专利名称：双歧杆菌中的遗传重建的制作方法
技术领域：
本发明涉及乳酸细菌中的抗生素敏感性。更特别地，其涉及双歧杆菌 种中四环素抗性基因的去除，以及去除或无效双歧杆菌种中基因的方法。
背景技术：
近几年对于针对可用抗生素增强的细菌抗性的关注已经不断增强。尽 管多数关注涉及获得的抗性，该抗性至少部分归因于医师对广谱抗生素的 广泛使用，也有一些关注是有关因食物和农业目的使用获得性抗生素抗性 基因的细菌所产生的抗生素抗性。例如，在从环境、动物和人类包括儿童 分离的微生物中四环素抗性基因的存在和分布是普遍的。在一些情况下， 抗生素抗性对于特定种类而言可能是固有的——例如，由于特定的细胞膜 特性。抗生素抗性也可通过细菌基因突变而获得，并且其可通过基因转移 从环境中的抗性细菌中获得。
在食物加工或农业生产中使用任何拥有或获得性抗生素抗性的细菌 造成在消费之前或之后的某点，抗性促进基因向其它细菌转移的潜在的理 论上的危险，所述其它细菌存在于食物中、消费食物之后人或动物的胃肠
道(GIT)中、或环境中。此类细菌的例子可发现于双歧杆菌种，例如， 动物双歧杆菌(^/MMfl"eW"附""/附"to)例如动物双歧杆菌乳酸亚种(也 ;f尔为动物双歧杆菌專'L酸亚种(5,yM06flcte/7'w附flw/附fl//5 subsp. /""/s subsp. nov.)，从前称为乳酸双歧杆菌(5折^6""c/"/w/""/y),且有时本文也 这样提及)。 一个此类菌种，动物双歧杆菌乳酸亚种菌林NCC2818， CNCMI-3446是商业上可获得的，已用作食品添加剂超过20年，并通常 被认为是安全的。最近发现，与人和动物来源的某些其它革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌一样，该细菌也有四环素抗性基因te,『存在。尽管四环素抗 性转移在理论上是可能的，但目前即使是在实验室条件下仍不可能证实这 一点。然而，从克隆实验已知来自此菌林的W『在革兰氏阳性细菌中是有 活性的，尽管在革兰氏阴性细菌中是无活性的。
然而，为排除该基因的任何意外转移的风险，需要用于从此菌林中去 除该基因的方法。也需要具有对四环素降低的抗性的菌林变体。
发明简述
本发明的一个方面描述了双歧杆菌细胞，所述细胞包含经定制的从而 缺乏有效功能基因的基因组。在某些实施方案中，双歧杆菌细胞是动物双 歧杆菌细胞，且更特别地，是动物双歧杆菌乳酸亚种细胞。本文示例了动
物双歧杆菌乳酸亚种菌林NCC卯34。
在某些实施方案中，功能基因提供了抗生素抗性；例如，功能基因是 W『并提供对四环素的抗性。在多种实施方案中，经定制的缺乏有效tetW 基因的双歧杆菌细胞比含有有效tetW基因的相当的细胞对四环素更敏感 至少5-10倍。在其它实施方案中，如利用平板扩散试验所测定的，细胞对 高于大约0.3微克每毫升的"环素浓度是敏感的。示例性实施方案的特征 是动物双歧杆菌乳酸亚种菌林NCC9034，保藏为CNCMI-3664。定制的双 歧杆菌细胞可基本上缺乏tetW基因的核酸序列。在一项实施方案中，定 制的细胞在其基因组的剩余部分是基本上未改变的。
本发明的另一方面特征在于包含上述细胞的动物双歧杆菌。 本发明的另一方面特征在于产生缺乏有效的预定功能基因的双歧杆 菌细胞的方法。该方法包括下述步骤(1)从双歧杆菌中获得预定功能基 因的上游和下游序列；(2 )用在双歧杆菌中非复制的质粒转化双歧杆菌细 胞群体，所述质粒包含该功能基因的上游和下游侧翼序列和编码选择性标 记的基因；(3)在允许含有编码质粒中选择性标记的基因的细胞生长、但 那些不具有编码选择性标记的基因的细胞不能生长的条件下培养双歧杆 菌细胞，从而选择含有整合质粒的转化体；(4 )在非选择性条件下培养转
5化体，所述条件允许细胞的生长但允许整合的质粒丢失；(5)通过在具有 和不具有选择压力的平板上影印培养菌落并选择那些对选择压力敏感的 菌落来选择已失去所整合质粒的细胞；和(6)确认对选择压力敏感的细胞 不再具有所述功能基因的功能，从而产生出缺乏有效预定功能基因的双歧 杆菌细胞。
