蛋白酶筛选方法及由此鉴别的蛋白酶的制作方法

专利名称：：蛋白酶筛选方法及由此鉴别的蛋白酶的制作方法蛋白酶筛选方法及由此鉴别的蛋白酶相关申请要求EdwinMadison2006年7月5日提交的名称为"ProteaseScreeningMethodsandProteasesIdentifiedThereby"的美国临时申请系列号No,60/818,804以及EdwinMadison2006年7月5日提交的名称为"ModifiedUrinary-PlasminogenActivator(u-PA)Proteases"的优先木又。当允许时，上述申请的主题以其全文引入本文。本申请与EdwinMadison2007年7月5日提交的名称为"ProteaseScreeningMethodsandProteasesIdentifiedThereby"的美国申请系歹U号11/825,627相关，其要求美国临时申请系列号60/818,804和美国临时申请系列号60/818,910的优先权。本申请还与JNguyen,CThanos，SWaugh画Ruggles,和CCraik2003年10月2曰提交的名称为"MethodsofGeneratingandScreeningforProteasesw池AlteredSpecificity"的美国申请系列号10/677,977并在2004年7月29日公幵为美国申请号US-2004-0146938相关以及与2004年4月15日公开的相应公开的国际PCT申请号WO2004/031733相关，其要求2002年10月2日提交的美国临时申请系列号60/415,388的优先权。本申请还与JNguyen和SWaugh-Ruggles2005年4月2日提交的名称为"CleavageofVEGFandVEGFReceptorbyWild-TypeandMutantMTSP-1"的美国申请系列号11/104,110并在2006年1月5日公开为美国申请号US-2006-0002916相关，以及与2005年11月24日公开的相应公开的国际PCT申请号WO2005/110453相关，其要求2004年4月12日提交的美国临时申请系列号60/561,720的优先权。本申请还与JNguyen和SWaugh-Ruggles2005年4月12日提交的名称为"CleavageofVEGFandVEGFReceptorbyWild-TypeandMutantProteases"的美国申请系列号11/104,111并在2006年2月2日公开为美国申请号US-2006-0024289相关，以及与2005年10月27日公开的相应公开的国际PCT申请号WO2005/100556相关，其要求2004年4月12日提交的美国临时申请系列号60/561,671的优先权。本申请还与EdwinL.Madison2005年10月21日提交的名称为"ModifiedProteasesthatInhibitComplementActivation"的美国临时申请系列号60/729,817相关。本申请还与EdwinL.Madison,JackNguyen,SandraWaughRuggles和ChristopherThanos2006年10月20日提交的美国申请系列号11/584,776相关，以及与2007年4月26日公开的相应公开的国际PCT申请号WO2007/047995相关，其各自要求美国临时申请号60/729,817的优先权。当允许时，上述相关申请的主题以其全文引入本文。在CD盘上的序列表的引用CD-R上电子形式的序列表在此提交4个拷贝(标为COPY1,COPY2，COPY3，和CRF)，它们的内容以其全文引入本文。每个上述CD盘的计算机可读文件在2007年7月5日创建，是相同的，大小为1809千比特，名称为4902SEQ.PCl.txt.发明领域本发明提供了鉴别具有修饰的底物特异性或者其它性质的修饰的蛋白酶的方法。所述方法通过将候选物和修饰的蛋白酶与底物接触而进行筛选，所述底物在底物裂解时捕获所述候选物和修饰的蛋白酶。背景蛋白酶是降解蛋白质的酶。由于蛋白酶可以与靶蛋白特异性相互作用并且使其失活或者活化，因此已经将它们用作治疗剂。天然发生的蛋白酶通常不是最佳的治疗剂，因为其不呈现使其适于作为生物治疗剂的特异性、稳定性和/或催化活性(见例如Fernandez-GacioWa/.(2003)7&"A21:408-414)。在治疗性质之中，重要的是无免疫原性或者免疫原性降低、对于耙分子的特异性及有限的副作用。天然发生的蛋白酶通常缺乏这些性质的一种或多种。已经尝试工程化具有改良性质的蛋白酶。这些方法包括1)合理设计(rationaldesign),这需要关于蛋白酶的结构、催化机制和分子建模的信息；2)定向进化，这是包括产生蛋白酶的各种突变体库(repertoire)及选择呈现预期特性的那些突变体的方法(BertschingerWa/.(2005)in尸/zagecfop/^y/"所o欣/.朋dl)n/gZ)/助v"(Sidhus,ed)，pp.461-491)。就前者而言，缺少关于蛋白酶的结构-功能关系的信息限制了合理设计大多数蛋白酶的突变的能力。采用定向进化方法取得有限的成功。筛选改良的蛋白酶活性通常导致底物选择性丧失，反之亦然。最佳的治疗性蛋白酶应呈现对于靶底物的高度特异性和高度催化效率。由于可利用的选择具有优化的特异性和优化的活性的蛋白酶的方法的效力有限，因此仍需要开发其它蛋白质选择方法。因此，本发明的目的是提供选择具有希望的底物特异性和活性的蛋白酶或者突变体蛋白酶的方法。发明概述本发明提供了选择或鉴别具有希望的或预定的底物特异性和活性的蛋白酶或突变体蛋白酶或其催化活性部分的方法。本发明特别提供了蛋白酶筛选方法，所述方法鉴别对于靶底物具有改变的、改良的或者优化的或者其它改变的底物特异性和/或活性的蛋白酶。所述方法可用于例如筛选对于疾病或病症的病因学中涉及的靶底物具有改变的底物特异性和/或活性的蛋白酶。依靠对于耙底物的改变的、典型地增加的特异性和/或活性，在本发明的方法中鉴别或被选择的蛋白酶是在所述靶底物所参与的疾病或病症的治疗中用作试剂或治疗剂的候选物。在实施本发明的方法中，将蛋白酶或其催化活性部分的集合与蛋白酶捕获多肽接触，导致形成蛋白酶捕获多肽与所述集合中的蛋白酶或其催化活性部分的稳定复合物。在一些实例中，所述蛋白酶捕获多肽被修饰为由对于靶底物(例如参与疾病或病症的靶底物)具有预定底物特异性和/或活性的蛋白酶裂解。所述方法可进一步包括筛选所述复合物对于耙底物的裂解序列的底物特异性。在这种实例中，被鉴别或选择的蛋白酶对于靶底物具有改变的活性和/或特异性。在一个实例中，所述稳定复合物是通过被选择的蛋白酶与蛋白酶捕获多肽的共价连接而形成的。所述被选择的蛋白酶或其催化活性部分是从本发明方法提供的复合物中鉴别或选择的。本发明的方法可进一步包括从集合中未复合的蛋白酶成员中分离复合的蛋白酶的步骤。在一个实例中，对所述蛋白酶捕获多肽进行标记以进行检测和分离，所述分离是通过捕获含有可检测的蛋白酶捕获多肽和所述蛋白酶或其催化活性部分的复合物而实现。捕获可以是在悬24浮液、溶液或者固体支持物上实现。在固体支持物的捕获情况中，使所述蛋白酶捕获多肽附着于所述固体支持物，这可以在所述蛋白酶捕获多肽与所述蛋白酶或其催化活性部分集合进行接触之前、期间或随后进行。所述固体支持物可包括例如96孔平板的孔。在一些实例中，用生物素标记所述蛋白酶捕获多肽。在其它实例中，可以用His标记对所述蛋白酶捕获多肽进行标记，所述分离可以通过用金属螯合剂例如但非限于硫酸镍(NiS04)、氯化钴(CoCl2)、硫酸铜(CuS04)和氯化锌(ZnCl2)进行捕获而实现。所述金属螯合剂可以与固体支持物缀合，例如与珠如琼脂糖珠或磁珠缀合。在本发明提供的方法中，所述方法可进一步包括扩增分离的复合物中的蛋白酶或其催化活性部分的步骤。在一些实例中，分离的复合物中的蛋白酶或其催化活性部分在噬菌体上展示，扩增是通过用所述噬菌体感染宿主细胞而实现。所述宿主细胞可包括细菌，例如大肠杆菌(E.coli)。可以筛选从细菌细胞培养基、细菌周质、噬菌体上清或者纯化的蛋白质中扩增的蛋白酶的靶底物特异性和/或活性。典型地，所述靶底物是疾病或病症病因学中涉及的多肽或裂解序列。本发明还提供了多重方法，其中将蛋白酶集合与多种不同的蛋白酶捕获多肽(包括其修饰的形式)接触，对每个蛋白酶捕获多肽均进行标记，由此其可以被可鉴别地检测。在这种方法中，至少两个蛋白酶捕获多肽被可鉴别地标记，由此可以形成一个以上的稳定复合物及鉴别一种以上的蛋白酶。在本发明提供的方法中，所述方法还包括多轮筛选以优化蛋白酶选择，其中在本发明筛选方法的第一轮中鉴别或选择蛋白酶之后对其进行扩增，从而产生蛋白酶或其催化活性部分的第二个集合。将所述第二个蛋白酶集合与蛋白质捕获多肽接触产生第二组稳定复合物，所述蛋白质捕获多肽与第一种蛋白酶捕获多肽相同或不同。鉴别或选择第二组稳定复合物中的蛋白酶。在本发明提供的方法中，所述蛋白酶捕获多肽是丝氨酸蛋白酶抑制蛋白，a巨球蛋白家族的成员，或者p35家族的成员。本发明提供的方法中使用的这种多肽分子通过蛋白酶或其催化活性部分与蛋白酶捕获多肽的共价连接而形成复合物。在本发明提供的方法的一方面，鉴别了具有希望的底物特异性的蛋白25酶，通过将蛋白酶和/或蛋白酶的蛋白酶解活性部分的集合与蛋白酶捕获多肽接触，在所述蛋白酶捕获多肽裂解时形成蛋白酶捕获多肽与蛋白酶的稳定复合物。选择蛋白酶捕获多肽或其修饰形式用于所述方法中，以由具有希望的底物特异性的蛋白酶裂解。在所述方法中，鉴别了所述蛋白酶或其蛋白酶解活性部分，以选择具有希望的底物特异性的蛋白酶。本发明提供的方法中使用的蛋白酶集合是蛋白酶或其催化活性部分的任何集合，包括至少、大约或者等于5、10、50、100、103、104、105、106或更多个成员。在一些情况中，所述蛋白酶是丝氨酸和/或半胱氨酸蛋白酶。在本发明提供的方法中，蛋白酶或其催化活性部分的集合被展示以与蛋白酶捕获多肽接触。在一个实例中，所述蛋白酶或其蛋白酶解活性部分被展示在固体支持物、细胞表面或者微生物表面上。所述蛋白酶可以被展示在酵母、细菌、病毒、噬菌体、核酸、mRNA分子或者核糖体上。在蛋白酶或其蛋白酶解活性部分被展示在微生物上的情况中，所述微生物包括但非限于大肠杆菌、酿酒酵母(S.cerevisiae)，或者病毒如M13、fd或T7噬菌体或者杆状病毒。在本发明提供的方法中，蛋白酶或其蛋白酶解活性部分被展示在噬菌体展示文库上，所述蛋白酶集合是蛋白酶噬菌体展示文库。在一些实施方案中，蛋白酶例如通过被展示为全长蛋白酶的蛋白酶解活性部分而提供在所述集合中。在一些实例中，蛋白酶集合与蛋白酶捕获多肽的接触是在同质混合物中进行。本发明提供了蛋白酶选择方法，其中将至少两种不同的蛋白酶捕获多肽与所述集合接触，但是只有一种蛋白酶捕获多肽是可检测地标记的。所述可检测地标记的蛋白酶捕获多肽可以捕获含有所述可检测的蛋白酶捕获多肽和蛋白酶或其催化活性部分的稳定复合物。在这种方法的一些实例中，在反应中存在与可检测地标记的蛋白酶捕获多肽相比过量存在的一或多种未被可检测地标记的其它蛋白酶捕获多肽。在所述方法中，所述标记是可以检测的任何标记，例如荧光标记或者表位标记，如His标记。在其它实例中，所述可检测的标记是生物素。本发明方法中进行选择的蛋白酶的集合包括蛋白酶的任何集合。在一些实例中，所述蛋白酶是丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶。所述蛋白酶集合包括是丝氨酸蛋白酶的胰凝乳蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶家族成员或者来自半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶家族的胱天蛋白酶。所述蛋白酶包括任何蛋白酶或其催化活性部分，如表7示出。在一些实例中，所述蛋白酶或其催化活性部分是尿激酶纤溶酶原激活物(u-PA)蛋白酶、组织纤溶酶原激活物(t-PA)蛋白酶或者MT-SP1蛋白酶。一方面，本发明方法中使用的蛋白酶捕获多肽是丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、p35家族成员、oc-巨球蛋白家族成员，或者其任何修饰形式。本发明方法中使用的蛋白酶捕获多肽包括但非限于纤溶酶原抑制剂-l(PAI-l)、抗凝血酶(AT3)或者a2-巨球蛋白，或者其修饰形式。本发明方法中使用的蛋白酶捕获多肽的修饰形式包括在所述蛋白酶捕获多肽的反应位点含有氨基酸置换、缺失或者取代的那些修饰形式。在一些实例中，所述修饰是相应于靶底物的裂解序列的任一或多个氨基酸置换。所述靶底物可以是疾病或病症病因学中涉及的任何蛋白质。靶底物的例子包括但非限于VEGFR、t-PA裂解序列，或者补体蛋白。例如，靶底物包括但非限于VEGFR2或者补体蛋白C2。靶底物的裂解序列包括但非限于SEQIDNO:389、479和498所示的任何序列。在一些情况中，所述蛋白酶捕获多肽是丝氨酸蛋白酶抑制蛋白，且所述一或多个氨基酸置换是位于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的反应位点环中。所述反应位点环(reactivesiteloop,RSL)中的一或多个置换包括在P4-P2，任一或多个位置中的那些置换。本发明的方法中使用的这种丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的例子是SEQIDNO:497、499、610和611所示的任何序列。在另一实例中，所述蛋白酶捕获多肽是a2巨球蛋白且所述一或多个氨基酸置换位于所述多肽的诱饵区。在本发明方法中针对修饰的蛋白酶捕获多肽被鉴别或选择的蛋白酶可以根据与非靶底物相比对于靶底物的改变的底物特异性进行筛选或选择。在这些实例中，所述非靶底物包括相应的模板蛋白酶的底物。典型地，被鉴别或选择的蛋白酶的底物特异性增加1.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍或更多倍。本发明提供的方法包括鉴别和/或选择具有希望的底物特异性的蛋白酶的方法被重复或者进行多次的重复方法。在这种方法中，在所述方法的第一次重复或者第一轮中可以鉴别多种不同的蛋白酶。在其它实例中，在第一次重复后基于在第一轮重复中选择的被鉴别的蛋白酶产生和制备多种蛋27白酶。此外，在一些实例中，将在第一轮或重复和/或在连续轮中鉴别的被选择的蛋白酶的氨基酸序列进行比较，以鉴别热点。热点是在多轮中被认为是修饰的基因座的那些位置，如与野生型或模板蛋白酶相比在所述方法使用的修饰的蛋白酶集合中至少2、3、4、5或更多种被鉴别的蛋白酶中出现的那些位置。本发明方法中还提供了在鉴别蛋白酶之后制备第二个蛋白酶集合的步骤，其中鉴别的蛋白酶用作模板以在蛋白酶序列或其催化活性部分中产生进一步的突变，由此所述第二个集合的成员(基于)含有具有鉴别的蛋白酶的突变及其它突变的多肽；然后将所述第二个集合与用于分离第一种蛋白酶的蛋白酶捕获剂(proteasetrap)相同或不同的蛋白酶捕获多肽接触，其中所述蛋白酶捕获剂经修饰以被具有希望的底物特异性的蛋白酶裂解；从复合物集合中鉴别蛋白酶或其蛋白酶解活性部分，由此鉴别的蛋白酶与第一种鉴别的蛋白酶相比对于希望的底物具有较高的活性或特异性。所述第二个集合与鉴别的模板蛋白酶或其蛋白酶解活性部分的氨基酸序列相比可以含有随机或聚焦突变(focusedmutation)。聚焦突变包括例如热点位置，如在丝氨酸蛋白酶如u-PA中基于胰凝乳蛋白酶编号的第30、73、89和155位。在实施本发明的方法中，形成稳定复合物的反应可以通过控制一或多个参数而调节。这种参数是改变反应速率或程度或者反应效率的任何参数，例如但非限于反应时间、温度、pH、离子强度、文库浓度和蛋白酶捕获多肽浓度。反应可以在存在反应竞争剂的条件下在蛋白酶捕获多肽与蛋白酶或其蛋白酶解活性部分之间进行，从而增强鉴别的蛋白酶或其蛋白酶解活性部分的选择性。所述竞争剂包括例如血清或血浆。如人血清或人血浆，细胞或组织提取物，生物学流体如尿液或血液，纯化或部分纯化的野生型形式(或者其它修饰形式)蛋白酶捕获剂。这种竞争剂的例子是纯化或部分纯化的蛋白酶捕获多肽的野生型形式或者蛋白酶捕获多肽的一或多种特异性变体。本发明提供了进化或者选择或者鉴别对于至少两种裂解序列具有特异性/选择性和/或活性的蛋白酶或其蛋白酶解活性部分的重复方法。所述方法包括如下步骤a)将蛋白酶和/或其蛋白酶解活性部分的集合与第一种蛋白酶捕获多肽接触，在所述蛋白酶捕获多肽被所述蛋白酶或其蛋白酶解活性部分裂解时形成含有蛋白酶捕获多肽与所述集合中的蛋白酶或其催化活性部分的稳定复合物，其中所述接触是在存在竞争剂的条件下进行；b)鉴别或者选择与第一种蛋白酶捕获多肽形成复合物的蛋白酶或其蛋白酶解活性部分；c)将与第一种蛋白酶捕获多肽形成复合物的蛋白酶或其蛋白酶解活性部分与第二种蛋白酶捕获多肽在存在竞争剂的条件下接触；及d)鉴别或者选择与第一种蛋白酶捕获多肽形成复合物的蛋白酶或其蛋白酶解活性成分。所述两个裂解序列可以在一个靶底物中或者可以在两个不同的耙底物中。所述鉴别的、选择的或者进化的蛋白酶或其蛋白酶解活性部分对于一或两个不同耙底物中的至少两个不同裂解序列具有底物特异性和/或裂解活性。所述第一种和第二种蛋白酶捕获多肽可以相同或不同。典型地，本发明方法中使用的第一种和第二种蛋白酶捕获多肽是不同的，且均被修饰为由对于不同靶底物具有预定底物特异性的蛋白酶裂解。所述方法可进一步包括重复至少一次步骤a)和b)或者a)-d)，直至对于至少两个识别序列具有希望的或者预定的底物特异性和裂解活性的蛋白酶被分离。底物特异性和裂解活性与模板蛋白酶相比典型地增加。所述方法中使用的竞争剂包括所述蛋白酶捕获多肽可以与其相互作用的任何物质，其典型地具有比靶蛋白酶低的稳定性。