糖基化无关，所有由本文所提供的核酸分子编码或包含本文所提供的氨基酸序列的RAGE融合蛋白为本发明的部分。在一实施方案中，重组表达载体可转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中且最优化表达。在替代实施方案中，细胞可产生0.1至20克/升或0.5至10克/升或约l至2克/升。如本
技术领域：
中已知，可通过突变，如(例如)通过用包含所关注突变的引物进行核酸模板的PCR扩增来修饰这类核酸构建体。以这种方式，可设计包含对RAGE配体的亲和力不同的多肽。在一实施方案中，突变序列可与起始DNA90%或90%以上一致。因此，变异体可包括在严格条件(即相当于比l摩尔盐中DM双链体的解链温度(TM)低约20°C至27。C)下杂交的核苷酸序列。可通过将表达栽体转染至适当宿主中来表达编码序列。例如，重组载体可稳定转染至中国仓鼠卵巢(CH0)细胞中且选择及克隆表达RAGE融合蛋白的细胞。在一实施方案中，针对质粒编码的新霉素抗性，通过应用抗生素G418来选择表达重组构建体的细胞。可选择单独克隆且可扩增如通过蛋白质印迹分析细胞上清液所检测的表达高水平重组蛋白的克隆，且通过使用蛋白A柱的亲和层析法来纯化基因产物。编码本发明的RAGE融合蛋白的重组核酸的样品实施方案展示于图2及3中。例如，如上文所述，通过重组DNA构建体而产生的RAGE融合蛋白可包含连接于第二非RAGE多肽的RAGE多肽。RAGE融合蛋白可包含两个来源于RAGE蛋白的结构域及两个来源于免疫球蛋白的结构域。编码具有此类结构的RAGE融合蛋白TTP-4000(TT4)的实例核酸构建体展示于图2中(SEQIDNO:30及SEQIDNO:54)。如SEQIDNO:30及SEQIDNO:54所示，编码序列1-753(以粗体突出)编码RAGEN末端蛋白序列，而序列754-1386编码无铰链的IgGFc蛋白序列。当来源于SEQIDNO:30或SEQIDNO:54或与其至少90%—致的序列时，RAGE融合蛋白可包含SEQIDNO:32的四域氨基酸序列或移除信号序列的多肽(例如参见图4中SEQIDNO:33、SEQIDNO:34或SEQIDNO:56)。在SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34或SEQIDNO:56中，RAGE氨基酸序列以粗体突出。免疫球蛋白序列为无铰链区的IgG的Ch2及Ch3免疫球蛋白域。图6展示在RAGE及IgG中发现的多肽域的比较(图6A)及RAGE融合蛋白TTP-3000及TTP-4000的域结构。如图6B所示，全长TTP-4000RAGE融合蛋白的前251个氨基酸含有包含氨基酸1-22/23的信号序列、包含氨基酸23/24-116的V免疫球蛋白域(包括配体结合位点)、包含氨基酸117至123的域间连接子、包含氨基酸124-221的第二免疫球蛋白域(Cl)及包含氨基酸222-251的下游域间连接子作为RAGE多肽序列。在一实施方案中，RAGE融合蛋白可无需包含第二RAGE免疫球蛋白域。例如，RAGE融合蛋白可包含一个来源于RAGE的免疫球蛋白域及两个来源于人类Fc多肽的免疫球蛋白域。编码此类RAGE融合蛋白的实例核酸构建体展示于图3中(SEQIDNO:31及SEQIDNO:55)。如SEQIDNO:31及SEQIDNO:55所示，来自核普酸1-408的编码序列(以粗体突出)编码RAGEN末端蛋白序列，而来自409-1041的序列编码IgGlFc(yl)蛋白序列。当来源于SEQIDNO:31或SEQIDNO:55或与其至少90°/。一致的序列时，RAGE融合蛋白可包含SEQIDNO:35的三域氨基酸序列或移除信号序列的多肽(例如参见图5中SEQIDNO:36、SEQIDNO:37或SEQIDNO:57)。在图5中SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37或SEQIDNO:57中，RAGE氨基酸序列以粗体突出。如图6B所示，全长TTP-3000RAGE融合蛋白的前136个氨基酸含有包含氨基酸1-22/23的信号序列、包含氨基酸23/24-116的V免疫球蛋白域(包括配体结合位点)及包含氨基酸117至136的域间连接子作为RAGE多肽序列。序列137至346包括先铰链区的IgG的Ch2及Ch3免疫球蛋白域。本发明的RAGE融合蛋白可包含比不包含第二多肽的RAGE多肽改良的体内稳定性。RAGE融合蛋白可经进一步修饰以增加稳定性、功效、效能及生物可用性。因此，可通过翻译后加工或通过化学修饰来修饰本发明的RAGE融合蛋白。例如，可合成制备RAGE融合蛋白以包括L-、D-或非天然氨基酸、ct双取代氨基酸或N-烷基氨基酸。此外，可通过乙酰化、酰基化、ADP-核糖基化、酰胺化、脂质(如磷脂酰肌醇)连接、二硫键形成等等来修饰蛋白质。此外，可添加聚乙二醇以增加RAGE融合蛋白的生物稳定性。RAGE拮抗剂与RAGE融合蛋白的结合本发明的RAGE融合蛋白可包含许多应用。例如，本发明的RAGE融合蛋白可用于结合试验中以鉴别RAGE配体(如RAGE激动剂、拮抗剂或调节剂)。例如，在一实施方案中，本发明提供一种检测RAGE调节剂的方法，该方法包含(a)提供包含连接于第二非RAGE多肽的RAGE多肽的RAGE融合蛋白，其中RAGE多肽包含配体结合位点；(b)将所关注化合物及已知的对RAGE具有结合亲和力的配体与RAGE融合蛋白混合；及(c)测量在所关注化合物存在下已知的RAGE配体与RAGE融合蛋白的结合。在一实施方案中，配体结合位点包含RAGE融合蛋白的大部分N末端结构域。RAGE融合蛋白还可提供用于检测RAGE调节剂的试剂盒。例如，在一实施方案中，本发明的试剂盒可包含(a)已知对RAGE具有结合亲和力的化合物作为阳性对照；(b)包含连接于第二非RAGE多肽的RAGE多肽的RAGE融合蛋白，其中RAGE多肽包含RAGE配体结合位点；及(c)使用说明。在一实施方案中，配体结合位点包含RAGE融合蛋白的大部分N末端结构域。例如，RAGE融合蛋白可用于结合试验中以鉴别潜在的RAGE配体。在该结合试验的一个实例实施方案中，可将已知的RAGE配体以每孔约5微克的浓度涂布至固体基质(例如Maxisorb板)上，其中各孔含有约IOO微升UL)的总体积。可在4。C下将所述板温育隔夜以允许配体吸收或结合基质。或者可使用较高温度(例如室温)下较短温育时间。在允许配体结合基质的时期后，可吸干试验孔且可添加封闭緩冲剂(例如50mM咪唑緩冲剂中的1%BSA，pH7.2)以封闭非特异性结合。例如，可在室温下将封闭緩沖剂添加至板中历时1小时。接着可将板吸干和/或用洗涤緩冲剂洗涤。在一实施方案中，包含20mM咪唑、150mMNaCl、0.05%Tween-20、5mMCaCh及5mMMgCl2的緩冲剂(pH7.2)可用作洗涤緩冲剂。接着以渐增的稀释度将RAGE融合蛋白添加至试验孔中。接着可使RAGE融合蛋白与固定化的配体在试验孔中温育以便结合可达到平衡。在一实施方案中，使RAGE融合蛋白与固定化的配体在37。C下温育约l小时。在替代实施方案中，可使用较低温度下较长温育时间。在温育RAGE融合蛋白及固定化的配体后，可洗涤板以移除任何未结合的RAGE融合蛋白。结合固定化的配体的RAGE融合蛋白可以多种方式检测。在一实施方案中，使用ELISA检测。因此在一实施方案中，可将含有单克隆小鼠抗人类IgGl、生物素化的山羊抗小鼠IgG及抗生物素蛋白连接的碱性磷酸酶的免疫检测复合物添加至固定在试验孔中的RAGE融合蛋白。可使免疫检测复合物结合已固定的RAGE融合蛋白以便RAGE融合蛋白与免疫检测复合物之间的结合达到平衡。例如，可在室温下使复合物结合RAGE融合蛋白历时1小时。在此时，可通过用洗涤緩冲剂洗涤试验孔来移除任何未结合的复合物。可通过添加碱性磷酸酶底物对硝基苯磷酸脂(PNPP)及测量PNPP转变成对硝基苯酚(PNP)使得405mii处吸光率增加来检测结合的复合物。在一实施方案中，RAGE配体以纳摩尔(nM)或微摩尔(iaM)的亲和力结合RAGE融合蛋白。说明RAGE配体结合本发明的RAGE融合蛋白的实验展示于图7中。制备分别具有1.082mg/mL及370jag/mL的初始浓度的TTP-3000(TT3)及TTP-4000(TT4)溶液。如图7所示，在不同稀释度下RAGE融合蛋白TTP-300Q及TTP-400G能够结合固定化的RAGE配体淀粉状蛋白P(A0)(购自Biosource的淀粉状蛋白P(1-40))、S100b(S100)及两性蛋白(Ampho)，导致吸光率增加。在配体不存在下(即仅以BSA涂布)，吸光率未增加。本发明的结合试验可用于定量结合RAGE的配体。在替代实施方案中，RAGE配体可以从0.1至1000纳摩尔(nM)或从1nM至500nM或从10nM至80nM范围的结合亲和力结合本发明的RAGE融合蛋白。本发明的RAGE融合蛋白还可用以鉴别能结合RAGE的化合物。如图8及9分别所示，可评估RAGE配体与固定化的淀粉状蛋白P竟争结合TTP-4000(TT4)或TTP-3000(TT3)RAGE融合蛋白的能力。因此可见在10jaM最终试验浓度(FAC)下的RAGE配体可置换在起始TTP-4000溶液(图8)或TTP-3000(图9)的1:3、1:10、1:30及1:100浓度下RAGE融合蛋白与淀粉状蛋白13的结合。细胞效应物的调控本发明的RAGE融合蛋白的实施方案可用于调控RAGE介导的生物反应。例如，可设计RAGE融合蛋白以调控RAGE诱导的基因表达增加。因此在一实施方案中，本发明的RAGE融合蛋白可用于调控生物酶的功能。例如，RAGE与其配体之间的相互作用可产生氧化应激及NF-KB和NF-kB调节的基因(如细胞因子IL-1P、TNF-ct等等)的活化。此外，已显示若干其它调节途径(如涉及p21ras、MAP激酶、ERK1及ERn的那些途径)通过AGE和其它配体与RAGE的结合而活化。本发明的RAGE融合蛋白调控细胞效应物TNF-oc的表达的用途展示于图10中。THP-1骨髓细胞可在补充有10°/。FBS的RPMI-1640培养基中培养且可通过用S100b刺激RAGE来诱导分泌TNF-a。当该刺激在RAGE融合蛋白存在下发生时，可抑制通过S100b结合RAGE对TNF-ct的诱导。因此如图IO所示，添加10TTP-3000(TT3)或TTP-4000(TT4)RAGE融合蛋白将使TNF-a的S100b诱导减少约50%至75%。RAGE融合蛋白TTP-400Q在阻断S100b诱导TNF-a方面至少与sRAGE—样有效(图10)。通过仅添加IgG至S100b刺激的细胞的实验展示TTP-4000及TTP-3000的RAGE序列的抑制特异性。将IgG及S100b添加至试验显示与添加单独S100b相同的TNF-cc水平。在另一基于细胞的试验中，评估TTP-4000防止RAGE配体HMGBl与RAGE及其它HMGBl受体相互作用的能力。不^f象结合RAGE的抗RAGE抗体，为防止RAGE配体与RAGE相互作用，TTP-4000可通过结合RAGE配体来阻断RAGE配体与RAGE的相互作用。已报导HMGBl为RAGE及Toll样受体2及4的配体(Park等人，/C力e瓜，2004;279(9):7370-7)。所有这三个受体(RAGE、Tol1样受体2及Tol1样受体4)均表达于THP-1细胞上(Parker等人，//边/z7"/20/.，2004，172(8):4977-86)。在该实验中，在TTP4000或抗RAGE抗体存在或不存在下通过HMGBl(50mg/mL)刺激THP-1细胞以产生TNF-a。在用于试验的条件下，HMGBl应为TNF-a的唯一诱导物质。图11中的结果证实抗RAGE抗体及RAGE融合蛋白TTP-4000阻断HMGBl与在THP-1细胞上表达的RAGE相互作用，且TTP-4000比抗RAGE抗体更大程度地抑制HMGBl诱导的TNF-a产生。因此，数据表明通过抑制HMGBl与Toll样受体247和4以及存在于THP-1细胞上的RAGE相互作用，TTP-4000比抗RAGE抗体更大程度地抑制HMGB1活性。RAGE融合蛋白的生理特征虽然sRAGE在调节RAGE介导的疾病中具有治疗益处，但基于sRAGE在血浆中相对短的半衰期，人类sRAGE作为卓越治疗剂存在限制。例如，虽然在正常及糖尿病大鼠中啮齿动物sRAGE具有约20小时的半衰期，但当通过保留免疫活性sRAGE来评估时人类sRAGE具有少于2小时的半衰期(Renard等人，/.户力ar鹏co/.^77.77er.，290:1458-1466(1999))。为产生具有与sRAGE相似的结合特征但具有更稳定的药代动力学概况的RAGE治疗剂，可使用包含连接至一个或多个人类免疫球蛋白域的RAGE配体结合位点的RAGE融合蛋白。如本
技术领域：
中已知，免疫球蛋白域可包括免疫球蛋白重链的Fc部分。免疫球蛋白Fc部分可赋予RAGE融合蛋白若干特征。例如，Fc融合蛋白可增加这类融合蛋白的血清半衰期，通常从数小时至数天。药代动力学稳定性的增加一般为Fc片段的CH2与CH3区之间的连接子与FcRn受体相互作用的结果(Wines等人，/.//zm;mo厶，164:5313-5318(2000))。虽然包含免疫球蛋白Fc多肽的融合蛋白可提供增加的稳定性的优点，但当导入宿主时免疫球蛋白融合蛋白可引起炎症反应。炎症反应在很大程度上可归因于融合蛋白的免疫球蛋白的Fc部分。若目标在需要消除的有病细胞类型(例如癌细胞、引起自身免疫疾病的大量淋巴细胞)上表达，则促炎反应可为所要特征。因为大部分可溶性蛋白不激活免疫球蛋白，所以若目标为可溶性蛋白，则促炎反应可为中性特征。然而，若目标在其破坏导致不当副作用的细胞类型上表达，则促炎反应可为负性特征。因为炎症的多种介体可对周围组织有害和/或可能引起全身影响，所以若在融合蛋白结合组织目标的位点处建立炎症级联反应，则促炎反应可为负性特征。免疫球蛋白Fc片段上主要促炎位点位于CH1与CH2之间的铰链区。该铰链区与各种白细胞上的FcRl-3相互作用且引发这些细胞侵袭目标(Wines等人，/,/羅"o人，164:5313-5318(2000))。作为RAGE介导的疾病的治疗剂，RAGE融合蛋白可能无需产生炎症反应。因此，本发明的RAGE融合蛋白的实施方案可包含如下RAGE融合蛋白，其包含连接于免疫球蛋白域的RAGE多肽，其中来自免疫球蛋白的Fc铰链区被移除且被RAGE多肽置换。以此方式，RAGE融合蛋白与炎症细胞上Fc受体之间的相互作用可最小化。然而，保持MGE融合蛋白的各种免疫球蛋白域之间的适当堆栈(stacking)及其它三维结构相互作用可为重要的。因此，本发明的RAGE融合蛋白的实施方案可取代生物学惰性但结构上类似的分离RAGE的V及Cl结构域的RAGE域间连接子或分离RAGE的Cl及C2结构域的连接子，代替免疫球蛋白重链的正常铰链区。因此，RAGE融合蛋白的RAGE多肽可包含在RAGE免疫球蛋白域的下游天然发现的域间连接子序列以形成RAGE免疫球蛋白域/连接子片段。以此方式，由RAGE或免疫球蛋白促成的免疫球蛋白域之间的三维相互作用可被保持。在一实施方案中，本发明的RAGE融合蛋白可包含与sRAGE相比实质增加的药代动力学稳定性。例如，图12展示当RAGE融合蛋白TTP-4000使其配体饱和后，其可保持超过300小时的半衰期。这可与sRAGE在人类血浆中仅几小时的半衰期形成对比。因此在一实施方案中，本发明的RAGE融合蛋白可用于拮抗生理配体结合RAGE，作为治疗RAGE介导的疾病而不产生不可接受量的炎症的方式。本发明的RAGE融合蛋白可展示与IgG相比产生促炎反应的实质减少。例如，如图13中所示，在检测人类IgG刺激TNF-a释放的条件下，RAGE融合蛋白TTP-4000不刺激TNF-ct从细胞释放。用RAGE融合蛋白治疗疾病本发明还可包含治疗人类受试者中RAGE介导的病症的方法。在一实施方案中，该方法包含将含有RAGE多肽(其包含连接于第二非RAGE多肽的RAGE配体结合位点)的RAGE融合蛋白施用给受试者。在某些实施方案中，RAGE制剂包含冻干的RAGE融合蛋白。在某些实施方案中，本发明可包含治疗受试者中RAGE介导的病症的方法，该方法包含将治疗有效量的包含RAGE融合蛋白、冻干保护剂及緩冲剂的重构制剂施用给受试者。本文所述的RAGE融合蛋白的任何实施方案可在本发明的治疗组合物及制剂中用于治疗疾病。因此，RAGE融合蛋白可包含来源于连接于免疫球蛋白多肽的RAGE配体结合位点的序列。RAGE融合蛋白的实施方案可包含直接连接于包含免疫球蛋白的CH2结构域或免疫球蛋白的CH2结构域的部分的多肽的RAGE多肽。在某些实施方案中，RAGE多肽可包含连接于RAGE免疫球蛋白域的RAGE域间连接子，以便RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸连接于域间连接子的N末端氨基酸且RAGE域间连接子的C末端氨基酸直接连接于包含免疫球蛋白的CK2结构域或其部分的多肽的N末端氨基酸。例如，融合蛋白的某些实施方案可包含连接于第二RAGE免疫球蛋白域及第二RAGE域间连接子的第一RAGE免疫球蛋白域及第一RAGE域间连接子，以便第一域间连接子的N末端氨基酸连接于第一RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸，第二RAGE免疫球蛋白域的N末端氨基酸连接于第一域间连接子的C末端氨基酸，第二域间连接子的N末端氨基酸连接于第二RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸，且RAGE第二域间连接子的C末端氨基酸直接连接于Ch2免疫球蛋白域或免疫球蛋白的CH2结构域的部分的N末端氨基酸。在该多域融合蛋白的替代实施方案中，RAGE多肽可包含如SEQIDNO:10中所述的氨基酸序列或与其至少90°/。一致的序列，或如SEQIDNO:47中所述的氨基酸序列或与其至少70%、75%、80%、85%、90%、95°/。、96%、97°/。、98%或99°/。一致的序列。在其它替代实施方案中，RAGE融合蛋白可包含如SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57中至少一个所述的氨基酸序列或与其至少70%、75°/。、80%、85%、90%、95°/。、96%、97%、98%或99%—致的序列。例如，在某些实施方案中，与SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57至少90%—致的序列包含无C末端赖氨酸的SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57的多肽。或如本文所述的其它实施方案可构成用于本发明的制剂中的RAGE融合蛋白。多种冻干保护剂可用于冻干的RAGE融合蛋白制剂中。在某些实施方案中，冻干保护剂可包含非还原性糖。例如，非还原性糖可包含蔗糖、甘露糖醇或海藻糖。多种緩沖剂还可用于冻干的MGE融合蛋白制剂中。在某些实施方案中，緩冲剂可包含组氨酸。冻干的RAGE融合蛋白可包含额外组份。在某些实施方案中，RAGE融合蛋白制剂可进一步包含表面活性剂、螯合剂或膨化剂的至少一种。在一实施方案中，重构RAGE融合蛋白制剂包含约40-100mg/mLRAGE融合蛋白(其包含如SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57中所述的序列)、约2mM至约50mM组氨酸、约60mM至约65mM蔗糖、约0.001%至约0.05%Tween80及约6.0至6.5的pH值。例如，在某些实施方案中，重构RAGE融合蛋白制剂包含约40-50mg/mLRAGE融合蛋白(其包含如SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57中所述的序列)、约10mM组氨酸、约65mM蔗糖、约0.01%Tween80及在约6.0的pH值下。