专利名称：：编码青霉素酰化酶的dna序列，携带该序列的新型重组dna结构及重组微生物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种编码青霉素酰化酶的DNA序列，携带该序列的新型重组DNA结构及重组微生物。
背景技术：
：青霉素酰化酶(E.C.3.5.1.11，青霉素酰胺水解酶)是由细菌、放线菌、真菌和酵母产生的。这些重要的工业酶根据其底物特异性可以分为三种青霉素G酰化酶(PGA)，青霉素V酰化酶(PVA)和a-氨基酸水解酶(AEH，也称氨苄青霉素酰化酶)。PGA类酶具有广泛的底物特异性，能催化青霉素和头孢菌素的氨键水解。PGA的细菌产物属于下述类别中的一种气单胞菌，无色杆菌，产碱菌，节杆菌，芽孢杆菌，棒状杆菌，大肠杆菌，欧文氏菌，黄杆菌，克吕沃尔菌，微球菌，诺卡氏菌，变形杆菌，普罗威登斯菌，假单胞菌，八叠球菌，黄单胞菌，木质部小菌属(ProcessBiochem.24:146—154，1989，ProcessBiochem.27:131—143,1992，Biotechnol.Adv.18:289-301，2000)除了由变异获得的能表达PGA的高产菌株之外，还可以从大肠杆菌(CS244343和CS246957)，产碱菌属或粪产碱菌属(CurrentMicrobiology39:2444-2448,1999;EP638649，Appl.Environ.Microbiol.63:3412-3418:1997)，粘节杆菌Appl.Environ.Microbiol.54:2603-2607，1988a55:1351-1356，1989;Gene143:79-83,1994)，巨大芽孢杆菌(J.Bacteriol.93:302-306，1967，Appl.Microbiol.Biotechnol.25:372-378，1987;US3145395;ProcessBiochemistry29:263-270,1994)，嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌(Agric.Biol.Chem.39:1225-1232，1975;Gene49:69-80，Biotechnol.Letters14:285-290，1992)，雷氏普罗威登斯菌(ActaBiochim.Polonica28:275-284，1981;J.Bacteriol.168:431-433,1986;DNAsequences3:195-200，1992)也可以产生具有重组质粒的重组微生物，其中重组质粒中含有可以编码PGA的结构基因。大多数产PGA的原核生物为革兰氏阴性菌，而酶是在细胞的外周胞质中。在巨大芽孢杆菌的培养中，酶是从细胞中分泌到培养基中。青霉素G酰化酶在工业上主要用于水解头孢菌素的苯乙酰衍生物，而青霉素G用于生产中间产物6-APA和7-ADCA。现在，合成反应中也会用到这些酶，在上述中间产物的酰基化中用来生产半合成抗生素(e.g.，US5753458andUS5801Oil;WO98/04732;WO97/04086;EnzymeMicrob.Technol.25:336—343，1999;SynthesisofP-lactamantibiotics:Chemistry,BiocatalysisandProcessIntegration,Ed.:A.Bruggink,KluwerAcademicPublishers,Dordrecht/Boston/London,2001)。酶是稳定地固定或封闭形成一种酶催化剂从而使PGA可以在酶催化反应中反复、长期的使用。这样，酶就能并在反应条件下显现较高的pH稳定性、温度稳定性和较长的半衰期。
发明内容本发明的目的是提供一种长度为2646bp的核苷酸序列，该核苷酸序列与图5所示的核苷酸序列至少有95%相同。本发明的另一个目的是进一步提供本发明的核苷酸序列的片断，至少由150个核苷酸组成的该序列片断用于编码青霉素酰化酶。本发明还有一个目的是提供一种含有本发明的核苷酸序列或核苷酸序列片断的核酸结构，它至少具有一个调控序列，用于调控基因表达和多肽的产生，所述的多肽具有青霉素酰化酶活性。本发明的另一个目的是提供一种重组质粒，它含有本发明的核苷酸序列或核苷酸序列片断。本发明还有一个目的是提供一种重组表达载体，它含有本发明的核酸结构、启动子、转译启动信号和转译转录终止信号。本发明另一个目的是提供一种宿主细胞，它含有本发明的核酸结构。在该宿主细胞中，本发明的重组表达载休携带了该核酸结构或该核酸结构被插入到该细胞基因组中。本发明还有一个目的是提供重组质粒pKXIPl，pKLP3和沐LP6，它们是从无色杆菌属菌种中分离出来的，并插入了本发明的核苷酸序列，其限制性内切酶图谱如图1和图2所示。