竞争剂包括但非限于血清、血浆、人血清或人血桨、细胞或组织提取物、生物学流体如尿液或血液、纯化或部分纯化的蛋白酶捕获剂的野生型形式及蛋白酶捕获多肽的一或多种特异变体。本发明还提供了蛋白酶选择方法，包括如下步骤a)将蛋白酶或其蛋白酶解活性部分的集合与第一种蛋白酶捕获多肽接触，在所述蛋白酶捕获多肽裂解时，所述蛋白酶捕获多肽与所述集合中的任何蛋白酶或其催化活性部分形成共价复合物；b)从未复合的蛋白酶捕获多肽中分离复合的蛋白酶；c)分离或者选择或者鉴别复合的蛋白酶；d)基于被选择的蛋白酶产生蛋白酶或其蛋白酶解活性成分的第二个集合；及e)重复步骤a)-c)，将蛋白酶或其蛋白酶解活性部分的第二个集合与第二种蛋白酶捕获多肽(与第一种蛋白酶捕获多肽不同)接触形成复合物；分离所述复合物；以及分离、选择或者鉴别复合的蛋白酶。所述第一种和第二种蛋白酶捕获多肽可以被修饰为含有29两个不同的靶底物识别序列，从而被鉴别的或者选择的蛋白酶对于至少两个识别序列具有特异性和高度裂解活性。这些方法可以重复多次。在这些方法中，可以将所述蛋白酶或其蛋白酶解活性部分的集合与所述第一种和/或第二种蛋白酶捕获多肽在存在竞争剂(见上述)的条件下接触。在本发明提供的任何蛋白酶选择方法中，所述集合可含有修饰的蛋白酶。所述蛋白酶中的修饰可以是随机或定向修饰或者在多肽的靶区域中的修饰。本发明还提供了含有蛋白酶和/或其蛋白酶解活性部分及至少一种蛋白酶捕获多肽的组合。所述成分可以是单独提供或者是以混合物提供。所述蛋白酶捕获多肽包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、p35家族成员、oc-巨球蛋白家族成员，其修饰的形式及混合物。蛋白酶和/或其催化活性部分的集合可以是以溶液或者悬浮液或者固相形式提供，或者另外展示在例如固体支持物(基质材料)上或者于展示文库中，例如但非限于噬菌体展示文库，其中文库成员展示至少蛋白酶的蛋白酶解活性部分。本发明提供了含有所述组合的试剂盒。典型地，所述试剂盒含有包装的成分，及任选其它试剂和进行所述方法的说明书。本发明还提供了通过修饰选自第30、73、89和155位(基于胰凝乳蛋白酶编号)的一或多个残基而修饰丝氨酸蛋白酶如u-PA的底物特异性的方法。本发明还提供了通过本发明的方法鉴别的修饰的蛋白酶。所述修饰的蛋白酶由于鉴别的修饰而呈现改变的底物特异性和/或活性。使用所述选择方法鉴别的任何修饰可以在野生型蛋白酶、其任何等位基因或物种变体或者在所述蛋白酶的任何其它变体中产生。另外，本发明还提供了含有与野生型蛋白酶或其等位基因或物种变体具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列相同性的修饰的蛋白酶，只要本文所述方法中鉴别的修饰存在即可。这种蛋白酶是修饰的蛋白酶，包括胰凝乳蛋白酶家族中修饰的丝氨酸蛋白酶，如在选自第30、73、89和155位(基于胰凝乳蛋白酶编号)的热点位置中含有一或多个突变的尿纤溶酶原激活物(u-PA)多肽或者其催化活性片段，其中底物特异性被改变。30本发明还提供了在本发明的方法中鉴别的修饰的尿纤溶酶原激活物(U-PA)蛋白酶，其呈现对于疾病或病症的病因学中涉及的靶底物的增加的特异性和/或活性。这种靶底物包括但非限于VEGFR或者组织纤溶酶原激活物(t-PA)底物。因此，本发明还提供了裂解t-PA底物的修饰的丝氨酸蛋白酶或者其催化活性部分。特别地，这种蛋白酶是修饰的尿纤溶酶原激活物(u-PA)多肽，其中所述u-PA多肽或其催化活性部分在选自第21、24、30、39、61(A)、80、82、84、89、92、156、158、159和187位(基于胰凝乳蛋白酶编号)的位置含有一或多个修饰。本发明还提供了这种修饰的u-PA多肽或其催化活性部分，其含有选自F21V、124L、F30V、F30L、T39A、Y61(A)H、E80G、E82E、E84K、189V、K92E、K156T、T158A、V159A和K187E的一或多个突变。本发明还提供了这些修饰的u-PA多肽，其中u-PA多肽或其催化活性部分含有两或多个突变，所述突变选自F30V/Y61(a)H、F30V/K82E、F30V/K156T、F30V/K82E/V159A、F30V/K82E/T39A/V159A、F30V/K82E/T158A/V159A、F30V/Y61(a)H/K92E、F30V/K82E/V159A/E80G/I89V/K187E及F30V/K82E/V159A/E80G/E84K/I89V\K187E。本发明还提供了裂解VEGFR、特别是裂解VEGFR-2的修饰的丝氨酸蛋白酶或其催化活性部分。特别地，本发明提供了修饰的尿纤溶酶原激活物(u-PA)多肽及其催化活性部分，其中所述u-PA多肽或其催化活性部分在选自第38、72、73、75、132、133、137、138、155、160和217位的位置(基于胰凝乳蛋白酶编号)含有一或多个修饰，从而改变对于VEGFR-2或其序列的底物特异性。本发明还提供了这样的多肽，其含有选自V38D、R72G、L73A、L73P、S75P、F132L、G133D、E137G、1138T、L155P、L155V、L155M、V160A和R217C的一或多个突变。这些多肽可进一步包括在第30和/或89位(基于胰凝乳蛋白酶编号)的修饰，如选自F30I、F30T、F30L、F30V、F30G、F30M和I89V的修饰。本发明还提供了含有一或多个突变及在一些情况中含有两或多个突变的这些u-PA多肽或其催化活性部分，所述突变选自L73A/I89V、L73P、R217C、L155P、S75P/I89V/I138T、E137G、R72G/L155P、G133D、V160A、V38D、F132L/V160A、L73A/I89V/F30T、L73A/I89V/F30L、L73A/I89V/F30V、L73A/I89曹30G、L73A/I89V/L155V、31L73A/I89V/F30M、L73A/I89V/L155M、L73A/I89V/F30L/L155M和L73A/I89V/F30G/L155M。本发明还提供了修饰的u-PA多肽，其中所述u-PA多肽或其催化活性部分含有选自F301、F30T、F30G和F30M的一或多个突变。本发明还提供了通过本发明方法鉴别的修饰的MT-SP1多肽。这种修饰的多肽包括具有选自如下的一或多个氨基酸修饰的SEQIDNO:253所示MT画SP1多肽D23E、I41F、141T、L52M、Y60(g)s、T56K、H71R、F93L、簡K、F97Y、F97L、T98P、F99L、A126T、V129D、P131S、1136T、1136V、H143R、T144I、H54V、画4D、T166A、L171F、P173S、F184(a)L、Q192H、S20U、Q209L、Q221(a)L、R230W、F234L和V244G(基于胰凝乳蛋白酶编号)。在一些实例中，所述修饰是在具有SEQIDNO:505所示氨基酸序列的MT-SP1的催化活性部分中。在其它实例中，所述修饰是在MT-SP1多肽中进一步包含相应于SEQIDNO:253所示MT-SP1多肽中C122S修饰的修饰(基于胰凝乳蛋白酶编号)，例如SEQIDNO:507或517所示MT-SPl。本发明特别提供的修饰是选自I41F、F97Y、L171F和V244G的任何修饰。本发明提供的修饰的MT-SP1多肽可进一步包括相应于SEQIDNO:253所示MT-SP1多肽中Q175R或D217V的一或多个修饰。这种修饰包括选自如下的任何修饰I136T/N164D/T166A/F184(A)L/D217V、I41F、I41F/A126T/V244G、D23E/I41F/T98P/T144I、I41F/L171F/V244G、H143R/Q175R、I41F/L171F、R230W、I41F/I154V/V244G、I141F/L52M/V129D/Q221(A)L、F99L、F97Y/I136V/Q192H/S201I、H71R/P131S/D217V、D217V、T65K7F93L/F97Y/D217V、I41T/P173S/Q209L、F97L/F234L、Q175R、N95K和Y60(G)S。任何上述修饰的MT-SP1多肽呈现增加对于C2补体蛋白的特异性或者对于C2补体蛋白的活性或者这二者的修饰。本发明还提供了药物组合物，其含有修饰的蛋白酶，包括修饰的丝氨酸蛋白酶如修饰的u-PA多肽或者修饰的MT-SPl多肽。所述药物组合物含有药物可接受的赋形剂，可以根据任何合适的给药途径而加以配制，所述给药途径包括但非限于系统、口月艮、经鼻、肺部、局部(local)及表面(topical)给药途径。本发明还提供了试剂盒，所述试剂盒含有任何所述药物组合物、给予所述组合物的装置及任选包含给药说明书。本发明提供了编码修饰的蛋白酶、包括u-PA蛋白酶和MT-SPl蛋白酶及其催化活性部分的核酸分子。本发明还提供了含有所述核酸分子的载体及含有所述核酸分子或载体的细胞。本发明提供了治疗患有疾病或病症的对象的方法，所述疾病或病症例如但非限于是动脉血栓形成、静脉血栓形成和血栓栓塞、缺血性脑中风、后天凝血障碍、弥散性血管内凝血、细菌感染和牙周炎及神经系统疾病，其通过给予t-PA治疗，通过给予含有修饰的u-PA蛋白酶或其蛋白酶解部分或者编码核酸分子或者细胞的药物组合物而进行。所述方法通过给予对象核酸分子、细胞或者药物组合物而实现。本发明还提供了治疗患有由VEGFR、特别是VEGFR-2介导的疾病或病症的对象的方法。这种疾病和病症包括但非限于癌症、血管生成相关疾病、眼病如黄斑变性、炎症疾病和糖尿病，特别是糖尿病并发症如糖尿病视网膜病变。所述方法通过给予含有或者编码修饰的u-PA蛋白酶的核酸分子或者细胞或者组合物实现，所述修饰的蛋白酶与未修饰的形式相比呈现对于VEGFR-2的底物特异性，特别是增加的底物特异性。所述方法任选包括给予治疗所述疾病或病症的另一种药物，例如在所述疾病是癌症时给予抗肿瘤药物。本发明还提供了治疗患有由补体蛋白、特别是C2介导的疾病或病症的对象的方法。这种疾病或病症包括但非限于败血症、类风湿性关节炎(RA)、膜增生性肾小球肾炎(MPGN)、多发性硬化(MS)、重症肌无力(MG)、哮喘、炎症性肠病、免疫复合物(IC)介导的急性炎症性组织损伤、阿尔茨海默病(AD)、缺血-再灌注损伤，及Guillan-Barre综合征。在一些实例中，所述缺血-再灌注损伤是由于例如但非限于心肌梗塞(MI)、中风、血管成形术、冠状动脉旁路移植术、心肺转流术(CPB)和血液透析等事件或治疗而导致的。所述方法是给予含有或编码修饰的MT-SP1蛋白酶的核酸分子或者细胞或者组合物实现的，所述修饰的蛋白酶与未修饰的形式相比呈现对于C2的底物特异性，特别是增加的底物特异性。在其它实例中，所述疾病或病症由对对象进行的治疗导致。例如，所述治疗可以导致补体介导的缺血-再灌注损伤。这种治疗包括但非限于血管成形术或冠状动脉旁路移植术。在这些33实例中，在对对象进行治疗之前给予修饰的MT-SP1蛋白酶。所述修饰的MT-SP1多肽可以通过在体外、离体或者在体内与体液或者组织样品接触而给予。本发明还提供了本发明提供的方法中使用的修饰的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽。这种修饰的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽在其反应位点环中相应于第P4-P2'位的位置用靶底物的裂解序列修饰。典型地，所述靶底物参与疾病或病症的病因学。这种耙底物包括但非限于VEGFR、补体蛋白或者t-PA底物。例如，靶底物包括VEGFR2和补体蛋白C2。本发明提供的修饰的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的例子是修饰的纤溶酶原激活物抑制剂-l(PAI-l)和抗凝血酶-3(AT3)。修饰的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白例如SEQIDNO:497、499、610和611所示。附图简述图1描述了丝氨酸蛋白酶抑制蛋白对蛋白酶的抑制机制及稳定的抑制复合物的产生。在接触之后，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(I)和蛋白酶(E)最初形成非共价的Michaelis样复合物(EI)。随后是P1-P1'易断裂键的裂解及蛋白酶的催化性丝氨酸对丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的反应位点环(RSL)羰基的亲核攻击以及共价的酰基-酶中间体(Ef)的形成。动态捕获的共价抑制产物(EI+)是RSL插入、蛋白酶移位、蛋白酶活性位点变形及整体蛋白酶结构变形的结果。次要的非抑制途径释放正常的裂解产物丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(I"和反应性蛋白酶(E)。详细描述概要A.定义B.筛选蛋白酶的方法C.蛋白酶捕获多肽1.丝氨酸蛋白酶抑制蛋白结构、功能和表达2.蛋白酶催化、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的抑制机制及酰基酶中间体的形成a.丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的例子i.PAI-1ii.抗凝血酶(AT3)3.其它蛋白酶捕获多肽a.p35b.a巨球蛋白(aM)4.蛋白酶捕获多肽竞争剂5.蛋白酶捕获多肽变体D.蛋白酶l.候选蛋白酶a.蛋白酶的类别i.丝氨酸蛋白酶(a)尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)(b)组织纤溶酶原激活物(t-PA)(c)MT-SPlii.半胱氨酸蛋白酶E.进行筛选的修饰的蛋白酶和集合1.变体蛋白酶的产生a.随机诱变b.聚焦诱变(FocusedMutagenesis)2.变体蛋白酶的嵌合形式3.组合文库及其它文库a.噬菌体展示文库b.细胞表面展示文库c.其它展示文库F.接触、分离和鉴别选择的蛋白酶的方法1.重复筛选2.选择的蛋白酶的例子G.评定蛋白酶活性和特异性的方法H.产生编码蛋白酶捕获多肽(即丝氨酸蛋白酶抑制蛋白)或其变体或者蛋白酶/修饰的蛋白酶的核酸的方法l.载体和细胞2表达a.原核细胞b.酵母细胞c.昆虫细胞d.哺乳动物细胞e.植物3.纯化技术4.融合蛋白5.核苷酸序列I.选择的蛋白酶多肽的制备、配制和给予1.组合物与输送2.选择的蛋白酶的体内表达与基因治疗a.核酸的输送i.载体-附加型载体与整合载体ii.人工染色体及其它非病毒载体输送方法iii.含有核酸的细胞的脂质体及其它胶囊形式和给予b.体外及离体输送c.全身、局部和表面输送3.组合治疗4.产品和试剂盒的物品J.使用选择的蛋白酶多肽的治疗方法实例l.裂解tPA耙位的选择的uPA多肽的治疗方法实例a.血栓形成性疾病和病症i.动脉血栓形成ii.静脉血栓形成和血栓栓塞(a)缺血性脑中风iii.后天凝血障碍(a)弥散性血管内凝血(DIC)(b)细菌感染和牙周炎b.其它tPA耙位相关病症36C.诊断方法2.裂解VEGF或VEGFR靶位的选择的蛋白酶多肽的治疗方法实例a.血管生成、癌症及其它细胞周期依赖性疾病或病症b.使用裂解VEGF或VEGFR的选择的蛋白酶的组合治疗3.裂解补体蛋白靶位的选择的MT-SP1多肽的治疗方法实例a.免疫介导的炎症性疾病b.神经退行性疾病c.心血管疾病K.实施例A.定义除非特别指出，本文所用所有技术和科学术语均具有本发明所属领域技术人员熟知的相同含义。除非特别指出，本文中所列举的所有专利、专利申请、公布的申请和出版物、Genbank序列、数据库、网站及其它公布的材料均以其全部内容并入作参考。当本文的术语有多种定义时，本章中的定义起决定作用。当参考URL或其它这种标识符或地址时，应理解这种标识符可以改变并且互联网上的特定信息可以来来去去，但是通过检索互联网可以发现等价信息。其中的引用表明这种信息的可利用性和公共传播。如本文所用，"蛋白酶捕获剂"或者"蛋白酶捕获多肽"是指由蛋白酶裂解的底物，且在裂解时与所述蛋白酶形成稳定复合物，从而随着所述蛋白酶经历实际的过渡状态形成酶复合物而捕获所述蛋白酶，从而抑制蛋白酶的活性并捕获它。因此，蛋白酶捕获剂是蛋白酶的抑制剂。蛋白酶捕获剂是多肽或分子，其包括由蛋白酶裂解的氨基酸残基，由此当裂解时形成稳定复合物。所述复合物足够稳定，可以允许从未反应的捕获剂或者从与所述蛋白酶较不稳定地相互作用的捕获剂中分离所述复合物。蛋白酶捕获剂包括被所述蛋白酶裂解的合成的、修饰的或者天然发生的任何分子，当裂解时与所述蛋白酶形成复合物，使得可以从未反应的捕获剂中分离出反应的蛋白酶或复合物。这种蛋白酶捕获剂的例子是丝氨酸蛋白酶抑制蛋白，修饰的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白，呈现与丝氨酸蛋白酶抑制蛋白相似机制的分子，例如p35，及由蛋白酶裂解并且捕获蛋白酶形成稳定复合物的任何其它分子，例如0t2巨球蛋白。蛋白酶捕获剂还包括合成的多肽，其由蛋白酶(或其蛋白酶解活性部分)裂解，当裂解时与所述蛋白酶或其蛋白酶解活性部分形成稳定复合物。如本文所用，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白是指抑制蛋白酶的一组结构相关的蛋白质，当其反应位点由蛋白酶裂解时导致稳定的酰基-酶中间体形成及稳定的共价复合物中的蛋白酶的捕获。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白包括等位基因和物种变体及其它变体，只要所述丝氨酸蛋白酶抑制蛋白分子通过形成稳定的共价复合物而抑制蛋白酶。