或者若需要，则其它浓度的RAGE融合蛋白可用于治疗RAGE介导的病症的制剂中。RAGE融合蛋白制剂可包含经调配用于临床中或用作处方药的稳定治疗剂。例如，在某些实施方案中，RAGE融合蛋白制剂可展示在40。C下一周后少于10%或少于5%或少于3%分解。RAGE融合蛋白制剂在稀释剂中重构时也可为稳定的。在某些实施方案中，少于约10%、5%、4%、3%、2%或1°/。的RAGE融合蛋白以聚集体形式存在于RAGE融合蛋白制剂中。重构RAGE融合蛋白制剂可适于通过各种途径且如治疗RAGE介导的相关病症所需来施用。施用本发明的RAGE融合蛋白可利用腹膜内(IP)注射。可选择地，RAGE融合蛋白可经口、经鼻内或作为气雾剂施用。在另一实施方案中，给药是静脉内(IV)的。RAGE融合蛋白还可皮下注射。在另一实施方案中，RAGE融合蛋白的给药是动脉内的。在另一实施方案中，给药是舌下的。给药还可利用緩释胶囊。在另一实施方案中，给药可经直肠，如通过栓剂等等。例如，当需要自我施用时，51皮下施用可适用于治疗慢性病症。如本文详述，RAGE已涉及多种疾病病况的发病机理，且发现本发明的RAGE融合蛋白有效改善这类疾病病况。因此，本发明的RAGE融合蛋白制剂可用以治疗多种RAGE介导的病症。在某些实施方案中，本发明的重构RAGE融合蛋白制剂可用以治疗糖尿病的症状或糖尿病晚期并发症的症状。例如，糖尿病或糖尿病晚期并发症的症状包含糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性足部溃疡、心血管并发症或糖尿病性神经病变的至少一种。在其它实施方案中，本发明的重构RAGE融合蛋白制剂可用以治疗淀粉状蛋白病、阿兹海默氏病、癌症、肾衰竭或与自身免疫相关的炎症、炎性肠病、类风湿性关节炎、牛皮裤、多发性硬化症、缺氧、中风、心脏病发作、失血性休克、脓毒病、器官移植或伤口愈合不良的至少一种。或者，重构RAGE融合蛋白制剂可用以治疗骨质疏松症。例如，在某些实施方案中，施用本发明的RAGE融合蛋白制剂增加受试者骨密度或减緩受试者骨密度降低的速率。在某些实施方案中，使用本发明的RAGE融合蛋白制剂治疗的自身免疫可包含皮肤细胞、胰腺细胞、神经细胞、肌肉细胞、内皮细胞、心脏细胞、肝细胞、肾细胞、心脏、骨髓细胞、骨、血细胞、动ii^细胞、静脉细胞、软骨细胞、甲状腺细胞或干细胞的至少一种的排斥反应。或者，重构RAGE融合蛋白制剂可用以治疗肾衰竭。在某些实施方案中，重构RAGE融合蛋白制剂可用于治疗与器官、组织或多个细胞的至少一种从第一位点移植至第二位点相关的炎症和/或排斥反应。第一及第二位点可在不同受试者中或在同一受试者体内。可使用本发明的RAGE融合蛋白制剂改良多种不同细胞类型的移植。例如，所移植的细胞、组织或器官可包含胰腺、皮肤、肝、肾、心脏、骨髓、血液、骨、肌肉、动脉、静脉、软骨、甲状腺、神经系统的细胞、组织或器官或干细胞。本文揭示了使用本发明的RAGE融合蛋白治疗这类疾病及病症的实例。例如，已使用多种动物模型证实作为治疗剂调控RAGE的化合物的用途。这些模型的实例如下(a)sRAGE在糖尿病及正常大鼠中在动脉损伤后再狭窄的大鼠模型中通过经由RAGE抑制内皮、平滑肌及巨噬细胞活化来抑制新血管内膜形成(Zhou等人，C/rc"7a〃o/107:2238-2243(2003));(b)使用sRAGE或抗RAGE抗体对RAGE/配体相互作用的抑制，减少全身淀粉状蛋白病小鼠模型中淀粉状蛋白斑形成(Yan等人，#ed.，6:643-651(2000))。伴随淀粉状蛋白斑减少的是炎性细胞因子(白细胞介素-6(IL-6)及巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF))减少以及NF-kB在所治疗的动物中活化减少；(c)在AD小鼠模型中RAGE转基因小鼠(RAGE过度表达者及RAGE显性阴性表达者)展示斑形成及认知功能障碍(Arancio等人，^#^/.,23:4096-4105(2004));(d)用sRAGE治疗糖尿病大鼠将降低血管通透性(Bonnardel-Phu等人，飾6"es，48:2052-2058(1999));(e)用sRAGE治疗减少脱脂裁脂蛋白E敲除的糖尿病小鼠体内动脉粥样硬化损害且预防db/db小鼠体内糖尿病性肾病的功能及形态指标(Hudson等人，Jrc力.刃/oc力e瓜，419:80—88(2003));且(f)sRAGE减弱胶原蛋白诱导关节炎的小鼠模型(Hofmann等人，Ge/2"/迈/77Mo/.，3:123-135(2002))、实验性过敏性脑脊髓炎的小鼠模型(Yan等人，9:28-293(2003))及炎性肠病的小鼠模型(Hofmann等人，Ce/入97:889-901(1999))中炎症的严重程度。因此在一实施方案中，本发明的RAGE融合蛋白可用于治疗糖尿病和/或源自由RAGE介导的糖尿病的并发症的症状。在替代实施方案中，糖尿病或糖尿病晚期并发症的症状可包含糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性足部溃疡、糖尿病的心血管并发症或糖尿病性神经病变。RAGE最初鉴别为其表达与糖尿病病理相关的分子的受体，其自身对糖尿病并发症的病理生理学而言是必要的。已显示体内抑制RAGE与其配体的相互作用治疗糖尿病并发症及炎症的多个模型(Hudson等人，Jrc力."/oc力e迈.^/o;/j^.,419:80-88(2003))。例如，在糖尿病小鼠体内用抗RAGE抗体治疗2个月使肾功能正常且减少异常肾组织病理(Flyvbjerg等人，飾6"es53:166-172(2004))。此外，用结合RAGE配体且抑制RAGE/配体相互作用的可溶形式的RAGE(sRAGE)治疗减少脱脂载脂蛋白E敲除的糖尿病小鼠体内动脉粥样硬化损害且减弱db/db小鼠体内糖尿病性肾病的功能及形态病理(Bucciarelli等人，C/rc"""'o2106:2827—2835(2002))。还显示最终导致晚期糖基化终产物(AGE)形成的巨分子的非酶促糖基化在炎症位点、肾衰竭中、高血糖症及与全身或局部氧化应激相关的其它病况存在下被增强(Dyer等人，J."/",//^e^.，91:2463-2469(1993);Reddy等人，，34:10872-10878(1995);Dyer等人，/,胁/.C力e瓜，266:11654-11660(1991);Degenhardt等人，Ce〃扁/.，44:1139-1145(1998))。如患有透析相关的淀粉状蛋白病的患者体内发现的AGE-fi2微球蛋白构成的关节淀粉状蛋白中(Miyata等人，/.67//.//re〃.，92:1243-1252(1993);Miyata等人，/.C7/".J歸".，98:1088-1094(1996))或一般如患有糖尿病的患者的维管结构及组织中所例示的(Schmidt等人，7VW"re#^/.，1:1002-1004(1995))，AGE在维管结构中的累积可集中出现。AGE随时间在患有糖尿病的患者体内的进行性累积表明在AGE沉积的位点内源性清除机制不能有效起作用。这类累积AGE具有通过多种机制改变细胞性质的能力。虽然RAGE在正常组织及维管结构、在其中受体的配体累积的环境中低水平表达，但已显示RAGE上调(Li等人，/.倫/.C力e瓜，272:16498-16506(1997);Li等人，/.C力e瓜，273:30870—30878(1998);Tanaka等人，/.C力e瓜，275:25781-25790(2000))。RAGE表达在糖尿病维管结构中的内皮、平滑肌细胞及浸润单核吞噬细胞中增加。细胞培养的研究也已证实AGE-RAGE相互作用引起对血管动态平衡中重要的细胞性质的改变。在图14中说明RAGE融合蛋白在治疗糖尿病相关病理中的用途。在再狭窄的糖尿病大鼠模型中评估RAGE融合蛋白TTP-4000,涉及测量血管损伤后平滑肌增殖及内膜扩增。如图14中说明，TTP-4000治疗可以剂量反应方式显著减少与糖尿病相关的再狭窄中内膜/介质(I/M)比率(图14A、表l)。TTP-4000治疗还可以剂量反应方式显著减少与再狭窄相关的血管平滑肌细胞增殖(图14B)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>*P<0.05;**对高剂量及低剂量而言，均使用每只动物3mg的负荷剂量。在其它实施方案中，本发明的RAGE融合蛋白还可用以治疗或逆转淀粉状蛋白病及阿兹海默氏病。RAGE为淀粉状蛋白P(AP)以及其它促淀粉状变蛋白(amyloidogenicprotein)(包括SAA及支链淀粉)的受体(Yan等人，#a/^re，382:685-691(1996);Yan等人，/Yoc.#a〃.JcaA^S^，94:5296-5301(1997);Yan等人，，6:643-651(2000);So謹等人，M/猜"，80:1101-1110(2000))。还在人类老年斑周围组织中发现RAGE配体(包括AGE、SlOOb及Ap蛋白)(Luth等人，Cere6.Cor^15:211-220(2005);Petzold等人，細r飾/.，336:167-170(2003);Sasaki等人，to/"虹，12:256-262(2001;Yan等人，We"or.肠ro/齡謹ci.，12:167-173(1998))。已显示RAGE与P片状纤维物质的结合与亚基(淀粉状蛋白P肽、支链淀粉、血清淀粉状蛋白A、朊病毒衍生的肽)的组成无关(Yan等人，l""re，382:685-691(1996);Yan等人,M歸.，6:643-651(2000))。此外，已显示淀粉状蛋白沉积导致RAGE表达增加。例如，在患有阿兹海默氏病(AD)的患者脑中，神经元及神经胶质中RAGE表达增加(Yan等人，^^"re382:685-691(1996))。与RAGE配体表达同时发生，RAGE在患有AD的个体海马区的星形胶质细胞及小胶质细胞中上调但在未患AD的个体中不上调(Lue等人，^r/,，171:29-45(2001))。这些发现表明表达RAGE的细胞经由在老年斑附近的RAGE/RAGE配体相互作用被活化。体外Ap介导的小胶质细胞活化还可用抗RAGE的配体结合域的抗体阻断(Yan等人，/Voc.jYs〃.//cs么，^S^，94:5296-5301(1997))。还证实RAGE可用作原纤维组装的焦点(Deane等人，〃".舰9:907-913(2003))。身淀粉状蛋白病小鼠模型中淀粉状蛋白斑形成(Yan等人，#ed，6:643-651(2000))。过表达人类RAGE及人类淀粉状前体蛋白(APP)的双转基因小鼠(在神经元中具有Swedish突变及Loadon突变(突变体hAPP))比其单个突变体hAPP转基因对应小鼠更早发生学习障碍及神经病理异常。相比之下，归因于在相同突变体hAPP背景下表达显性阴性形式RAGE的神经元，具有减小的AP信号转导能力的双转基因小鼠显示比其单个APP转基因对应小鼠延迟的神经病理及学习异常发作(Arancio等人，23:4096-4105(2004))。此外，已显示RAGE-淀粉状蛋白相互作用的抑制减少细胞RAGE的表达及细胞应激标记(以及NF-kB活化)且减少淀粉状蛋白沉积(Yan等人，6:643-651(2000))，这表明RAGE-淀粉状蛋白相互作用在富含淀粉状蛋白(甚至在早期)的环境中对扰动细胞性质以及淀粉状蛋白沉积的作用。因此，本发明的RAGE融合蛋白还可用以治疗减少淀粉状蛋白病且减少淀粉状蛋白斑及与阿兹海默氏病(AD)相关的认知功能障碍。如上文所述，已显示sRAGE减少AD动物模型中脑中淀粉状蛋白斑形成及随后炎症标记的增加。图15A及15B显示患有AD且经TTP-4000或小鼠sRAGE治疗3个月的小鼠比接受媒剂或人类IgG阴性对照(IgGl)的动物淀粉状蛋白|3(A0)斑更少且认知功能障碍更轻。类似于sRAGE，TTP-4000也可减少与AD相关的炎症细胞因子IL-1及TNF-oc(数据未展示)。本发明的RAGE融合蛋白还可用于治疗动脉粥样硬化及其它心血管病症。因此，已显示缺血性心脏病在糖尿病患者中尤其高发(Robertson等人，Ls6，18:538-551(1968);Ka腸l等人，/.j瓜J;^oc，241:2035-2038(1979);Kannel等人，"/a6.Care:2:120-126(1979))。此外，研究表明糖尿病患者中动脉粥样硬化比未罹患糖尿病的患者中动脉粥样硬化更快且更广泛(例如参见Wa11er等人，」瓜/.#ed，69:498-506(1980);Crall等人，J迈./.#ed64:221-230(1978);Hamby等人，C力eW，2:251-257(1976);及Pyorala等人，//a6.，3:463-524(1978))。虽然在糖尿病背景下加速动脉粥样硬化的原因是多方面的，但已显示AGE减少可减少斑形成。例如，本发明的RAGE融合蛋白还可用于治疗中风。当在中风的疾病相关动物模型中将TTP-4000与sRAGE相比时，发现TTP-4000提供显著更大的梗塞体积减小。在该模型中，将小鼠的中部颈动脉结扎且接着再灌注以形成梗塞。为评估RAGE融合蛋白治疗或预防中风的功效，在即将再灌注前用sRAGE或TTP-4000或对照免疫球蛋白治疗小鼠。如表2中可见，在这些动物中在限制梗塞面积方面，TTP-4000比sRAGE有效，表明TTP-4000由于其在血浆中更佳的半衰期而能够比sRAGE保持更大保护。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>IgG同型对照4%(300ug)*p<0.OOl显著；**与生理盐水相比在另一实施方案中，本发明的RAGE融合蛋白可用于治疗癌症。在一实施方案中，使用本发明的RAGE融合蛋白治疗的癌症包含表达RAGE的癌细胞。例如，可用本发明的RAGE融合蛋白治疗的癌症包括某些肺癌、某些神经胶质瘤、某些乳头状瘤等等。两性蛋白为高迁移率I族非组蛋白染色体DNA结合蛋白(Rauvala等人，/,C力e迈.，262:16625-16635(1987);Parkikinen等人，/.A/o厶Oe迈.268:19726-19738(1993)),已显示其与RAGE相互作用。已显示两性蛋白促进神经突外生长以及用作纤维蛋白溶解系统中组装蛋白酶复合物的表面(已知促进细胞迁移)。此外，在原发性肿瘤模型(C6神经胶质瘤)、Lewis肺癌转移模型(Taguchi等人，iVa^re405:354-360(2000))及表达v-Ha-rss转基因的小鼠中自发出现的乳头状瘤(Leder等人，尸藩.JcaA5W.，87:9178-9182(1990))中观察到阻断RAGE的局部肿瘤生长抑制作用。在另一实施方案中，本发明的RAGE融合蛋白可用于治疗炎症。在替代实施方案中，本发明的MGE融合蛋白可用于治疗与炎性肠病相关的炎症、与类风湿性关节炎相关的炎症、与牛皮癣相关的炎症、与多发性硬化症相关的炎症、与缺氧相关的炎症、与中风相关的炎症、与心脏病发作相关的炎症、与出血性休克相关的炎症、与脓毒相关的炎症、与器官移植相关的炎症、与伤口愈合不良相关的炎症或与自身(例如自身免疫)或非自身(例如移植)细胞、组织或器官的排斥反应相关的炎症。例如，进行溶栓治疗后，如粒细胞的炎症细胞浸润缺血组织且产生可摧毁比缺氧杀死的细胞更多的细胞的氧自由基。用抗体或其它蛋白拮抗剂抑制嗜中性粒细胞上使嗜中性粒细胞能浸润组织的受体展示对反应的改善。因为RAGE为该嗜中性粒细胞受体的配体，所以含有RAGE片段的RAGE融合蛋白可充当诱饼且防止嗜中性粒细胞运动至再灌注位点且因此防止组织进一步破坏。RAGE预防炎症的作用可通过经由RAGE抑制内皮、平滑肌细胞增殖及巨噬细胞活化的研究说明，该研究展示糖尿病及正常大鼠的动脉损伤后再狭窄大鼠模型中sRAGE抑制新血管内膜扩增(Zhou等人，6V環/"/叫107:2238-2243(2003))。此外，sRAGE抑制包括迟发型超敏反应、实验性自身免疫性脑炎及炎性肠病的炎症模型(Hofman等人，Ce7/,97:889-901(1999))。在一实施方案中，本发明的RAGE融合蛋白可用于治疗基于自身免疫的病症。例如，在一实施方案中，本发明的RAGE融合蛋白可用于治疗肾衰竭。因此，本发明的RAGE融合蛋白可用于治疗全身性狼疮性肾炎或炎性狼疮性肾炎。例如，已显示S100/钙粒蛋白包含紧密相关的钩结合多肽家族，其特征为由连接肽连接的两个EF手区(Schafer等人，77AS;21:134-140(1996);Zimmer等人，Ars//Wes.5"".，37:417-429(1995);Rammes等人，/.肠/.C力e瓜，272:9496-9502(1997);Lugering等人，/,67/".i/p^".，25:659-664(1995))。虽然其缺乏信号肽，但长期以来已知如在嚢肿性纤维化及类风湿性关节炎中尤其在慢性免疫/炎症反应的位点处S100/钩粒蛋白可进入细胞外空间。RAGE为S100/钧粒蛋白家族的多个成员的受体，介导它们对如淋巴细胞及单核吞噬细胞的细胞的促炎作用。对迟发型超敏反应、IL-10敲除小鼠的结肠炎、胶原蛋白诱导的关节炎及实验性自身免疫性脑炎模型的研究也表明RAGE-配体相互作用(假定与S100/4丐粒蛋白)在炎症级联反应中具有最接近作用。I型糖尿病为可通过用本发明的RAGE融合蛋白治疗来预防或改善的自身免疫病症。例如，已显示sRAGE可使脾细胞从非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠转移至患有严重复合型免疫缺陷症的NOD小鼠(廳-scid小鼠)。虽然NOD-scid小鼠未自发显示糖尿病，但其需要能够破坏胰岛细胞的免疫细胞存在以便接着诱导糖尿病。与未经sRAGE治疗的NOD-scid接受小鼠相比，发现经sRAGE治疗的NOD-scid接受小鼠显示由从糖尿病(NOD)小鼠转移的脾细胞诱导的糖尿病发作减少(美国专利公开2002/0122799)。如US2002/0122799中所述，该模型中使用sRAGE的实验结果与如其中可发生未来免疫疗法及胰岛移植的临床环境的人类疾病相关。因此在一实施方案中，本发明的RAGE融合蛋白可用于治疗与器官、组织或多个细胞的至少一种从第一位点移植至第二位点相关的炎症。第一及第二位点可在不同受试者或相同受试者体内。在替代实施方案中，所移植的细胞、组织或器官可包含胰腺、皮肤、肝、肾、心脏、肺、骨髓、血液、骨、肌肉、内皮细胞、动脉、静脉、软骨、甲状腺、神经系统的细胞或干细胞。例如，施用本发明的RAGE融合蛋白可用于促进胰岛细胞从第一非糖尿病受试者至第二糖尿病受试者的移植。在另一实施方案中，本发明可提供一种通过将治疗有效量的本发明的RAGE融合蛋白施用给受试者来治疗骨质疏7^症的方法(Zhou等人，/.fx;,，203:1067-1080(2006))。在一实施方案中，治疗骨质疏松症的方法可进一步包含增加受试者骨密度或减少受试者骨密度下降速率的步骤。因此在各种所选实施方案中，本发明可提供一种通过将治疗有效量的本发明的RAGE融合蛋白施用给受试者来抑制受试者体内AGE与RAGE相互作用的方法。使用本发明的RAGE融合蛋白治疗的受试者可为动物。在一实施方案中，受试者为人类。受试者可惟患与AGE相关的疾病，如糖尿病、糖尿病并发症(如肾病、神经病变、视网膜病、足部溃疡、淀粉状蛋白病或肾衰竭)及炎症。或者，受试者可为患有阿兹海默氏病的个体。在一替代实施方案中，受试者可为患有癌症的个体。在其它实施方案中，受试者可罹患系统性红斑狼疮或炎性狼疮性肾炎。其它疾病可由RAGE介导且因此可使用本发明的RAGE融合蛋白进行治疗。因此，在本发明的其它替代实施方案中，RAGE融合蛋白可用于治疗人类或动物受试者的克罗恩氏病(Crohn'sdisease)、关节炎、血管炎、肾病、视网膜病及神经病变。在其它实施方案中，包含自身免疫炎应(例如自身排斥反应)及非自身免疫反应(例如非自身排斥反应)的炎症可通过RAGE介导且因此可使用本发明的RAGE融合蛋白治疗。治疗有效量可包含能够预防受试者体内RAGE与AGE或其它类型的内源性RAGE配体相互作用的量。因此，该量视所治疗的受试者而变。化合物施用可为每小时、每天、每周、每月、每年施用或为单一事件。在各种替代实施方案中，RAGE融合蛋白的有效量的范围可从每千克体重约1ng至每千克体重约100mg或从每千克体重约10Mg至每千克体重约50mg或从每千克体重约100yg至每千克体重约20mg变化。实际有效量可通过剂量/反应试验使用本