本发明还有一个目的是提供一种大肠杆菌菌种BL21,它含有由质粒pKXIPl，pKLP3和pKLP6携带的本发明的序列。本发明的基础是长度为2646bp的核苷酸序列，该核苷酸序列与图5所示的核苷酸序列相同，然后长度至少为150个碱基的含有该序列的片断用于编码青霉素酰化酶。所述的序列可以成为DNA结构，重组质粒和载体的一部分。所述的序列可以通过合适的载体被插入到一个细菌或酵母宿主的基因组中，这样该细菌或酵母宿主就可以产生青霉素酰化酶了。本发明的一个实施例是含有重组质粒PKX1P1的大肠杆菌菌种BL21(pKXlPl)(CCM7394)，它是基于最新分离出的，具有青霉素酰化酶活性的结构基因的核苷酸序列制备的。所述的质粒特征是将长度为2646bp的DNA片断(含有SD序列的区域)插入到质粒载体pK19(R.D.Pridmore，Gene56:309-312，1987)中，其限制性内切酶图谱如图1所示。制备该重组微生物包括将染色体DNA从无色杆菌属菌种CCM4824(古生睾酮丛毛单胞菌子CCM4824;Plhackovaetal.,Appl.Microbiol.Biotechnol.62:507-516，2003)中分离出来，然后制备携带了一个5.lkb长的染色体DNA片断的重组微生物大肠杆菌T0P10(pKLP3)。用质粒pKLP3的DNA，通过PCR技术(聚合酶链式反应)获得结构基因/^a的核苷酸序列。根据已测定的基因NT序列，提出了可以测定基因完整核苷酸序列的DNA引物(表1)，引物包括具有通过了相同的PCR-测序技术的SD序列的调控区。在完整核苷酸序列的基础上，提出了用于青霉素酰化酶中整个结构基因的PCR扩增引物(PCR;W.Rychlik:MethodsinMolecularBiology15，3卜39，1993)。以无色杆菌属菌种CCM4824的染色体DNA为模板。分离获得的PCR产物并插入到多拷贝质粒pK19(R.D.Pridmore，Gene:309-312,1987)中，获得的重组质粒用于宿主菌株大肠杆菌T0P10(Invitrogen，USA.)的转化。H.Hanahan，J.Mol.Biol.166:557-580,1983中公开了使用一组重组质粒制备感受态细胞和转化宿主菌种。使用碱裂解法(HC.BirnboimaJ.Doly:MethodsinEnzymology100,243-254，1983)可以将重组质粒从生长后的菌落中分离出来，并确定插入片断的大小和位置。在所选择的宿主T0P10的重组克隆中，采用LB培养基分批培养来测试青霉素酰化酶的酶活。将从菌种中分离出来的，具有最高的PGA整个活性的重组质粒被命名为pKXIPl。这种质粒结构中可以基本表达p狩基因。宿主菌种BL21随后被该质粒转化。在一个搅拌式生物反应罐中培养已获得的携带有质粒PKXIP1，并产生青霉素酰化酶的重组菌种大肠杆菌。最优选的过程是在矿物培养基M9中培养菌种，其中培养基中加入了酪蛋白水解产物和甘油作为碳源及能量来源。补料分批培养的温度为20-30'C，而pH值保持在5.5-7.5之间，培养基中的氧溶解浓度为10-40%。图1是重组质粒PKXIP1的限制性内切酶图谱。图2是质粒pKAG&i/401，pKLP3andpKLP6。图3是搅拌式生物反应罐中菌种BL21(pKXIPl)分批培养时，培养光密度(0D600)变化和细胞(干燥)干重的变化。图4是搅拌式生物反应罐中菌种BL21(pKXlPl)分批培养时，总活性(TA)和特异性活性(SA)的变化。图5是结构基因P^9及其相邻区域的核苷酸序列。例1Asp.的培养及染色体DNA的分离将从土壤中分离出来的无色杆菌属CCM4824(Skrobetal.，EnzymeMicrobiol.Technol.32:738-744，2003;Plhackovaetal.,Appl.Microbiol.Biotechnol.62:507-516，2003)培养在50ml的LB培养基(其中，蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl5g/l;pH7.2-7。5)中，37。C下震荡(200rpm)12-16小时。用离心法将2ml培养基中的生物量从培养基中分离出来，再用盐水洗涤，-2(TC下储存。使用商用组GENOMIOTIP100/G(Qiagen，Switzerland)和适宜的缓冲液套装GENOMICBUFFERSET(Qiagen)将染色体DNA从解冻后的生物量中分离出来。例2重组DNA技术所有限制性内切酶(Fermentas，Lithuania)裂解DNA的方法，加入了TBE缓冲液的1.09&琼脂糖凝胶(USB，U.S.A.)中对DNA分子的分析，T4DNA连接酶的连接都是根据标准实验方案(J.Sambrook，1989)进行的。