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白还包括全长丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的截短或连续的氨基酸片段，其最低限度包括至少足够的反应位点环(RSL)部分，以促进蛋白酶抑制及与所述蛋白酶的稳定的共价复合物的形成。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的实例在表2中列出和/或具有SEQIDNO:l-38任一所示的氨基酸序列、其等位基因变体或者截短部分。如本文所用，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的"突变体"或者"变体"是指含有氨基酸修饰的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白，特别是在丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的反应位点环中含有修饰。所述修饰可以是在相应于1^15-14-13....4-3-2-1-1，-2，-3，..？11，的位置一或多个氨基酸的置换、缺失或者取代。典型地，所述丝氨酸蛋白酶抑制蛋白与野生型丝氨酸蛋白酶抑制蛋白相比在反应位点环中的l、2、3、4、5、6、7、8、9、IO或更多个氨基酸位置上含有氨基酸置换。最通常地，所述置换是在相应于P4-P2'位置的一或多个氨基酸上。例如，SEQIDNO:ll所示的PAI-l丝氨酸蛋白酶抑制蛋白，相应于SEQIDNO:11第366-370氨基酸位置的P4-P1'位置(VSARM)可以被修饰。实施例1描述了VSARM氨基酸残基被修饰为RRVRM或PFGRS。如本文所用，"易断裂的键"是指被蛋白酶裂解的多肽中的键，表示在底物的裂解序列中P1-P1'位置之间形成的键。如本文所用，反应位点是指由蛋白酶裂解的那部分靶底物序列。典型地，反应位点包括P1-P1'易断裂键序列。如本文所用，反应位点环(RSL，也称作反应中心环RCL)是指丝氨酸蛋白酶抑制蛋白分子中的氨基酸序列(典型为17-22个连续氨基酸)，其作为蛋白酶识别位点且通常含有唯一的或者主要的蛋白酶特异性决定簇。RSL序列的裂解及其构象变化是稳定的共价复合物中丝氨酸蛋白酶抑制蛋白分子对蛋白酶的捕获的结果。对于本发明之目的，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的RSL环中的任一或多个氨基酸均可以被修饰为相应于希望的耙蛋白的裂解序列。这种修饰的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白或其含有变体RSL序列的部分可以用于选择具有改变的底物特异性的蛋白酶。如本文所用，分配(partitioning)是指稳定的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-蛋白酶复合物与裂解的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白之间丝氨酸蛋白酶抑制蛋白分配的过程。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白中的分配的原因与抑制途径的性质有关，其得自裂解的反应位点环经过丝氨酸蛋白酶抑制蛋白表面的大量移位。如果蛋白酶在采取抑制的位置之前有时间解离(即酶-丝氨酸蛋白酶抑制蛋白复合物去酰基)，则发生分配。因此，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-蛋白酶相互作用的结果依赖于抑制(^)和底物(^)途径之间的分配比率(如图1示出)，其由抑制作用的化学计量表示(Shl良好的抑制剂的值为l，因为大多数丝氨酸蛋白酶抑制蛋白分子分配为复合物形成且&/&接近为0。然而如果RSL环未足够快速地插入蛋白酶中，则发生分配且反应直接向裂解产物行进。如本文所用，如本领域技术人员所熟知，催化效率或者kcat/km是蛋白酶裂解底物效率的一种测量方法，是在稳定状态条件下测量的。如本文所用，抑制作用的二级速率常数是指蛋白酶与抑制剂相互作用的速率常数。通常蛋白酶与抑制剂如蛋白酶捕获剂如丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的相互作用是与每种反应物、抑制剂和蛋白酶的浓度产物成比例的二级反应。由紧密结合或者不可逆的抑制剂或者蛋白酶捕获剂对于蛋白酶的抑制作用的二级速率常数是恒定的，当乘以酶浓度和抑制剂浓度时获得特定的抑制剂使酶失活的速率。每对蛋白酶捕获剂和酶的速率常数独特地反映其相互作用。作为二级反应，二级速率常数的提高意味着修饰的被选择的蛋白酶与抑制剂之间的相互作用比未修饰的蛋白酶与抑制剂之间的相互作用快。因此，二级速率常数的变化反映出反应成分即蛋白酶和/或抑制剂之间相互作用的变化。当筛选蛋白酶时，二级速率常数提高可以反映蛋白酶中希望的选择修饰。如本文所用，酰基酶中间体是指底物与丝氨酸蛋白酶的催化中心内的39必需丝氨酸(典型为Serl95，基于胰凝乳蛋白酶编号)之间催化反应第一步期间形成的共价中间体。所述反应如下进行丝氨酸-OH攻击底物Pl位置的羰基碳，组氨酸的氮接受来自丝氨酸的-OH的氢，来自羰基氧的双键的一对电子移动至所述氧原子。这样导致负电荷的四面体样中间体产生。连接底物肽键中氮与碳的键断裂。产生这个键的共价电子移动去攻击组氨酸的氢，从而破坏连接。先前从羰基氧双键移动的电子移动返回负电荷氧，再次形成键，导致共价酰基酶中间体形成。所述酰基酶中间体由水水解，导致脱酰作用并且形成裂解的底物和游离的酶。如本文所用，蛋白酶集合是指含有至少10种不同蛋白酶和/或其蛋白酶解活性部分的集合，通常含有至少50、100、500、1000、104、105或更多个成员。所述集合典型地含有准备筛选底物特异性的蛋白酶(或其蛋白酶解活性部分)。所述集合中包括天然发生的蛋白酶(或者其蛋白酶解活性部分)和/或修饰的蛋白酶(或其蛋白酶解活性部分)。所述修饰包括沿着所述蛋白酶长度的随机突变和/或在靶定或选择区域中的修饰(即聚焦突变)。所述修饰可以是组合的，且可以包括在特定基因座或者所有基因座或者其亚集的取代所有氨基酸的所有变换。所述集合可包括全长或者较短的蛋白酶，包括仅蛋白酶结构域。所述蛋白酶可包括任何蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。所述集合及特定集合的大小由用户确定。在其它实施方案中，所述集合含有少如2种蛋白酶。如本文所用，"组合集合"或者"组合文库"是在其序列中具有与起始模板蛋白酶多肽序列相比独特和多样的氨基酸突变的蛋白酶多肽的集合。集合中表现的突变可以是贯穿多肽序列或者可以位于多肽序列的特定区域。所述突变可以随机产生或者可以基于结构或功能信息根据经验或者合理地设计的靶向突变。如本文所用，"模板蛋白酶"是指具有用于诱变的氨基酸序列的蛋白酶。模板蛋白酶可以是野生型蛋白酶或者其催化活性部分的序列，或者其可以是产生另外突变的变体蛋白酶或者其催化活性部分的序列。例如，在本发明的选择方法中鉴别的突变体蛋白酶可以用作起始模板以在随后轮次的选择中进一步诱变。如本文所用，随机突变是指不考虑突变或者对于突变没有偏好而在多肽的序列中导入一或多个氨基酸变化。随机诱变可以方便地通过本领域技术人员已知的多种技术进行，包括例如UV照射、化学方法及PCR方法(例如易错PCR)。如本文所用，聚焦突变是指在多肽的特定区域或者特定位置的一或多个氨基酸改变。例如，可以在蛋白酶的特异性结合口袋中产生氨基酸的靶向突变。聚焦诱变可以例如使用本领域已知的标准重组技术通过定点诱变或者多位点定向诱变方法进行。如本文所用，蛋白酶捕获剂与蛋白酶或其蛋白酶解活性部分之间的稳定复合物是指足够稳定的能从与所述蛋白酶捕获剂未形成复合物的蛋白酶(即未复合的蛋白酶)中分离出的复合物。这种复合物可以通过任何稳定的相互作用包括共价、离子和疏水性相互作用而形成，但是在反应条件下是足够稳定的以保持足够时间的复合以对复合物进行分离。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白与裂解的蛋白酶之间的这种相互作用典型是共价键。如本文所用，"热点"是在通过蛋白酶选择获得的对于希望的新底物序列呈现改良的活性和/或选择性的多个变体中被突变的位置。一或多个"热点"可以在蛋白酶选择期间鉴别。因此，这种位置是蛋白酶的特异性和/或选择性决定簇，并因此促成底物特异性，也可以在蛋白酶家族如丝氨酸蛋白酶家族或者特定的蛋白酶家族的一个以上成员中的相应基因座(如基于胰凝乳蛋白酶编号)作为广泛的特异性和/或选择性决定簇而发生。如本文所用，关于底物特异性的希望的特异性是指对于预定的或预选的或者其它方式靶定的底物的裂解特异性。如本文所用，"选择"或其语法上的变化用语是指挑选或者选择与蛋白酶捕获多肽复合的蛋白酶。因此，对于本发明而言，选择是指基于蛋白酶在稳定的复合物中与蛋白酶捕获多肽之间的结合而选出蛋白酶。通常地，选择可以通过捕获共价复合物而方便地进行，且如果需要时可以分离所述蛋白酶。例如，选择可以通过例如用预定的标记、标签或者其它可检测的部分标记所述蛋白酶捕获多肽而方便地进行，从而基于其在稳定复合物中的结合而鉴别所述蛋白酶。如本文所用，"鉴别"及其语法上的变化用语是指识别或者了解稳定复合物中的蛋白酶。典型地，在本发明的方法中，蛋白酶是通过其在稳定复41合物中与蛋白酶捕获多肽的结合而鉴别的，例如通过扩增(即在合适的宿主细胞中生长)复合物中结合的蛋白酶及随后通过DNA测序进行鉴别。如本文所用，为了进行检测或分离而进行的标记是指使分子如蛋白酶捕获多肽与可检测的标记如荧光团或者与标签或者其它部分结合以进行纯化或者分离或者分开。可检测地标记是指对分子如蛋白酶捕获多肽标记以进行检测或分离。如本文所用，蛋白酶或其蛋白酶解活性部分的扩增是指所述蛋白酶或其蛋白酶解活性部分的量增加，如通过分离和克隆及表达，或者在蛋白酶或其蛋白酶解活性部分在微生物上展示的情况中，将所述微生物导入合适的宿主中并且使其生长或培养以便产生更多展示的蛋白酶或其蛋白酶解活性部分。如本文所用，与反应混合物均质是指所述反应物是液相混合物，包括溶液或悬浮液。如本文所用，蛋白酶或其蛋白酶解活性部分的集合"基于"特定的蛋白酶是指所述集合衍生自特定的蛋白酶，例如通过随机或者定向诱变或者合理设计或者其它修饰方案产生集合。如本文所用，通过给予t-PA治疗的疾病或病症是指本领域技术人员给予t-PA进行治疗的疾病或病症。这种病症包括但非限于纤维蛋白溶解病，如动脉血栓形成、静脉血栓形成和血栓栓塞、缺血性中风、后天凝血障碍、弥散性血管内凝血，及这些病症的前期状况，如细菌或病毒感染、牙周炎及神经系统病症。如本文所用，由VEGFR-2介导的疾病或病症参与病理学或病因学中。这种病症包括但非限于炎症和血管生成病症，例如癌症、糖尿病视网膜病变和眼部疾病包括黄斑变性。如本文所用，"蛋白酶"和"肽酶"可互换使用，是指催化共价肽键水解的酶。这些名称包括酶原形式及其活化的单链、双链和多链形式。为清楚起见，蛋白酶是指所有形式的蛋白酶。依赖于其活性位点的催化活性和裂解耙底物肽键的机制，蛋白酶包括例如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。如本文所用，酶原是指通过蛋白酶解激活的蛋白酶，包括通过成熟裂解如激活裂解和/或与其它蛋白质和/或辅因子形成复合物而激活。酶原是蛋白酶解酶的无活性前体。这种前体通常较大，但是非必需比其活性形式大。对于丝氨酸蛋白酶而言，酶原通过特异性裂解而转变为活性酶，包括催化和自身催化裂解，或者通过结合激活的辅因子，产生活性酶。因此，酶原是酶学上无活性形式的蛋白质，通过激活物的作用而将其转变为蛋白酶解酶。裂解可以通过自身催化而实现。酶原通常是无活性的，可以通过催化或者自身催化裂解所述酶原的前区(proregion)而被转变为成熟活性多肽。如本文所用，"前区"、"前肽"或者"前序列(pros叫uence)"是指被裂解以产生成熟蛋白质的区域或节段。其可包括通过掩蔽催化机构(catalyticmachinery)及因此防止催化中间体的形成(即通过在空间上封闭底物结合位点)而发挥抑制酶活性的功能的节段。前区是位于成熟的生物活性多肽的氨基末端的氨基酸序列，可以是小如几个氨基酸或者可以是多结构域结构。如本文所用，激活序列是指酶原中为激活裂解或者成熟裂解以形成活性蛋白酶所需要的部位的氨基酸序列。激活序列的裂解可以自身催化裂解或者通过其激活配体偶催化。激活裂解是一种成熟裂解类型，其中发生为活性所需的构象改变。这是经典的激活途径，例如对于丝氨酸蛋白酶而言，其中裂解产生新的N末端，其与催化机构的保守区域如催化残基相互作用，诱导活性所需的构象改变。激活可以导致多链形式的蛋白酶产生。在一些情况中，单链形式的蛋白酶可以呈现与单链一样的蛋白酶解活性。如本文所用，结构域是指分子如蛋白质或者编码核酸的一部分，其在结构上和/或在功能上与所述分子的其它部分不同且是可鉴别的。如本文所用，蛋白酶结构域是蛋白酶的催化活性部分。蛋白酶的蛋白酶结构域包括任何这些蛋白质的单链、双链和多链形式。蛋白质的蛋白酶结构域含有为其蛋白酶解活性所需的该蛋白质所有必需性质，例如其催化中心。如本文所用，蛋白酶的催化活性部分或蛋白酶解活性部分是指蛋白酶结构域，或者其保留蛋白酶活性的任何片段或部分。重要的是，至少在体外，所述蛋白酶的单链形式及其催化结构域或者其蛋白酶解活性部分(典型为C末端截短)呈现蛋白酶活性。如本文所用，"编码蛋白酶结构域或其催化活性部分的核酸"是指作为连续序列的仅编码所述单链蛋白酶结构域或其活性部分而不编码所述蛋白酶的其它连续部分的核酸。如本文所用，所述基本上由蛋白酶结构域组成的多肽是指所述多肽的唯一部分是蛋白酶结构域或其催化活性部分。所述多肽可任选地且通常包括其它的非蛋白酶衍生的氨基酸序列。如本文所用，"S1-S4"是指形成底物P1-P4残基的结合位点的氨基酸残基(见例如SchecterandBerger(1967)所oc/zew5/op/z>wi&sCowmw"27:157-162)。每个S1-S4均含有一、二或多个残基，其可以是非连续的。这些位点从识别位点N末端至蛋白酶解位点相继编号，称作易断裂键。如本文所用，术语"P1-P4"和"P1'-P4'"是指底物肽中的残基，其分别与Sl-S4残基和Sl'-S4'残基特异性相互作用，且由蛋白酶裂解。Pl-P4是指位于裂解位点N末端侧的残基位置；Pl'-P4'是指位于裂解位点C末端侧的残基位置。氨基酸残基从多肽底物的N末端至C末端被标记为(Pi,...，P3,P2，Pl，Pl',P2'，P3'，…，Pj)。各自的结合亚位点被标记(Si，...，S3,S2,Sl，Sl'，S2',S3',...,Sj)。在Pl与Pl，之间催化裂解。如本文所用，"结合口袋"是指与底物上特定氨基酸相互作用的残基。"特异性口袋"是较其它结合口袋提供更多能量的结合口袋(最重要的或者决定性的结合口袋)。典型地，结合步骤在过渡态形成之前进行，为发生催化过程所必需。S1-S4和S1'-S4'氨基酸组成底物序列结合口袋，并且通过分别与肽、多肽或者蛋白质底物的P1-P4和P1'-P4'氨基酸相互作用而促进底物识别。无论蛋白酶与底物相互作用是否是Sl-S4和Sl'-S4'位置中氨基酸的功能。如果任一或多个S1、S2、S3、S4、Sl'、S2，、S3，和S4，亚位点中的氨基酸与底物中P1、P2、P3、P4、Pl'、P2'、P3，和P4'位点的任一或多个氨基酸相互作用或者识别其，则所述蛋白酶可裂解所述底物。结合口袋使靶氨基酸与蛋白酶处于合适位置，由此实现肽键的催化和底物的裂解。例如，丝氨酸蛋白酶典型识别底物中的P4-P2，位点；其它蛋白酶可以具有超出P4-P2'的扩大的识别作用。如本文所用，"有助于扩大底物特异性"的氨基酸是指除了特异性口袋之外活性位点裂口(cleft)中的那些残基。这些氨基酸包括蛋白酶中的Sl-S4、44sr-S4，残基。如本文所用，二级相互作用位点在活性位点裂口外面。这些位点可有助于底物识别和催化。这些氨基酸包括可导致与底物的第二和第三壳相互作用(shellinteraction)的氨基酸。例如，蛋白酶结构中围绕Sl-S4、S1，画S4，氨基酸的环在定位底物中的P1-P4、Pl'-P4'氨基酸中起作用，从而将易断裂键记录于(registering)蛋白酶活性位点中。如本文所用，蛋白酶的活性位点是指底物结合位点，在此发生对底物的催化。活性位点的结构和化学性质使得可以识别及结合所述底物，及随后水解和裂解底物中的易断裂键。蛋白酶的活性位点含有有助于肽裂解的催化机制的氨基酸以及有助于底物序列识别的氨基酸，例如有助于扩大底物结合特异性的氨基酸。如本文所用，丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶的"催化三联体"或者"活性位点残基"是指丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶活性位点中的氨基酸组合，典型为三个氨基酸的组合，其有助于肽裂解的催化机制。通常地，催化三联体在丝氨酸蛋白酶中发现，提供活性亲核体及酸/碱催化作用。丝氨酸蛋白酶的催化三联体含有三个氨基酸，在胰凝乳蛋白酶中是Asp皿、His"和Ser195。这些残基对于丝氨酸蛋白酶的催化效率是关键的。如本文所用，"底物识别位点"或者"裂解序列"是指由蛋白酶裂解的蛋白酶活性位点识别的序列。典型地，例如对于丝氨酸蛋白酶而言，裂解序列由底物中的P1-P4和P1'-P4'的氨基酸组成，在P1位置之后发生裂解。典型地，丝氨酸蛋白酶的裂解序列的长度为6个残基，以匹配许多蛋白酶的扩大的底物特异性，但是根据蛋白酶而可以更长或更短。例如，为自身催化所需的MT-SP1的底物识别位点或裂解序列是RQARVV，其中R在P4位置，Q在P3位置，A在P2位置，R在P1位置。MT-SP1中的裂解发生在位置R后，随后是序列VVGG。