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中的标准方法来测定(Johnson等人，"/a6<^e&42:1179，(1993))。因此如本领域技术人员已知，有效量可视化合物的生物可用性、生物活性及生物降解性而定。组合物本发明可包含一种组合物，其包含与药学上可接受的载体混合的本发明的RAGE融合蛋白。RAGE融合蛋白可包含连接于第二非RAGE多肽的RAGE多肽。在一实施方案中，RAGE融合蛋白可包含RAGE配体结合位点。在一实施方案中，配体结合位点包含RAGE融合蛋白的大部分N末端结构域。RAGE配体结合位点可包含RAGE的V结构域或其部分。在一实施方案中，RAGE配体结合位点包含SEQIDNO:9或与其至少90%—致的序列或SEQIDNO:10或与其至少90%—致的序列或SEQIDNO:47或与其至少90%—致的序列。在一实施方案中，RAGE多肽可连接于包含免疫球蛋白域或免疫球蛋白域的部分(例如其片段)的多肽。在一实施方案中，包含免疫球蛋白域的多肽包含人类IgG的CH2或CH3结构域中至少一个的至少一部分。在某些实施方案中，RAGE融合蛋白包含如SEQIDNO:56或SEQIDNO:57中所述的氨基酸序列或与其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98°/。或99%—致的序列。例如，在某些实施方案中，与SEQIDNO:56或SEQIDNO:57至少90°/。一致的序列包含无C末端赖氨酸的SEQIDNO:56或SEQIDNO:57的序列。RAGE蛋白或多肽可包含全长人类RAGE(例如SEQIDNO:l)或人类RAGE的片段。在一实施方案中，RAGE多肽不包括任何信号序列残基。RAGE信号序列可包含全长RAGE(SEQIDNO:1)的残基l-22或残基1-23。在替代实施方案中，RAGE多肽可包含与人类RAGE或其片段至少70°/。、75%、80%、85%、90%、95°/。、96°/。、97%、98°/。或99%—致的序列。例如，在一实施方案中，RAGE多肽可包含人类RAGE或其片段，其中甘氨酸而非甲硫氨酸作为第一残基(例如参见Neeper等人，(1992))。或者，人类RAGE可包含移除信号序列的全长RAGE(例如SEQIDNO:2或SEQIDNO:3)(图1A及IB)或该氨基酸序列的一部分。本发明的RAGE融合蛋白还可包含sRAGE(例如SEQIDNO:4)、与sRAGE至少90%—致的多肽或sRAGE的片段。例如，RAGE多肽可包含人类sRAGE或其片段，其中甘氨酸而非曱硫氨酸作为第一残基(例如参见Neeper等人，(1992))。或者，人类RAGE可包含移除信号序列的sRAGE(例如参见图1中的SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:45)或该氨基酸序列的部分。在其它实施方案中，RAGE蛋白可包含V结构域(例如参见图1中的SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:46)。或者，可使用与V结构域或其片段至少90%—致的序列。或者RAGE蛋白可包含RAGE片段，该RAGE片段包含V结构域的部分(例如参见图1中的SEQIDNO:9、SEQIDNO:10或SEQIDNO:47)。在一实施方案中，配体结合位点可包含SEQIDNO:9或与其至少90%—致的序列，或SEQIDNO:10或与其至少90%—致的序列，或SEQIDNO:47或与其至少90%—致的序列。在另一实施方案中，RAGE片段为合成肽。例如，RAGE多肽可包含人类RAGE的氨基酸23-116(SEQIDNO:7)或与其至少90°/。一致的序列或人类RAGE的氨基酸24-116(SEQIDNO:8)或与其至少90%—致的序列，或其中Q24环化以形成pE的人类RAGE的氨基酸24-116(SEQIDNO:46)，或与其至少90%—致的序列，对应于RAGE的V结构域。或者，RAGE多肽可包含人类RAGE的氨基酸124-221(SEQIDNO:11)或与其至少90%—致的序列，对应于RAGE的Cl结构域。在另一实施方案中，RAGE多肽可包含人类RAGE的氨基酸227-317(SEQIDNO:12)或与其至少90%—致的序列，对应于RAGE的C2结构域。或者，RAGE多肽可包含人类RAGE的氨基酸23-123(SEQIDNO:13)或与其至少90。/。一致的序列，或人类RAGE的氨基酸24-123(SEQIDNO:14)或与其至少90%—致的序列，对应于RAGE的V结构域及下游域间连接子。或者，RAGE多肽可包含其中Q24环化以形成pE的人类RAGE的氨基酸24-123(SEQIDNO:48)或与其至少90%—致的序列。或者，RAGE多肽可包含人类RAGE的氨基酸23-226(SEQIDNO:17)或与其至少90%—致的序列，或人类RAGE的氨基酸24-226(SEQIDNO:18)或与其至少90°/。一致的序列，对应于V结构域、CI结构域及连接这两个结构域的域间连接子。或者，RAGE多肽可包含其中Q24环化以形成pE的人类RAGE的氨基酸24-226(SEQIDNO:50)或与其至少90%一致的序列。或者，RAGE多肽可包含人类RAGE的氨基酸23-339(SEQIDNO:5)或与其至少90%—致的序列，或人类RAGE的24-339(SEQIDNO:6)或与其至少90%—致的序列，对应于sRAGE(即编码V、CI及C2结构域及域间连接子)。或者，RAGE多肽可包含其中Q24环化以形成pE的人类RAGE的氨基酸24-339(SEQIDNO:45)或与其至少90°/。一致的序列。或者，可使用这些序列的每一个的片段。在另一实施方案中，配体结合位点可包含SEQIDNO:1的氨基酸22-51。在另一实施方案中，配体结合位点可包含SEQIDNO:1的氨基酸23-51。在另一实施方案中，配体结合位点可包含SEQIDNO:1的氨基酸31-51。在另一实施方案中，配体结合位点可包含SEQIDNO:l的氨基酸31-116。例如，配体结合位点可包含RAGEV结构域或其部分，如RAGE配体结合域(例如SEQIDNO:l的氨基酸1-118、23-118、24-118、31-118、1-116、23-116、24-116、31-116、1-54、23-54、24-54、31-54、1-53、23-53、24—53或31-53或其片段)(图1)。或可使用功能性结合RAGE配体的多肽片段。或者，可使用与RAGEV结构域或其片段(例如如上文所述)至少70%、75°/。、80°/。、85%、90%、95%、97%、98%或99%—致的序列。此外如本
技术领域：
中已知，在其中融合蛋白的N末端为谷氨酰胺的实施方案中，如(例如)在移除包含SEQIDNO:1的残基1-23的信号序列(例如多肽的Q24包含氨基酸24-118或SEQIDNO:l)后，谷氨酰胺可环化以形成焦谷氨酸(pE)。RAGE融合蛋白可包括非来源于RAGE或其片段的数种类型的肽。RAGE融合蛋白的第二多肽可包含来源于免疫球蛋白的多肽。重链(或其部分)可来源于任何已知重链同种型IgG(y)、IgMU)、IgD(S)、IgE(s)或IgA(cc)。此外，重链(或其部分)可来源于任何已知重链亚型IgGl(yl)、IgG2(y2)、IgG3(y3)、IgG4(y4)、IgAl(al)、IgA2(a2)或这些同种型或亚型的改变生物活性的突变。第二多肽可包含人类IgGl的CH2及CH3结构域或这些结构域的任一个或两个的部分。作为实例实施方案，包含人类IgGl的(:2及"3结构域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:40或其部分。在一实施方案中，包含人类IgGl的CH2及CH3结构域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:38或其部分。例如，包含人类IgGl的CH2及Ch3结构域或其部分的多肽可包含移除末端赖氨酸(K)的SEQIDNO:38或SEQIDNO:40。免疫球蛋白肽可由核酸序列SEQIDNO:39或SEQIDNO:41编码。SEQIDNO:38或SEQIDNO:40中的免疫球蛋白序列还可分别通过SEQIDNO:52或SEQIDNO:53编码。免疫球蛋白链的Fc部分在体内可为促炎性的。因此在一实施方案中，本发明的RAGE融合蛋白包含来源于RAGE的域间连接子而非来源于免疫球蛋白的域间铰链多肽。因此在一实施方案中，RAGE融合蛋白可进一步包含直接连接于包含免疫球蛋白的CH2结构域或其片段的多肽的RAGE多肽。在一实施方案中，CH2结构域或其片段包含SEQIDNO:42。在一实施方案中，SEQIDNO:42的片段包含移除前十个氨基酸的SEQIDNO:42。在一实施方案中，RAGE多肽包含连接于RAGE免疫球蛋白域的RAGE域间连接子，以便RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸连接于域间连接免疫球蛋白的CH2结构域或其片段的多肽的N末端氨基酸。包含免疫球蛋白的CH2结构域或其部分的多肽可包含人类IgGl的CH2及CJ结构域或这些结构域的两个或任一个的部分。作为实例实施方案，包含人类IgGl的CH2及CH3结构域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:40或其部分。在一实施方案中，包含人类IgGl的CH2及CH3结构域或其部分的多肽可包含SEQIDNO:38或其部分。例如，包含人类IgGl的CH2及Ch3结构域或其部分的多肽可包含移除末端赖氨酸(K)的SEQIDNO:38或SEQIDNO:40。本发明的RAGE融合蛋白可包含单个或多个来自RAGE的结构域。包含连接于RAGE免疫球蛋白域的域间连接子的RAGE多肽可包含全长RAGE蛋白的片段。例如，在一实施方案中，RAGE融合蛋白可包含两个来源于RAGE蛋白的免疫球蛋白域及两个来源于人类Fc多肽的免疫球蛋白域。RAGE融合蛋白可包含连接于第二RAGE免疫球蛋白域及第二RAGE域间连接子的第一RAGE免疫球蛋白域及第一域间连接子，以便第一域间连接子的N末端氨基酸连接于第一RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸，第二RAGE免疫球蛋白域的N末端氨基酸连接于第一域间连接子的C末端氨基酸，第二域间连接子的N末端氨基酸连接于RAGE第二免疫球蛋白域的C末端氨基酸，且RAGE第二域间连接子的C末端氨基酸直接连接于包含CH2免疫球蛋白域或其片段的多肽的N末端氨基酸。例如，RAGE多肽可包含人类RAGE的氨基酸23-251(SEQIDNO:19)或与其至少90%—致的序列或人类RAGE的氨基酸24-251(SEQIDNO:20)或与其至少90%—致的序列，或其中Q24环化以形成PE的人类RAGE的氨基酸24-251或与其至少90%—致的序列(SEQIDNO:51)，对应于V结构域、CI结构域、连接这两个结构域的域间连接子及CI下游的第二域间连接子。在一实施方案中，包含SEQIDNO:30或其片段的核酸构建体可编码四域RAGE融合蛋白。在另一实施方案中，包含SEQIDNO:54的核酸构建体可编码四域RAGE融合蛋白，其中加入在序列的C末端编码脯氨酸(CCG至CCC)及甘氨酸(GGT至GGG)的密码子的沉默碱基变化以移除末端密码子附近的隐含RM剪接位点(即SEQIDNO:30的核苷酸1375-1380经修饰产生SEQIDNO:54)。可选择地，三域RAGE融合蛋白可包含一个来源于RAGE的免疫球蛋白域及两个来源于人类Fc多肽的免疫球蛋白域。例如，RAGE融合蛋白可包含经由RAGE域间连接子连接于包含CH2免疫球蛋白域或其片段的多肽的N末端氨基酸的单个RAGE免疫球蛋白域。例如，RAGE多肽可包舍人类RAGE的氨基酸23-136(SEQIDNO:15)或与其至少90%一致的序列，或人类RAGE的氨基酸24-136(SEQIDNO:16)或与其至少90%—致的序列，或其中Q24环化以形成pE的人类RAGE的氨基酸24-136或与其至少90%—致的序列(SEQIDNO:49)，对应于RAGE的V结构域及下游域间连接子。在一实施方案中，包含SEQIDNO:31或其片段的核酸构建体可编码三域RAGE融合蛋白。在另一实施方案中，包含SEQIDNO:55的核酸构建体可编码三域RAGE融合蛋白，其中加入在序列的C末端编码脯氨酸(CCG至CCC)及甘氨酸(GGT至GGG)的密码子的沉默碱基变化以移除末端密码子附近的隐含RNA剪接位点(即SEQIDNO:31的核苷酸1030-1035经修饰产生SEQIDNO:55)。RAGE域间连接子片段可包含天然为RAGE免疫球蛋白域的下游且因此连接至RAGE免疫球蛋白域的肽序列。例如，对RAGEV结构域而言，域间连接子可包含天然为V结构域下游的氨基酸序列。在一实施方案中，连接子可包含SEQIDNO:21,对应于全长RAGE的氨基酸117-123。或者，连接子可包含具有天然RAGE序列的额外部分的肽。例如，可使用包含SEQIDNO:21的上游及下游的数个氨基酸(例如l-3个、1-5个或1-10个或1-15个氨基酸)的域间连接子。因此在一实施方案中，域间连接子包含SEQIDNO:23,SEQIDNO:23包含全长RAGE的氨基酸117-136。或者，可使用自连接子的任一末端删除(例如)l、2或3个氨基酸的SEQIDNO:21片段。在替代实施方案中，连接子可包含与SEQIDNO:21或SEQIDNO:23至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97°/。、98°/。或99%—致的序列。对RAGBCI结构域而言，连接子可包含其为CI结构域的天然下游的肽序列。在一实施方案中，连接子可包含SEQIDNO:22，对应于全长RAGE的氨基酸222-251。或者，连接子可包含具有天然RAGE序列的额外部分的肽。例如，可使用包含SEQIDNO:22的上游及下游的数个氨基酸(l-3个、1-5个或1-10个或1-15个氨基酸)的连接子。或者，可使用自连接子的任一末端删除(例如)1-3个、1-5个或1-10个或1-15个氨基酸的SEQIDNO:22片段。例如，在一实施方案中，RAGE域间连接子可包含SEQIDNO:24，对应于氨基酸222-226。在替代实施方案中，连接子可包含与SEQIDNO:22或SEQIDNO:24至少70%、75°/。、80°/。、85%、90%、95°/。、96%、97%、98%或99%—致的序列。或者域间连接子可包含SEQIDNO:44，对应于RAGE氨基酸318-342。在替代实施方案中，连接子可包含与SEQIDNO:44至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%—致的序列。药学上可接受的载体可包含本
技术领域：
中已知的标准的药学上可接受的载体的任一种。在一实施方案中，药学栽体可为液体且RAGE融合蛋白或核酸构建体可呈溶液形式。在另一实施方案中，药学上可接受的栽体可为粉末、冻干粉末或片剂形式的固体。或药学载体可为凝胶、栓剂或乳骨。在替代实施方案中，载体可包含脂质体、微囊、聚合物封装的细胞或病毒。因此，术语药学上可接受的栽体涵盖(但不限于)标准的药学上接受的载体的任一种，如水、醇类、磷酸盐緩冲生理盐水溶液、糖类(例如蔗糖或甘露糖醇)、油类或乳液(如油/水乳液或甘油三酯乳液)、各种类型的润湿剂、片剂、包衣片剂及胶嚢。在某些实施方案中，RAGE融合蛋白可以中性形式(包括两性离子形式)或以带正电或负电的物质形式存在。在某些实施方案中，RAGE融合蛋白可与平衡离子复合以形成药学上可接受的盐。术语"药学上可接受的盐"指包含一或多种RAGE融合蛋白及一或多种平衡离子的复合物，其中平衡离子来源于药学上可接受的无机及有机酸及碱。药学上可接受的无机碱包括金属离子。更优选的金属离子包括(但不限于)适当碱金属盐、碱土金属盐及其它生理可接受的金属离子。衍生自无机碱的盐包括铝、铵、钙、钴、镍、钼、钒、锰、铬、硒、锡、铜、铁、亚铁、锂、镁、锰盐、亚锰、钾、铷、钠及锌且为其常用化合价。药学上可接受的本发明的RAGE融合蛋白的酸加成盐可从下列酸制备，包括(但不限于)甲酸、乙酸、乙酰氨基苯曱酸、脂肪酸、抗坏血酸、硼酸、丙酸、苯曱酸、樟脑酸、碳酸、环拉酸、脱氢胆酸、丙二酸、依地酸(edeticacid)、乙基石危酸、芬地拃酸(fendizoicacid)、偏磷酸、丁二酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、鞣酸、柠檬酸、硝酸、抗坏血酸、葡糖醛酸、顺丁烯二酸、叶酸、反丁烯二酸、丙酸、丙酮酸、天冬胺酸、谷氨酸、苯甲酸、盐酸、氩溴酸、氢碘酸、赖氨酸、异柠檬酸、三氟乙酸、双羟萘酸、丙酸、邻氨基苯甲酸、曱磺酸(mesylicacid)、乳清酸、草酸、草乙酸、油酸、硬脂酸、水杨酸、氨基水杨酸、硅酸盐、对羟基苯甲酸、烟碱酸、苯乙酸、扁桃酸、双羟萘酸、磺酸、甲磺酸、磷酸、膦酸、乙磺酸、乙二磺酸、铵、苯磺酸、泛酸、萘磺酸、曱苯磺酸、2-羟基乙烷磺酸、对氨基苯磺酸、硫酸、硝酸、亚硝酸、疏酸单甲酯、环己基氨基磺酸、(3-羟基丁酸、甘氨酸、双甘胺肽、谷氨酸、二甲紳酸盐、二氨基己酸、樟脑磺酸、葡糖酸、硫氰酸、酮戊二酸、5-磷酸吡哆醛、氯代苯氧基乙酸、十一酸、N-乙酰基-L-天冬胺酸、半乳糖二酸及半乳糖醛酸。