PCR反应和DNA测序中使用的引物(表1)由MWG-BiotechAG(Germany)和Metabion(Germany)联合组成。使用热循环仪PTC-200(MJ-Research,Inc.,U.S.A.)进行PCR反应，所有反应都在GC-RICH溶液(ROCHE,Switzerland)中，加入了AraSuperYieldDNA聚合酶进行的。加入了TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶中测定PCR技术中产物的大小，其中抗菌素入被限制性核酸内切酶裂解的DNA作为分子重量标准。按照其使用说明使用QIAEXIIGelExtractionKit(Qiagen,Germany)将需要进一步克隆或测序的PCR特异性产物从琼脂糖凝胶中分离出来。按照其使用说明使用HighPurePCRProductPurificationKit(ROCHE,Switzerland)，纯化单一的DNA片断。根据J.Hanahan，Mol.Biol.166:557-580，1983制备感受态细胞并转化宿主菌种，其中感受态细胞被携带了预定PCR片断的质粒转化，然后在37t:下，添加了卡那霉素抗生素(Km，50"g/ml)的固体培养基Luria-Bertani(LB，其中，蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl5g/1;pH7.2-7.5)中培养16h，然后加入到50ml添加了Km的液体LB培养基中置于震荡摇床Gallenkamp上(200rpm)培养。接着根据使用说明使用QiagenPlasraidMidiKit(Qiagen,Germany)禾口HighPurePlasmidIsolationKit(ROCHE,Switzerland)分离重组质粒，以便后面的分析。所有的NTDNA序列的测定都是根据微生物ASCR研究自动地于3100DNA序列(Perkin-Elmer,U.S.A.)之上的。用软件Lasergene(DNASTARInc.，U.S.A.)分析获得的序列。使用软件BLAST(NationalCenterforBiotechnologyInformation,U.S.A.;S.F.Altschuletal:NucleicAcidsRes.25:3389-3402，1997)检测NT序列的同源性。表lDNA引物及它们在pga基因中的位置<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>例3pga基因核苷酸序列的测定及表达系统的制备无色杆菌属菌种CCM4824的染色体DNA被酶5"a"3Al部分裂解。这些DNA片断被与载体pK19的^/m-线性化质粒DNA连接(RD.Pridmore:Gene56,309-312，1987)。所得到的结构随后被用于转化宿主菌种大肠杆菌TOPIO。从显现为青霉素酰化酶显型(PGA+)的大肠杆菌重组菌种中分离出来的质粒pKAG&"401(图2)被P"I所限制。5.lkb的最大PWI片断，随后被克隆入P"I-线性化载体pK19，形成具有相反的P"I-插入方向的pKLP3和pKLP6(图2)2种结构。重组菌种大肠杆菌T0P10(pKLP3)和大肠杆菌TOP10(pKLP6)均具有显型PGA+。被分离的引物PKLP3和pKLP6作为模板用于获得/^s基因的完整核苷酸序列，其中引物包括常用的M13/pUC序列弓I物及随后衍生的p辟严格特异性引物(引物列表-见表1)。该结构基因P《s的核苷酸序列具有2592个核苷酸(包括三联体终止子TAA)，并与相关微生物木糖氧化物色杆菌木糖氧化亚种(GenBankAF490005)的核苷酸63-2592有92%的相同性。因此基于所获得的具有调控区的/^s基因核苷酸序列，以无色杆菌属菌种CCM4824的染色体DNA为模板，用引物对/^a结构基因进行PCR扩增。PCR反应中使用的引物UPACYLJ力al和REVACYL尸Wl均在相邻区域到;^a结构基因间插入了限制性位点ibal，resp.Atl(表l)，该反应包括以下步骤1)94。C下5分钟；2)94。C下变性45秒，30个循环，60。C下结合引物45秒，72"C下聚合3分钟；3)72匸下10分钟，完成聚合。这样就制成了2663bp长的特异性PCR产物，该产物携带了具有上述SD序列调控区的整个结构基因；ga。这个pga特异性PCR产物被限制性内切酶ibal(耙序列在UPACYLJfoal引物上)裂解，随后连接到载体pK19上，再被北al和6ksl两种多聚接头酶裂解。所获得的重组结构即为pKXIPl质粒(图1)。对该质粒的DNA序列进行分析后发现，在PCR产物的插入中，没有发生插入缺失突变，但是与原来预计的核苷酸序列相比，发现在结构基因/^a的第99个核苷酸上的C-T有突变。然而，这种突变是隐性的，因为它并不改变三联体编码的氨基酸类型。