如本文所用，靶底物是指在其底物识别位点由蛋白酶特异性裂解的底物。靶底物最低程度包括组成裂解序列的氨基酸。任选地，靶底物包括含有裂解序列及任何其它氨基酸的肽。全长蛋白质、其等位基因变体、同工型或者含有由蛋白酶识别的裂解序列的任何部分是该蛋白酶的耙底物。此外，靶底物包括含有不影响蛋白酶裂解底物的其它部分的肽或蛋白质。例45如，靶底物可包括与荧光部分化学连接的四氨基酸肽或者全长蛋白质。如本文所用，裂解是指蛋白酶对肽键的破坏。蛋白酶的裂解位点基序包含易断裂键的N和C末端残基(分别为unprimed和primedsides,蛋白酶的裂解位点称作...P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'...，裂解发生在Pl与Pl'残基之间)。典型地，底物的裂解是激活裂解或者抑制裂解。激活裂解是指多肽从无活性形式转变为活性形式的裂解。这种裂解包括例如酶原裂解为活性酶，和/或前生长因子(progrowthfactor)裂解为活性生长因子。例如，MT-SP1可以通过在Pl-P4序列RQAR裂解耙底物而自动激活。激活裂解也可以是蛋白质裂解为一或多种自身具有活性的蛋白质的裂解。例如，激活裂解在补体系统中发生，其是不可逆的蛋白酶解级联事件，其终止导致多个效应分子的形成，刺激炎症、促进抗原吞噬作用及直接溶解一些细胞。如本文所用，抑制裂解是蛋白质裂解为一或多种非功能性降解产物。抑制裂解导致蛋白质活性的减小或降低。典型地，蛋白质活性的降低降低了涉及所述蛋白质的途径或过程。在一个实例中，任一或多种靶蛋白例如VEGFR的裂解是抑制裂解，导致耙底物的任一或多种功能或活性的伴随降低或抑制。例如，对于VEGFR的裂解，可以被抑制的活性包括但非限于配体结合、激酶活性或者血管发生活性如在体内或体外的血管发生活性。对于抑制而言，所述裂解使得活性与天然形式蛋白质的活性相比降低至少大约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99.9%或更多。抑制裂解所需的蛋白质裂解百分比根据蛋白质而变化，但是可以通过测定蛋白质的活性而确定。如本文所用，蛋白酶多肽是具有相应于本文所述任一候选蛋白酶或者其变体蛋白质的氨基酸序列的多肽。如本文所用，"修饰的蛋白酶"或者"突变蛋白酶"是指在其一级序列中与野生型或模板蛋白酶相比具有一或多个修饰的蛋白酶多肽(蛋白质)。所述一或多个突变可以是一或多个氨基酸置换(取代)、插入、缺失及其任意组合。修饰的蛋白酶多肽包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个修饰位置的那些蛋白酶多肽。修饰的蛋白酶可以是全长蛋白酶，或者可以是修饰的全长蛋白酶的催化活性部分，只要所述修饰的蛋白酶是蛋白酶解活性的。通常地，这些突变改变了野生型或者模板蛋白酶裂解任一或多种希望的或预定的靶底物的特异性和活性。除了在改变蛋白酶的底物特异性的区域中含有修饰之外，修饰的蛋白酶在对于蛋白酶的底物特异性非必需的区域中也可允许具有其它修饰。因此，修饰的蛋白酶与相应的野生型或者支架蛋白酶的氨基酸序列典型具有60%、70%、80%、85%、90%、91°/。、92%、93%、94°/。、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列相同性。修饰的全长蛋白酶或者修饰的蛋白酶的其催化活性部分可包括是融合蛋白的蛋白酶，只要所述融合蛋白自身不改变蛋白酶的底物特异性。如本文所用，胰凝乳蛋白酶编号是指SEQIDNO:391所示成熟胰凝乳蛋白酶多肽的氨基酸编号。胰凝乳蛋白酶家族蛋白斷即u-PA、t-PA、MT-SPl及其它成员)包括蛋白酶结构域的对比可以用胰凝乳蛋白酶进行。在这种情况中，相应于胰凝乳蛋白酶的氨基酸的蛋白酶的氨基酸以胰凝乳蛋白酶氨基酸的编号示出。相应位置可以由本领域技术人员使用人工对比方式或者使用多种可利用的对比程序(例如BLASTP)通过这种对比而确定。相应位置也可以基于结构对比，例如通过使用计算机模拟的蛋白酶结构对比而确定。相应于揭示的序列中氨基酸的多肽的氨基酸是指使用标准对比算法如GAP算法对比所述多肽与所揭示的序列以使得相同性或同源性最大化(其中对比保守氨基酸)而鉴别的氨基酸。例如，在对比u-PA与成熟胰凝乳蛋白酶多肽时，SEQIDNO:191所示u-PA的前体序列中氨基酸C168与成熟胰凝乳蛋白酶多肽的氨基酸C1对比在一起。因此，u-PA中的氨基酸C168基于胰凝乳蛋白酶编号也是C1。使用这种胰凝乳蛋白酶编号标准，SEQIDNO:191所示前体u-PA序列中氨基酸L244与基于胰凝乳蛋白酶编号的L73相同，氨基酸1260与基于胰凝乳蛋白酶编号的189相同。在另一实例中，在对比MT-SP1丝氨酸蛋白酶结构域(相应于SEQIDNO:253的第615-855位氨基酸)与成熟胰凝乳蛋白酶时，在MT-SP1第615位的V以胰凝乳蛋白酶编号V16示出。随后的氨基酸相应编号。因此，在全长MT-SP1(SEQIDNO:253)第708位的氨基酸F基于胰凝乳蛋白酶编号相应于F99。在残基存在于蛋白酶中而在胰凝乳蛋白酶中不存在的情况中，该氨基酸残基以字母表示。例如，是胰凝乳蛋白酶中是具有氨基酸60(基于胰凝乳蛋白酶编号)的环的一部分但是与胰凝乳蛋白酶相比插入在MT-SP1序列中的残基，例如称作47Asp60b或Arg60c。如本文所用，对于靶底物的特异性是指与另一底物(称作非靶底物)相比蛋白酶优先裂解靶底物。特异性以二级速率常数或特异性常数反映(kcat/Km)，这是蛋白酶与其底物的亲和性及该酶的效率的测量数据。如本文所用，对于裂解的特异性常数是(k^/Km)，其中Km是Michaelis-Menton常数(在一半V鹏的[S])，Kcat是V腿/[Et]，其中Et是最终的酶浓度。参数keat、Km和k^/Km可以通过将底物浓度的倒数对底物裂解速度的倒数作图并拟合进Lineweaver-Burk方程(1/速度KKm/V皿)(l/[S])+1/Vmax，其中Vma^[et]keat)而计算。可以使用在存在不同浓度底物的条件下确定裂解速度随着时间而增加的任何方法计算特异性常数。例如，将底物与荧光部分连接，其在由蛋白酶裂解时释放。通过确定在不同酶浓度下的裂解速度，可以确定特定蛋白酶的k^。特异性常数可以用于使用本领域的标准方法例如使用位置扫描组合文库(positionalscanningcombinatoriallibrary,PS-SCL)确定蛋白酶的任一或多个Sl-S4口袋中的氨基酸相对于底物中伴随的Pl-P4氨基酸的位点特异性偏爱。此外，特异性常数也可以用于确定蛋白酶对于一个靶底物相对于另一个靶底物的偏爱。如本文所用，底物特异性比率是特异性常数的比率，可用于对比两或多个蛋白酶的特异性或者蛋白酶对于两个以上底物的特异性。例如，蛋白酶对于竞争底物的底物特异性或者竞争蛋白酶对于底物的底物特异性可以通过对比kca/Km而进行比较。例如，对于靶底物具有2X106M"sec"特异性常数或者对于非靶底物具有2X104M"sec"特异性常数的蛋白酶对于所述靶底物更具特异性。使用上述特异性常数，所述蛋白酶对于耙蛋白酶具有100的底物特异性比率。如本文所用，对于靶底物的偏爱可以底物特异性比率表示。反映偏爱性的特定比率值是底物与所研究的蛋白酶之间的函数。大于1的底物特异性比率表示对于靶底物的偏爱，小于1的底物特异性比率表示对于非靶底物的偏爱。通常地，至少或者大约为1的比率反映出被认为是候选治疗剂的蛋白酶的充分差异。如本文所用，改变的特异性是指与起始野生型或模板蛋白酶相比修饰的或选择的蛋白酶的底物特异性变化。通常，特异性变化是与模板蛋白酶的野生型底物(在此称作非耙底物)相比修饰的蛋白酶对于靶底物的偏爱性变化。典型地，与靶蛋白酶的底物特异性相比，本发明提供的修饰的蛋白酶或者选择的蛋白酶对于耙蛋白质的任一或多种预定或希望的裂解序列呈现增加的底物特异性。例如，对于耙底物相对于与非靶底物的底物特异性比率为100的修饰的蛋白酶或者选择的蛋白酶与底物特异性比率为10的支架蛋白酶相比呈现出特异性增加io倍。在另一实例中，底物特异性比率为1相对于底物特异性比率为0.1的修饰的蛋白酶呈现出底物特异性增加10倍。为了呈现出与模板蛋白酶相比增加的特异性，修饰的蛋白酶对于任一或多种预定靶底物具有1.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍或更高的底物特异性。如本文所用，当用于描述蛋白酶从竞争底物混合物中选择和裂解一种靶底物的能力时，"选择性"可以与特异性互换使用。可以通过例如对比蛋白酶裂解靶底物的特异性常数而确定与任一或多种靶底物相比，蛋白酶对于一种靶底物增加的选择性。例如，如果蛋白酶对于耙底物的裂解特异性常数为2X106M"sec—1而对于其它任一其他底物的裂解特异性常数为2X1(^M"sec'1，则该蛋白酶对于前者靶底物更具选择性。如本文所用，活性是指多肽或其与全长(完整)蛋白质相关联的一部分的一或多种功能活性。功能活性包括但非限于生物学活性、催化或酶活性、抗原性(结合或者与多肽竞争结合抗多肽抗体的能力)、免疫原性、形成多聚体的能力及特异性结合所述多肽的受体或配体的能力。如本文所用，催化活性或者裂解活性是指在检测选择的底物的蛋白酶解作用的体外蛋白酶解测定中评价的蛋白酶的活性。裂解活性可以通过评价蛋白酶的催化效率而测量。如本文所用，对于靶底物的活性是指裂解活性和/或功能活性，或者反映蛋白酶对于靶底物的活性的其它量度。裂解活性可以通过评价蛋白酶的催化效率而测量。对于本发明而言，如果与不存在蛋白酶的条件相比，蛋白酶呈现出更高的对耙底物的蛋白酶解或者裂解作用和/或调节(即激活或抑制)靶底物蛋白的功能活性，则表示活性增加。如本文所用，丝氨酸蛋白酶或者丝氨酸内肽酶是指一类肽酶，其特征在于在酶的活性中心存在丝氨酸残基。丝氨酸蛋白酶参与机体内的许多功49能，包括血液凝固、炎症以及在原核生物和真核生物中的消化酶。由"丝氨酸蛋白酶"所致的裂解机制是基于丝氨酸对于粑定肽键的亲核攻击。与天冬氨酸相关的半胱氨酸、苏氨酸或水分子或金属也可以发挥这个作用。丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸的排列的侧链形成大多数丝氨酸蛋白酶共有的催化三联体。丝氨酸蛋白酶的活性位点在多肽底物结合之处是裂口形状。丝氨酸蛋白酶的例子包括SEQIDNO:433所示尿纤溶酶原激活物(u-PA)及SEQIDNO:253所示MT-SP1，及其催化活性部分，例如SEQIDNO:505所示MT-SP1蛋白酶结构域(也称作B-链)。如本文所用，人蛋白质是由人基因组中存在的核酸分子如DNA编码的蛋白质，包括其所有等位基因变体和保守变体。如果修饰基于人蛋白质的野生型或者主要序列，则蛋白质的变体或修饰是人蛋白质。如本文所用，天然发生的oi-氨基酸残基是在自然界发现的那20种(X-氨基酸残基，其通过负载tRNA分子由人体中关联mRNA密码子的特异性识别而掺入蛋白质中。如本文所用，非天然发生的氨基酸是指非遗传编码的氨基酸。如本文所用，核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以是单链或双链的。当用于描述探针或引物时，包括单链分子，其任选被标记，如用可检测的标记如荧光或放射性标记进行标记。这种分子典型是这样的长度，以便其靶位用于探查或引发文库时在统计学上是唯一的或者是低拷贝数的(典型小于5，通常小于3)。通常探针或引物含有与感兴趣的基因互补或相同的序列的至少14、16或30个连续核苷酸。探针和引物的长度可以是IO、20、30、50、IOO或更多个核酸。如本文所用，肽是指长度为2-40个氨基酸的多肽。如本文所用，在本发明提供的各个氨基酸序列中出现的氨基酸根据其己知的三字母或单字母縮写的方式表示(表1)。在各个核酸片段中出现的核苷酸以本领域常用的标准单字母命名法命名。如本文所用，"氨基酸"是含有氨基基团和羧酸基团的有机化合物。多肽含有两或多个氨基酸。对于本发明而言，氨基酸包括20种天然发生的氨基酸、非天然氨基酸及氨基酸类似物(即其中a-碳具有侧链的氨基酸)。如本文所用，"氨基酸残基"是指多肽在其肽键部位被化学消化(水解)时形成的氨基酸。本文所述的氨基酸残基推定为L异构体形式。也如此命名的D异构体形式的残基可以由任何L-氨基酸残基取代，只要多肽保留希望的功能性质。NH2是指在多肽的氨基末端存在的游离氨基基团。COOH是指在多肽的羧基末端存在的游离羧基基团。与/AW.C&m.,243:3552-3559(1969)及采用的37C.F.R..§§1.821-1.822所述标准多肽命名法一致，表l示出了氨基酸残基的縮写。表i-对应表符号l个字母3个字母氨基酸YTyr酪氨酸GGly甘氨酸FPhe苯丙氨酸MMet甲硫氨酸AAla丙氨酸SSer丝氨酸Ilie异亮氨酸Leu亮氨酸TThr苏氨酸VVal缬氨酸PPro脯氨酸KLys赖氨酸HHis组氨酸QGin谷氨酰胺EGlu谷氨酸ZGlxGlu禾口/或GinwTip色氨酸RArg精氨酸DAsp天冬氨酸NAsn天冬酰胺BAsxAsn禾口/或AspCCys半胱氨酸XXaa未知或其它氨基酸应注意本文示出的所有氨基酸残基序列均是从左至右方向是氨基末端至羧基末端常规方向。另外，短语"氨基酸残基"广泛是指包括对应表(表l)中列出的氨基酸及修饰的和不常见的氨基酸，如并入作参考的37C.F.R.§§1.821-1.822中提及的那些。此外，应注意在氨基酸残基序列的起始处或末端的破折号"一"表示与一或多个氨基酸残基的进一步序列的肽键，与氨基末端基团如NH2或者与羧基末端基团如COOH的肽键。51如本文所用，"天然发生的氨基酸"是指在多肽中出现的20种L-氨基酸。如本文所用，"非天然氨基酸"是指这样的有机化合物，其具有与天然氨基酸相似的结构，但是在结构上已经被修饰为模拟天然氨基酸的结构和反应性。非天然发生的氨基酸因此包括例如除了所述20种天然发生的氨基酸之外的氨基酸或氨基酸类似物，但非限于氨基酸的D-立体异构体(D-isostereomer)。非天然氨基酸的例子在本文中描述，且为本领域技术人员所已知。如本文所用，等动力混合物是其中氨基酸的摩尔比率已经基于其报道的反应速率而调节的混合物(见例如Ostreshetal.,(1994)Biopolymers34:1681)。如本文所用，DNA构建体是单链或双链、线性或环形DNA分子，含有以天然未发现的方式组合和并列的DNA节段。DNA构建体以人工操纵的结果而存在，包括操纵的分子的克隆及其它拷贝。如本文所用，DNA节段是具有特定属性的较大DNA分子的一部分。例如，编码特定多肽的DNA节段是较长的DNA分子的一部分，如质粒或质粒片段，当从5'至3'方向读取时，其编码特定多肽的氨基酸序列。如本文所用，术语直向同源物是指得自一个物种的是功能对应物的多肽或蛋白质，或者来自不同物种的多肽或蛋白质。直向同源物的序列差异是物种形成的结果。如本文所用，术语多核苷酸是指从5'至3'末端读取的脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，可以分离自天然来源、在体外合成或者从天然分子与合成分子的组合中制备。多核苷酸分子的长度在本文以核苷酸(縮写为nt)或碱基对(縮写为bp)示出。术语核苷酸根据上下文用于描述单链和双链分子。当该术语用于双链分子时，其用于表示全长分子，且应理解为与术语碱基对相同。本领域技术人员意识到双链多核苷酸的两个链在长度上可以略微不同，其末端可以是交错的；因此双链多核苷酸分子内的所有核苷酸可以不都是配对的。这种不配对的末端通常不超过20个核苷酸长度。如本文所用，两个蛋白质或核酸之间的"相似性"是指蛋白质的氨基酸序列或者核酸的核苷酸序列之间的关联性。相似性可以基于残基序列和其中包含的残基的相同性和/或同源性程度。评价蛋白质或核酸之间相似性程度的方法为本领域技术人员所已知。例如，在评价序列相似性的一个方法中，将两个氨基酸或核苷酸序列以在序列之间产生最大水平相同性的方式对比。"相同性"是指氨基酸或者核苷酸序列无差异的程度。氨基酸序列的对比及在一定程度上核苷酸序列的对比也可以考虑到氨基酸(或者核苷酸)中的保守差异和/或频繁取代。保守差异是保持所包含残基的物理-化学性质的那些差异。对比可以是整体对比(对全长序列进行对比，包括所有残基)或者局部对比(仅包括最相似区域的序列部分的对比)。"相同性"具有本领域公认的含义，可以使用公开的技术计算(见例如C細p她"o打a/她/ecw/ar所o/ogy，Lesk，A.M.,ed.，OxfordUniversityPress,NewYork,1988;所oco附/wri"g.,Z^/b/Twaricsaw/Cewo膨iVq/e加，Smith,D.W"ed.,AcademicPress,NewYork,1993;Cow/w/er^"a/戸So/5fe《we"ceD"fa，PartI，Griffin，A.M.,andGriffin,H.G.，eds.，HumanaPress,NewJersey,1994;5fegwewceJwa—'sz>zMo/ecw/ar5/o/ogy，vonHeinje，G.，AcademicPress,1987;及SequenceAnalysisPrimer,Gribskov，M.andDevereux，J.，eds.，MStocktonPress,NewYork,1991)。存在测量两个多核苷酸或多肽之间相同性的许多方法，术语"相同性"为本领域技术人员所熟知(Carillo，H.&Lipton,D.，WM"A栃073(1988》。如本文所用，同源(关于核酸和/或氨基酸序列)是指大约高于或等于25%序列同源性，典型高于或等于25%、40%、50%、60°/。、70%、80%、85%、90%或95%序列同源性；如果需要，可以指明精确的百分比。对于本发明而言，除非特别指出，则术语"同源性"和"相同性"通常可互换使用。