在某些实施方案中，预定功能基因被缺失。功能基因可为提供对抗生 素增强的抗性的基因；例如，提供对四环素抗性的,w『基因。
在本文所述的某些实施方案中，缺失的或致使其失效的唯一功能基因 是预定的功能基因。
在多种实施方案中，选择压力是抗生素例如大观霉素的存在。
在某些实施方案中，质粒通过同源重组整合进基因组。整合质粒可通 过第二次同源重组而失去。
在前述方法的多种实施方案中，在非选择性条件下培养转化体至少大 约100代。
上述方法可在动物双歧杆菌种的双歧杆菌细胞上实施，更特别地在动 物双歧杆菌乳酸亚种，且甚至更特别地动物双歧杆菌乳酸亚种菌林 NCC2818细胞上实施。从对菌林NCC2818实施该方法所获得的细胞通过 动物双歧杆菌乳酸亚种菌林NCC9034来例证。
上述方法还可在长双歧杆菌/ortg"m)种的双歧杆菌细胞上实施。
本发明的另一方面特征在于动物双歧杆菌乳酸亚种细胞，如利用平板 扩散试验所测定的，其对高于大约0.3微克每毫升的四环素浓度是敏感的。 在示例性实施方案中，动物乳酸双歧杆菌细胞是菌林NCC9034。
本发明的其它特征和优势将通过参考下列的发明详述、附图和实施例 而得到理解。
附图简述
图1. pMDY28的限制性内切酶切割位点图谱，其显示出大观霉素 (spec)和氨苄青霉素(Amp)抗性标记的位置。W『侧翼序列插入Apal位点(碱基659 )和位于6840的Hindlll之间。质粒不含有用于在双歧杆 菌中复制的有效orZ。
图2.上图显示了从两个单独的突变体(命名为A和B的泳道)获得 的基因组DNA的Clal、 EcoRI、 Kpnl和Notl限制性片段的DNA印迹分 析。泳道C含有获得自用于产生突变体的野生型菌林(NCC2818)的比较 片段。下图显示了在DNA印迹上观察到的片段的大小，所述片段是获得 自突变体(A&B)的与获得自野生型菌林的那些。
图3.如利用E-TEST检测最小抑制浓度(MIC)所测定的，动物双 歧杆菌乳酸亚种菌抹NCC362 (野生型)(左图，大约16 ng/ml四环素) 和NCC9034 (右图，大约0.3 ng/ml四环素)对抗生素四环素的抗性。
图4.NCC362 (上图)和NCC9034 (下图)菌林的W基因座图谱，显 示出后一菌林中W『基因的缺失。用于产生敲除突变体的W『侧翼序列 显示于两图中的阴影条形中。
图5. pMDY24的限制性内切酶切割位点图谱，显示出氯霉素(Cm) 和氨节青霉素(Amp )抗性标记的位置。5W7卵側翼序列插入EcoRI位点 (碱基l)和位于5766的Sail之间。质粒不含有用于在双歧杆菌中复制的 有效o"'。
图6. NCC2705 (上图)和NCC9035(下图)菌林的说W卵基因座图谱， 显示出后一菌林中i5州/卵基因缺失。用于产生敲除突变体的5W/卵侧翼 序列显示于两图中的阴影条形中。
图7.图A显示在第二次重组事件和在Bi^/M缺失方法的最后步骤中 质粒解离后获得的氯霉素敏感克隆的PCR分析。来自两个菌落(第l&2 泳道)的PCR片段的大小表明5/W卵(3885bp)的缺失，然而来自IO个其 它菌落的PCR片段的大小表明5W/卵基因座的野生型构型。图B显示了 取自两个单独的突变体(第l&2泳道)的基因组DNA的HindIII限制性 片段的DNA印迹分析。泳道3含有获得自用于产生突变体的野生型菌抹 (NCC2705)的比较片段。下图显示了在DNA印迹上观察到的片段的大 小，所述片段是获得自突变体(1&2)的与获得自野生型菌抹(3)的那些。失功能基因的通用策略的图解。该策略是 用于本文所述的方法中以及实施例中策略的一个例子。简要地，将目的突 变区域(在此实施例中为突变的似『基因座)克隆进大肠杆菌(E.coli) 质粒中(A)并转化至双歧杆菌细胞中(B)。通过同源重组获得质粒向双 歧杆菌基因组的整合，并通过在含有合适抗生素(在本实施例中为大观霉 素)的生长培养基上平板接种细胞进行选择(C)。在无抗生素选择下复 制细胞以便允许导致质粒解离的第二次同源复制事件(D)且染色体区域 以如图A中所^t粒相同的构型突变。等位基因交换之后含有野生型基因 座区域的质粒不能在双歧杆菌中复制，并且在无抗生素选择的培养基上培 养的细胞复制过程中被消除(E)。用合适的分子生物学技术例如PCR或 DNA印迹分析来检查最终的突变细胞。