使用所分离出来的重组质粒沐LP6和pKXIPl及原核表达系统BL21(pKXlPl)转化原养型宿主菌种大肠杆菌BL21(Invitrogen公司，美国)，从而制备PGA。例4/^a在大肠杆菌中的表达制备用于培养大肠杆菌BL21(pKXIPl)菌种的接种体将-7(TC下，甘油保藏的菌种(按照J.Sambrook，1989的向生长后的培养物中混入甘油)接种至50ml，加入了卡那霉素(Km，50"g/ml)的LB培养基中。该接种体在28-C下，摇床Gallenkamp震荡(200rpm)培养16小时。生物反应罐中的发酵在搅拌式生物反应罐BiostatMD(B.BraunBiotechIntl.,Melsungen,Germany)中，使用添加了甘油(5-25g/l)和酪蛋白的水解产物(5-25g/l)作为碳源和能量来源的培养基M9(表2)，严格控制条件培养菌种BL21(pKXIPl):工作体积8.21，空气流入速度8-91/分钟，初始搅拌速率200-300rpm，温度控制在20-28°C。培养基的pH控制在7.5-5.5之间，将搅拌速率控制在200-840rpm之间，使氧溶解浓度(p02)自动地保持在5-30%的培养基最大氧饱和度。分批补料培养20-25小时(图3和4)。最后测定下述参数青霉素酶的生物量浓度(细胞干重，cdw)，总活性(TA)和特异性活性(SA)。测定的参数如下生物量浓度培养基的28gcdw/1总活性培养基的18000U/1特异性活性670U/gcdw酶活性的测定从实例的培养产物中取l-2ml体积的培养物来测定PGA酶活性。离心过滤分离生物量，然后用1-2ml蒸馏水洗涤，再进行离心过滤，-2(TC下储存。解冻后的生物量悬浮在0.005M磷酸盐缓冲液中(pH8.0)。37-C下，以青霉素G作为酶作用物，用滴定法测定PGA的活性。表2培养基M9的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>工业应用含有本发明的核苷酸序列的微生物重组菌种可以用于制备各种应用在化学及制药工业领域的青霉素酰化酶。权利要求1.一种长度为2646bp的核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列与图5所示的核苷酸序列至少有95％相同。2.如权利要求1所述的核苷酸序列的片断，其特征在于至少由150个核苷酸组成的该序列片断用于编码青霉素酰化酶。3.—种含有如权利要求1所述的核苷酸序列或如权利要求2所述的核苷酸序列片断的核酸结构，其特征在于它至少具有一个调控序列，用于调控基因表达和多肽的产生，所述的多肽具有青霉素酰化酶活性。4.一种重组质粒，其特征在于它含有如权利要求1所述的核苷酸序列或如权利要求2所述的核苷酸序列片断。5.—种重组表达载体，其特征在于它含有如权利要求3所述的结构、启动子、'转译启动信号和转译转录终止信号。6.—种宿主细胞，其特征在于它含有如权利要求3所述的核酸结构。7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于如权利要求5所述的重组表达载体携带了该宿主细胞中的核酸结构。8.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于细胞基因组中含有所述的核酸结构。9.重组质粒pKXIPl，pKLP3和pKLP6，其特征在于它们是从无色杆菌属菌种中分离出来的，并插入了如权利要求l所述的核苷酸序列，其限制性内切酶图谱如图l和图2所示。10.—种大肠杆菌菌种BL21，其特征在于含有由如权利要求9所述的质粒pKXIPl，pKLP3和pKLP6携带的如权利要求1所述的序列。全文摘要本发明包括一种长度为2646bp的核苷酸序列，其中从无色杆菌属CCM4824(古生睾酮丛毛单胞菌子CCM4824)中得到的该核苷酸序列具有编码青霉素酰化酶的核苷酸序列的特征，最终该序列片断至少由150个核苷酸组成。该序列可用于形成一种DNA结构，最后得到的结构至少有一个调控序列来调控基因表达和具有青霉素酰化酶活性的多肽的产生。该序列可以成为一个含有上述结构、启动子、转译启动信号和转译转录终止信号的重组表达载体的一部分。此外，本发明还涉及一种重组宿主细胞，含有被载体携带或细胞基因组中的核酸，以及一种大肠杆菌菌种BL21，它含有质粒pKXIP1，pKLP3和pKLP6携带的，可以编码青霉素酰化酶的核苷酸序列。文档编号C12N15/55GK101563459SQ200780032936公开日2009年10月21日申请日期2007年5月15日优先权日2007年1月31日发明者D·阿奴巴玛,J·马萨雷克,K·普拉科瓦,L·哈罗诺华,P·肯斯利克,S·贝卡,V·斯特帕尼克,W·R·维亚萨蕊亚妮申请人:酵素生物技术有限公司;微生物研究所