通常地，为了确定同源性或相同性百分比，对比序列以便获得最高级另U的匹配(见例如Com/wto//owa/Afo/ecw/(2r所o/ogv，Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversityPress,NewYork,1988;说ocom/w""g..朋d/Vq/ec&,Smith,D.W"ed.，AcademicPress,NewYork,1993;Compilero/SegwewceDato,尸aW/,Griffin,A.M.,andGriffin,H.G.,eds.,HumanaPress,NewJersey,1994;5fe《wewce爿朋/戸's,"Mo/ecw/or所o/ogv,vonHeinje，G.，AcademicPress,1987;及5fe《wewce爿"(3/拜'51ZV/mer,Gribskov，MDevereux，J.，eds.，MStocktonPress,NewYork,1991;Carilloda/.(1988)5Z4MJ々7^WM^^:1073)。通过序列同源性，保守氨基酸的数目通过标准对比算法程序确定，可以使用每个供应商确定的默认缺口罚分。基本上同源的核酸分子典型在中等严格条件或者在高度严格条件下沿着感兴趣的核酸的长度杂交。本发明还涉及含有简并密码子代替杂交核酸分子中的密码子的核酸分子。任两个分子是否具有至少60%、70%、80%、85°/。、卯％、95%、96%、97%、98%或99%"相同"或"同源"的核苷酸序列或氨基酸序列可以使用已知的计算机算法如FASTA程序利用例如默认参数确定，如PearsonW(1988)尸rac.iVa".JcW.L/iS^S5:2444所述(其它程序包括GCG程序包(Devereux,J.，&a/.，脸c/dci^舰rc/27卿387(1984》、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.R，d"/"/Mo/ec历o/"5:403(1990》；GuidetoHugeComputers,MartinJ.Bishop,ed"AcademicPress,SanDiego,1994及Carilloa/.(1988)5X4MJ^p//^/A/w/24S:1073)。例如，NationalCenterforBiotechnologyInformation数据库的BLAST可用于确定相同性。其它可商购或可公开获得的程序包括DNAStar"MegAlign"程序(Madison,WI)和theUniversityofWisconsinGeneticsComputerGroup(UWG)"Gap"禾呈序(MadisonWI)。蛋白质和/或核酸分子的同源性或者相同性百分比可以例如通过使用GAP计算机程序对比序列信息而确定(例如Needleman"a/.(1970)Mo/,所o/.48:443，由SmithandWaterman((1981)Jc/v.Ma仇2:482修订)。简而言之，GAP程序将相似性规定为相似的对比符号(即核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短序列的符号总数。GAP程序的默认参数可包括:(l)一元比较矩阵(含有相同性值为1，非相同性值为0)及Gribskov"(1986)7Vwc/.爿c/A14:6745的加权比较矩阵，如SchwartzandDayhoff，eds.，爿:TL4SOFi^OZHTV促0C/五AO;厕DOTC/C7mE,NationalBiomedicalResearchFoundation,pp.353-358(1979)所述；(2)每个缺口的3.0罚分及每个缺口中每个符号的额外0.10罚分；及(3)末端缺口无罚分。因此，如本文所用，术语"相同性"或者"同源性"表示测试多肽或多核苷酸与参考多肽或多核苷酸之间的对比。如本文所用，术语至少"90%相同"是指相对于参考核酸或多肽的氨基酸序列从90至99.99的相同性百54分比。在90%或者更高水平的相同性是指假定对比长度为100个氨基酸的测试多肽和参考多肽。在测试多肽中不超过10%的(即100分之IO)氨基酸与参考多肽的氨基酸不同。在测试多核苷酸与参考多核苷酸之间可以进行相似对比。这种差异可以表示随机分布于多肽全长的点突变，或者其可以聚集在不同长度的一或多个位置直至最大容许值，例如10/100氨基酸差异(大约90%相同性)。差异定义为核酸或者氨基酸取代、插入或者缺失。在大约85-90%以上的同源性或相同性水平，结果应与程序和缺口参数设置无关，这种高水平相同性可以易于通过人工对比而不用依靠软件即可评定。如本文所用，对比的序列是指使用同源性(相似性和域相同性)对比核苷酸或氨基酸序列中的相应位置。典型地，对比50%或更高相同性的相关的两或多个序列。对比的序列组是指在相应位置对比的两或多个序列，且可以包括衍生自RNA的对比序列，例如EST及与基因组DNA序列对比的其它cDNA。如本文所用，"引物"是指可作为模板指导的DNA合成的起始点的核酸分子，所述合成是在适当条件下(例如存在四种不同的核苷三磷酸和聚合剂如DNA聚合酶、RNA聚合酶或者逆转录酶)、在合适的缓冲液中及在合适的温度下进行。本领域技术人员意识到某些核酸分子可以作为"探针"和"引物"。然而，引物具有3'羟基基团以进行延伸。引物可用于多种方法中，包括例如聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶(RT)-PCR、RNAPCR、LCR、多重PCR、panhandlePCR、捕获PCR、表达PCR、3'和5'RACE、原位PCR、连接介导的PCR及其它扩增方法。如本文所用，"引物对"是指一组引物，其包括与被扩增(例如通过PCR扩增)的序列的5'末端杂交的5'(上游)引物及与被扩增的序列的3'末端的互补序列杂交的3，(下游)引物。如本文所用，"特异性杂交"是指通过互补碱基配对，核酸分子(例如寡核苷酸)与靶核酸分子退火。本领域技术人员熟知影响特异性杂交的体外和体内参数，例如特定分子的长度和组成。与体外杂交特别相关的参数进一步包括退火和洗涤温度、缓冲液组成和盐浓度。在高度严格条件下，除去非特异性结合的核酸分子的洗涤条件例如是O.lxSSPE、0.1%SDS、65°C，在中等条件下是0.2xSSPE、0.1%SDS、50。C。等价的严格条件为本领域所已知。技术人员可容易地调节这些参数以实现核酸分子与适于特定用途的靶核酸分子的特异性杂交。如本文所用，与产物基本上相同是指足够的相似，由此感兴趣的性质足以未加改变以便所述基本上相同的产物可用于代替所述产物。如本文所用，也应理解术语"基本上相同"或者"相似"根据上下文而有所不同，这种用法为相关领域技术人员所了解。如本文所用，等位基因变体或者等位基因变异是指占据相同染色体基因座的基因的两或多种变化形式任一。等位基因变异通过突变天然产生，且可以导致群体内的表型多态性。基因突变可以是沉默突变(编码的多肽中无变化)或者可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语"等位基因变体"在本文也用于描述由基因的等位基因变体编码的蛋白质。典型地，基因的所述参考形式编码来自群体或者来自物种的一个参考成员中野生型形式和/或优势形式多肽。典型地，等位基因变体包括物种之间或者物种之中的变体，与相同物种的野生型和/或优势形式典型具有至少80%、90%或更高的氨基酸相同性；相同性的程度取决于基因及对比是种间还是种内对比。通常，种内等位基因变体与野生型和/或优势形式具有至少大约80%、85%、90%或95%或者更高的相同性，包括与多肽的野生型和/或优势形式具有96%、97%、98%、99%或者更高的相同性。本文提及的等位基因变体通常是指相同物种的成员之中的变异蛋白质。如本文所用，"等位基因"与"等位基因变体"在本文可互换使用，是指基因或其一部分的替换形式。等位基因占据同源染色体上的相同基因座或位置。当对象具有基因的两个相同的等位基因时，称所述对象是该基因或等位基因纯合的。当对象具有基因的两个不同的等位基因时，称所述对象是该基因杂合的。特定基因的等位基因彼此可以有一个核苷酸或者几个核苷酸的不同，且可以包括核苷酸的取代、缺失和插入。基因的等位基因可以是含有突变的基因形式。如本文所用，物种变体是指不同物种中的多肽变体，包括不同的哺乳动物物种如小鼠和人。如本文所用，剪接变体是指通过对基因组DNA的一级转录物进行不同加工，产生一种以上类型的mRNA而产生的变体。如本文所用，修饰是指多肽的氨基酸序列或者核酸分子的核苷酸序列中的修饰，分别包括氨基酸和核苷酸的缺失、插入和置换。修饰多肽的方法为本领域技术人员所熟知，例如使用重组DNA方法学进行。如本文所用，肽模拟物(peptidomimetic)是模拟特定肽的生物学活性形式的构象和某些立体化学特征的化合物。通常，肽模拟物被设计为模拟化合物的某些希望的性质而不模拟不希望的性质，例如导致生物学活性构象丧失和键破坏的柔性。通过用生物等构物(bioisostere)置换导致不希望的性质的某些基团或键，可以从生物学活性化合物制备肽模拟物。生物等构物为本领域技术人员所已知。例如，亚甲基生物等构物CH2S已经在脑啡肽类似物中用作酰胺置换物(见例如Spatola(1983)pp.267-357inChemistryandBiochemistryofAminoAcids,Peptides,andProteins,Weinstein，Ed-volume7，MarcelDekker,NewYork)。可以口服的吗啡是内啡肽的肽模拟物化合物。对于本发明而言，环肽包括在肽模拟物中，是其中一或多个肽键由模拟物置换的多肽。如本文所用，一种多肽包含特定百分比的参考多肽的氨基酸是指在多肽与参考多肽之间共有的连续相同氨基酸的比例。例如，包含具有SEQIDNO:XX所示氨基酸序列(其列举了147个氨基酸)的参考多肽中70%氨基酸的同工型是指所述参考多肽含有SEQIDNO.XX所示氨基酸序列的至少103个连续氨基酸。如本文所用，术语启动子是指含有用于RNA聚合酶结合及转录起始的DNA序列的基因部分。启动子序列通常但非总是在基因的5'非编码区中发现。如本文所用，分离的或纯化的多肽或蛋白质或其生物学活性部分基本上不含细胞材料或者来自从中衍生所述蛋白质的细胞或组织中的其它污染蛋白质，或者当其是经化学合成的时，基本上不含化学前体或其它化学物。如果通过标准分析方法确定制备物看起来没有易于可检测的杂质，则可以确定所述制备物基本上是不含污染物的，所述方法如薄层层析法(TLC)、凝胶电泳法和高效液相层析法(HPLC)，本领域技术人员使用这些方法评定这种纯度，或者所述制备物是足够纯的由此进一步的纯化将不会可检测地改变所述物质的物理和化学性质，如酶和生物学活性。纯化化合物以产生基本上化学纯的化合物的方法为本领域技术人员所已知。基本上化学纯的化合物可以是立体异构体的混合物。在这种情况中，进一步纯化可增加化合物的比活性。术语"基本上不含细胞材料"包括这样的蛋白质制备物，其中蛋白质自从中分离或者重组产生蛋白质的细胞的细胞成分中分离出。在一个实施方案中，术语基本上不含细胞材料包括这样的蛋白酶蛋白质制备物，其具有低于大约30%(干重)的非蛋白酶蛋白质(在本文也称作污染蛋白质)，通常低于大约20%的非蛋白酶蛋白质或者10%的非蛋白酶蛋白质或者低于大约5%的非蛋白酶蛋白质。当所述蛋白酶蛋白质或其活性部分是重组产生的时，其也基本上不含培养基，即培养基低于大约或者为所述蛋白酶蛋白质制备物体积的20%、10%或5%。如本文所用，术语基本上不含化学前体或者其它化学物包括这样的蛋白酶蛋白质制备物，其中所述蛋白质从参与蛋白质合成的化学前体或者其它化学物中分离出。该术语包括这样的蛋白酶蛋白质制备物，其具有低于大约30%(干重)、20%、10%、5%或更少的化合物前体或非蛋白酶化学物或成分。如本文所用，术语"合成的"，例如合成的核酸分子或者合成的基因或者合成的肽是指核酸分子或者多肽分子是通过重组方法和/或通过化学合成方法产生的。如本文所用，通过使用重组DNA方法重组产生是指使用分子生物学领域熟知的方法表达由克隆的DNA编码的蛋白质。如本文所用，载体(或质粒)是指用于将异源核酸导入细胞中以进行表达或复制的不连续元件。载体典型地保持为附加体，但是可以设计为实现基因或其一部分整合进基因组染色体中。本发明还涉及作为人工染色体的载体，例如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。这种载体的选择和应用为本领域技术人员所熟知。如本文所用，表达载体包括能表达DNA的载体，所述DNA与能实现这种DNA片段表达的调节序列如启动子区域可操纵地连接。这种额外的节段可包括启动子和终止子序列，及任选可包括一或多个复制起点、一或多个可选择的标记、增强子、聚腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生自质粒58或病毒DNA，或者可以含有这两种元件。因此，表达载体是指重组DNA或RNA构建体，如质粒、噬菌体、重组病毒或者其它载体，在导入合适的宿主细胞中时导致克隆的DNA表达。合适的表达载体为本领域技术人员所熟知，包括在真核细胞和/或原核细胞中可以复制的那些载体，及保持为附加体的那些载体或者整合进宿主细胞基因组中的那些载体。如本文所用，载体还包括"病毒载体"。病毒载体是工程化的病毒，其与外源基因可操纵地连接以(作为运载体或穿梭工具)将所述外源基因转移进细胞中。如本文所用，腺病毒是指在人体内导致结膜炎和上呼吸道感染的含有DNA的任何病毒。如本文所用，裸DNA是指无组蛋白的DNA，其可以用于疫苗和基因治疗。裸DNA是遗传材料，其在称作转化的基因转移过程中在细胞与细胞中传递。在转化中，纯化的或裸DNA由受体细胞摄取，其将为受体细胞提供新的特性或表型。如本文所用，可操纵地连接当用于描述DNA节段时是指所述节段的排列使得其功能与指定目的一致，例如转录在启动子中起始且从编码节段行进至终止子。如本文所用，蛋白质结合序列是指能特异性结合其它蛋白质或肽序列、通常是一组蛋白质或肽序列或者特定的蛋白质或肽序列的蛋白质或肽序列。如本文所用，表位标记是指相应于表位的一段较短的氨基酸残基序列，便于随后对表位标记的蛋白质或肽进行生物化学和免疫学分析。表位标记是通过将表位标记序列加入在合适的表达载体中的蛋白酶编码序列中而实现。表位标记的蛋白质可以通过使用针对所述标记的高度特异性抗体进行亲和纯化。如本文所用，金属结合序列是指能特异性结合金属离子、通常为一组金属离子或者特定的金属离子的蛋白质或肽序列。如本文所用，术语评定是指包括定量和定性确定，获得样品中存在的蛋白质或其结构域活性的绝对值，也可以获得关于活性水平的指数、比率、百分比、目测值或者其它数值。评定可以是直接或间接评定，且实际检测的化学种类不需要是自身蛋白酶解产物，而是可例如是其衍生物或者一些进一步的物质。例如，通过SDS-PAGE及用考马斯蓝染色蛋白质检测补体蛋白的裂解产物。如本文所用，生物学活性是指化合物的体内活性或者在体内给予化合物、组合物或者其它混合物时产生的生理反应。因此，生物学活性包含这种化合物、组合物和混合物的治疗效果和药物活性。生物学活性可以在设计为测试或使用这种活性的体外系统中观测。因此，对于本发明而言，蛋白酶的生物学活性是其催化活性，其中多肽被水解。如本文所用，当用于描述核酸的两个序列时，术语等价是指所述两个序列编码相同的氨基酸序列或者等价的蛋白质。当等价用于描述两个蛋白质或肽时，是指这两个蛋白质或肽具有基本相同的氨基酸序列，仅具有基本不改变所述蛋白质或肽的活性或功能的氨基酸取代。当等价用于描述性质时，所述性质不需要以相同程度存在(例如两个肽可以表现为不同速率的相同类型酶活性)，但是所述活性通常基本相同。当用于描述两个核苷酸序列时，互补是指两个核苷酸序列能杂交，在相对的核苷酸之间典型具有低于25%、15%或5%的错配。如果需要，指明互补百分比。典型地，选择在高度严格条件下杂交的两个分子。如本文所用，调节蛋白质活性或者基因或核酸表达的物质降低或者增加或者另外改变蛋白质的活性，或者以一些方式上调或下调或者另外改变核酸在细胞中的表达。如本文所用，药物作用或者治疗作用是指在给予用于治疗疾病或病症或者改善其症状的物质时观测到的作用。如本文所用，"调节"或"改变"是指分子例如蛋白质的活性的改变。活性例如包括但非限于生物学活性，如信号转导。调节可包括活性增加(即上调或激动剂活性)、活性降低(即下调或抑制)或者活性的任何其它改变(如周期性、频率、持续时间、动力学或者其它参数的改变)。调节可以根据情况而定，典型地，调节是与指定状态相对比，例如与野生型蛋白质、组成型状态的蛋白质或者在指定细胞类型或条件中表达的蛋白质相对比。如本文所用，抑制是指相对于未被抑制的活性，活性降低。如本文所用，组合物是指任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水溶液、非水溶液或者其任意组合。如本文所用，组合是指两或多个项目(items)之间或之中的任何结合。所述组合可以是两或多个单独项目，如两个组合物或两个集合，可以是其混合物，如两或多个项目的单一混合物，或者其任何变体。组合的元件通常是功能关联或相关的。试剂盒是包装的组合，其任选包括使用所述组合或其元件的说明书。如本文所用，"疾病或失调"是指生物体由于一些原因或条件而引起的病理学病症，所述原因和条件包括但非限于感染、后天获得的病症、遗传病症，及特征在于可鉴别的症状。本发明感兴趣的疾病或失调是涉及补体激活的那些，包括由补体激活介导的那些及其中补体激活在病因学和病理学中起作用的那些。疾病和失调也包括由于蛋白质的缺乏而引起的那些，如免疫缺陷，本发明感兴趣的疾病和失调是其中由于补体蛋白的缺陷而不发生补体激活的那些失调。如本文所用，"治疗"患有疾病或病症的对象是指在治疗后所述对象的症状部分或全部减轻，或者保持稳定状态。