药学上可接受的有机碱包括三甲胺、二乙胺、N，『-二节基乙二胺、氯代普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二爷胺、二乙醇胺、乙二胺、葡曱胺(N-甲基葡糖胺)、普鲁卡因(procaine)、环胺、季铵阳离子、精胺酸、甜菜碱、咖啡因、克立咪唑(clemizole)、2-乙胺基乙醇、2-二乙胺基乙醇、2-二曱胺基乙醇、乙二胺、丁胺、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、乙基葡糖胺、葡萄糖胺、葡糖胺、组氨酸、哈胺(Hydrabamine)、咪喳、异丙胺、甲基葡糖胺、吗啉、派-秦、p比啶、吡哆辛、钕、哌啶、多元胺树脂、普鲁卡因、喋呤、可可碱、三乙胺、三丙胺、三乙醇胺、氨丁三醇、甲胺、牛磺酸、胆酸盐、6-氨基-2-甲基-2-庚醇、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇、2-氨基-2-甲基-l-丙醇、脂肪族单及二羧酸、经苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂肪族及芳族磺酸、锶、曲辛(tricine)、肼、苯基环己胺、2-(N-吗啉基)乙磺酸、双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷、^(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸、1，4-哌嗪二乙磺酸、3-吗啉基-2-羟基丙磺酸、1，3-双[三(幾甲基)甲氨基]丙烷、4-吗啉丙磺酸、4-(2-羟乙基)哌嗪-l-乙磺酸、2-[(2-羟基-1，1-双(轻甲基)乙基)氨基]乙磺酸、N，N-双(2-幾乙基)-2-氨基乙磺酸、4-(N-吗啉基)丁磺酸、3-OV，^双[2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸、2-羟基-3-[三(羟甲基)甲氨基]-l-丙磺酸、4-(2-幾乙基)哌溱-l-(2-羟基丙磺酸)、哌嗪-l，4-双(2-羟基丙烷磺酸)二水合物、4-(2-羟乙基)-l-哌溱丙烷磺酸、《^双(2-羟乙基)甘氨酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-『-(4-丁磺酸)、N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸、N-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁磺酸、N-(l，1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-幾基丙磺酸、2-(环己氨基)乙磺酸、3-(环己氨基)-2-羟基-l-丙磺酸、3-(环己氨基)-1-丙磺酸、^(2-乙酰氨基)亚胺二乙酸、4-(环己氨基)-1-丁磺酸、^[三(羟甲基)甲基]甘氨酸、2-氨基-2-(羟甲基)-l，3-丙二醇及氨基丁三醇。可利用各种途径施用本发明的RAGE融合蛋白。因此，可利用腹膜内(IP)注射来施用本发明的RAGE融合蛋白。可选择地，RAGE融合蛋白可经口、经鼻内或作为气雾剂施用。在另一实施方案中，给药为静脉内(IV)给药。RAGE融合蛋白还可皮下注射。在另一实施方案中，RAGE融合蛋白给药为动脉内给药。在另一实施方案中，给药为舌下给药。给药还可利用緩释胶嚢。例如，当需要自我给药时，皮下给药可适用于治疗慢性病症。在本发明的另一方面中，本发明的RAGE融合蛋白可用于与任何其它已知治疗剂的辅助治疗或组合治疗。以下为可与本发明的RAGE融合蛋白调节剂组合使用的佐剂及额外治疗剂的非详尽列表。抗癌剂的药理分类1.烷基化药剂环磷酰胺、亚硝基脲、卡铂(carboplatin)、顺賴(cisplatin)、丙卡巴肼(procarbazine)2.抗生素博来霉素(Bleomycin)、柔红霉素(Daunorubicin)、多柔比星(Doxorubicin)3.抗代谢剂氨甲喋呤(Methotrexate)、阿糖胞苷(Cytarabine)、氟尿嘧咬(Fluorouraci1)、硫峻噪呤(Azathioprine)、6-巯嘌呤(6-Mercaptopurine)及细胞毒素癌症化疗剂4.植物碱长春碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、依托泊苷(Etoposide)、紫杉醇(Paclitaxel),5.激素他莫昔芬(Tamoxifen)、乙酸奥曲肽(Octreotideacetate)、非那雄胺(Finasteride)、氟他胺(Flutamide)6.生物反应修饰剂干扰素(Interferon)、白细胞介素治疗类风湿性关节炎的药理分类1.止痛剂阿司匹林(Aspirin)2.NSAID(非类固醇消炎药)布洛芬(Ib叩rofen)、萘普生(Naproxen)、双氯芬酸(Diclofenac)3.DMARD(改善疾病的抗风湿药)氨甲喋呤(Methotrexate)、金制剂、幾氣唾(hydroxychloroquine)、杉卩氣碌p比梵(sulfasalazine)4.生物反应修饰剂、DMARD:依那西普(Etanercept)、英夫利昔单抗(Infliximab)，糖皮质激素，如倍氯米*>(beclomethasone)、曱泼尼龙(methylprednisolone)、倍他米松(betamethasone)、泼尼松(prednisone)、地塞米松(dexamethasone)及氢化可的松(hydrocortisone)治疗糖尿病的药理分类1.磺酰脲类甲苯碌丁脲(Tolbutamide)、妥拉磺脲(Tolazamide)、格列本脲(Glyburide)、格列吡-泰(Glipizide)2.双胍类二甲双胍(Metformin)3.混杂口月l药剂阿卡波糖(Acarbose)、曲格列酮(Troglitazone)4.胰岛素治疗阿兹海默氏病的药理分类1.胆碱酯酶抑制剂他克林(Tacrine)、多奈哌齐(Donepezi1)2.安定药氟哌啶醇(Haloperidol)、硫利达漆(Thioridazine)3.抗抑郁剂地昔帕明(Desipramine)、氟西汀(Fluoxetine)、曲唾酉同(Trazodone)、帕罗西S丁(Paroxetine)4.抗痉挛剂卡马西平(Carbamazepine)、丙戊酸(Valproicacid)在一实施方案中，本发明的组合物可包含治疗有效量的RAGE融合蛋白以及单个或多个额外治疗剂。除上文所述的药剂外，以下治疗剂可与本发明的RAGE融合蛋白組合4吏用免疫抑制剂，如环孢素(cyclosporin)、他克莫司(tacrolimus)、雷巾白霉素(rapamycin)及其它FK-506型免疫抑制剂。因此在一实施方案中，本发明提供一种治疗RAGE介导的疾病的方法，该方法包含将治疗有效量的RAGE融合蛋白与选自下列的治疗剂组合施用给有需要的受试者烷基化药剂、抗代谢剂、植物碱、抗生素、激素、生物反应修饰剂、止痛剂、NSAID、DMARD、生物反应修饰剂(例如糖皮质激素)、磺酰脲类、双胍类、胰岛素、胆碱酯酶抑制剂、安定药、抗抑郁剂、抗痉挛剂及免疫抑制剂，如环孢素、他克莫司、雷帕霉素及其它FK-506型免疫抑制剂。在另一实施方案中，本发明提供如上所述的本发明的药物組合物，其进一步包含一或多种选自下列的治疗剂烷基化药剂、抗代谢剂、植物碱、抗生素、激素、生物反应修饰剂、止痛剂、NSAID、DMARD、生物反应^f'务饰剂(例如糖皮质激素)、磺酰脲类、双胍类、胰岛素、胆碱酯酶抑制剂、安定药、抗抑郁剂、抗痉挛剂及免疫抑制剂，如环孢素、他克莫司、雷帕霉素及其它FK-506型免疫抑制剂。冻干制剂在其它实施方案中，本发明还提供包含RAGE融合蛋白的制剂。制剂的实施方案可包含冻干保护剂、RAGE融合蛋白及緩冲剂的冻干混合物。多种冻千保护剂可用于本发明的冻干RAGE融合蛋白制剂中。在某些实施方案中，冻干保护剂可包含非还原性糖。例如，非还原性糖可包含蔗糖、甘露糖醇或海藻糖。多种緩冲剂还可用于冻干RAGE融合蛋白制剂中。在某些实施方案中，緩冲剂可包含组氨酸。冻干RAGE融合蛋白可包含额外组份。在某些实施方案中，RAGE融合蛋白制剂可进一步包含表面活性剂、螯合剂或膨化剂的至少一种。在一实施方案中，重构RAGE融合蛋白制剂包含约40-100mg/mLRAGE融合蛋白(其包含如SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57中所述的序列)、约2mM至约50mM组氨酸、约60mM至约65mM蔗糖、约0.001%至约0.05%Tween80及约6.0至6.5的pH值。例如，在某些实施方案中，重构RAGE融合蛋白制剂可包含约40-50mg/mLRAGE融合蛋白(其包含如SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57中所述的序列)、约10mM组氨酸、约65mM蔗糖、约0.01%Tween80及约6.0的pH值。或者，其它浓度RAGE融合蛋白可如本文进一步所述使用。在一实施方案中，本发明包含一种重构制剂，其包含在稀释剂中重构的冻干RAGE融合蛋白，其中重构制剂中的MGE融合蛋白浓度在约lmg/mL至约400mg/mL的范围内。或者可如本文所述使用其它浓度的RAGE融合蛋白。在其它实施方案中，本发明还可包含制备RAGE融合蛋白的稳定重构制剂的方法。重构制剂可包含适于直接使用(例如直接施用给受试者)或可进一步稀释和/或与递送剂混合的浓度。在某些实施方案中，该方法可包含在稀释剂中重构RAGE融合蛋白与冻干保护剂的冻干混合物以便RAGE融合蛋白在重构制剂中的浓度在约1mg/mL至约400mg/mL的范围内。或者可如本文所述使用如本文所述的其它浓度。多种冻干保护剂可用于本发明的重构RAGE融合蛋白制剂中。在某些实施方案中，冻干保护剂可包含非还原性糖。例如，非还原性糖可包含蔗糖、甘露糖醇或海藻糖。多种緩冲剂还可用于冻干RAGE融合蛋白制剂中。在某些实施方案中，緩冲剂可包含组氨酸。重构RAGE融合蛋白制剂可包含额外组份。在某些实施方案中，RAGE融合蛋白制剂可进一步包含表面活性剂、螯合剂或膨化剂的至少一种。在一实施方案中，重构RAGE融合蛋白制剂包含约40-100mg/mLRAGE融合蛋白(其包含如SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57中所述的序列)、约2mM至约50mM组氨酸、约60mM至约65mM蔗糖、约0.001%至约0.05%TVeen80及约6.0至6.5的pH值。例如，在某些实施方案中，重构RAGE融合蛋白制剂可包含约40-50mg/mLRAGE融合蛋白(其包含如SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57中所述的序列)、约10fflM组氨酸、约65mM蔗糖、约0.01%Tween80及约6.0的pH值下。多种适于药物的稀释剂可用以重构冻干RAGE融合蛋白。在一实施方案中，冻干RAGE融合蛋白无菌。在一实施方案中，稀释剂也无菌。在一实施方案中，稀释剂可包含用于注射的水(WFI)。在某些实施方案中，所添加的稀释剂的量还基于RAGE融合蛋白的治疗剂量及药代动力学概况以及所施用的制剂及载体的生物兼容性。在一实施方案中，重构制剂为等渗的。RAGE融合蛋白制剂可包含经调配用于临床中或用作处方药的稳定治疗剂。例如，在某些实施方案中，重构RAGE融合蛋白制剂可展示在4(TC下一周后少于10%或少于5%或少于3%分解。RAGE融合蛋白制剂在稀释剂中重构后还可为稳定的。在某些实施方案中，少于约10°/。或约5%或约4%或约3%或约2%或约1%的RAGE融合蛋白以聚集体形式存在于RAGE融合蛋白制剂中。重构RAGE融合蛋白制剂可适于通过各种途径且如治疗RAGE介导的相关病症所需来施用。在某些实施方案中，重构RAGE融合蛋白制剂适于将制剂以静脉内、腹膜内或皮下中的至少一种施用给受试者。例如，在某些实施方案中，本发明可包含一种稳定重构制剂，其包含以至少10mg/mL或至少20mg/mL或至少50mg/mL的浓度的RAGE融合蛋白及稀释剂，其中重构制剂从RAGE融合蛋白与冻干保护剂的冻干混合物制备。在替代实施方案中，重构制剂中RAGE融合蛋白浓度可为至少100mg/mL或至少200mg/mL或至少400mg/mL。在替代实施方案中，重构制剂中RAGE融合蛋白浓度为在约0.5mg/mL至约400mg/mL或约1mg/mL至约200mg/mL或约40mg/mL至约400mg/mL、约40至100mg/mL或约40-50mg/mL的范围内的量。制剂还可包含緩冲剂。在其它实施方案中，本发明可包含包括RAGE融合蛋白的制品。例如，在某些实施方案中，制品可包含保存冻干RAGE融合蛋白的容器及用于以稀释剂重构冻干制剂的说明。在某些实施方案中，制品可包含保存包含冻干保护剂、RAGE融合蛋白与緩冲剂的冻干混合物的制剂的容器。制品还可包含用于以稀释剂重构冻干制剂的说明。多种冻干保护剂可用于本发明的制品中。在某些实施方案中，冻干保护剂可包含非还原性糖。例如，非还原性糖可包含蔗糖、甘露糖醇或海藻糖。多种緩冲剂还可用于冻干RAGE融合蛋白制剂中。在某些实施方案中，緩冲剂可包含组氨酸。本发明的制品的RAGE融合蛋白制剂可包含额外组份。在某些实施方案中，冻干RAGE融合蛋白制剂可进一步包含表面活性剂、螯合剂或膨化剂的至少一种。在本发明的制品的一个实施方案中，在根据所提供的说明重构后，RAGE融合蛋白制剂包含约40-100mg/mLRAGE融合蛋白(其包含如SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57中所述的序列)、约2mM至约50mM组氨酸、约60mM至约65mM蔑糖、约0.001%至约0.05%Tween80及约6.0至6.5的pH值。例如，在某些实施方案中，重构RAGE融合蛋白制剂可包含约40-50mg/mLRAGE融合蛋白(其包含如SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57中所述的序列)、约10mM组氨酸、约65mM蔑糖、约0.01%Tween80及约6.0的pH值。或者可如本文所述使用其它浓度的RAGE融合蛋白。可提供多种适于药物的稀释剂以重构冻干RAGE融合蛋白。在一实施方案中，冻干制剂无菌。可选择地或额外地，稀释剂可无菌。在一实施方案中，稀释剂可包含用于注射的水(WFI)。因此，制品可进一步包含保存用于重组冻干制剂的稀释剂的第二容器，其中稀释剂为用于注射的水(WFI)。在一实施方案中，重构制剂为等渗的。在某些实施方案中，所添加的稀释剂的量还基于RAGE融合蛋白的治疗剂量及药代动力学概况以及所施用的制剂与载体的生物兼容性。在替代实施方案中，说明用于重构冻干制剂以使其具有如本文所述的浓度。例如，在某些实施方案中，说明用于重构冻干制剂以便重构制剂中RAGE融合蛋白浓度在约40mg/mL至约100mg/mL的范围内。如制品所提供的RAGE融合蛋白制剂可包含经调配用于临床中或用作处方药的稳定治疗剂。例如，在某些实施方案中，当根据所提供的说明重构时，RAGE融合蛋白可展示在40C下一周后少于10%或少于5%或少于3%分解。在稀释剂中重构后，RAGE融合蛋白制剂还可为稳定的。在某些实施方案中，少于约10%或约5%或约4%或约3%或约2%或约1%的RAGE融合蛋白以聚集体形式存在于RAGE融合蛋白制剂中。在某些实施方案中，当根据所提供的说明重构时，重构RAGE融合蛋白制剂还可适于通过各种途径及如治疗RAGE介导的所关注病症需要来施用。在某些实施方案中，重构RAGE融合蛋白制剂适于将制剂以静脉内、腹膜内或皮下中的至少一种施用给受试者。在制剂、制品及制造包含RAGE融合蛋白的制剂的方法的某些实施方案中，重构制剂中RAGE融合蛋白浓度可为至少10mg/mL或至少20mg/mL或至少50mg/mL。在替代实施方案中，重构制剂中RAGE融合蛋白浓度可为至少100mg/mL或200mg/mL或400mg/mL。例如，在替代实施方案中，重构制剂中RAGE融合蛋白浓度为至少约0.5至400mg/mL或约1至200mg/mL、40至400mg/mL、50至400mg/mL、40至100mg/mL、50至100mg/mL或约40-50mg/mL。例如，在一实施方案中，RAGE融合蛋白作为制剂施用，该制剂呈具有约5.O至约6.5范围的pH值且包含约lmg/mL至约200tng/ml的RAGE融合蛋白、约1毫摩尔至约100毫摩尔的组氨酸緩冲剂、约0.01mg/mL至约10mg/mL的聚山梨醇酯80、约100毫摩尔至约400毫摩尔的海藻糖及约0.01毫摩尔至约1.Q毫摩尔的乙二胺四乙酸二钠二水合物的无菌水溶液形式。本文所述的任一实施方案可用作本发明制剂中的RAGE融合蛋白。因此，对冻干制剂、重构冻干制剂或制备冻干制剂或重构冻干制剂的方法或包含本发明的冻干制剂或重构冻干制剂的制品的每一者而言，RAGE融合蛋白可包含来源于连接于免疫球蛋白多肽的RAGE配体结合位点的序列。因此如本文所述，RAGE融合蛋白的实施方案可包含直接连接于包含免疫球蛋白的CH2结构域或免疫球蛋白的CH2结构域的部分的多肽的RAGE多肽。在某些实施方案中，RAGE多肽可包含连接于RAGE免疫球蛋白域的RAGE域间连接子，以便RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸连接于域间连接子的N末端氨基酸，且RAGE域间连接子的C末端氨基酸直接连接于包含免疫球蛋白的CH2结构域或其部分的多肽的N末端氨基酸。例如，融合蛋白的某些实施方案可包含连接于第二RAGE免疫球蛋白域及第二RAGE域间连接子的第一RAGE免疫球蛋白域及第一RAGE域间连接子，以便第一域间连接子的N末端氨基酸连接于第一RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸，第二RAGE免疫球蛋白域的N末端氨基酸连接于第一域间连接子的C末端氨基酸，第二域间连接子的N末端氨基酸连接于第二RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸，且RAGE第二域间连接子的C末端氨基酸直接连接于CH2免疫球蛋白域或免疫球蛋白的CH2结构域的部分的N末端氨基酸。例如，在RAGE融合蛋白的替代实施方案中，RAGE多肽可包含如SEQIDNO:10中所述的氨基酸序列或与其至少90%—致的序列，或如SEQIDNO:47中所述的氨基酸序列或与其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96°/。、97°/。、98%或99。/。一致的序列。在其它替代实施方案中，RAGE融合蛋白可包含如SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57的至少一个中所述的氨基酸序列或与其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99°/。一致的序列。例如，在某些实施方案中，与SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57至少90%—致的序列包含无C末端赖氨酸的SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37或57多肽。冻干制剂的制备在另一实施方案中，本发明提供预冻干制剂、冻干制剂、重构制剂及其制备方法。在制备如上文所述的所关注RAGE融合蛋白后，可产生"预冻干制剂"。可考虑所要剂量体积、给药模式等来确定存在于预冻干制剂中的RAGE融合蛋白的量。在一实施方案中，预冻干制剂中融合蛋白的量可超过1mg/mL。在某些实施方案中，预冻干制剂中融合蛋白的量还可少于约5mg/ml、10mgM、50mg/mL、100mg/mL或200mg/mL。在另一实施方案中，预冻干制剂可为在约4-8的pH值下的pH緩冲溶液。在另一实施方案中，预冻干制剂可为在约5-7的pH值下的pH緩沖溶液。在另一实施方案中，预冻千制剂可为在少于6.7的pH值下的pH緩冲溶液。在另一实施方案中，预冻干制剂可为在约6.0的pH值下的pH緩冲溶液。例示性緩冲剂包括组氨酸、磷酸盐、Tris、杼檬酸盐、琥珀酸盐及如本文所述的其它有机酸。緩冲剂浓度视(例如)緩冲剂及制剂(例如重构制剂)的所要等渗性而定可为约1mM至约100mM，或少于约50mM，或约2mM至约50mM，或少于约15mM，或约3mM至约15mM。在一实施方案中，緩冲剂为組氨酸。冻干保护剂可添加至预冻千制剂中。在一实施方案中，冻干保护剂包含糖。在另一实施方案中，冻干保护剂包含非还原性糖。在另一实施方案中，冻干保护剂包含非还原性糖蔗糖。或者，非还原性糖可包含甘露糖醇。或者，非还原性糖可包含海藻糖。预冻干制剂中冻千保护剂的量一般使重构后所得制剂等渗。然而，高渗性重构制剂也可适于(例如)以制剂形式用于外周肠胃外给药。此外，冻干保护剂的量不应过低使得在冻干后出现不可接受量的蛋白降解和/或聚集。