说明性实施方案详述 细月包和培养物
在本发明的几方面的第一方面提供了双歧杆菌细胞，例如来自动物双 歧杆菌或长双歧杆菌的那些，其包含定制的从而缺乏或基本缺乏有效的预 定功能基因的基因组。任何特定的预定基因的定向破坏或缺失都还未在双 歧杆菌中完成。
在一项实施方案中，双歧杆菌是来自食品或饲料加工或者饮食或药物 补充物中所用菌林的细胞。合适的双歧杆菌菌林包括但不限于动物双歧杆 菌和长双歧杆菌的菌林。另外合适的为分类或未分类的其它双歧杆菌，其 被有意地添加至食品或饲料产品，或大量发现于食品或饲料产品中。其它 有用的双歧杆菌种包括由于制造或生产食品或饲料、或通过其它商业过 程、或通过人或动物对此类产品的消费而释放进环境的任何细胞。双歧杆 菌种还可以有意作为人类或动物，包括人类嬰儿和动物幼崽的补充物的多 种形式获得，例如用来治疗胃肠状况例如腹泻、或促进健康的肠道微生物 区系。在一项实施方案中，细胞是动物双歧杆菌乳酸亚种细胞。
尽管所要破坏或缺失的基因可为任何功能基因(例如，为细胞编码功
8能的任何基因)，在一项目前优选的实施方案中，功能基因提供抗生素抗 性。在具体的实施方案中，基因是获得性抗生素抗性基因，即，认为基因 不是双歧杆菌细胞中当前发现的内在基因，而认为其为非外在的，例如来 自环境或另一生物。在另一实施方案中，功能基因编码酶或酶抑制剂，例 如能够负面影响食品加工或生物的其它目的特性(例如，促进健康肠道微 生物区系)的抑制剂。本领域技术人员将理解，多种此类抑制剂可由一种 或多种基因编码。在一项实施方案中，抑制剂是蛋白酶抑制剂。
在特别的实施方案中，基因产物提供了对四环素的抗性。在一项实施 方案中，功能基因是W『。已知W『基因分布相对广泛。在一项实施方
案中，动物双歧杆菌乳酸亚种菌林NCC2818目前优选作为含有待缺失/W『 基因的细胞来源。W『基因座序列显示于SEQIDNO:l中。
在某些实施方案中，野生型细胞与本发明的细胞即具有缺失基因的细 胞相比对更高浓度的抗生素有抗性。微生物细胞对特定抗生素的敏感性可 以多种方式进行测定。测定抗生素敏感性的一种方便的方法是利用平板扩 散试验，例如E-试验(由ABBIODISK在商业上生产)。E-试验系统使用在
确的最小抑制浓度(MIC)。
在目前优选的实施方案中，本发明的双歧杆菌细胞具有^皮破坏的W酽 基因，但无其它功能基因缺失，且该细胞比含有有效W『基因的对照野生 型细胞对四环素更敏感至少5倍。在另一实施方案中，具有失效的tetW基 因的双歧杆菌细胞比含有有效W『基因的对照细胞更敏感至少10倍。
在一项实施方案中，如用平板扩散试验所测定的，具有失效的W『基 因的双歧杆菌细胞对高于大约0.3pg每毫升的四环素浓度是敏感的。
如本文所用的，与基因组有关的术语"定制的，，表明该基因组已通过人 手进行处理或修饰。在一些实施方案中，通过缺失特定基因的整个基因座 来定制基因组。在其它定制的基因组中，调节序列中的缺失或突变可提供 预定基因功能性的完全或至少基本丧失。除了那些经操作而丧失整个基因 座、基因或甚至编码序列的基因组外，定制的基因组包括仅仅具有小的改变(包括插入或缺失)的那些，所述改变例如导致功能基因的功能丧失或 基本丧失的点突变或移码突变。
尽管定制导致有效性的完全丧失是优选的，但这也许不总是容易完成 的，并且有时某种活性的基本丧失将是有用的。如本文所用的"基本上丧失" 表明多于一半的功能活性丧失，即具有定制基因组的细胞具有由预定功能 基因所提供的功能属性的一半以下。例如，当与其所来源的亲本细胞相比