因此，治疗包含预防、治疗和/或治愈。预防是指预防潜在的疾病和/或预防症状恶化或者疾病进展。治疗还包含本文提供的修饰的干扰素和组合物的药物学应用。如本文所用，治疗剂、治疗方案、放射防护剂或者化学疗法是指常规的药物和药物治疗，包括疫苗，这些为本领域技术人员所已知。放射疗法为本领域所熟知。如本文所用，治疗是指其中病症、失调或疾病的症状或者其它指征得以改善或者另外得以有益改变的任何方式。如本文所用，治疗作用是指对对象进行治疗后获得的改变、典型为改善或者减轻疾病或病症的症状或者治愈疾病或病症的作用。治疗有效量是指在给予对象之后产生治疗作用的组合物、分子或者化合物的量。如本文所用，术语"对象"是指动物，包括哺乳动物，如人类。如本文所用，患者是指人对象。如本文所用，通过例如给予药物组合物或者其它治疗方法进行处理而改善特定疾病或失调的症状是指由于给予所述组合物或者治疗方法引起的或者与之相关的症状的任何减轻，无论是永久或暂时、长期或短暂的。如本文所用，预防是指降低发生疾病或病症的风险的方法。61如本文所用，有效量是预防、治愈、改善、阻止或部分阻止疾病或失调的症状必需的治疗剂的量。如本文所用，给予蛋白酶如修饰的蛋白酶是指将所述蛋白酶与其底物接触的任何方法。可以在体内或离体或在体外给予。例如，对于离体给予，将体液如血液从对象体内取出，并且在机体之外与修饰的非补体蛋白酶接触。对于体内给予，可以将修饰的蛋白酶导入机体中，如通过局部、表面、全身和/或其它导入途径。体外给予包含如细胞培养方法等方法。如本文所用，如本领域技术人员所已知，单位剂量形式是指适于人和动物对象且单独包装的物理分立单位。如本文所用，单一剂量制剂是指直接给予的制剂。如本文所用，"制造品"是生产和销售的产品。如本说明书中所用，该术语包含包装物品中包含的修饰的蛋白酶多肽及核酸。如本文所用，流体是指可以流动的任何组合物。因此，流体包含半固体、糊剂、溶液、水溶液混合物、凝胶、洗剂、乳液及其它这种组合物形式的组合物。如本文所用，"试剂盒"是指本发明提供的修饰的蛋白酶多肽或者核酸分子与另一项目的组合，所述另一项目用于包括但非限于给予、诊断和评定生物学活性或性质的项目。试剂盒典型包括使用说明书。如本文所用，细胞提取物或者溶解产物是指从溶解或破坏的细胞中制备的制备物或级分。如本文所用，动物包括任何动物，例如但非限于灵长类动物包括人、大猩猩和猴子；啮齿类动物如小鼠和大鼠；禽类如鸡；反刍动物如山羊、牛、鹿、绵羊；猪类如猪，及其它动物。非人动物是除了人之外的动物。本发明提供的蛋白酶来自任何来源，动物、植物、原核生物和真菌。大多数蛋白酶源于动物，包括源于哺乳动物。如本文所用，对照是指与测试样品基本相同的样品，不同之处是其未用测试参数处理，或者如果样品是血浆样品，则其可以来自未受所述感兴趣病症影响的正常志愿者。对照也可以是内部对照。如本文所用，除非特别指出，则单数形式"一个"、"一种"包括复数形式。因此，例如包含"一个胞外结构域"的化合物包括具有一或多个胞62外结构域的化合物。如本文所用，范围和数量可以用"大约"的特定数值或范围表示。大约也包括精确量。因此，"大约5个碱基"是指"大约5个碱基"也指"5个碱基"。如本文所用，"任选"是指随后描述的事件或情况发生或不发生，且所述描述包括其中所述事件或情况发生及不发生的情况。例如，任选取代的基团是指该基团不被取代或者被取代。如本文所用，除非特别指出，则任何保护基团、氨基酸及其它化合物均根据其常用的公认縮写形式或者根据IUPAC-IUBCommissiononBiochemicalNomenclature(见(1972)Biochem.ii:1726)所述进行縮写。B.筛选蛋白酶的方法
技术领域：
：本发明提供了筛选性质改变、特别是底物特异性和选择性改变的蛋白酶的方法。所述方法还提供了这种改变的蛋白酶，其对于治疗用途呈现出基本未改变的活性或者具有足够活性。本发明提供的方法可以使用蛋白酶修饰及设计修饰的蛋白酶的任何方法。这种方法包括产生文库、使用现有文库的随机方法，也包括定向进化方法。已经应用了许多选择方案以鉴别具有改变的底物特异性/选择性的蛋白酶，但是每种方法均有限制。本发明提供的方法克服了这种限制。通常，选择方案包括l)根据蛋白酶结合进行选择或者2)根据蛋白酶催化作用进行选择。利用蛋白酶结合的策略的例子包括例如使用过渡态类似物(TSA)及应用小分子自杀底物的那些策略。TSA是稳定的化合物，其模拟蛋白酶底物反应的过渡态的电子和结构特征。蛋白酶与底物之间最强的相互作用典型发生在反应的过渡态。TSA用作模型底物以选择具有高度结合亲和性的蛋白酶。TSA不是真正过渡态的理想模拟物且其合成困难(Bertschinger"a/.(2005)in尸/zage/"Z>wgZ)/sc0v^7(SidhuS,ed)，pp.461-491)。这种策略鉴别了具有改变的底物特异性的蛋白酶变体，但是这种蛋白酶通常呈现出活性降低，因为蛋白酶催化作用的需求不是该选择方案的一部分。在另一种策略中，小分子自杀底物(也称作基于机制的抑制剂)用于基于结合而选择蛋白酶。这种自杀底物典型是小分子抑制剂，其共价结合酶的活性位点。这些自杀底物含有反应性亲电体，其与酶亲核体反应形成共价键。这个反应不需要蛋白酶对天然肽键的裂解。典型地，这种抑制剂仅在结合正确的酶及经历正常催化步骤时才产生反应性亲核体(见例如Bertschinger&a/.(2005)in尸/2agecfc^/ay丑/o&c/z.awe/Z>wg_D&cove^y(SidhuS,ed)，pp.461-491)。在许多情况中，底物抑制剂模拟催化作用中涉及的第一过渡态的构象，但是不允许催化循环的完成。结果，这种抑制剂的使用是针对强结合而不是催化作用进行有效选择，导致选择了底物解离减弱的失活酶(Droge"a/.(2006)ChemBioChem，7:149-157)。同样，由于其大小和缺乏底物裂解的需求，因此其未重现蛋白酶与天然蛋白质底物的相互作用。己经尝试了针对催化作用而不是结合进行选择的蛋白酶选择策略(见例如HeinisWa/.(2001)，尸rate/"五"&"een'"g，14:1043-1052)。针对催化作用进行测定的一种主要限制是反应产物在反应完成后迅速扩散，使得难以分离催化活性酶。因此，针对催化作用进行选择的策略依赖于将底物和酶锚定于噬菌体，由此使其紧密相邻。例如，钙调蛋白已经用作固定剂(Demartis(1999)JMol.Biol.，286:617-633)。使用钙调蛋白结合肽衍生物将反应底物非共价地锚定于钙调蛋白标记的噬菌体酶上。在催化反应之后，使用抗产物亲和性试剂从非催化活性噬菌体中分离展示反应产物的噬菌体。然而由于底物附着于噬菌体颗粒，由此可以阻碍催化反应。因此，选择蛋白酶的这些及其它方法有一些限制，未鉴别出具有改变的特异性及基本未改变的具有足够治疗应用活性的蛋白酶。本发明的方法解决了这些限制。本发明提供了选择蛋白酶的方法，以鉴别具有改变的、优化的或者改良的底物特异性的蛋白酶和/或蛋白酶变体。这种蛋白酶被鉴别用于优化及用作治疗性蛋白酶，其可裂解并失活(或者激活)希望的蛋白质靶位，例如疾病或失调的病因学中涉及的蛋白质靶位。在本发明提供的筛选蛋白酶的方法中，候选蛋白酶作为蛋白酶酶反应的稳定中间体复合物而被捕获，然后得以鉴别。所述稳定的中间体复合物典型是共价复合物或者其它复合物，可以从未复合的分子中分离。这种中间体包括例如酰基酶中间体，允许捕获及最终鉴别具有选择的或预定的底物特异性的蛋白酶。通过将蛋白酶集合与由所述蛋白酶裂解的蛋白酶捕获多肽接触，并在裂解时形成稳定复合物而实现蛋白酶的捕获。这种蛋白酶捕获多肽的例子是丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、Ct2巨球蛋白及其它这种分子。所述蛋白酶捕获多肽可以是天然发生的和/或可以是修饰的以针对特定靶底物进行选择。在实施本发明方法时，将蛋白酶、典型为修饰或突变体蛋白酶集合和/或天然蛋白酶集合与蛋白酶捕获多肽接触，在底物裂解之后所述蛋白酶捕获多肽与蛋白酶反应形成含有捕获的中间体的复合物。这些方法可用于鉴别具有希望的底物特异性/选择性的蛋白酶。为了鉴别具有希望的底物特异性/选择性的蛋白酶，可以在蛋白酶捕获多肽中修饰易断裂键的氨基酸序列和/或反应位点周围序列如反应环序列或者类似序列以模拟希望的靶底物的底物裂解序列。所述筛选反应通过将蛋白酶集合与蛋白酶捕获多肽在一定条件下接触由此形成稳定的复合物、典型为共价复合物而进行。所述复合物具有足够稳定性，允许其从稳定性较差的复合物和未反应的蛋白酶捕获多肽中分离。所述蛋白酶捕获多肽可以是可鉴别地标记的或者亲和标记的，以便于鉴别复合物。例如，通过荧光部分、亲和标记或其它这种标记物质对所述蛋白酶捕获多肽进行标记，便于分离蛋白酶-抑制剂复合物及鉴别选择的蛋白酶。可以对选择的蛋白酶进行活性分析以评定蛋白酶解效率和底物特异性。鉴别的或选择的蛋白酶也可以例如通过测序或者其它鉴别方法包括质谱分析法鉴别，或者通过其它标记方法，以鉴别复合物中的选择的蛋白酶。本发明提供的方法还包括任选地重复筛选步骤，由此对于希望的或预定的特异性/选择性和/或裂解活性的蛋白酶可以进行一次或者可以进行多轮所述方法。例如，蛋白酶选择可包括随机或者根据经验或者系统地修饰被选择的蛋白酶(在靶定区域和/或沿着长度修饰)及重复(一轮、两轮、三轮、四轮或更多轮)将所述蛋白酶集合与一或多种蛋白酶捕获多肽接触的方法。本发明提供的方法可以是多重的，例如包括两或多个差异标记的或者可差异鉴别的蛋白酶捕获多肽。在本发明提供的方法中，所述蛋白酶捕获多肽非必需在复合反应中呈现100%或者极高的效率，只要至少可检测的百分比、典型为至少1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高百分比可形成稳定的复合物，所述复合物可以从稳定性较差的复合物或者未反应的蛋白酶捕获多肽中分离或者另外鉴别。因此，在反应中发生分配的情况中可选择蛋白酶，其中存在蛋白酶捕获多肽的低于100%抑制作用，例如1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60°/。、70%、80%、90%、95%、99%或者更高的蛋白酶催化反应的抑制。在本发明提供的方法中，可以调节选择及其它参数的严格性，例如通过控制反应时间、温度、pH、离子强度和/或文库和底物浓度进行。特异性限制也可以在选择期间加以调节，通过包括竞争剂如含有不希望的底物裂解序列的特定竞争剂或者较广泛类别的竞争剂如人血浆而进行。本发明提供的方法也可以通过将蛋白酶集合与一种蛋白酶捕获多肽或者不同蛋白酶捕获多肽的混合物接触(例如通过多重)而进行。在使用多个不同蛋白酶捕获多肽的情况中，每个蛋白酶捕获多肽均可以单独及独特地进行标记，由此其可以被可鉴别地检测。这种方法使得可以在一个反应中从蛋白酶集合中分离和鉴别多个蛋白酶。本发明提供的方法允许立即对多个蛋白酶集合进行筛选以鉴别具有希望的或预定的底物特异性的那些蛋白酶。蛋白酶集合包括包含各种野生型蛋白酶、修饰的蛋白酶、其混合物及其蛋白酶解活性部分的集合的任何蛋白酶集合。可以应用任何集合。所述集合也可以是一组突变体蛋白酶或者含有所述突变的其蛋白酶解活性部分。这种集合包括组合集合，其中所述集合的成员含有多样的突变。所述突变可以是沿着蛋白酶(或其催化活性部分)长度的随机突变，或者靶向特定位置或区域的突变，例如靶向蛋白酶的特异性结合口袋的突变。本发明提供的方法可以鉴别和揭示先前未意识到作为特异性决定簇的非接触的残基(即埋没的残基)。因此，本发明提供的蛋白酶选择技术方法可用于产生具有完全新的特异性和活性的蛋白酶和/或用于优化现有蛋白酶的特异性或活性。C.蛋白酶捕获多肽本发明提供的方法中使用的蛋白酶捕获多肽是一种多肽或者含有反应位点的多肽部分，其作为蛋白酶的底物在裂解时导致稳定的蛋白酶-底物中间体复合物形成。通常，这种蛋白酶复合物需要通过所述蛋白酶裂解易断裂键(pi-pr)以产生捕获的底物-蛋白酶复合物。所述稳定的复合物典型是在蛋白酶与蛋白酶捕获多肽之间通过紧密的相互作用而形成的不可逆复合66物，如通过共价键、离子、疏水性或者其它紧密连接形成。由于这种复合物通常可以稳定几小时、几天、几周或者更长时间，由此可以分离该复合物。在一个实例中，稳定的中间体复合物可以是酰基酶中间体，其是在丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶与蛋白酶捕获多肽反应时形成的。最通常地，在蛋白酶捕获多肽裂解后，复合物中的快速构象变化使得蛋白酶变形且阻止酰基-酶复合物脱酰作用。因此，用蛋白酶捕获多肽淘选蛋白酶容许针对催化作用的限速步骤(即P1-P1，键的裂解和酶的酰化)进行选择，同时形成易于从集合混合物中分离出非常紧密的(即共价)复合物。典型地，这种蛋白酶捕获多肽是较大的(ioo个氨基酸以上)单结构域蛋白，含有由蛋白酶识别的反应位点序列。通常，所述反应位点裂解序列是柔性的、暴露的及较长的大反应环的一部分，使其成为靶底物(Otlewski(2005)77ze五M50丄24:1303-1310)，然而，只要蛋白酶捕获剂含有可以由蛋白酶裂解的反应位点序列，从而模拟底物裂解，则其可以用于本发明的方法中。因此，任何大的多肽或者合成产生的多肽均可以用于本发明的方法中，所述多肽含有由蛋白酶裂解的易断裂键，导致在长期稳定复合物中捕获蛋白质。这种蛋白酶捕获多肽的例子是丝氨酸蛋白酶抑制蛋白，如本文所述任何多肽。其它蛋白酶捕获多肽也可以用于在本发明提供的方法中，如其作用机制与丝氨酸蛋白酶抑制蛋白分子相似的那些多肽。这些多肽包括例如合成或者重组产生的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白样分子，或者含有丝氨酸蛋白酶抑制蛋白分子的连续片段或者序列的多肽，包括丝氨酸蛋白酶抑制蛋白分子的反应位点环的足够部分。另外，可以使用其抑制机制与丝氨酸蛋白酶抑制蛋白相似的其它蛋白酶抑制剂，例如抑制胱天蛋白酶的杆状病毒p35蛋白(Xuaa/.(2001)A^wre,410:494-497;Otlewski"a/.(2005)772eEMBO24:1303-1310)。其它蛋白酶捕获多肽包括捕获稳定复合物中蛋白酶的任何多肽，其可易于分离，例如但非限于a2巨球蛋白。l.丝氨酸蛋白酶抑制蛋白结构、功能和表达丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(丝氨酸蛋白酶抑制剂)与其它丝氨酸蛋白酶抑制剂(通常为大约少于60个氨基酸)相比是较大的蛋白质分子(大约330-500个氨基酸)的蛋白酶抑制剂。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白超家族是最大及最广泛分布的蛋白酶抑制剂。目前在不同动物、痘病毒、植物、细菌和古细菌中己经鉴别了超过1500个丝氨酸蛋白酶抑制蛋白家族成员(Law"(2006)Ge"owe历o/ogv，7:216)，迄今为止已经研究了超过30个不同的人丝氨酸蛋白酶抑制蛋白。大多数人丝氨酸蛋白酶抑制蛋白在血液中发现，在此其发挥广泛的调节作用，包括例如炎症、补体、血液凝固和纤维蛋白溶解级联反应。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白也在细胞内发挥细胞保护作用，例如调节细胞毒性蛋白酶的不适当释放。尽管大多数丝氨酸蛋白酶抑制蛋白对于蛋白酶活性具有抑制作用，但是一些丝氨酸蛋白酶抑制蛋白具有其它非抑制性作用，例如但非限于激素转运、皮质类固醇激素结合球蛋白、及血压调节作用(Silverman"a/.(2001)，/BC，276:33293-33296)。非抑制性丝氨酸蛋白酶抑制蛋白是类固醇结合球蛋白和卵清蛋白。典型地，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白抑制丝氨酸蛋白酶的作用，但是已经鉴别出几个丝氨酸蛋白酶抑制蛋白是木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶或胱天蛋白酶的抑制剂(Whisstocketal.(2005)FEBSJournal,272:4868-4873)。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白家族成员的序列相同性较差，然而，其结构是高度保守的。例如，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白家族成员与丝氨酸蛋白酶抑制蛋白al-抗胰蛋白酶呈现大约30%氨基酸序列同源性，且具有保守的三级结构。在结构上，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白由三个卩折叠(A、B和C)和8-9个a-螺旋(A-I)组成，其组成上部|3-桶结构域和下层螺旋结构域。这两个结构域由5链B-折叠A桥连，其是丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的主要结构特征(Huntingtonefa/.(2003),/777row6ow's//aemasfas7's,1:1535-1549)。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白是亚稳定蛋白，由此其在活性形式仅是部分稳定的；其需要蛋白酶以采取完全稳定构象。称作反应位点环(RSL)的环可以改变丝氨酸蛋白酶抑制蛋白分子的构象。RSL是一段大约17个氨基酸残基的暴露序列，其在A和Cp-折叠之间的区域中从分子的顶部突出。RSL作为蛋白酶识别位点，通常含有唯一的蛋白酶特异性决定簇。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白结构的最稳定形式是RSL-裂解的形式。