在替代实施方案中，不可接受量的聚集可为20%、或10%、或5%、或5%以上的RAGE融合蛋白以聚集体形式存在于制剂中。预冻干制剂中冻干保护剂浓度的例示性范围可少于约400mM。在另一实施方案中，预冻干制剂中冻干保护剂浓度的范围可少于约100mM。因此，在替代实施方案中，预冻干制剂中冻干保护剂浓度的范围可为约0.5mM至400mM或约2mM至200mM或约30mM至约150mM或约60mM至65niM。在某些实施方案中，冻干保护剂还以使重构制剂等渗的量添加。针对各RAGE融合蛋白及冻干保护剂组合选择预冻干制剂中RAGE融合蛋白与冻干保护剂的比率。在具有高RAGE融合蛋白浓度(例如大于或等于约50mg/mL)的等渗重构制剂的实施方案中，冻干保护剂与RAGE融合蛋白的摩尔比可为约50摩尔至约1500摩尔冻干保护剂比1摩尔RAGE融合蛋白。在另一实施方案中，冻干保护剂与RAGE融合蛋白的摩尔比可为约150摩尔至约IOOO摩尔冻干保护剂比l摩尔融合蛋白。在另一实施方案中，冻干保护剂与RAGE融合蛋白的摩尔比可为约150摩尔至约300摩尔冻干保护剂比1摩尔RAGE融合蛋白。例如，在冻干保护剂为非还原性糖(如蔗糖、海藻糖或甘露糖醇)的情况下，这些范围可为适合的。在本发明的另一实施方案中，表面活性剂可添加至预冻干制剂中。可选择地或另外，表面活性剂可添加至冻干制剂和/或重构制剂中。例示性表面活性剂包括非离子表面活性剂，如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)(Tween2(P或Tween80)、泊洛沙姆(poloxamer)(例如泊洛沙姆188)。所添加的表面活性剂的量使得其减少重构蛋白的聚集且最小化重构后^:粒形成。例如，表面活性剂可以约0.001%至0.5%的量存在于预冻干制剂中。例如，在其中表面活性剂包含聚山梨醇酯80的实施方案中，表面活性剂可以约0.005°/。至0.05%或约0.008%至0.012%或约0.01。/。的量存在于预冻干制剂中。可选择地，表面活性剂可存在于制剂中以致包含O.001mg/mL至约100mg/mL或约0.01mg/mL至约IOmg/mL范围的最终浓度。在本发明的某些实施方案中，冻干保护剂(如蔗糖或组氨酸)与膨化剂(例如甘露糖醇或甘氨酸)的混合物可用于预冻干制剂的制备中。膨化剂可允许均匀冻干饼块(其中无过多凹穴等)产生。其它药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(如Remington'sPharmaceuticalSciences第16版，Osol，A.Ed.(1980)中描述的那些栽体、或重构制剂)中，只要它们不负面影响制剂的所要特征。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量及浓度下对接受者而言为无毒的且包括额外緩冲剂、防腐剂、助溶剂、抗氧化剂(包括抗坏血酸及甲硫氨酸)、螯合剂(如EDTA)、金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)、生物可降解聚合物(如聚酯)和/或形成盐的平衡离子(如钠)。本发明的RAGE融合蛋白制剂还可含有如所治疗的特定适应症所需的额外蛋白质。可选择额外蛋白质使得各蛋白质具有不负面影响彼此或RAGE融合蛋白的互补活性。这类蛋白质适合于以有效达成所期望目的的量存在于组合物中。对体内施用而言，本发明的RAGE融合蛋白制剂可为无菌的。这可通过在冻干及重构之前或之后经由无菌过滤膜过滤来达成。将RAGE融合蛋白、冻干保护剂及其它任选组份共同混合后可冻干制剂。许多不同冻干机可用于该目的，如Hull50TM(Hull，USA)或GT20(Leybold-Heraeus，Germany)冻干机。通过冷冻制剂且随后在条件下，产物温度在制剂低共溶点或坍塌温度以下。通常，在适合压力(通常在约50mTorr至250mTorr范围内)下初步干燥的板层温度在约-5(TC至25。C范围内(只要产物在初步干燥期间保持冷冻)。在一实施方案中，压力为约100mTorr且样品可在约-30。C与25。C之间冻干。制剂、保存样品的容器(例如玻璃瓶)的大小及类型及液体体积可指示干燥所要时间，该时间可在数小时至数天(例如40-60小时)范围内。冷冻干燥条件可视制剂及小瓶大小而变化。在某些情况下，可能需要在进行蛋白重构的容器中冻干蛋白制剂以避免转移步骤。在这种情况下，容器可为(例如)2、3、5、10、20、50、IOO或250cc小瓶。在一实施方案中，容器为适于制备体积小于或等于100niL的重构制剂的任何容器。作为一般建议，冻干将导致水分含量少于约5%的冻干制剂。在一实施方案中，冻干制剂的水分含量少于约3%。在另一实施方案中，冻干制剂的水分含量少于约1%。冻干制剂的重构在所要阶段，通常在将RAGE融合蛋白施用给患者或受试者时，用稀释剂重构冻干制剂以便重构制剂中RAGE融合蛋白浓度大于约10mg/mL或大于20mg/ml或大于50mg/mL或约30-50mg/mL或约50mg/mL。在替代实施方案中，重构制剂中RAGE融合蛋白浓度可为至少100mg/mL或200mg/mL或400mg/mL。例如，在替代实施方案中，重构制剂中RAGE融合蛋白浓度可在约1mg/mL至约600mg/mL，或约1mg/mL至约500mg/mL，或约1mg/mL至约400mg/mL，或约1mg/mL至约200mg/mL,或约10mg/mL至约400mg/mL，或约10mg/mL至约200mg/mL,或约40mg/mL'至约400mg/mL，或约40mg/mL至约200mg/mL，或约50mg/mL至约400mg/mL，或约50mg/mL至约200mg/mL的范围内。在其它实施方案中，重构制剂中RAGE融合蛋白浓度可为约40mg/mL至约100mg/mL，或约50mg/mL至约100mg/mL,或约40mg/mL至约50mg/mL。在需要皮下递送重构制剂的情况下，认为重构制剂中这类RAGE融合蛋白浓度尤其有用。然而，对其他给药途径(如静脉内施用)而言，可能需要重构制剂中较低蛋白浓度(例如重构制剂中RAGE融合蛋白约5-50mg/ml或约10-40mg/ml)。因此在某些实施方案中，重构制剂中融合蛋白浓度可等于或小于预冻干制剂中融合蛋白浓度的2倍。在某些实施方案中，重构制剂中融合蛋白浓度显著高于预冻干制剂中融合蛋白浓度。例如，在某些实施方案中，重构制剂中融合蛋白浓度可为预冻干制剂的融合蛋白浓度的约2-40倍或2-10倍或3-8倍。在一实施方案中，重构制剂中RAGE融合蛋白浓度可为预冻干制剂中RAGE融合蛋白浓度的约3-6倍。在预冻干制剂中RAGE融合蛋白浓度为约15mg/mL的另一实施方案中，重构制剂中RAGE融合蛋白浓度大于或等于约50mg/mL(例如大至少3倍或至少4倍)。由于体积限制(小于或等于1.5mL)及剂量需要(大于或等于100mg)，所以对皮下给药而言高蛋白浓度递送常为有利的或所需的。然而，因为在高浓度下蛋白质在加工期间可能具有聚集的趋势且难以操作(例如抽吸)及无菌过滤，所以在制造过程中可能难以达到蛋白浓度(大于或等于50mg/mL)。可选择地，冻干过程可提供一种使蛋白浓缩的方法。例如，RAGE融合蛋白可填充至一定体积(Vf)小瓶中且接着冻干。接着用比初始体积小的体积(Vr)(例如Vr-O.25Vf)的水或防腐剂(例如BWFI)重构冻干RAGE融合蛋白，导致重构溶液中更高RAGE融合蛋白浓度。此过程还导致緩沖剂及赋形剂浓缩。皮下给药需要溶液等渗。虽然需要时可使用其它温度，但重构一般发生在约25。C的温度下以确保完全水合。重构所需时间可视(例如)稀释剂类型、赋形剂及蛋白质的量而定。例示性稀释剂包括无菌水、用于注射的抑菌水(BWFI)、pH緩冲溶液(例如磷酸盐緩沖生理盐水)、无菌生理盐水溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液。在一实施方案中，稀释剂提供适于注射的重构制剂。在另一实施方案中，在稀释剂提供适于注射的重构制剂的情况下，稀释剂包含用于注射的水(WFI)。稀释剂任选地含有防腐剂。可通过评估与蛋白质兼容的不同防腐剂浓度及防腐剂功效测试来确定所用防腐剂的量。在替代实施方案中，在每50mL容器中重构制剂可具有少于8，000个、或少于6，000个、或少于4,000个、或少于2，000个、或少于1，000个、或少于600个、或少于400个、或少于200个、或少于100个、或少于50个大小等于或大于10jam的微粒。在其它实施方案中，在每50mL容器中重构制剂可具有少于8,000个、或少于6，000个、或少于4，000个、或少于2，000个、或少于1，000个、或少于600个、或少于400个、或少于200个、或少于100个、或少于50个大小等于或大于25jim的孩吏粒。重构制剂的施用根据已知方法(如以大丸剂静脉内施用或通过经一段时间连续输液、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、经口、局部或吸入途径)可将重构制剂施用给需要用RAGE融合蛋白治疗的哺乳动物(如人类)。在实施方案中，重构制剂可通过皮下(即在皮肤下)给药来施用给哺乳动物。为此，可使用注射器注射重构制剂。然而，施用重构制剂的其它装置可购得，如注射装置(例如Inject-easeTM及GenjectTM装置)、注射笔(如GenPen)、无针装置(例如Medi化"0^及BioJector)及皮下贴片递送系统。RAGE融合蛋白的适当剂量或治疗有效量视(例如)待治疗的病况、病况的严重程度及过程、RAGE融合蛋白为预防目的还是治疗目的施用、先前疗法、患者临床病史及对RAGE融合蛋白的反应及主治医师的判断而定。RAGE融合蛋白可一次或经一系列治疗施用给受试者(例如患者)或可自诊断起的任何时间施用给患者。RAGE融合蛋白可作为唯一治疗或与其它适于治疗所论述的病况的药物或疗法结合施用。在一实施方案中，无论(例如)通过一或多种单独给药，约0.1-20mg/kg的剂量为施用给受试者的最初候选剂量。如上所述，其它给药方案可能是有用的。制品在本发明的另一实施方案中，提供含有本发明的冻干制剂且提供其重构和/或用途的说明的制品。制品可包含一容器。适合容器包括(例如)瓶、小瓶(例如两室小瓶)、注射器(如两室注射器)及试管。容器可由如玻璃或塑料的多种材料形成。容器可保存冻干制剂。在某些实施方案中，可存在粘贴于容器或与容器相关联的标签。标签可指示重构和/或用途的说明。例如，在某些实施方案中，标签可指示将冻干制剂重构成如上所述的蛋白质浓度。标签可进一步说明制剂适于或旨在皮下给药。'保存制剂的容器可为多用途小瓶，其允许重复施用(例如2-6次或2-10次或2-50次施用)重构制剂。制品可进一步包含第二容器，该第二容器包含适合稀释剂(例如WFI)。将稀释剂与冻干制剂混合后，重构制剂中最终RAGE融合蛋白浓度一般为至少10mg/mL。在一实施方案中，重构制剂中最终RAGE融合蛋白浓度为至少约20mg/mL。在另一实施方案中，重构制剂中最终RAGE融合蛋白浓度为至少约50mg/mL。在替代实施方案中，重构制剂中RAGE融合蛋白浓度可为至少100mg/mL、或200mg/mL或400mg/mL。在其它实施方案中，重构制剂中最终RAGE融合蛋白浓度介于约1-400mg/mL、或1-200mg/mL、或l-100mg/mL、或10-400mgM、或10-200mg/mL、或10-100mg/mL、或40-400mgM、或40-200mg/mL、或40-100mgM、或50-400mg/mL、或50-200mg/mL、或50-100mg/mL或40mg/mL至50mg/mL之间。从商业及使用者观点，制品可进一步包括其它所要物质，包括其它緩冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器及具有用途说明的药品说明书。实施例在以下实施例中进一步说明本发明所涵盖的本发明概念的特征及优点。实施例1A:RAGE融合蛋白的产生构建两个质粒以表达RAGE-IgG融合蛋白。通过连接来自人类RAGE的不同长度的5'cDNA序列与来自人类IgGFc(yD的相同3'cDNA序列构建两个质粒。接着将这些表达序列(即连接产物)插入pcDNA3.1表达载体(Invitrogen，CA)中。编码RAGE融合蛋白编码区的核酸序列展示于图2及3中。对TTP-4000RAGE融合蛋白而言，1至753的核酸序列(以粗体突出)编码RAGEN-末端蛋白序列，而754至1386的核酸序列编码无铰链的IgGFc蛋白序列(图2)。对TTP-3000而言，1至408的核酸序列(以粗体突出)编码RAGEN-末端蛋白序列，而409至1041的核酸序列编码无铰链的IgGFc蛋白序列(图3)。为产生RAGE融合蛋白，将包含SEQIDNO:30或SEQIDNO:31的核酸序列的表达载体稳定转染至CHO细胞中。针对由质粒赋予的新霉素抗性来选择及克隆阳性转化林。扩增如通过上清液的蛋白质印迹分析法所检测的高产克隆且通过使用蛋白A柱的亲和层析法来纯化基因产物。最优化表达使得细胞产生约1.3g/1水平的重组TTP-4000。实施例IB:四域RAGE融合蛋白的替代产生构建一质粒以表达RAGE-IgG融合蛋白。通过连接来自人类RAGE的5'cDNA序列与来自无Fc铰链区的人类IgGFc(yl)的3'cDNA序列构建该质粒。用PCR扩增cDNA。此外，在5'末端，PCR引物添加来自克隆的EcoRI限制酶位点及Kozak共有(consensus)翻译起始序列。在3'末端，PCR引物在末端密码子的紧邻后方添加XhoI限制位点。在3'末端，PCR引物还包括移除末端密码子附近的免疫球蛋白部分所隐含的RNA剪接位点的两个沉默碱基改变。编码脯氨酸(依据SEQIDNO:32中蛋白序列编号，为残基459)的密码子自CCG变成CCC，且编码甘氨酸(依据SEQIDNO:32中蛋白序列编号，为残基460)的密码子自GGT变成GGG。用EcoRI及XhoI消化PCR片段且接着将其插入经MfeI消化(以形成具有EcoRI的兼容末端)及经XhoI消化的逆转录病毒载体质粒(pCNS-newMCS-WPRE(newori)，购自Gala,Inc.)中。可对克隆质粒的插入部分及克隆连接处测序以确保克隆期间无突变发生。为产生RAGE-IgG融合蛋白，将包含核酸序列SEQIDNO:54的表达载体稳定转染至CHO细胞中。由转染细胞表达的分离RAGE融合蛋白TTP-4000的序列通过各种特征研究证实为SEQIDNO:34或SEQIDNO:56,或SEQIDNO:34及SEQIDNO:56两者。因此，切除由SEQIDNO:32的前23个氨基酸编码的信号序列且N末端残基为谷氨酰胺(Q)或焦谷氨酸(pE)或其混合物。特征研究还展示N2及N288(基于SEQIDNO:34或SEQIDNO:56的编号)处的糖基化位点且展示当在该重组系统中表达时RAGE融合蛋白的CH3区可经由翻译后修饰来切除其C末端残基。实施例1C:三域RAGE融合蛋白的替代产生以上述针对TTP-4000的方式可构建质粒以表达三域RAGE-IgG融合蛋白(例如，一个RAGE域及两个IgG域)，如TTP-3000。通过连接来自人类RAGE的编码人类RAGE的氨基酸1-136的cDNA序列与无Fc铰链区的来自人类IgGFc(yl)的3'cDNA序列来构建质粒。PCR可用于扩增cDNA。在5'末端，PCR引物可添加用于克隆的限制位点(例如，如TTP-4000所用的EcoRI限制酶位点)及Kozak共有翻译起始序列。在3'末端，PCR引物还可紧在末端密码子之后添加限制位点(例如Xhol限制位点)。如若需要，则PCR引物还可包括沉默碱基变化以移除任何隐含RNA剪接位点，如位于如实施例1B中所述的免疫球蛋白CH2结构域的3'末端处的隐含RNA剪接位点。为移除这些隐含剪接位点，编码SEQIDNO:35的脯氨酸344(即基于SEQIDNO:31中DM序列编号的残基1030-1032)的密码子可自CCG变成CCC，且编码SEQIDNO:35的甘氨酸345(基于SEQIDNO:31中DNA序列编号的残基1033-1035)的密码子可自GGT变成GGG。接着可用适当限制酶(例如EcoRI及XhoI)消化PCR片段且将其插入逆转录病毒载体质粒pCNS-newMCS-WPRE(newori;购自Gala,Inc.)中。可用MfeI消化载体以形成与EcoRI兼容的末端，且还用XhoI消化。可对克隆质粒的插入部分及克隆连接处测序以确保克隆期间无突变发生。如实施例IA及IB中所述，为产生RAGE-IgG融合蛋白，可将包含核酸序列SEQIDNO:55(即包含移除隐含剪切位点的DNA序列变化)的表达载体稳定转染至CH0细胞中。由转染细胞表达的分离RAGE融合蛋白TTP-3000的序列可为SEQIDNO:36、SEQIDNO:37或SEQIDNO:57或SEQIDNO:36、SEQIDNO:37和/或SEQIDNO:57的组合。因此，由SEQIDNO:35的酰胺(Q)或焦谷氨酸(pE)或其混合物。糖基化可发生在N2及N174(基于SEQIDNO:37或SEQIDNO:57的编号)位点和/或其它可能存在的糖基化位点处。当在该重组系统中表达时RAGE融合蛋白的CH3区可经由翻译后修饰来切除其C末端残基。实施例2:测试RAGE-IgGl融合蛋白活性的方法A.体外配体结合将已知RAGE配体以每孔5;微克的浓度涂布于Maxisorb板的表面上。将板在4X:下温育隔夜。配体温育后，吸干板且室温下将1%BSA于50mM咪唑緩沖剂中的封闭緩沖剂(pH7.2)添加至板中历时1小时。接着吸干板和/或用洗涤緩沖剂(20mM咪唑、150mMNaCl、0.05%Tween-20、5mMCaCl2及5mMMgCl2，pH7.2)洗涤。制备起始浓度为1.082mg/mL的TTP-3000(TT3)溶液及起始浓度为370|ag/mL的TTP-4000(TT4)溶液。以起始样品的递增稀释度添加RAGE融合蛋白。在37。C下使RAGE融合蛋白与固定化的配体温育一'卜时，接着洗涤板且分析RAGE融合蛋白的结合。通过添加含有单克隆小鼠抗人类IgGl(以1:11，000稀释成21ng/100nL的最终试验浓度(FAC))、生物素化的山羊抗小鼠IgG(以1:500稀释成500ng/pL的FAC)及抗生物素蛋白连接的碱性磷酸酶的免疫检测复合物来检测结合。室温下用固定的RAGE融合蛋白温育复合物1小时，接着洗涤板且添加碱性磷酸酶底物对硝基苯基磷酸酯(PNPP)。通过测量PNPP至对硝基苯酚(PNP)的转化(在405nm下分光光度测量)来定量复合物与固定的RAGE融合蛋白的结合。如图7所说明，RAGE融合蛋白TTP-4000(TT4)及TTP-3000(TT3)与已知RAGE配体淀粉状蛋白P(Ap)、S100b(S100)及两性蛋白(Ampho)特异性相互作用。在配体不存在下(即单独BSA涂布(BSA或BSA+洗涤剂))，可归因于免疫检测复合物的非特异性结合的吸光率水平未增加。在淀粉状蛋白P用作标记配体时，可能需要在试验前预温育淀粉状蛋白P。预温育可使淀粉状蛋白P自身聚集成折叠片状形式，因为淀粉状蛋白P可优选地以折叠片状形式结合RAGE。RAGE融合蛋白TTP-4000及TTP-3000与RAGE配体之间的特异性相互作用的额外证椐可例示于展示RAGE配体能够与结合RAGE融合蛋白的已知RAGE配体有效竟争的研究中。在这些研究中，淀粉状蛋白P(Ap)固定于Maxisorb板上且如上文所述添加RAGE融合蛋白。此外，将RAGE配体与RAGE融合蛋白同时添加至某些孔中。发现在TTP-4000以123jag/mL存在的情况下(l:3稀释，图8)，RAGE配体可将TTP-4000(TT4)的结合阻断约25°/。至30%。当TTP-4000的起始溶液以系数10或30(1:10或1:30)稀释时，RAGE融合蛋白与固定的配体的结合完全纟皮RAGE配体抑制。