较时，具有关于酶的定制基因组的细胞将具有该酶的低于50%的活性。备 选地，具有定制基因组的细胞可产生少于50%的与预定功能基因相关的基 因产物。本领域:汰术人员将理解，在处理某些功能活性中，具有少于50% 的特定功能基因的基因产物的细胞可能不总是丧失细胞中可测定活性的 50 % 。
优选在定制的基因组中，在其本身编码序列中至少有一个点突变或移 码突变，以便阻止完整功能基因向与具有定制基因组的细胞邻近的、或其 环境中的其它细胞转移。因此，如本文所用的，"定制"需要有基因组的操 作，其中该操作针对预定功能基因有效性的丧失或基本丧失。
因此，在一项实施方案中，功能基因是完全缺失的、或至少部分缺失 的。该实施方案确保了没有功能性抗生素抗性基因可不经意地转移至环 境、其它肠道樣i生物区系、或环境中的其它生物中，并且还确保了甚至没 有一个破坏的基因可被转移以仅通过下游事件而被恢复。因此，在优选的 实施方案中，根据本发明此方面的双歧杆菌细胞基本上缺乏W『基因的核 酸序列。在一项实施方案中，编码序列至少基本上缺失。备选地，与预定 功能基因相关的一个或更多编码序列也可被缺失。例如功能基因的在细胞 中无其它功能的结合序列或调节序列可被缺失。在其它实施方案中，具有 定制基因组的细胞具有更精细的改变，例如导致预定基因的功能性丧失或 基本丧失的点突变或移码突变，例如，定制的基因组的功能基因的有效性 降低。
另外在优选的实施方案中，双歧杆菌细胞在其基因组的剩余部分中是 基本上未改变的。换句话说，除了丧失功能基因的有效性，并且优选该功
10能基因完全或至少基本上从细胞缺失外，双歧杆菌细胞与其来源的细胞 (例如亲本细胞)是相同的，或接近相同的。在已经经过长时间适应从而 提供目的特性的菌抹或培养物的情况下，这是特别有用的，所述目的特性 对于例如食品加工，例如乳制品例如酸乳等的发酵是有用的。例如，在下
面更加详细描述的一项实施方案中，其中动物双歧杆菌乳酸亚种NCC2818 是起始(亲本)细胞，W『是预定的功能基因的情况下，所获得的细胞是 动物双歧杆菌乳酸亚种NCC卯34，其定制的基因组与亲本区别仅在于缺乏 预定的W『基因。如预期的，除了 NCC卯34细胞所展示出来的对四环素 增加的敏感性，细胞在表型上也是类似的。前述实施方案对用于帮助治疗 临床状况的菌林也是有用的，特别是那些已经选择或开发而具有目的功能 例如快速的传代时间或在肠道中延长的停留时间的菌林。
在其几个方面的另一方面，本发明提供了双歧杆菌的培养物，其包含 具有缺失的、或至少失效的功能基因的细胞。此类培养物的用途无需详细 讨论，因为本领域技术人员将理解它们。在一项实施方案中，培养物包含 来源于已知培养物的细胞，该已知培养物经发现或测定在其基因组中具有 不期望的功能基因。在一项实施方案中，基因是外源获得性基因，例如编 码抗生素抗性的基因。在一项实施方案中，基因是四环素抗性基因。在一 项特定的实施方案中，基因是似『基因，且在特别的实施方案中相关的 W『基因序列是SEQIDNO:1,中提供的序列。
制备细胞和培养物的方法
在另一方面，本发明提供了生产缺乏有效预定功能基因的双歧杆菌细 胞的方法。该方法包含下述步骤
从双歧杆菌中获得预定功能基因的上游和下游序列；
用质粒转化双歧杆菌细胞群体，所述质粒在双歧杆菌中是非复制的且 包含所述功能基因的上游和下游侧翼序列、以及编码选择性标记的基因；
在仅允许含有编码质粒中选择性标记的基因的细胞生长的条件下培 养双歧杆菌细胞，从而选择已将质粒整合进染色体的功能基因的基因座上的转化体；在非选择性条件下培养转化体，所述条件允许细胞的生长但允许整合质粒的丟失；通过在具有和不具有选择压力的平板上影印培养菌落并选择那些对选择压力敏感的菌落来选择已失去所整合质粒的细胞；确认对选择压力敏感的细胞不再具有所述功能基因的功能，从而产生 缺乏有效预定功能基因的双歧杆菌细胞。如上面对细胞和培养物的描述，优选双歧杆菌细胞来自食品或饲料加 工中所用的细胞，例如动物双歧杆菌或长双歧杆菌。考虑将其它双歧杆菌 用于本文，例如那些用于人类或动物临床治疗的、或其中预防所用的双歧 杆菌。