在蛋白酶裂解之后，RSL的氨基末端部分插入P-折叠A的中心，成为六链P-折叠的第四链。这个构象改变称作从"紧张(stressed)"至"松弛(relaxed)"(或者S至R)转换。这种构象特征在于分子的热稳定性增加，这是由于五链P-折叠A向六链反平行形式的重构所致(LawrenceWa/.(2000),/伤o/.C7^m.，275:5839-5844)。换句话说，68丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的天然结构与潜在的中间体等价，所述潜在的中间体仅在经蛋白酶裂解之后转变为更稳定的结构(LawW(2006)7:216)。典型地，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白耙向丝氨酸蛋白酶，但是一些丝氨酸蛋白酶抑制蛋白使用相似机制抑制半胱氨酸蛋白酶。RSL环决定哪种蛋白酶被靶向抑制，因为其提供了所述靶蛋白酶的假底物。实质上，特定丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的抑制特异性由RSL序列介导，其是丝氨酸蛋白酶抑制蛋白中的最可变区域(Travisd(1990)说o/.C&w.T/o/pe&_y/er，371:3-11)。RSL模拟蛋白酶的底物识别序列，因此含有以..^11-3-241-1，-2，-3，-，11...编号的反应位点，其中所述反应位点是Pi与P之间的易断裂键。对于成熟的Otl-抗胰蛋白酶，在Met358-Sef359键(相应于SEQIDNO:l所示氨基酸序列的Met啦和Ser389氨基酸)发生P1-P1，键的裂解。所述蛋白酶上残基的相应结合位点是...811-83-82-81-81'，S2，,S3，,Sn，-...。在本发明提供的方法中，对RSL序列进行修饰以从展示文库中选择底物特异性改变的蛋白酶，如下文详细论述。2.蛋白酶催化、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的抑制机制及酰基酶中间体的形成本发明提供的蛋白酶选择方法利用多肽捕获蛋白酶的能力鉴别具有改变的底物特异性的蛋白酶，如通过丝氨酸蛋白酶抑制蛋白所例证。蛋白酶催化机制在蛋白酶解酶的不同类别之间略为不同，所述蛋白酶例如是丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶或者金属蛋白酶。例如，丝氨酸肽酶具有包含在活性中心内的丝氨酸残基，天冬氨酸肽酶催化中心内具有两个天冬氨酸，半胱氨酸型肽酶具有半胱氨酸残基，苏氨酸型肽酶具有苏氨酸残基，金属肽酶在催化机制中使用金属离子。通常，形成共价中间体的那些蛋白酶家族是本发明提供的蛋白酶选择方法的耙。这些包括例如丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶家族的成员。例如，对于丝氨酸蛋白酶而言，催化作用的第一步是在底物与蛋白酶的催化中心内的丝氨酸之间形成酰基酶中间体。这种共价中间体的形成通过负电荷四面体过渡态中间体行进，然后底物的P1-P1'肽键被裂解。在第二步或脱酰作用期间，酰基-酶中间体由水分子水解，释放肽及恢复所述酶的Ser-羟基。也包含四面体过渡态中间体形成的脱酰作用通过酰化的反向反应途径行进。对于脱酰作用，水分子代替Ser残基成为攻击亲核体。丝氨酸蛋白酶催化中心的His残基提供了通用碱，并接受反应性Ser的OH基团。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白使用上述S至R转换抑制丝氨酸和半胱氨酸靶蛋白酶的催化反应。其作用机制在蛋白酶抑制剂中是独特的，通过在脱酰化之前破坏蛋白酶的活性位点，从而不可逆地阻碍蛋白酶解，随后形成酰基-酶中间体(Otlewski"a/.(2005)7Txe五MBOJowr"a/，24:1303)。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白与蛋白酶反应的动力学模型与底物的蛋白酶解的相同(见例如图1;Zhouefa/.(2001)j:所o/.CTzew.，276:27541-27547)。在与靶蛋白酶相互作用之后，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白最初通过P1-P1'易断裂键两侧RSL中的的残基的相互作用而形成非共价Michaelis样复合物(Silverman"(2001),/历o/.C7ze肌，276:33293-33296)。蛋白酶活性位点中的丝氨酸残基(对于丝氨酸蛋白酶而言)攻击P1-P1，键，促进肽键裂解及丝氨酸残基与Pl残基的主链羰基之间共价酯键的形成。在RSL被裂解之后，RSL插入丝氨酸蛋白酶抑制蛋白分子的(3-折叠A中。插入的第一个残基是P14(即成熟od-抗胰蛋白酶中第345位氨基酸，其相应于SEQIDNO:l所示氨基酸序列中的T369氨基酸)，随后是RSL的柔性铰链区(P15-P9)(Buck"(2005)M/.说o/.五w/.，22:1627-1634)。RSL的插入转运与其共价结合的蛋白酶，导致蛋白酶的构象改变，特征在于变形的活性位点(见图l)以及丝氨酸蛋白酶抑制蛋白转换为"松弛"状态。蛋白酶的构象变化改变了活性位点的催化三联体，由此P1侧链从S1口袋中除去。构象重排的最终结果是捕获酰基酶中间体(SilvermanWa/.(2001),/所o/.C/ze附.，276:33293-33296)。酰基酶的形成对于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白相互作用是重要的，因此丝氨酸蛋白酶抑制蛋白典型特异于在催化作用中具有酰基酶中间体的蛋白酶类别。这些类别的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶家族的主要成员，包括胰凝乳蛋白酶超家族中的那些蛋白酶及蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶超家族中的那些蛋白酶，这些蛋白酶在下文详细描述。此外，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白对于半胱氨酸蛋白酶也具有反应性，所述半胱氨酸蛋白酶包括例如丝氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶家族和胱天蛋白酶家族中的那些蛋白酶。典型地，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白不抑制金属-、苏氨酸或天冬氨酸家族的蛋白酶。例如，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白与金属蛋白酶的相互作用不产生共价捕获的中间体，而是金属蛋白酶使所述抑制剂裂解而不形成任何复合物(Li"a/.(2004)Ca騰r7^.64:8657-8665)。因此，尽管大多数丝氨酸蛋白酶抑制蛋白抑制胰凝乳蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶，但是确实存在抑制半胱氨酸蛋白酶的跨类别(cross-class)抑制剂。所述跨类别抑制剂是抑制胱天蛋白酶1的病毒丝氨酸蛋白酶抑制蛋白CrmA和PI9(SEPRINB9)及抑制木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶(包括组织蛋白酶L、K和S)的SCCA1(SEPRINB3)。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白介导的丝氨酸蛋白酶抑制机制看起来适于半胱氨酸蛋白酶。然而，差异之处是动力学捕获的中间体是硫羟酸酯而不是在丝氨酸蛋白酶情况中的氧酯(oxyester)(Silverman"a/.(2001)所o/.Ozem.，276:33293-33296)。稳定的共价硫羟酸酯型键的存在通过检测到SCCA1与组织蛋白酶S之间SDS稳定复合物而支持(SilvermanWa/.(2001)/5z'o/.C/^m.，276:33293-33296;Schick"(1998)伤oc/z画勿，37:5258-5266)。根据丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-蛋白酶对，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白-蛋白酶对高度稳定持续几周至几年，然而最后终会发生解离以产生正常蛋白酶解产物(即裂解的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白和活性蛋白酶；见例如Zhou"(2001)J!Ao/.276:27541-27547)。另外，如果RSL环未足够快地插入蛋白酶中，则反应直接行进至裂解产物。这个现象称作分配(partitioning)且反映出可以发生的分支途径的存在，导致稳定抑制复合物或者丝氨酸蛋白酶抑制蛋白至底物的转换，如图1所示，抑制复合物的形成相对非抑制途径(Lawrence"(2000)，/说o/.Ozem.,275:5839-5844)。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的分配可以通过改变RSL环、特别是起始环插入的RSL的铰链区中的残基(即P14)而调节，或者通过改变丝氨酸蛋白酶抑制蛋白与其最佳相互作用的蛋白酶而调节。例如，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的抑制活性在蛋白酶uPA、tPA与凝血酶之间不同，靶向偏爱uPA和tPA。另夕卜，RSL环在例如铰链区的P14位置的变化改变了PAI-1的耙向偏爱性突变为带电荷的氨基酸(即Arg、Lys、Asp、Glu)降低了PAI-1对于uPA、tPA和凝血酶的抑制活性；突变为中性氨基酸(即His、Tyr、Gln、Asn)或者突变为无侧链的Gly导致PAI-1对于tPA和凝血酶的抑制活性与对于uPA相比降低10-100倍；突变为疏水性氨基酸与野生型PAI-1相比不改变PAI-1的抑制活性(LawrenceW"/.(2000),/CTzem.,275:5839-5844)。在丝氨酸蛋白酶抑制蛋白介导的对蛋白酶催化的成功抑制中重要的因子是RSL环的长度，其必须是精确长度以保证丝氨酸蛋白酶抑制蛋白与蛋白酶的相互作用提供了丝氨酸蛋白酶抑制蛋白本体(body)与蛋白酶之间的杠杆作用，允许催化性丝氨酸从活性位点的位移及蛋白酶的变形(Zhou"(2001)/5〖o/.CZzem.，276:27541-27547;Huntington&(2000)A^^wre，407:923-926)。实际上，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白本体使得所述蛋白酶被变形。大多数丝氨酸蛋白酶抑制蛋白具有RSL，所述RSL长度为17个残基，而仅几个丝氨酸蛋白酶抑制蛋白经鉴别具有16个残基的环(即oc2-抗纤溶酶、Cl-抑制剂和CrmA)。具有18个残基环的a2-抗纤溶酶变体丝氨酸蛋白酶抑制蛋白已经从出血性疾病患者中鉴别，但是这种变体不是有功能的抑制性丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(Zhou"a/.(2001)/历o/.C7zem.，276:27541-27547)。因此，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白抑制机制可以适应縮短的RSL，但是不适应加长的RSL(ZhouWa/.(2001)/历o/.C/zem.,276:27541-27547)。除了丝氨酸蛋白酶抑制蛋白家族成员的环长度的保守性之外，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的RSL通常也保留保守的铰链区(P15-P9)组成，且典型不含有带电荷的或大的P残基。a.丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的例子本发明提供的方法中使用的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白可以是任何丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽，包括但非限于重组产生的多肽、合成产生的多肽和从细胞、组织和血液中提取的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白还包括等位基因变体及来自不同物种的多肽，包括但非限于来自人及非人动物、痘病毒、植物、细菌和古细菌。典型地，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的等位基因或物种变体与天然或野生型丝氨酸蛋白酶抑制蛋白具有大约或者至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的不同。人丝氨酸蛋白酶抑制蛋白包括本发明提供的任何丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(例如下表2所示)、等位基因变体同工型、从核酸合成的分子、从人组织、细胞或血液分离的蛋白质，及任何人丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的修饰形式。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白还包括截短的多肽片段，只要存在足够的RSL环部分以介导与蛋白酶的相互作用及形成共价酰基酶中间体。表2:丝氨酸蛋白酶抑,纣蛋白的例子丝氨酸蛋白酶抑制蛋白蛋白质名称别名功能Acc.#成熟多肽(aa)SEQIDNO胞外抑制性丝氨酸蛋白酶抑制蛋白SERP腿1a-l-抗胰蛋白酶AIAT抑制弹性蛋白酶P0100925-4181SERPINA2a-l-抗胰蛋白酶相关蛋白A1AU也许是假基因P2084822-4202SERP證2a-2-抗纤溶酶A2AP抑制纤溶酶和胰蛋白酶P0869740-491SERP脆3a-l-抗胰凝乳蛋白酶AACT抑制嗜中性细胞组织蛋白酶G和肥大细胞cymassP0101124-4234SERPINC1抗凝血酶-IIIANT3调节血液凝固级联；凝血酶和因子Xa抑制剂P0100833-4645SERP腸1肝素辅因子IIHEP2调节血液凝固级联；凝血酶抑制剂P0554620-4996SERPING1血浆蛋白酶Cl抑制剂IC1调节补体激活、血液凝固、纤维蛋白溶解及激肽产生；C1酯酶抑制剂P0515523-500SERP脆5血浆丝氨酸蛋白酶抑制齐U，c蛋白抑制剂IPSP,PAI-3抑制激活的c蛋白和纤溶酶原激活物P0515420-4068SERPINA4KallistatinKAIN,PI4抑制人组织激肽释放酶的酰胺裂解和激肽原酶活性P2962221-4279SERP画神经丝氨酸蛋白酶抑制蛋白NEUS,PII2突触连接与突触可塑性的形成与重构；Q9957417-4101073<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>典型地，本发明提供的方法中使用的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白是抑制性丝氨酸蛋白酶抑制蛋白或其片段，能在丝氨酸蛋白酶抑制蛋白与蛋白酶之间形成共价酰基酶中间体。通常，这种丝氨酸蛋白酶抑制蛋白用于选择由丝氨酸蛋白酶抑制蛋白正常靶向的蛋白酶，在此发生接近于蛋白酶的完全抑制并且在抑制性复合物与裂解的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白底物之间的分配被最小化。表3示出丝氨酸蛋白酶及其关联丝氨酸蛋白酶抑制蛋白抑制剂的实例。预期这种丝氨酸蛋白酶抑制蛋白/蛋白酶对具有高缔合常数或者抑制作用二级速率常数并且低或不分配为非抑制性复合物。例如，t-PA的主要生理抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制蛋白PAI-l,—种大约50kD的糖蛋白(Pa皿ekoek"a/.(1986)丄，5:2539-2544;Ginsbergefa/.，(1980)/C7/"./"veW"78:1673-1680;andCarrell/Vofez'wose/"/h'6"o/^,Ed.Barrett,A丄etal.，Elsevier,Amsterdam,pages403-420(1986)。然而，其它丝氨酸蛋白酶抑制蛋白/蛋白酶对也可以用于本发明提供的方法中，即使缔合常数较低而分配较高。例如，其他丝氨酸蛋白酶抑制蛋白如Cl酯酶抑制剂和a-2-抗纤溶酶与tPA的缔合常数较PAI-1的低几个数量级(RanbyWa/.(1982)77znm.i^s,，27:175-183;Hekmanefa/.(1988)Jrc/z.丑/o//7j^.，262:199-210)，但是这些丝氨酸蛋白酶抑制蛋白仍抑制tPA(见例如LucoreWa/.(1988)Cz>c.77:660-669)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>弹性蛋白酶a-l-抗胰蛋白酶激肽释放酶Cl酯酶抑制剂a-l-抗胰蛋白酶纤溶酶a-2-抗纤溶酶凝血酶抗凝血酶III肝素辅因子IItPAPAI-1,PAI-2,PAI-3胰蛋白酶a-l-抗胰蛋白酶生长激素调节蛋白胰蛋白酶样蛋白酶蛋白酶微管连接蛋白Iu-PAPAI-1,PAI-2,PAI-3因此，在本发明提供的方法中用于选择蛋白酶的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白通常产生这样的反应产物，其中80%、90%、93%、94°/。