类似地，在TTP-3000以360yg/mL存在的情况下(1:3稀释，图9),RAGE配体将TTP-3000(TT3)的结合阻断约50%。当TTP-3000的起始溶液以系数10(1:IO)稀释时，RAGE融合蛋白与固定的配体的结合完全被RAGE配体抑制。因此，RAGE融合蛋白与RAGE配体结合的特异性是剂量依赖性的。还如图8及9中所示，在RAGE融合蛋白不存在下(即仅使用免疫检测复合物("单独的复合物"))基本上未检测到结合。B.RAGE融合蛋白在基于细胞的试验中的作用先前工作展示骨髓THP-1细胞可对RAGE配体应答而分泌TNF-ct。在该试验中，使用ATCC提供的方法，在补充有10%FBS的RPMI-1640培养基中培养THP-1细胞。在RAGE融合蛋白TTP-3000(TT3)或TTP-4000(TT4)(10jag)、sRAGE(10jug)及人类IgG(10ng)(即作为阴性对照)不存在或存在下，经由用0.1mg/mlSlOOb刺激RAGE来诱导细胞分泌TNF-cc。在将蛋白质添加至细胞培养物24小时后使用市售的4十对TNF—ot的ELISA试剂盒(R&DSystems,Minneapolis,MN)测量由THP-1细胞分泌的TNF-oc的量。图10中的结果证明RAGE融合蛋白抑制这些细胞中S100b/RAGE诱导的TNF-ct产生。如图10所示，在添加10jugTTP-3000或TTP-4000RAGE融合蛋白时，SlOOb(O.lmg/mlFAC)诱导的TNF-a分别减少约45%至70°/。。融合蛋白TTP-4000在阻断SlOOb诱导TNF-a方面至少与sRAGE—才羊有效(图10)。通过其中仅将IgG添加至SI00b刺激的细胞的实验展示TTP-4000及TTP-3000RAGE序列的抑制特异性。将IgG及S100b添加至试验展示与仅添加SlOOb相同的TNF-a含量。通过其中仅将IgG添加至SlOOb刺激的细胞的实验展示对RAGE融合蛋白的RAGE序列而言TTP-4000及TTP-3000抑制TNF-a诱导的特异性。可见将IgG(即无RAGE序列的人类IgG，以每孔10)ig添加的Sigma人类IgG)及S100b添加至试验中展示与仅添加S100b相同的TNF-ct含量。在另一基于细胞的试验中，评估TTP-4000预防RAGE配体HMGB1与RAGE及其它HMGB1受体相互作用的能力。与结合RAGE且预防RAGE配体与RAGE相互作用的抗RAGE抗体不同，TTP-4000可通过与RAGE配体结合来阻断RAGE配体与RAGE的相互作用。已报导HMGB1为RAGE及Toll样受体2及4的配体(Park等人，/Wo/，2004;279(9):7370-7)。所有这三个受体(RAGE、Tol1样受体2及Tol1样受体4)均表达于THP-1细胞上(Parker等人，//迈迈Mo/.，2004，172(8):4977-86)。在该实验中，在TTP4000或抗RAGE抗体存在或不存在下通过HMGBl(5Qmg/mL)刺激THP-l细胞产生TNF-cc。在试验所用的条件下，HMGB1应为TNF-ot的唯一谦导剂。在将蛋白质添加至细胞培养物24小时后使用市售的针对TNF-ot的ELISA试剂盒(R&DSystems,Minneapolis,MN)测量由THP-1细胞分泌的TNF-cc的量。虽然图11的结果证明抗RAGE抗体及RAGE融合蛋白TTP-400Q阻断HMGB1与在THP-1细胞上表达的RAGE相互作用，但TTP-4000比抗RAGE抗体更大程度地抑制HMGB1诱导的TNF-oc产生。因此，该数据表明通过抑制HMGB1与Toll样受体2及4以及存在于THP-1细胞上的RAGE相互作用，TTP-4000比抗RAGE抗体更大程度地抑制HMGB1活性。实施例3:TTP-4000药代动力学概况为测定与人类sRAGE相比TTP-4000是否具有较好药代动力学概况，给大鼠及非人类灵长类动物静脉内(IV)注射TTP-4000(5mg/kg)且接着针对TTP-4000的存在来评估血浆。在这些实验中，两只首次用于实验的的雄性猴的外周静脉接受单独IV单次剂量的TTP_4000(5mg/ml/kg)接着约1.0毫升(ml)生理盐水冲洗。在给药前(即在注射TTP-4000前)或在给药后0.083、0.25、0.5、2、4、8、12、24、48、72、96、120、168、240、288及336小时收集血样(约1.0mL)至含有肝素锂的管。收集后，将管置放在湿水上(最长30分钟)直至在冷冻下(在2至8。C下)以1500xg离心15分钟。接着冷冻(-70。C士10。C)储存各个所釆集血浆样品直至使用ELISA分析在注射后不同时间点的RAGE多肽，如实施例6中所述。图12中所示的动力学概况表明如通过两只动物中oc相相对陡的斜率所证明TTP-40004吏其配体饱和后，TTP-4000保持超过300小时的终末半衰期。该半衰期比人类sRAGE在血浆中的半衰期(一般约2小时)显著大且为急性及半慢性适应症的单次注射提供机会。图12中，各曲线表示在相同实验条件下的不同动物。实施例4:TTP-4000Fc活化进行实验以测量与人类IgG相比RAGE融合蛋白TTP-4000对Fc受体的活化。通过测量从表达Fc受体的THP-1细胞分泌的TNF-oc来测量Fc受体活化。在这些实验中，用每孔IOjag的TTP-4000或人类IgG涂布96孔板。Fc刺激导致TNF-a分泌。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测量TNF-a的量。因此在该试验中，根据ATCC说明将骨髓细胞系THP-l(ATTC#TIB-202)保持在补充有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中。通常，通过用每孔IOmg的热聚集(63。C下30min)TTP-4000或人类IgGl预涂布孔，经由Fc受体刺激来诱导每孔40,000-80，000个细胞分泌TNF-cc。根据说明4吏用市售的TNFELISA试剂盒(R&DSystems,Minneapolis,MN#DTAOOC)在从所处理的孔中的24小时细胞培养物收集的上清液中测量由THP-l细胞分泌的TNF-oc的量。结果展示于图13中，其中可见TTP-4000产生少于每孔2ng的TNF且IgG产生超过每孔40ng的TNF。实施例5:TTP-4000的体内活性在若干人类疾病的体内模型中比较TTP-4000与sRAGE的活性。A.TTP-4000在再狭窄的动物才莫型中在再狭窄的糖尿病大鼠;t莫型中评估RAGE融合蛋白TTP-4000,涉及测量血管损伤后21天平滑肌增殖及内膜扩增。在这些实验中，使用标准方法在Zucker糖尿病及非糖尿病大鼠体内进行左颈总动脉的球嚢损伤。在损伤前一天将负载剂量(每只大鼠3mg)的IgG、TTP-4000或磷酸盐緩沖生理盐水(PBS)经腹膜内施用(IP)。每两天递送维持剂量直至损伤后第7天(即在损伤后第1、3、5及7天)。较高维持剂量为一组每只动物lmg，或较低为第二组每只动物0.3mg。为测量血管平滑肌细胞(VSMC)增殖，在损伤后第4天及第21天处死动物。为测量细胞增殖，在安乐死前18小时、12小时及2小时^f吏4天的动物接受腹膜内注射50mg/kg的溴代脱氧尿苷(BrDdU)。处死后，采集完整左侧颈动脉及右侧颈动脉。在包埋前将试样储存于Histochoice中历时至少24小时。使用小鼠抗BrdU单克隆抗体进行VSMC增殖的评估。应用焚光标记的山羊抗小鼠二抗。由两名对处理方案盲向的观测者计数每部分BrdU阳性细胞核数。在21天处死剩余大鼠以进行形态测量分析。由对研究群组盲向的观测者使用计算机化数字化显微面积测定软件Image-ProPlus对由VanGieson染色法染色的颈动脉连续切片(相隔5mm)进行形态测量分析。所有数据均表示为平均值士SD。使用SPSS软件进行统计分析。使用非配对t检验法来比较连续变量。认为P<0.05的值为统计学显著的。如图14A及14B中可见，TTP-4000处理以剂量反应方式显著减少内膜/介质比率及血管平滑肌细胞增殖。在图14B中，y轴表示BrdU增殖细胞数量。B.AD动物才莫型中的TTP4000进行实验以评估TTP-4000是否可影响AD小鼠模型中淀粉状蛋白形成及认知功能障碍。该实验利用在PDGF-B链启动子控制下表达人类Swedish突变体淀粉状前体蛋白(APP)的转基因小鼠。这些小鼠随时间产生高水平的RAGE配体淀粉状蛋白P(Ap)。先前，展示sRAGE治疗3个月减少该模型中脑中淀粉状蛋白斑形成及相关的炎症标记增加。通过在血小板衍生生长因子B(PDGF-B)链基因启动子的控制下将计用于该实验的APP小鼠(雄性)。在C57BL/6背景下产生小鼠且通过MolecularTherapeuticsInc，来发育小鼠。随意喂养动物且通过兄妹交配来保持。从6个月大时开始，从该构建体产生的小鼠发展淀粉状蛋白沉积物。动物成长到6个月大且接着供养90天并处死以进行淀粉状蛋白定量。在6个月大时开始每两天向APP转基因小鼠施用[qod(i.p.)]媒剂或TTP4000，历时90天。在实验结束时，处死动物且检查脑中AP斑负荷(即斑数目)。6个月大对照APP组用于测定淀粉状蛋白沉积物的基线。此外在研究结束时，使动物经受行为(Morris水迷宫(Morriswatermaze))分析。研究者对研究化合物为盲向的。将样品以每两天每只小鼠0.25ml给予小鼠。此外，给予一组小鼠每天200)ig的人类sRAGE。厶淀粉炎'f^-沉积为进行组织学检查，利用腹膜内注射(IP)戊巴比妥钠(50mg/kg)来麻醉动物。用4'C磷酸盐緩沖生理盐水(PBS)接着4%低聚曱醛经心灌注动物。将脑移除且置放于4%低聚曱醛中过夜。以石蜡加工脑且包埋。获得十个连续30Mm厚经由脑部的切片。在4'C下使切片经受一抗(AP肽抗体)过夜以检测转基因动物的脑中淀粉状蛋白沉积物(Guo等人，/.vVewo;c/.,22:5900-5909(2002))。在Tris緩冲生理盐水(TBS)中洗涤切片且添加二抗且在室温下温育1小时。洗涂后，如VectorABCElite试剂盒(VectorLaboratories)中所指示温育切片且用二氨基苯甲酸(DAB)染色。在水中停止反应且用二甲苯处理后以盖玻片覆盖。用计算机辅助影像分析系统(由装备有QuickCaptureframegrabbercard的PowerMacintosh计算机、安装在Olympus显微镜及相机支架上的HitachiCCD相机组成)测定各切片中淀粉状蛋白面积。使用NIH影像分析软件v.1.55。捕捉影像且测定出十个切片的淀粉状蛋白的总面积。对处理状况盲向的单个操作员进行所有测量。对切片的淀粉状蛋白体积求和且除以切片总数以计算淀粉状蛋白体积。为进行定量分析，使用酶联免疫吸附试验(ELISA)来测量APP转基因小鼠的脑中人类总Ap、A0总及APh2水平(BiosourceInternational,Camarillo，CA)。通过盐酸胍从小鼠脑中提取AP总及A(3h2且如制造商所述定量。该试验从脑中提取出总肽(均可溶且聚集)。么"余^教如下进行Morris水迷宫测试在实验结束时在Morris水迷宫测试中测试所有小鼠一次。在1.2m户外水迷宫中训练小鼠。将池用水填充至30cm深且保持在25。C。将逃跑平台(1Gcm"置放在水平面下1cm。在试验期间，自池中移除平台。在用白色帘子围绕以隐藏任何迷宫外提示的池中进行提示测试。所有动物均连续三天经历非空间预先训练(NSP)。这些试验为动物进行最终行为测试作准备以测定找到平台的记忆保留。虽然未记录这些试验，但这些试验仅为了训练的目的。为进行训练及认知研究，移除帘子以提供额外迷宫提示(这允许鉴别具有游泳损伤的动物)。在第1天，将小鼠置于隐藏平台上历时20秒(试验1)，针对试验2-3，将动物释放在距离提示平台或隐藏平台(试验4)10cm处的水中且允许其游至平台。在试验第二天，在池中心或各四分部的中心之间随机移动隐藏平台。将动物释放至池中，随机面对墙壁且允许60秒到达平台(3个试验)。在第三个试验中，对动物进行三个试验，两个试验为隐藏平台且一个为提示平台。NSP后两天，允许动物经受最终行为试验(Morris水迷宫测试)。针对这些试验(每只动物3次)，将平台置于池之一个四分部中心，且以随机方式面向墙壁释放动物。使动物找到平台或游泳60秒(潜伏时间，动物找到平台的时间)。在给药4-6小时内测试所有动物且由对测试群组盲向的操作员随才几选择以进4亍测试。结果表示为平均值士标准差(SD)。使用t检验法分析淀粉状蛋白与行为研究差异的显著性。比较6个月大APP对照组与经TTP-4000处理的动物以及9个月大APP媒剂处理组与经TTP-4000处理的动物。认为在0.05以下的差异为显著的。通过对各组中数据求和且除以对照来确定淀粉状蛋白及行为的变化°/。(即1i.P./6个月大对照=变化％)。图15A及15B展示经TTP-4000或小鼠sRAGE处理3个月的小鼠具有比媒剂及阴性对照人类IgGl(IgGl)处理的动物更少的A3斑及更轻的认知功能障碍。该数据表明TTP-4000有效减少转基因小鼠模型中AD病理。还发现，类似于sRAGE，TTP-4000可减少炎症细胞因子IL-1及TNF-a(数据未展示)。C.TTP-4000在中风动物模型中的功效还在中风的疾病相关动物模型中比较TTP-4000与sRAGE。在该模型中，结扎小鼠的中部颈动脉历时1小时接着再灌注23小时，在此刻处死小鼠且评估脑中梗塞面积。在即将再灌注前用sRAGE或TTPMOOO或对照免疫球蛋白处理小鼠。在这些实验中，将媒剂(以每只小鼠250nl)或TTP测试物(TTP-3000、TTP-4000，以每只小鼠250pl)注射给雄性C57BL/6。在缺血开始后l小时，经腹膜内注射小鼠。使小鼠经受l小时脑缺血接着24小时再灌注。为诱导缺血，麻醉每只小鼠且通过外部加温使体温保持在36。C至37。C下。经由颈部的中部切口暴露左颈总动脉(CCA)。将显微外科夹置放在颈内动脉(ICA)的起端周围。用真丝结扎ECA的远端且横切。将6-0真丝松散地系在ECA残端周围。将尼龙缝线的火焰磨光末端轻轻插入ECA残端中。在残端周围拉紧6-0真丝圏且使尼龙缝线进入且穿过颈内动脉(ICA)，直至其停留在大脑前动脉中，从而闭塞前面交通及大脑中动脉。当尼龙缝线在适当位置历时1小时后，将动物再次麻醉，记录直肠温度且移除缝线和缝合切口。通过腹膜内注射戊巴比妥钠(50mg/kg)将动物麻醉且接着移除大脑来测定梗塞体积。接着将大脑切成4个经由梗塞区的2mm切片且置于2y。氯化三苯基四氮唑(TTC)中30分钟。接着将切片置于4%低聚甲醛中过夜。用计算机辅助影像分析系统(由装备有QuickCaptureframegrabbercard的PowerMacintosh计算机、安装在相机支架上的HitachiCCD相机组成)测定各切片中梗塞面积。使用NIH影像分析软件v.1.55。捕捉影像且测定出切片的梗塞总面积。对处理状况盲向的单个操作员进行所有测量。对切片的梗塞体积求和计算出总梗塞体积。结果表示为平均值土标准差(SD)。使用t检验法分析梗塞体积数据差异的显著性。如由表2中数据所说明，在限制这些动物的梗塞面积方面TTP-4000比sRAGE有效，这表明TTP-4000由于其在血浆中更佳的半衰期而能在这些小鼠体内保持更大保护。实施例6:通过ELISA检测RAGE融合蛋白最初经由过夜温育将50|iLRAGE特异性单克隆抗体1HB1011以在IXPBSpH7.3中10jug/ml的浓度涂布于板上。当准备使用时，将板用300nL1X咪唑-Tween洗涤緩冲剂洗涤三次且用1。/。BSA封闭。以100uL最终体积添加样品(经稀释)及已知TTP-4000稀释液的标准稀释液。将样品在室温下温育1小时。温育后，将板洗涤3次。添加在具有1%BSA的IXPBS中的山羊抗人类IgGl1(SigmaA3312)AP结合物且在室温下温育1小时。将板洗涤3次。颜色用对硝基苯基磷酸酯来说明。实施例7:RAGE配体结合RAGE融合蛋白的定量图16展示TTP-4000与各种已知的固定的RAGE配体的饱和结合曲线。配体固定于微量滴定板上且在从0渐增至360nM的RAGE融合蛋白存在下温育。使用结合特异性针对融合嵌合体的IgG部分的碱性磷酸酶的多克隆抗体来检测RAGE融合蛋白-配体相互作用。使用GraphpadPrizm软件计算相对Kd且与已建立的RAGE-RAGE配体值的文献值匹配。HMGlB-两性蛋白，CML-羧甲基赖氨酸，A^-淀粉状蛋白P1-40。实施例8:使用RAGE融合蛋白防止同种异体移植排斥反应可预期RAGE阻滞阻断同种异体移植排斥反应。如通过被移植动物血糖水平保持低于目标浓度的时间长度所测量，这些实验探究使用本发明的RAGE融合蛋白阻滞配体-RAGE相互作用是否削弱从健康供体移植至糖尿病动物的胰岛细胞的排斥反应。如本文所论述，发现将RAGE融合蛋白(例如TTP-4000)施用给已接受胰岛细胞移植物的糖尿病动物显著延迟高血糖症的复发及因此移植的胰岛细胞在两个移植(同种异体及同源)动物模型中的排斥反应。A.小鼠中同种异体胰岛移植第一组实验测试RAGE融合蛋白(TTP-4000)的施用是否调节糖尿病C57BL/6J(B6)小鼠模型中移植的胰岛细胞的同种异体排斥反应及糖尿病的复发。糖尿病动物模型通过以200mg/kg单次静脉内注射链脲佐菌素(STZ)(SigmaChemicalCo.，St.Louis,MO)使C57BL/6J(6-8周大)(B6)小鼠患糖尿病。将BALB/cJ(6-8周大)(BALB)小鼠用作胰岛移植的供体，因此提供用于胰岛移植的同种异体错配。胰岛分离用盐酸氯胺酮/盐酸甲苯噻唤(xylazineHC1)溶液(Sigma，St.LouisMO)麻醉小鼠(BALB/c)。管内注射3ml含有1.5mg/ml胶原酶P(RocheDiagnostics,Branchburg,NJ)的冷汉克斯平衡盐溶液(HBSS，Gibco，GrandIslandNY)后，经外科手术获得胰腺且在37C下消化20min。用HBSS洗涤胰岛且通过^f吏用具有四个不同密度(26%、23%、20°/。及11%)的聚蔗糖400(Cellgro，HerndonVA)的间断梯度离心来纯化。收集在20%与23°/。层的界面处的组织片段，洗涤且再悬浮于HBSS中。在倒置显微镜下手选无连接腺泡、血管及管道组织的单独胰岛，产生用于移植的高纯度胰岛。胰岛移植在诊断出糖尿病2天内链脲佐菌素诱导的糖尿病C57BL/6(B6)小鼠接受胰岛移植物。将BALB/cJ(6-8周大)(BALB)小鼠用作供体以进行同种异体胰岛移植。为了移植，用灌输装置从供体小鼠拣取500-600个新分离的胰岛(即约550个胰岛等价物)且将其移植至受体右肾的包膜下(subcapular)空间。用测试化合物治疗胰岛移植的同时施用测试化合物；给药视对照动物进展而定持续约60天。根据以下方案(表3)用0.25ml磷酸盐緩冲生理盐水(PBS)、PBS中的TTP-4000或PBS中的IgG注射小鼠。95表3施用测试化合物和/或媒剂<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>胰岛移植物功能的监测胰岛移植后前2周每天连续测量血糖，接着此后每两天测量来监测胰岛移植物功能。糖尿病的逆转定义为两次连续测量的血糖水平少于200mg/dl。当两次连续测量的血糖超过250mg/dl时确定移才直物损失。结果展示于表4中。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>*表4中的值反映如通过增加的血糖水平的复发所定义的各动物的移植物损失的天数。施用TTP-4000对BALB/c胰岛在B6小鼠体内的同种异体移植排斥反应的影响如图17中Kaplan-Meier累积存活曲线所示。