在一项实施方案中，用作起始细胞的细胞是动物双歧杆菌乳酸亚种。 在本文例证的某些实施方案中，动物双歧杆菌乳酸亚种细胞是菌林 NCC2818 (商业上可以"BB12"获得自Chr. Hansen )。缺失的基因可为任何功能基因(例如，为细胞编码功能的任何基因)， 在一项目前优选的实施方案中，功能基因提供抗生素抗性。在具体的实施 方案中，基因是获得的抗生素抗性基因，即，认为基因不是双歧杆菌细胞 当前发现内在的，而认为其为外在的，例如来自环境或另一生物。在一项实施方案中，致使失效或缺失的基因编码对四环素的抗性。在 一项实施方案中，功能基因是W^。在一项实施方案中，W『基因具有如 SEQ ID NO:l所提供的序列，其代表了动物双歧杆菌乳酸亚种NCC2818 中整个W『基因座。在一项实施方案中，起始细胞是动物双歧杆菌乳酸亚 种细胞菌林NCC2818。这些细胞的样品按照布达佩斯条约的规定已保藏于 巴斯德研究所的专利保藏机构中。当动物双歧杆菌乳酸亚种NCC2818是 起始细胞时，W『是预定的功能基因，所获得的细胞是动物双歧杆菌乳酸 亚种NCC卯34，其样品也按照布达佩斯条约的规定已保藏于巴斯德研究所 的专利保藏机构中。BIODISK)是检测细胞对抗生素敏感性的优选途径。然而，所测定的抗生 素对特定生物的最小抑制浓度(MIC)是比较相对敏感性的便利途径。在目前优选的实施方案中，本发明的双歧杆菌细胞具有被破坏的或缺 失的似『基因，但没有其它功能基因在其功能方面受到损失或破坏。在一 项实施方案中，由该方法产生的细胞比含有有效/W『基因的对照野生型细 胞对四环素更敏感至少5倍。更特别地，所获得的双歧杆菌细胞比含有有 效W『基因的对照细胞对四环素更敏感至少10倍。在其它实施方案中， 细胞比保留似W基因的对照细胞更敏感20、 30、 40或甚至50倍或更多倍。 在特定的实施方案中，如利用平板扩散试验或E-TEST所测定的，所获得 的双歧杆菌细胞对高于大约0.3jig每毫升的四环素浓度敏感。如上所述，对于细胞和培养物，在一项实施方案中，功能基因被完全 缺失，或至少基本上缺失，使得没有功能性抗生素抗性基因可不经意地转 移至环境、其它肠道^t生物、或环境中的其它生物中。类似地，甚至没有 一个被>5皮坏的基因可转移，因为基本上所有的序列已从生物丢失。因此， 在此类实施方案中，根据该方法制备所获得的双歧杆菌细胞基本上缺乏 似『基因的核酸序列。在多项实施方案中，编码序列至少基本上缺失，且 甚至与预定功能基因相关的非编码序列也被缺失。在目前优选的实施方案中，除了缺失或致使失效的基因外，所获得的 双歧杆菌细胞基因組基本上未改变。优选地，除了致使失效或缺失的功能 基因外，所获得的双歧杆菌细胞的基因组与其来源的细胞(桐如，亲本细 胞)的是相同的或近乎相同的。因此，由本方法所产生的细胞将与其来源 的亲本、野生型或原始型菌林具有基本上或甚至完全相同的功能或属性 (例如营养需求、酶谱、生长特性、风味产生、和酸产生)。因此，如此 产生的细胞可用于产生有用的双歧杆菌培养物，其包含具有缺失的、或至 少失效的功能基因的细胞。当细胞来自已知培养物时这是特别正确的，其 中发现已知培养物在其基因组中具有不希望的功能基因，例如获得的抗生 素抗性基因，例如四环素抗性基因，特别地W『基因。在本方法的一项实施方案中，质粒编码另外的选择性标记。在某些实13施方案中，选择性标记提供了抗生素抗性。在此类实施方案中，筛选整合 质粒的转化体的选择性条件包括以对应于抗性标记的抗生素形式的选择 压力。在一项实施方案中，抗生素是大观霉素，在另一实施方案中其为氯 霉素。在某些实施方案中，质粒通过同源重组整合进基因组，优选地位于上游和/或下游側翼序列；发生交换事件，从而允许环形质粒变为整合进双歧 杆菌基因组。在另一实施方案中，整合的质粒通过第二次同源重组事件而 丟失，优选地伴随着丟失全部或基本上全部的预定功能基因——例如，fe《『 基因座或其它靶向基因。如上所述，在优选的实施方案中，缺失或致使失效的唯一功能基因为 预定的功能基因。