、95%、96%、97%、98%、99%或100%所述反应产物是抑制性复合物的形成。在一些情况中，在本发明提供的方法中可以发生丝氨酸蛋白酶抑制蛋白与蛋白酶之间的分配增加，例如如果本发明方法中使用的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白不是最佳靶向蛋白酶。因此，在本发明提供的方法中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白可用于选择蛋白酶，其中所得反应导致为或大约为20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%或更多的稳定抑制性复合物，其余的产物是裂解的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白底物。当发生分配时可被改变以优化蛋白酶选择的因素包括例如增加的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白浓度和增加的反应时间。在一些情况中，如下文讨论的其它非抑制性丝氨酸蛋白酶抑制蛋白或其突变体可以用于本发明提供的方法中，只要进行选择的靶蛋白酶能与丝氨酸蛋白酶抑制蛋白底物相互作用产生可以被捕获的共价抑制性复合物。i.PAI-1蛋白酶选择方法中使用的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白例如是纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)或其变体。PAI-1是组织纤溶酶原激活物(t-PA)和尿激酶或者尿纤溶酶原激活物(u-PA)的主要抑制剂，其是参与由纤溶酶原激活所致的纤维蛋白溶解中的蛋白酶。PAI-1对于t-PA和u-PA具有大约2X107M"s'1的二级速率常数。PAI-1参与肿瘤浸润、纤维蛋白溶解、细胞迁移、组织重塑、组织内巻、排卵、炎症、滋养层浸润及恶性转化(Salonen"a/.(1988)/5/o/.CAem.，264:6339-6343)。PAI-1主要由内皮产生，但是也由其它组织类型例如脂肪组织分泌。其它相关的纤溶酶原激活物抑制剂包括PAI-2和PAI-3。例如，PAI-2也是一种u-PA和t-PA抑制齐U，但是由胎盘分泌，且典77型仅在妊娠期间大量存在。PAI-1是具有SEQIDNO:ll所示前体序列的单链糖蛋白，包括23个氨基酸的信号序列，当裂解时产生379个氨基酸的成熟序列。与其它丝氨酸蛋白酶抑制蛋白一样，PAI-1在由蛋白酶在其位于Arg346-Met347(即相应于SEQIDNO:11所示前体序列的Arg^和Met37e氨基酸)的Pl-Pl'反应位点裂解之后由潜伏形式转换为活性形式，从而导致稳定的共价复合物形成及结合的蛋白酶失活。然而，与其它丝氨酸蛋白酶抑制蛋白不同，PAI-1采用潜伏过渡态自发产生失活的、高度稳定的但共价完整的形式，从而RSL的残基P15至P4插入P-折叠A中形成(3-折叠的第四链(g卩s4A)，残基P3至P10'在分子表面形成突出的环(DeTaeye"a/.(2003)/所o/.CTzem.，278:23899-23905)。因此，活性PAI-1在37。C相对不稳定，呈现仅2.5小时的半衰期，之后自发转变为潜伏构象。然而，这种潜伏形式可以通过变性而再激活，例如通过十二烷基硫酸钠、胍氯化物(guanidiniumchloride)和脲变性(Declerekda/.(1992)/说o/.C/zem.,267:11693-11696)及加热(Katagirietal.(1988)EurJ.Biochem.，176:81-87)变性。PAI-1的活性形式也通过与玻连蛋白相互作用而稳定化。已经鉴别了不能经历转变为潜伏构象及因此在温度和pH升高时更长期更稳定的突变PAI-1(见例如Berkenpas"a/.(1995)7T^五MBO丄，14:2969-2977)。己经对丝氨酸蛋白酶(即t-PA或u-PA)和/或抑制性丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(即PAI-1)进行修饰以调节或改变抑制作用的二级速率常数以便使得蛋白酶对其关联丝氨酸蛋白酶抑制蛋白抑制剂或其变体具有抗性，例如用于需要野生型蛋白酶活性的治疗应用中(见例如U.S.PatentSerialNos.5，866，413;5,728,564;5,550,042;5,486602;5,304,482)。ii.抗凝血酶(AT3)用于本发明方法中的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白或其变体的另一例子是抗凝血酶(AT3)。AT3也是丝氨酸蛋白酶抑制蛋白家族的成员，使得许多酶失活，包括例如来自凝血系统的那些酶，例如但非限于因子X、因子IX、因子II(凝血酶)、因子VII、因子XI和因子XII。典型地，抗凝血酶主要在血液中发现，在此其通过阻断凝血酶的功能而防止或抑制血液凝固。AT3的活性通过一或多种辅因子、典型为肝素的存在而增加。在与肝素相互作用78时，AT3经历构象重排，包括环从丝氨酸蛋白酶抑制蛋白结构中排出及P1暴露，导致形成具有暴露的蛋白酶可及构象的AT3结构。另外，肝素既可结合蛋白酶也可结合抑制剂，从而加速抑制机制(LawWfl/.(2006)Ge"ome5油gy，7(216):l國ll)。AT3的基因序列编码跨越七个外显子的DNA，所述DNA编码SEQIDNO:5所示前体蛋白。相应于SEQIDNO:5所示序列1-32位氨基酸的信号序列的裂解导致产生432个氨基酸的、分子量为大约58000道尔顿的成熟蛋白质。其中6个氨基酸是半胱氨酸，其导致三个分子内二硫键形成。AT3的RSL中P4-P2，位含有氨基酸残基IAGRSL(SEQIDNO:478)，其相应于SEQIDNO:5所示氨基酸序列中第422-427位氨基酸，其中在反应位点P1-P1'的裂解发生在Arg425-Ser426氨基酸之间。3.其它蛋白酶捕获多肽本领域己知或者可以鉴别其它蛋白酶捕获多肽，其呈现与丝氨酸蛋白酶抑制蛋白相似的抑制机制(例如靶底物由蛋白酶裂解产生稳定的中间体及蛋白酶结构的构象变化)。这种蛋白酶捕获多肽预期用于本发明提供的方法中。这种蛋白酶捕获多肽的例子是p35。另外，本发明提供的方法中可以使用由蛋白酶裂解导致在长期稳定复合物中捕获蛋白酶的任何其它分子。a.p35例如，杆状病毒p35蛋白(SEQIDNO:473)是广谱胱天蛋白酶抑制剂，其可以这种方式抑制胱天蛋白酶(Xu"a/.(2001)A^ww410:494-497;Xu"a/.(2003)J!&o/.278(7):5455-5461)。胱天蛋白酶对p35的P广P!，键的裂解(在胱天蛋白酶裂解位点DQMD")在p35环的氨基节段(Asp87)与胱天蛋白酶催化三联体的半胱氨酸残基(胱天蛋白酶-8中Cys350)之间产生共价硫酯中间体。在硫酯键形成时，所述蛋白酶经历构象改变，允许裂解的环的氨基节段埋入胱天蛋白酶中，而在第2位含有Cys残基的p35的N末端插入胱天蛋白酶活性位点中，因此阻断胱天蛋白酶-8中His317残基的溶剂可及性。对水解性水分子的不可及性因此防止随后的硫酯键水解。除了p35之外，相似的病毒胱天蛋白酶抑制剂包括但非限于p49(SEQIDNO:491)和丝氨酸蛋白酶抑制蛋白CrmA牛痘基因(SEQIDNO:492)。p49抑制剂呈现与p35相似的胱天蛋白酶抑制机制，其中在p49胱天蛋白79酶识别序列TVTD^裂解时与胱天蛋白酶的活性位点形成稳定的硫酯键。使用本发明提供的方法进行筛选的靶底物可以包括病毒胱天蛋白酶抑制剂多肽，如p35、p49或CrmA多肽。修饰本发明提供的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的RSL环的方法可以容易地适应于病毒胱天蛋白酶抑制剂多肽的修饰。例如，可以对p35RSL中裂解的耙位点进行修饰，以选择对于耙底物具有改变的反应性或特异性的蛋白酶。在野生型p35中，在84-87(DQMD87)氨基酸位置发现胱天蛋白酶识别。对于病毒胱天蛋白酶抑制剂多肽进行的修饰因此可包括改变裂解序列和/或周围氨基酸残基的修饰。例如，这种修饰的胱天蛋白酶抑制剂多肽例如p35、p49或CrmA多肽可以设计为模拟希望的靶底物的裂解序列，例如疾病或病症的病因学中涉及的靶底物。在本发明提供的方法中可以对病毒胱天蛋白酶抑制剂多肽的RSL环序列进行任何修饰。本发明提供的方法中使用的病毒胱天蛋白酶抑制剂多肽如p35、p49或CrmA多肽可以是任何病毒胱天蛋白酶抑制剂多肽，包括但非限于重组产生的多肽、合成产生的多肽及通过杆状病毒纯化方法产生的p35或p49多肽。病毒胱天蛋白酶抑制剂多肽也包括多肽的等位基因变体，如p35、p49或CrmA多肽变体。b.ct巨球蛋白(aM)蛋白酶的a巨球蛋白(aM)家族包括蛋白酶抑制剂，如举例的蛋白酶抑制剂oc-2-巨球蛋白(a2M，SEQIDNO:490)，预期在本发明提供的方法中用作蛋白酶捕获剂。aM分子抑制所有类别的蛋白酶。aM蛋白酶捕获剂特征在于相似的抑制机制，包括蛋白酶对抑制剂诱饵区域的裂解。所述诱饵区域是对蛋白酶解敏感的节段，在裂解时aM分子中发生构象改变，导致蛋白酶周围结构折拢(collapse)。例如在SEQIDNO:490所示a2M序列中的诱饵区域相应于第6卯-728位氨基酸。在获得的aM-蛋白酶稳定复合物中，蛋白酶的活性位点在空间上被隔离，从而降低对正常蛋白酶底物的可及性。典型地，捕获的蛋白酶保留对于小肽底物的活性，但是丧失其与大蛋白质底物或抑制剂相互作用的能力。另外，aM分子特征在于存在反应性硫羟酸酯，通过硫羟酸酯与胺的反应使得抑制能力失活。另外，在诱饵区域裂解时发生的构象变化暴露了保守的COOH-末端受体结合结构域(RBD)。RBD序列的暴露便于从循环中除去aM-蛋白酶复合物。4.蛋白酶捕获竞争剂在本发明提供的方法中可以使用竞争剂，以调节被选择的蛋白酶对于靶底物的特异性和选择性限制。可以将竞争剂在任何时间与蛋白酶或其集合接触，如在蛋白酶与希望的蛋白酶捕获多肽接触之前或之后进行接触，或者竞争剂与希望的蛋白酶捕获多肽可以同时与蛋白酶接触。竞争剂可以是特异性竞争剂或者广谱竞争剂。特异性竞争剂被设计为模拟预定的非靶底物，从而作为预定的潜在脱耙物(off-target)。典型地，这种竞争剂未被标记，以便不选择形成的稳定蛋白酶复合物。另外，这种竞争剂以大大超过选择方案中使用的设计的蛋白酶捕获多肽的量加入，典型以过量的摩尔量加入，由此所述竞争剂结合所述集合中不希望的蛋白酶。在特异性竞争的一个实例中，将两个不同的蛋白酶捕获多肽(每个多肽均设计为模拟不同的底物识别)与蛋白酶集合接触，其中仅一个蛋白酶捕获多肽是可检测地标记的。例如，竞争剂可包括设计为具有模拟非靶底物的裂解序列的反应位点的多肽蛋白酶捕获剂。因此，竞争剂如丝氨酸蛋白酶抑制蛋白可以设计为其P4-P1'RSL残基由预定的非靶底物的裂解序列置换。所述竞争剂可以与蛋白酶捕获多肽组合用于本发明方法中，例如与另一种丝氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽组合使用，其RSL序列已经修饰为在P4-P1'位含有模拟希望的或预定的耙底物的裂解序列的氨基酸，且被标记以进行分离。因此，这两种蛋白酶捕获多肽均选择对靶裂解序列或非靶裂解序列呈现选择性的蛋白酶，但是仅那些呈现希望的靶底物特异性且被可检测地标记的稳定的蛋白酶复合物可以从反应中分离。特异性竞争剂的其它实例包括例如天然蛋白酶捕获多肽，其反应位点已经在本发明提供的方法中被修饰。实施例6例证了这种策略，其中血浆纯化的AT3丝氨酸蛋白酶抑制蛋白用作修饰的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白AT3SU1R-KI的竞争剂。广谱竞争剂也可以用于本发明提供的方法中，以限制被选择的蛋白酶的特异性和选择性。广谱竞争剂的例子包括例如含有多种天然蛋白酶抑制剂的人血浆或人血清。或者，可以产生蛋白酶捕获多肽的广泛小分子文库，其中P2、P3或P4的每个位置均是不同的，例如Acxxx-Thiaphine文库。5.变体蛋白酶捕获多肽已经修饰为在其反应位点具有改变的裂解序列的蛋白酶捕获多肽可以用于本发明提供的方法中，以用希望的或预定的耙底物选择蛋白酶。因此，蛋白酶捕获剂在其作为公认的蛋白酶裂解位点的序列区域被修饰，以选择对于靶底物具有改变的反应性或特异性的蛋白酶。例如，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白可以被修饰为在RSL环的易断裂键或其周围具有改变的裂解序列。在另一实例中，a2M可以在其诱饵区域中被修饰以具有改变的裂解序列。这种修饰的蛋白酶捕获剂可以设计为模拟希望的靶底物的裂解序列，例如疾病或病症的病因学中涉及的靶底物。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白分子的RSL环序列中的任何修饰均可以在本发明提供的方法中产生。举例的野生型丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的RSL序列的对比在下表4中示出。在下表中，P15至P5'位的编号是就成熟otl-抗胰蛋白酶分子而言(相应于SEQIDNO:l所示氨基酸序列的第367-387位氨基酸)。RSL环序列的特性为本领域技术人员所已知和/或可以通过序列对比而确定，例如通过与下表4示出的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白对比。表4:RSL环序列对比A丝氨酸蛋白酶抑制蛋白RSL环序列SEQIDNO3"Pl5PlOP4PlPl'Ps'3S3Manducasexta丝氨酸蛋白酶EGAEAAAANAFGIVPKSLILY397抑制蛋白1BManducasexta丝氨酸蛋白酶EGAEAAAANAFKITTYSFHFV398抑制蛋白1Kal-抗胰凝乳蛋白酶EGTEASAATAVKITLIiSALVE399抗凝血酶-IIIEGSEAAASTAWIAGRSLNPN400PAI-IIEGTEAAAGTGGVMTGRTGHGG401al-抗胰蛋白酶KGTEAAGAMFIiEA工PMSIPPE402PAI-ISGTVASSSTAVIVSARMAPEE403PAI-IIISGTRAAAATGTIFTFRSARLN404卵清蛋白AGREWGSAEAGVDAASVSEE405*根据Yeetal.(2001)NatureStructuralBiology8:979所述改编因此，可以修饰丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的RSL环中相应于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白反应位点中的任一或多个氨基酸的氨基酸序列(即相应于如上表4示出的P15至P5'位的任一或多个氨基酸)。典型地，作为RSL环序列的82铰链区一部分的氨基酸(即相应于P15-P9位的氨基酸)未被修饰。在一个实例中，Pl和/或pr位中的一或多个氨基酸被修饰以相应于在易断裂键两侧的那些氨基酸。在另一实例中，相应于反应位点位置P4-P2，的任一或多个氨基酸被修饰。例如，PAI-1的P4-P1，是VSARM(SEQIDNO:378)，其中在R(Pl)与M(Pl，)氨基酸之间发生裂解。可以修饰VSARM序列的任一或多个氨基酸以修饰PAI-I的裂解序列以选择具有改变的特异性的蛋白酶。实施例1例证了PAI-I的修饰，其中反应位点环中的VSARM序列被修饰为RRARM(SEQIDNO:379)。在另一实例中，反应位点环VSARM序列可以被修饰为已知的有效肽底物PFGRS(SEQIDNO:389)。这种突变PAI-1的例子如SEQIDNO:610和611示出。在另一实例中，可以在抗凝血酶III(AT3)的RSL中产生修饰。例如，AT3的P4-P1，是IAGRSL(SEQIDNO:478)，其中裂解发生在R(Pl)与S(Pl，)氨基酸之间。可以对IAGRSL序列的任一或多个氨基酸进行修饰以修饰AT3的裂解序列以选择具有改变的特异性的蛋白酶。实施例6和7例证了AT3的修饰，其中反应位点环中的IAGRSL序列被修饰为RRVRKE(SEQIDNO:498)。在另一实例中，反应位点环中的IAGRSL氨基酸序列可以被修饰为SLGRKI(SEQIDNO:479)。其它修饰的AT3多肽含有IAGRSL氨基酸序列由氨基酸序列SKGRSL(SEQIDNO:501)或者氨基酸序列PRFKII(SEQIDNO:503)置换。这种突变AT3分子的例子以SEQIDNO:497、499、500和502示出。或者及如果需要，则可以以一次一个、一次两个、一次三个等方式对P4-P2，位置的任一或多个氨基酸进行修饰，获得的修饰的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白可以在连续轮的选择中单独检测，以优化在每个修饰的位置呈现底物特异性和/或选择性的蛋白酶。在大多数情况中，置换野生型丝氨酸蛋白酶抑制蛋白反应位点环或者另一蛋白酶捕获剂中类似序列中的氨基酸残基的氨基酸残基是基于在希望的靶底物中的裂解序列而选择。靶底物蛋白是正常参与病理学中的底物，其中在指定底物序列裂解靶蛋白作为对病理进行治疗的方式(见例如美国专利发明者E·L·麦迪逊申请人:催化剂生物科学公司;托里派因斯分子研究院