可见与未经处理(对照)或经媒剂(PBS)或(人类IgGl)处理的动物对比，在检测到用TTP-4000(组1及3)处理的动物移植物衰竭前时间增加。使用多种统计学分析(Mantel-CoxLogrank、Breslow-Gehan-Wilcoxon、Tarone-Ware、Peto-Peto-Wilcoxin及Harrington-Fleming)，对照与TTP-4000(组1及3)之间的差异显著(表5)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>*自由度B.作为自身免疫疾病模型的NOD小鼠体内胰岛移植第二批实验测试施用RAGE融合蛋白(即TTP-400G或TTP-3000)是否调控NOD小鼠(使用同源NOD移植模型)体内糖尿病复发过程。糖尿病动物模型自发性自身免疫非肥胖糖尿病小鼠(膽/LtJ)(12-25周大)用作胰岛细胞的受体，而年幼糖尿病前期N0D/LtJ小鼠(6-7周大)用作同源胰岛移植的供体。如上文部分A(同种异体胰岛移植)中所述分离用于移植的胰岛。胰岛移植糖尿病N0D/LtJ小鼠在诊断出糖尿病2天内接受胰岛移植物。用灌输装置从供体小鼠拣取500-600个新分离的胰島(约550个胰岛等价物)且将其移植至右肾的包膜下空间。用测试化合物治疗在胰岛移植同时施用测试化合物且持续约8周。根据以下方案(表6)用0.25mlPBS、PBS中TTP-4000或PBS中TTP-3000注射小鼠。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>胰岛移植物功能的监测胰岛移植后通过在前2周每天连续测量血糖，随后每两天测量来监测胰岛移植物功能。糖尿病的逆转定义为两次连续测量的血糖少于200mg/dl。当两次连续测量的血糖超过25Qmg/dl时测定移植物损失%。结果展示于表7中。表7TTP-4000及TTP-3000对NOD小鼠体内同源胰岛移植物的糖尿病复发的影响*TTP-4000TTP-3000对照300|agLD+100(jgqodip300mg+100HgQodip(组1)(组2)3544233846254042264341223634224532244430213820222124平均值39.87538.4285722.727273SD3.7583246.320791,8488326n8711*数值反映如通过增加的血糖水平的复发所定义的各动物移植物损失的天数。施用TTP-4000对糖尿病NOD小鼠体内同源移植胰岛排斥反应的影响如图18中Kaplan-Meier累积存活曲线所示。如表7的数据所示，与未经处理(对照)的动物相比，在检测到用TTP-4000(组l)及TTP-3000(组2)处理的动物的移植物衰竭前时间增加。图18展示在检测到用TTP-4000(组l)处理的动物及未经处理的动物的移植物衰竭前时间的增加。使用多种统计学分析(Mantel-CoxLogrank、Breslow-Gehan-Wilcoxon、Tarone-Ware、Peto-Peto-Wilcoxin及Harrington-Fleming)，对照与TTP-4000(组1)以及对照与TTP-3000(组2)之间的差异显著(表8)。99表8<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>*自由度实施例9-RAGE融合蛋白冻干制剂在使用RAGE融合蛋白TTP-4000研制冻干制剂中，最初通过测量冻千及重构后蛋白稳定性来篩选冻干保护剂及緩冲剂。各制剂中冻干蛋白还经受加速稳定性研究以测定蛋白在其保存期的潜在稳定性。在最初筛选研究中，设计实验以评估可提供被调配为冷冻块体的TTP-4000的适当溶解性及稳定性且提供具有约50mg/ml或50mg/ml以上的RAGE融合蛋白浓度的重构制剂的调配条件。测试含有乙酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠、琥珀酸钠、組氨酸及氯化钠以及蔗糖及甘露糖醇的制剂。还评估介于5.5与7.0之间的各种pH值。使用尺寸排阻层析法(SEC)、SDS-Page、傅立叶转换红外光谱学(FTIR)、圆二色性(CD)、肽图及紫外光-可见光吸光率(UV-Vis)评估TTP-4000的生物物理及化学稳定性。基于含有柠檬酸钠、组氨酸、蔗糖、甘露糖醇及Tween8Q之一或多者的制剂中RAGE融合蛋白在7.0或7.0以下的pH值下的稳定性，选择含有这些緩冲剂、冻干保护剂或表面活性剂之一或多者的制剂以供进一步研究。实施例10-RAGE融合蛋白冻干制剂基于实施例9中所收集的信息，研究TTP-4000的额外制剂。研究集中于鉴别用于保持经由冷冻干燥过程稳定的产物且在重构后潜在达到高浓度TTP-4000(即约50mg/ml或50mg/ml以上)的緩冲剂和/或冻干保护剂。在2周加速稳定性研究期间研究六个制剂。这些制剂概述于表9中。研究还集中于发展用于如下所述的更大剂量的TTP-4000(250mg)的冷冻干燥循环。冷冻干燥后，制剂研制样品小瓶起褶且置于40C腔室中历时2周。在2。C至8。C下储存按比例增加的研制样品直至进行测试。样品分析方法通过UV-Vis光谦法测量样品中TTP-4000浓度。AglientUV-Vis用于获得蛋白质光谱以及緩冲剂空白光镨。获得后，针对作为任何蛋白质聚集的结果可能发生的任何光散射校正吸光率值。使用KarlFisher滴定方法分析残余水分。用适当量的WFI重构冷冻干燥制剂研制样品。认为重构时间为从水添加的时间至无可见固体的时间。重构后使用适当校准的半微探针测量各样品的pH值。使用TSKgelSuperSW2000柱来进行尺寸排阻层析法(SEC)以分析或监测冷冻干燥及在加速条件下储存期间TTP-4000的物理稳定性(降解及可溶聚集体形成)。将样品注射至适配有两个TSKgelS叩erSW2000,4.6x300mm,4ym柱(TosohBioscience,18674)的Aglient1100系列LC中。为测量微粒数，将1mL样品20倍稀释成20mL。通过超声处理约3G秒使样品脱气，且通过不产生气泡的手动旋涡轻轻搅拌样品。将三个等分试样(体积各为5mL)抽至不透光度计数感应器中。将仪器设置成积分模式，在大于或等于10ym及大于或等于25jam的设置下收集微粒。结果基于实施例9中的预调配研究，最初研究两个緩冲剂柠檬酸钠及L-组氨酸。使用离心浓缩机制备浓缩制剂1-6(表9)。表9中制剂1-6的最终蛋白浓度在约4-15mg/ml之间的范围内。表9TTP-4000的调配<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>使用表9中制剂1-6，使用具有O.7mL填充体积的小瓶(2mL)。小瓶顶部空间充满空气。在干燥前，在-5(TC至-20'C之间的保存温度下冷冻样品约12小时。将样品在lOOmTorr的减压及-20'C与-10r之间的保存温度下干燥约36小时，接着在20。C的保存温度下干燥约12小时。冷冻千燥后，塞住小瓶且顶部变硬。自各制剂l-6产生粗糙饼块。使冷冻干燥产物经受加速稳定性研究以获得制剂的化学稳定性。将冷冻干燥产物置于40'C及75%相对湿度下储存2周。用0.206mLWFI重构冷冻干燥产物。所有冷冻干燥产物均在20秒或少于20秒内重构。所有重构制剂中pH值在整个2周的储存期保持一致。在0及2周时刻测定的冷冻干燥产物的残余水分值介于3.0%与0.8%之间且展示冷冻干燥循环能够充分干燥预冻干的制剂。所有重构制剂的渗透压度均在250mOsm/kg与400mOsm/kg之间的所要等渗范围内(参见表IO)。各重构制剂的黏度在3.7cP(厘泊)以下。表IO.TTP-4000的重构制剂及渗透压度<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>对在冷冻干燥过程的各步骤下采用的表10中制剂5的样品进行SEC分析且基于一致低水平的聚集体及分解物质表明在这些制剂中TTP-4000不对冷冻干燥过程的任一步尤其灵敏。还对冷冻干燥前预冻干制剂以及零时刻和2周加速稳定性研究后的重构制剂进行SEC分析。杂质(聚集体或分解产物)量一致为低的(即低于4%)(表ll)。表ll.TTP-4000的重构制剂及完整蛋白质％<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table>肽图说明TTP-400G未因为冷冻干燥及在加速条件下储存而氧化或脱酰胺。对制剂1、3、4及6进行SDS-PAGE且展示这些制剂中TTP-4000在整个冷冻干燥及储存过程中保持物理稳定性。为扩大冷冻干燥过程以与50mLlyo小瓶及250mg剂量的TTP-4000—起4吏用，通过4吏用超过滤将溶液浓缩成15mg/mLTTP-4000且接着经由在pH6.0下逆着10mM组氨酸及65mM蔗糖透析过滤(diafilter)溶液来制备样品。添加Tween80至0.01°/。的最终量(体积比)。将预冻干制剂(16.67mL)添加至各50mL小瓶中。将样品暴露于冷冻干燥循环，其中样品在5。C与-5。C之间的保存温度下冷却30min，接着在-50。C的保存温度下冷却约3小时。在100mTorr的减压及-20。C与-1(TC之间的保存温度下干燥约34小时接着在5X:与20C之间的保存温度下干燥约11小时来干燥样品。冷冻干燥后，塞住小瓶且顶部变硬。产生药学上优良的白色饼块。饼块外观粗糙且在处理及储存期间未失去其结构。如通过在280nm下的吸光率所测定的，重构样品的浓度为40.5mg/mL的TTP-4000。在类似条件下的额外研究中，重构样品中TTP-4000的浓度一致为约50mg/mL。在室温下储存0、2及6个小时，测量重构样品的微粒含量。表12中结果展示重构样品具有低量的微粒含量。表12储存期间重构样品中所检测的微粒数粒径时间=0时间=2h时间=6h每毫升微粒>10/am562368948〉25)im81620每个容器的微粒>10|Jm275318034645>25pm397898总之，在含有蔗糖、甘露糖醇及Tween80之一或多者的柠檬酸及组氨酸緩冲剂中调配TTP-4000。测试展示含有柠檬酸钠或组氨酸的制剂具有类似工作特征且TTP-4000在含有组氨酸的制剂中更可溶。关注于含有组氨酸的制剂的进一步的扩大研究。冷冻干燥循环后，评估TTP-400G的化学及物理稳定性且检测到组氨酸制剂之间无显著差异。还从制剂中除去甘露糖醇。从制剂研制研究选择的最终制剂含有约pH6.0的10mM组氨酸、60mM蔗糖及0.01%Tween80。该制剂证实在冷冻干燥及储存期间保持TTP-4000稳定的较好能力且还提供研究期间最高浓度的TTP-4000。在扩大研究中，蔗糖水平升至65mM以将制剂的渗透压度调节至接近等渗性。在扩大研究期间，还发现将TTP-4000预冻干制剂及重构制剂的pH值保持为pH6.O或pH6.0附近，且小于6.7的pH值为适于减少蛋白沉淀或聚集的pH值。认为上文仅作为本发明的主题的说明。因为本领域技术人员可容易地提出许多修改及变化，所以不欲将本发明限于所示及所述的确切实施方案，且认为所有在随附权利要求范围内的适合修改及等价物均在本发明的概念内。附图简述参考下列附图，本发明的各种特征，方面和优点将更明显。图1展示本发明替代实施方案的各种RAGE序列及免疫球蛋白序列图A，SEQIDNO:1，人类RAGE的氨基酸序列；及SEQIDNO:2，无氨基酸1-22的信号序列的人类RAGE的氨基酸序列；图B，SEQIDNO:3，无氨基酸1-23的信号序列的人类RAGE的氨基酸序列；图C，SEQID104NO:4，人类sRAGE的氨基酸序列；SEQIDNO:5,无氨基酸1-22的信号序列的人类sRAGE的氨基酸序列；及SEQIDNO:6，无氨基酸1-23的信号序列的人类sRAGE的氨基酸序列；图D，SEQIDNO:7，包含人类RAGE的V结构域的氨基酸序列；SEQIDNO:8，包含人类RAGE的V结构域的另一氨基酸序列；SEQIDNO:9，人类RAGE的V结构域的N末端片段；SEQIDNO:10,人类RAGE的V结构域的另一N末端片段；SEQIDNO:11，人类RAGE的氨基酸124-221的氨基酸序列；SEQIDNO:12，人类RAGE的氨基酸227-317的氨基酸序列；SEQIDNO:13,人类RAGE的氨基酸23-123的氨基酸序列；图E，SEQIDNO:14，人类RAGE的氨基酸24-123的氨基酸序列；SEQIDNO:15，人类RAGE的氨基酸23-136的氨基酸序列；SEQIDNO:16，人类RAGE的氨基酸24-136的氨基酸序列；SEQIDNO:17，人类RAGE的氨基酸23-226的氨基酸序列；SEQIDNO:18,人类RAGE的氨基酸24-226的氨基酸序列；图F，SEQIDNO:19，人类RAGE的氨基酸23-251的氨基酸序列；SEQIDNO:20，人类RAGE的氨基酸24-251的氨基酸序列；SEQIDNO:21,RAGE域间连接子；SEQIDNO:22，第二RAGE域间连接子；SEQIDNO:23，第三RAGE域间连接子；SEQIDNO:24，第四RAGE域间连接子；图G，SEQIDNO:25，编码人类RAGE氨基酸1-118的DNA;SEQIDNO:26，编码人类RAGE氨基酸1-123的DNA;及SEQIDNO:27,编码人类RAGE氨基酸1-136的DNA;图H，SEQIDNO:28，编码人类RAGE氨基酸1-230的DNA;及SEQIDNO:29,编码人类RAGE氨基酸1-251的DNA;图I，SEQIDNO:38,人类IgG的CH2及Ch3结构域的部分氨基酸序列；SEQIDNO:39,编码人类IgG的一部分人类CH2及CH3结构域的DNA;SEQIDNO:40,人类IgG的(:2及(:3结构域的氨基酸序列；图J，SEQIDNO:41，编码人类IgG的人类CH2及CH3结构域的DNA;SEQIDNO:42，人类IgG的CH2结构域的氨基酸序列；SEQIDNO:43，人类IgG的CH3结构域的氨基酸序列；及SEQIDNO:44，第五RAGE域间连接子；图K，SEQIDNO:45，无氨基酸1-23的信号序列的人类sRAGE的氨基酸序列，其中N末端的谷氨酰胺残基环化形成焦谷氨酸；SEQIDNO:46，包含人类sRAGE的V结构域的另一氨基酸序列，其中N末端的谷氨酰胺残基环化形成焦谷氨酸；SEQIDNO:47,人类RAGE的V结构域的另一N末端片段，其中N末端的谷氨酰胺残基环化形成焦谷氨酸；SEQIDNO:48,人类RAGE的氨基酸24-123的氨基酸序列，其中N末端的谷氨酰胺残基环化形成焦谷氨酸；图L,SEQIDNO:49,人类RAGE的氨基酸24-136的氨基酸序列，其中N末端的谷氨酰胺残基环化形成焦谷氨酸；SEQIDNO:50，人类RAGE的氨基酸24-226的氨基酸序列，其中N末端的谷氨酰胺残基环化形成焦谷氨酸；SEQIDNO:51，人类RAGE的氨基酸24-251的氨基酸序列，其中N末端的谷氨酰胺残基环化形成焦谷氨酸；图M，SEQIDNO:52，编码SEQIDNO:38中人类IgG的人类CH2及CH3结构域的部分的另一DNA序列；及SEQIDNO:53，编码SEQIDNO:40中人类IgG的人类CH2及Ch3结构域的另一DNA序列。图2展示根据本发明的一个实施方案编码第一RAGE融合蛋白(TTP-4000)编码区的其它DNA序列SEQIDNO:30(图A)及SEQIDNO:54(图B)。以粗体突出的编码序列1-753编码RAGEN末端蛋白序列，而序列754-1386编码无铰链区的人类IgGFc(yl)蛋白序列。图3展示根据本发明的一个实施方案编码第二RAGE融合蛋白(TTP-3000)编码区的其它DNA序列SEQIDNO:31(图A)及SEQIDNO:55(图B)。以粗体突出的编码序列1-408编码RAGEN末端蛋白序列，而序列409-1041编码无铰链区的人类IgGFc(yl)蛋白序列。图4展示根据本发明的替代实施方案各编码四域RAGE融合蛋白的氨基酸序列SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34及SEQIDNO:56。RAGE序列以粗体字体突出。图5展示根据本发明的替代实施方案各编码三域RAGE融合蛋白的氨基酸序列SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37及SEQIDNO:57。RAGE序列以粗体字体突出。图6图A展示根据本发明的替代实施方案人类RAGE及人类IgY-1Fc蛋白中蛋白域的比较及用于制备TTP-3000(在位置136处)及TTP-4000(在位置251处)的切除位点；及图B展示根据本发明的替代实施方案TTP-3000及TTP-4000的域结构。图7展示根据本发明的一个实施方案sRAGE及第一RAGE融合蛋白TTP-4000(TT4)及第二RAGE融合蛋白TTP-3000(TT3)结合RAGE配体淀粉状蛋白P(A3)、S100b(S100)及两性蛋白(Ampho)的体外结合试验的结果。图8展示根据本发明的一个实施方案与仅包括免疫检测试剂("单独的复合物")的阴性对照相比第一RAGE融合蛋白TTP-4000(TT4)("蛋白质")结合淀粉状蛋白P的体外结合试验及该结合通过RAGE拮抗剂("RAGE配体")的拮抗作用的结果。图9展示根据本发明的一个实施方案与仅包括免疫检测试剂("单独的复合物")的阴性对照相比第二RAGE融合蛋白TTP-3000(TT3)("蛋白质")结合淀粉状蛋白P的体外试验及该结合通过RAGE拮抗剂("RAGE配体")的拮抗作用的结杲。图10展示根据本发明的一个实施方案测量RAGE融合蛋白TTP-3000(TT3)及TTP-4000(TT4)及sRAGE对S100b-RAGE"i秀导TNF-a产生的抑制作用的基于细胞的试验的结果。图11展示根据本发明的一个实施方案测量RAGE融合蛋白TTP-4000及抗RAGE抗体对HMGB1-RAGEi秀导TNF-a产生的抑制作用的基于细胞的试验的结果。图12展示根据本发明的一个实施方案RAGE融合蛋白TTP-4000的药代动力学概况，其中各曲线表示在相同实验条件下的不同动物。图13展示根据本发明的一个实施方案由于RAGE融合蛋白TTP-4000刺激及人类IgG刺激而从THP-l细胞释放的作为炎症反应的量度的TNF-cc相对水平。图14展示根据本发明的替代实施方案RAGE融合蛋白TTP-4000减少糖尿病动物再狭窄的用途，其中图A展示与阴性对照(IgG)相比TTP-4000RAGE融合蛋白减少内膜/介质比率；且图B展示TTP-4000RAGE融合蛋白以剂量反应方式减少血管平滑肌细胞增殖。图15展示根据本发明的替代实施方案RAGE融合蛋白TTP-4000能障碍的用途，其中图A展示TTP-4000RAGE融合蛋白减少脑中淀粉状蛋白负荷，且图B展示TTP-4000RAGE融合蛋白改善认知功能。图16展示根据本发明的一个实施方案TTP-4000与各种被固定的已知的RAGE配体的饱和结合曲线。图17展示根据本发明的替代实施方案RAGE融合蛋白TTP-4000减少同种异体胰島细胞移植物的排斥反应的用途，其中空心(未填充)圆圏表示未经治疗的对照动物；具有对角阴影的圆圏表示经第一剂量TTP-4000治疗的动物；具有波浪阴影的圓圏表示经第二剂量TTP-4000治疗的动物；经菱形填充的圆圏表示经对照PBS治疗的动物；且实心圆圏表示经对照IgG治疗的动物。图18展示根据本发明的替代实施方案RAGE融合蛋白TTP-4000减少同源胰岛细胞移植物的排斥反应的用途，其中空心(未填充)圆圏表示未经治疗的对照动物；且实心圆圏表示经TTP-4000治疗的动物。权利要求1.一种RAGE融合蛋白，其包含如SEQIDNO56或SEQIDNO57中所述的氨基酸序列或与其至少90％一致的序列。2.