在一项实施方案中，在非选择条件下培养转化体足够的代数，从而允 许不需要的序列丟失，包括预定的功能基因。在一项实施方案中，培养至 少100代将促进此类丢失。提供下列实施例进一步解释本发明的这些或其它方面，并不应理解为 将本发明限制至所举例的内容。实施例非复制性质粒的构建用下列引物对扩增起始密码子上游和其终止密码子下游两側的 大约3kb的DNA片段mdyl00: 5，- CGCACCGGGCCCCCTCACGCAAACTCTACG國3， (SEQ ID NO.:2);mdy98: 5，-TGTGGTGTATCACATGTGATTGTCCTCCCTTTA-3' (SEQ ID NO.:3)和mdy99: 5，-AGGACAATCACATGTGATACACCACAGCGAGG-3" (SEQ ID NO.:4)mdy89: 5，- CCGTCCAAGCTTTCTATCGCGAGATAATCAGC國3，) (SEQ ID NO.:5)。将获得的扩增产物用作模板，利用引物mdy100和mdy89来进行融合 PCR，其获得含有通过tetW的起始和终止密码子连接起来的tetW上游和 下游区域的DNA片段。通过HindIII和Apal在其末端消化DNA片段并将其克隆进pJL74 (Ledeaux和Grossman, / 1995 Jan; 177(1):166-75.)中位于HindIII和Apal之间。所获得的质粒命名为pMDY28 (SEQ ID NO.:6)。 图1提供了详细的限制性内切酶位点图语。插入pJL74从而形成pMDY28 的DNA片段的序列得到验证并显示与来自动物双歧杆菌乳酸亚种 NCC2818染色体的序列相同。这表明在PCR介导的DNA扩增过程中和 在随后的DNA操作中均未引入突变。动物双歧杆菌的转化和等位基因交换利用Argnani爭人1996 (Af/m^'o/og);;142:109-14.)所述的方法将质粒 pMDY28转化入动物双歧杆菌细胞中。将细胞置于每升含有100mg大观 霉素的MRS平板上。厌氧选择所获得的specK转化体。由于质粒pMDY28 不能在动物双歧杆菌中复制，specR菌落最可能来自经单次交换事件通过同 源重组而整合进动物双歧杆菌基因组的质粒。从前还未报道过非复制性质 粒向双歧杆菌细胞的成功转化。在无抗生素选择的MRS培养液中培养specR转化体大约100代从而允 许质粒丢失，并将单独的菌落平板接种于MRS琼脂培养基上。为了确保 质粒已从动物双歧杆菌基因组中移除，通过在添加和不添加大观霉素的 MRS琼脂上影印培养测试单独菌落的大观霉素抗性的丢失。在所测试的750个菌落中，163个菌落是大观霉素敏感的(21% )， 表明质粒已通过第二次交换事件的发生从动物双歧杆菌染色体中切除。第二次此事件可导致两种基因组构型i)回复至带有与野生型细胞相同的/W『基因座的野生型构型，或者ii)缺失fef W。为了区别这两种可能性，利用下列引物对通过直接菌落PCR测试了 上述163个大观霉素敏感菌落中135个菌落的W『缺失mdy94: 5'-GAGCATGTATTCGGTGTCG-3， (SEQ ID NO.:7)和 mdy95: 5'-GATTTGCCCTATCGACTG-3， (SEQ ID NO.:8)。 在135个所测的菌落中，两个产生了 1034bp的DNA条带，表明似『 缺失，而其它获得了与野生型细胞所获得的相似的更高分子量(2949)的 PCR片段(见图2，小图B)。f"『缺失突变体的DNA印迹分析利用从经PCR分析所鉴定的两个候选突变体提取的基因组DNA，通 过PCR和DNA印迹分析证实了 te^F的缺失(见图2，小图A&B)。用 限制性酶(ClaI、 EcoRI或Notl)消化染色体DNA样品。DNA印迹与来自 pMDY28的DNA杂交。DNA印迹杂交确认W『已从两个候选突变体的 基因组中缺失(泳道A&B)。仅保留了一个菌株，随后将其命名为 NCC卯34。动物双歧杆菌乳酸亚种菌株NCC9034相对于NCC2818的抗生素敏感性测试将动物双歧杆菌乳酸亚种野生型菌林NCC2818的四环素敏感性与显 示出缺失了基本上全部W『基因的衍生菌抹NCC卯34相比较。使用商业 化的E-TEST(AB BIODISK)测定每个菌株的四环素MIC。结果显示于图3中。尽管菌林NCC2818具有16 pg/ml的MIC， NCC卯34对四环素更加敏感，具有仅大约0.3照/ml的MIC。因此， NCC卯34比其亲本野生型菌林NCC2818对四环素更敏感大约50倍。该 敏感表型与tetW基因功能性的丧失完全一致。如上面DNA印迹分析中所 看到的，这得到了基因分析的支持。16编码蛋白酶抑制因子蛋白质的长双歧杆菌基因(B10108)的缺失 非复制型质粒的构建
利用下列引物对扩增B10108两侧大约3kb的DNA片段 mdy82: 5，國CGACCCAAGCTTGGATCGGCTCGTGCATCATTGC画3， (SEQ ID NO.:9);
mdy83: 5，-GCAAACCGTACCTCAATACC -3， (SEQ ID NO.:IO)和 mdy84: 5'-CGACCCAAGCTTGCAGTCCGTCAATTAGGGTG-3" (SEQ ID NO. :11)
mdy85: 5，匿CGTTGCTGACGTTGCGGTTC-3，) (SEQ ID NO.:12)。
利用Ecorl和HindIII消化用mdy82和mdy83所获得的PCR产物。 通过HindIII和Sail消化用mdy84和mdy85所获得的PCR产物。
通过它们共同的HindIII限制性位点连接扩增的DNA片段，并通过三 路连接将其克隆进入pJH101(Ferrari， F.R.爭入，/ J ""en》/. (1983) 154:1513-1515)在EcoRI和Sail之间。将所获得的质粒命名为pMDY24 (SEQIDNO.:13)。 pMDY24详细的限制性内切酶位点图在图5中提供。
长双歧杆菌的转化和等位基因交换
根据Argnani爭人1996 (Af/m^Zo/ogv;142:109-14)所述的方法将质粒 pMDY24转化进长双歧杆菌NCC2705细胞中，只是在生长培养基中省去 蔗糖。将细胞涂布在含有每升3.5mg氯霉素的MRS平板上。厌氧选择所 获得的cmR转化体。因为质粒pMDY24在长双歧杆菌中不能复制，cmR 菌落最可能来自于经单次交换事件通过同源重组整合进长双歧杆菌基因 组的质粒。
在将单独的菌落平板接种于MRS琼脂培养基之前，在无抗生素选择 下培养cmR转化体大约100代从而允许质粒丢失。为确保质粒已从长双歧 杆菌基因组中移除，通过在添加和不添加氯霉素的MRS琼脂上影印培养 来测试个体菌落的氯霉素抗性的丢失。
在所测试的200个菌落中，22个菌落是氯霉素敏感的(11%)，表明质粒已通过第二次交换事件的发生从长双歧杆菌染色体中切除。
第二次交换事件可导致两种基因组构型
i) 回复至带有与野生型细胞相同的B10108基因座的野生型构型，或
者
ii) 缺失B10108。
为了区别这两种可能性，从22个氯霉素敏感菌落的12个中提取染色
体DNA。利用下列引物对通过PCR测试了染色体DNA中B10108的缺失
mdy27: 5，-TCGGAAGATCTCATGGTCAACGAGTTCGC-3， (SEQ ID NO.:14)和
mdy39: 5'画TAGTACTAAGCTTCTTGAGCTCTTCCTTCTGC-3' (SEQ ID NO.:15)。
在所测的12个菌落中，两个显示出3885bp的PCR片段，表明B10108 的缺失(图7，小图A，泳道l-2)。测试的其它IO个菌落导致与野生型细胞 所获得的片段相似的5311 bp的较大PCR片段(见图7,小图A，泳道 3-12)。
B10108缺失突变体的DNA印迹分析