如权利要求1的RAGE融合蛋白，其中与SEQIDNO:56或SEQIDNO:57至少90%—致的序列包含无C末端赖氨酸的SEQIDNO:56或SEQIDNO:57的序列。3.—种分离的DNA分子，其编码如权利要求1的RAGE融合蛋白。4.如权利要求3的分离的DNA分子，其中该DNA包含如SEQIDNO:54或SEQIDN0:55中所述的序列或与其至少90%—致的序列。5.—种表达载体，其编码如权利要求1的RAGE融合蛋白。6.—种细胞，其被权利要求5的表达载体转染，使得该细胞表达包含如SEQIDNO:56或SEQIDNO:57中所述的氨基酸序列或与其至少90%—致的序列的RAGE融合蛋白。7.如权利要求6的细胞，其中与SEQIDNO:56或SEQIDNO:57至少90%—致的序列包含无C末端赖氨酸的SEQIDNO:56或SEQIDNO:57的序列。8.—种制剂，其包含冻干保护剂、RAGE融合蛋白与緩冲剂的冻干混合物。9.如权利要求8的制剂，其中所述冻干保护剂包含非还原性糖。10，如权利要求9的制剂，其中所述非还原性糖包含蔗糖、甘露糖醇或海藻糖的至少一种。11.如权利要求8的制剂，其中所述緩冲剂包含组氨酸。12.如权利要求8的制剂，其中所述RAGE融合蛋白包含RAGE多肽，所述RAGE多肽直接连接于包含免疫球蛋白的CH2结构域或免疫球蛋白的CH2结构域的部分的多肽。13.如权利要求12的制剂，其中所述RAGE多肽包含连接于RAGE免疫球蛋白域的RAGE域间连接子，以便所述RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸连接于所述域间连接子的N末端氨基酸，且所述RAGE域间连接子的C末端氨基酸直接连接于包含免疫球蛋白的CH2结构域或其部分的多肽的N末端氨基酸。14.如权利要求12的制剂，其中所述RAGE融合蛋白包含连接于第二RAGE免疫球蛋白域及第二RAGE域间连接子的第一RAGE免疫球蛋白域及第一RAGE域间连接子，以便所述第一域间连接子的N末端氨基酸连接于所述第一RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸，所述第二RAGE免疫球蛋白域的N末端氨基酸连接于所述第一域间连接子的C末端氨基酸，所述第二域间连接子的N末端氨基酸连接于所述第二RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸，且所述RAGE第二域间连接子的C末端氨基的N末端氨基酸，15.如权利要求12的制剂，其中所述RAGE多肽包含RAGE配体结合位点，所述RAGE配体结合位点包含如SEQIDNO:10中所述的氨基酸序列或与其至少90°/。一致的序列，或如SEQIDNO:47中所述的氨基酸序列或与其至少90%—致的序列。16.如权利要求8的制剂，其中所述RAGE融合蛋白包含如SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57的至少一个中所述的氨基酸序列或与其至少90°/。一致的序列。17.如权利要求16的制剂，其中与SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57至少90%—致的序列包含无C末端赖氨酸的SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57的多肽。18.如权利要求8的制剂，其进一步包含表面活性剂、螯合剂或膨化剂的至少一种。19.一种重构制剂，其包含在稀释剂中重构的冻干RAGE融合蛋白，其中所述重构制剂中RAGE融合蛋白浓度在约1mg/mL至约400mg/mL的范围内。20.如权利要求19的重构制剂，其中所述RAGE融合蛋白包含RAGE多肽，所述RAGE多肽直接连接于包含免疫球蛋白的CH2结构域或免疫球蛋白的CH2结构域的部分的多肽。21.如权利要求20的重构制剂，其中所述RAGE多肽包含连接于RAGE免疫球蛋白域的RAGE域间连接子，以便所述RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸连接于所述域间连接子的N末端氨基酸，且所述RAGE域间连接子的C末端氨基酸直接连接于包含免疫球蛋白的CH2结构域或其部分的多肽的N末端氨基酸。22.如权利要求20的重构制剂，其中所述RAGE融合蛋白包含连接于第二RAGE免疫球蛋白域及第二RAGE域间连接子的第一RAGE免疫球蛋白域及第一RAGE域间连接子，以便所述第一域间连接子的N末端氨基酸连接于所述第一RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸，所述第二RAGE免疫球蛋白域的N末端氨基酸连接于所述第一域间连接子的C末端氨基酸，所述第二域间连接子的N末端氨基酸连接于所述第二RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸，且所述RAGE第二域间连接子的C末端氨基酸直接连接于所述CH2免疫球蛋白域或免疫球蛋白的CH2结构域的部分的N末端氨基酸。23.如权利要求20的重构制剂，其中所述RAGE多肽包含RAGE配体结合位点，所述RAGE配体结合位点包含如SEQIDNO:1G中所述的氨基酸序列或与其至少90%—致的序列，或如SEQIDNO:47中所述的氨基酸序列或与其至少90%—致的序列。24.如权利要求19的重构制剂，其中所述RAGE融合蛋白包含如SEQIDNo:32、33、34、35、36、37、56或57的至少一个中所述的氨基酸序列或与其至少90%—致的序列。25.如权利要求24的重构制剂，其中与SEQIDNo:32、33、34、35、36、37、56或57至少90%—致的序列包含无C末端赖氨酸的SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57的多肽。26.如权利要求19的重构制剂，其中所述稀释剂包含用于注射的水(WFI)。27.如权利要求19的重构制剂，其中所述重构制剂适于皮下或肌肉内给药。28.如权利要求19的重构制剂，其中所迷重构制剂是等渗的。29.如权利要求19的重构制剂，其中所述制剂包含约1-400mg/mL的包含如SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57中所述的序列或与其至少90%—致的序列的RAGE融合蛋白、约1mM至约lOOmM组氨酸緩沖剂、约60mM至约65mM蔗糖、约0.001%至约0.05%Tween80及约6.0至6.5的pH值。30.如权利要求19的重构制剂，其中所述制剂包含约40-50mg/mL的包含如SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57中所述的序列或与其至少90%—致的序列的RAGE融合蛋白、约lOmM组氨酸、约65mM蔗糖、约0.01%Tween80及约6.0的pH值。31.如权利要求19的重构制剂，其中所述制剂在40'C下1周后展示少于5%的分解。32.如权利要求19的重构制剂，其中重构后少于约10%的所述RAGE融合蛋白以聚集体形式存在于所述制剂中。33.如权利要求19的重构制剂，其中所述RAGE融合蛋白的冻干制剂包含冻干保护剂。34.如权利要求33的重构制剂，其中所述冻干保护剂包含非还原性糖。35.如权利要求34的重构制剂，其中所述非还原性糖包含蔗糖、甘露糖醇或海藻糖的至少一种。36.如权利要求19的重构制剂，其中所述RAGE融合蛋白的冻干制剂包含緩冲剂、表面活性剂、螯合剂或膨化剂的至少一种。37.—种制品，其包含保存冻干RAGE融合蛋白的容器及用稀释剂重构所述冻干制剂的说明。38.如权利要求37的制品，其中所述RAGE融合蛋白包含RAGE多肽，所述RAGE多肽直接连接于包含免疫球蛋白的CH2结构域或免疫球蛋白的CH2结构域的部分的多肽。39.如权利要求38的制品，其中所述RAGE多肽包含连接于RAGE免疫球蛋白域的RAGE域间连接子，以便所述RAGE免疫球蛋白域的C接子的C末端氨基酸直接连接于包含免疫球蛋白的CH2结构域或其部分的多肽的N末端氨基酸。40.如权利要求38的制品，其中所述RAGE融合蛋白包含连接于第二RAGE免疫球蛋白域及第二RAGE域间连接子的第一RAGE免疫球蛋白域及第一RAGE域间连接子，以便所述第一域间连接子的N末端氨基酸连接于所述第一RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸，所述第二RAGE免疫球蛋白域的N末端氨基酸连接于所述第一域间连接子的C末端氨基酸，所述第二域间连接子的N末端氨基酸连接于所述笫二RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸，且所述RAGE第二域间连接子的C末端氨基的N末端氨基酸。41.如权利要求38的制品，其中所述RAGE多肽包含RAGE配体结合位点，所述RAGE配体结合位点包含如SEQIDNO:10中所述的氨基酸序列或与其至少90%—致的序列，或如SEQIDNO:47中所述的氨基酸序列或与其至少90%—致的序列。42.如权利要求37的制品，其中所述RAGE融合蛋白包含如SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57的至少一个中所述的氨基酸序列或与其至少90%—致的序列。43.如权利要求42的制品，其中与SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57至少90%—致的序列包含无C末端赖氨酸的SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57的多肽。44.如权利要求37的制品，其中所述稀释剂包含用于注射的水(WFI)。45.如权利要求37的制品，其中所述重构制剂适于皮下或肌肉内给药。46.如权利要求37的制品，其中所述重构制剂是等渗的。47.如权利要求37的制品，其中根据所述说明重构后，所述制剂包含约1-400mg/mL的包含如SEQIDNO:32、33、34、35、36、`37、56或57中所述的序列或与其至少90°/。一致的序列的RAGE融合蛋白、约1mM至约100mM组氨酸緩冲剂、约60mM至约65mM庶糖、约0.001%至约0.05%Tween80及约6.0至6.5的pH值。48.如权利要求37的制品，其中重构后所述制剂包含约40-50mg/mL的包含如SEQIDNO:32、33、34、56、35、36、37、56或57中所述的序列或与其至少90%—致的序列的RAGE融合蛋白、约10mM组氨酸、约65mM蔗糖、约O.01%Tween80及约6.0的pH值。49.如权利要求37的制品，其中所述说明用于重构所述冻干制剂，以便所述重构制剂中RAGE融合蛋白浓度在约40mg/mL至约100mg/mL的范围内。50.如权利要求37的制品，其中所述冻千制剂是无菌的。51.如权利要求37的制品，其进一步包含保存用于重构所述冻干制剂的稀释剂的第二容器，其中所述稀释剂为用于注射的水(WFI)。52.如权利要求37的制品，其中根据所述说明重构后，所述制剂在^'C下1周后展示少于5%的分解。53.如权利要求37的制品，其中重构后少于约10。/。的所述RAGE融合蛋白以聚集体形式存在于所述制剂中。54.如权利要求37的制品，其中所述冻干RAGE融合蛋白包含冻干保护剂。55.如权利要求54的制品，其中所述冻干保护剂包含非还原性糖。56.如权利要求54的制品，其中所述非还原性糖包含蔗糖、甘露糖醇或海藻糖的至少一种。57.如权利要求37的制品，其中所述冻干RAGE融合蛋白包含緩冲剂、表面活性剂、螯合剂或膨化剂的至少一种。58.—种制备RAGE融合蛋白的稳定重构制剂的方法，其包含在稀释剂中重构所述RAGE融合蛋白与冻干保护剂的冻干混合物以便所述重构制剂中RAGE融合蛋白浓度在约1mg/mL至约400mg/mL的范围内。59.如权利要求58的方法，其中所述RAGE融合蛋白包含RAGE多肽，所述RAGE多肽直接连接于包含免疫球蛋白的CH2结构域或免疫球蛋白的CH2结构域的部分的多肽。60.如权利要求58的方法，其中所述冻干保护剂包含非还原性糖。61.如权利要求58的方法，其中所述冻干保护剂包含蔗糖、甘露糖醇或海藻糖的至少一种。62.如权利要求58的方法，其中所述冻干混合物进一步包含緩冲剂、表面活性剂、螯合剂或膨化剂的至少一种。63.如权利要求58的方法，其中所述RAGE融合蛋白包含如SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57的至少一个中所述的氨基酸序列或与其至少90%—致的序列。64.如权利要求63的方法，其中与SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57至少90%—致的序列包含无C末端赖氨酸的SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57的多肽。65.如权利要求58的方法，其中所述重构制剂包含约40-100mg/mL的包含如SEQIDN0:32、33、34、35、36、37、56或57中所述的序列的RAGE融合蛋白、约2mM至约60mM组氨酸、约60mM至约65mM蔗糖、约0.001°/。至约0.05%Tween80及约6.0至6.5的pH值。66.如权利要求58的方法，其进一步包含通过冻干包含RAGE融合蛋白与冻干保护量的冻干保护剂的混合物来制备所述冻干RAGE融合蛋白。67.—种治疗受试者的RAGE介导的病症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的包含RAGE融合蛋白、冻干保护剂及緩沖剂的重构制剂。68.如权利要求67的方法，其中所述冻干保护剂包含非还原性糖。69.如权利要求68的方法，其中所述非还原性糖包含蔗糖、甘露糖醇或海藻糖。70.如权利要求67的方法，其中所述緩冲剂包含组氨酸。71.如权利要求67的方法，其中所述RAGE融合蛋白包含RAGE多肽，所述RAGE多肽直接连接于包含免疫球蛋白的CH2结构域或免疫球蛋白的CH2结构域的部分的多肽。72.如权利要求71的方法，其中所述RAGE多肽包含连接于RAGE免疫球蛋白域的RAGE域间连接子，以便所述RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸连接于所述域间连接子的N末端氨基酸，且所述RAGE域间连接子的C末端氨基酸直接连接于包含免疫球蛋白的CH2结构域或其部分的多肽的N末端氨基酸。73.如权利要求71的方法，其中所述RAGE融合蛋白包含连接于第二RAGE免疫球蛋白域及第二RAGE域间连接子的第一RAGE免疫球蛋白域及第一RAGE域间连接子，以便所述第一域间连接子的N末端氨基酸连接于所述第一RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸，所述第二RAGE免疫球蛋白域的N末端氨基酸连接于所述第一域间连接子的C末端氨基酸，所述第二域间连接子的N末端氨基酸连接于所述第二RAGE免疫球蛋白域的C末端氨基酸，且所述RAGE第二域间连接子的C末端氨基的N末端氨基酸。74.如权利要求71的方法，其中所述RAGE多肽包含如SEQIDNO:10中所述的氨基酸序列或与其至少90%—致的序列，或如SEQIDNO:47中所述的氨基酸序列或与其至少90%—致的序列。75.如权利要求67的方法，其中所述RAGE融合蛋白包含如SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57的至少一个中所述的氨基酸序列或与其至少90%—致的序列。76.如权利要求75的方法，其中与SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57至少90%—致的序列包含无C末端赖氨酸的SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57的多肽。77.如权利要求67的方法，其中所述RAGE融合蛋白制剂进一步包含表面活性剂、螯合剂或膨化剂的至少一种。78.如权利要求67的方法，其中所述RAGE融合蛋白制剂在40X:下1周后展示少于5%的分解。79.如权利要求67的方法，其中少于约10°/。的所述RAGE融合蛋白以聚集体形式存在于所述RAGE融合蛋白制剂中。80.如权利要求67的方法，其包括对所述受试者的所述RAGE融合蛋白制剂的静脉内、腹膜内或皮下施用中的至少一种。81.如权利要求67的方法，其中所述重构RAGE融合蛋白制剂包含约40-100mg/mL的包含如SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57中所述的序列的RAGE融合蛋白、约2mM至约50mM组氨酸、约60mM至约65mM篇糖、约0.001°/。至约0.05%Tween80及约6.0至6.5的pH值。82.如权利要求67的方法，其中所述重构RAGE融合蛋白制剂包含约40-50mg/mL的包含如SEQIDNO:32、33、34、35、36、37、56或57中所述的序列的RAGE融合蛋白、约10mM组氨酸、约65mM庶糖、约0.01%Tween80及约6.0的pH值。83.如权利要求67的方法，其中所述重构RAGE融合蛋白制剂用于治疗糖尿病症状或糖尿病晚期并发症的症状。84.如权利要求83的方法，其中糖尿病或糖尿病晚期并发症的症状包含糖尿病性肾病、糖尿病性#见网膜病、糖尿病性足部溃疡、心血管并发症或糖尿病性神经病变的至少一种。85.如权利要求67的方法，其中所述重构RAGE融合蛋白制剂用于治疗淀粉状蛋白病、阿兹海默氏病、癌症、肾衰竭或与自身免疫相关的炎症、炎性肠病、类风湿性关节炎、牛皮瓣、多发性硬化症、缺氧、中风、心脏病发作、失血性休克、脓毒病、器官移植或伤口愈合不良的至少一种。86.如权利要求67的方法，其中所述重构RAGE融合蛋白制剂用于治疗骨质疏松症。87.如权利要求86的方法，其中所述方法包括增加受试者骨密度或减緩受试者骨密度下降的速率。88.如权利要求85的方法，其中所述自身免疫包含皮肤细胞、胰腺细胞、神经细胞、肌肉细胞、内皮细胞、心脏细胞、肝细胞、肾细胞、心脏、骨髓细胞、骨、血细胞、动脉细胞、静脉细胞、软骨细胞、甲状腺细胞或干细胞的至少一种的排斥反应。89.如权利要求67的方法，其中所述重构RAGE融合蛋白制剂用于治疗肾衰竭。90.如权利要求67的方法，其中所述重构RAGE融合蛋白制剂用于治疗与器官、组织或多个细胞的至少一种从第一位点移植至第二位点相关的炎症和/或排斥反应。91.如权利要求90的方法，其中所述第一位点及所述第二位点在不同受试者体内。92.如权利要求90的方法，其中所述第一位点及所述第二位点在同一受试者体内。93.如权利要求90的方法，其中所述移植的细胞、组织或器官包含胰腺、皮肤、肝、肾、心脏、骨髓、血液、骨、肌肉、动脉、静脉、软骨、曱状腺、神经系统的细胞、组织或器官，或者干细胞。全文摘要本发明公开包含连接于第二非RAGE多肽的RAGE多肽序列的RAGE融合蛋白。RAGE融合蛋白可利用包含RAGE配体结合位点及直接连接于免疫球蛋白C<sub>H</sub>2结构域的N末端的域间连接子的RAGE多肽域。本发明还公开RAGE融合蛋白制剂及RAGE融合蛋白及RAGE融合蛋白制剂用作RAGE介导的病变的治疗剂的用途。文档编号C12N15/13GK101548012SQ200780018207公开日2009年9月30日申请日期2007年4月25日优先权日2006年5月5日发明者A·M·M·米贾里,E·J·本杰明,J·C·韦伯斯特,R·罗思莱因,Y·E·田申请人:转化技术制药公司