利用从如上所述的经PCR分析所鉴定的两个候选突变体提取的基因 组DNA，通过PCR和DNA印迹分析证实了 B10108的缺失，并显示于图 7。用限制酶(EcoRI和HindIII)消化染色体DNA样品。用来自pMDY24 的DNA与DNA印迹杂交。DNA印迹分析确认B10108基因已从两个候选 突变体的基因组中缺失(图7，泳道A和B)。仅保留了一个菌林，随后 将其命名为NCC卯35。
权利要求
1.双歧杆菌细胞，其包含经定制从而缺乏有效功能基因的基因组。
2. 权利要求l的双歧杆菌细胞，其为动物双歧杆菌细胞。
3. 权利要求2的双歧杆菌细胞，其为动物双歧杆菌乳酸亚种细胞。
4. 权利要求1的双歧杆菌细胞，其为动物双歧杆菌乳酸亚种菌林NCC卯34。
5. 权利要求1的双歧杆菌细胞,其中所述功能基因提供了抗生素抗性。
6. 权利要求5的双歧杆菌细胞，其中所述功能基因是似『。
7. 权利要求6的双歧杆菌细胞，其与含有有效如『基因的对照细胞相比对四环素更敏感至少5倍。
8. 权利要求7的双歧杆菌细胞，其与舍有有效w『基因的对照细胞相比对四环素更敏感至少10倍。
9. 权利要求8的双歧杆菌细胞，如利用平板扩散试验所测定，其对高于大约0.3微克每毫升的四环素浓度敏感。
10. 权利要求9的双歧杆菌细胞，其为动物双歧杆菌乳酸亚种菌林NCC9034。
11. 权利要求1的双歧杆菌细胞，其基本上缺少W『基因的核酸序列。
12. 权利要求1的双歧杆菌细胞，其在其基因组的剩余部分中基本上未改变。
13. 动物双歧杆菌的培养物，其包舍权利要求12的细胞。
14. 生产缺乏有效预定功能基因的双歧杆菌细胞的方法，其包括步骤从双歧杆菌中获得预定功能基因的上游和下游序列；用在双歧杆菌中不复制的质粒转化双歧杆菌细胞群体，所述质粒包含功能基因的上游和下游侧翼序列和编码选择性标记的基因；在允许含有编码质粒中选择性标记的基因的细胞生长、但那些不具有编码所述选择性标记的基因的细胞不能生长的条件下培养所述双歧杆菌细胞，从而选择含有整合质粒的转化体；在非选择性条件下培养转化体，所述条件允许细胞的生长但允许整合质粒的丟失；通过在具有和不具有选择压力的平板上影印培养菌落并选择那些对选择压力敏感的菌落来选择已失去所整合质粒的细胞；确认对选择压力敏感的细胞不再具有所述功能基因的功能，从而产生缺乏有效预定功能基因的双歧杆菌细胞。
15. 权利要求14的方法，其中所述预定的功能基因被缺失。
16. 权利要求14的方法，其中所述功能基因赋予对抗生素增强的抗性。
17. 权利要求16的方法，其中所述抗生素是四环素。
18. 权利要求17的方法，其中所述功能基因是W『。
19. 权利要求14的方法，其中所述选择压力是抗生素的存在。
20. 权利要求19的方法，其中所述抗生素是大观霉素。
21. 权利要求14的方法，其中所述质粒通过同源重组整合进基因组。
22. 权利要求21的方法，其中所述整合的质粒通过第二次同源重组而丟失。
23. 权利要求15或21的方法，其中缺失或致使失效的唯一功能基因是所述预定的功能基因。
24. 权利要求14的方法，其中在非选择条件下培养转化体至少大约100代。
25. 权利要求14的方法，其中双歧杆菌细胞是动物双歧杆菌细胞。
26. 权利要求14的方法，其中双歧杆菌细胞是动物双歧杆菌乳酸亚种细胞。
27. 权利要求14的方法，其中双歧杆菌细胞是动物双歧杆菌乳酸亚种NCC2818，且所获得的细胞是动物双歧杆菌乳酸亚种NCC9034。
28. 权利要求14的方法，其中双歧杆菌细胞是长双歧杆菌细胞。
29. 动物双歧杆菌乳酸亚种细胞，如利用平板扩散试验所测定，其对高于0.3微克每毫升的四环素浓度敏感。
30. 权利要求30的动物双歧杆菌乳酸亚种细胞，其为菌林NCC9034。
全文摘要
公开了包含经定制从而缺乏有效功能基因的基因组的双歧杆菌。还公开了制备此类细胞的方法。该方法用于制备双歧杆菌细胞，其缺少某些功能性抗生素抗性基因，如tetW，并且对抗生素如四环素敏感。
文档编号C12N1/20GK101517076SQ200780033914
公开日2009年8月26日 申请日期2007年8月17日 优先权日2006年8月18日
发明者F·阿里戈尼, M·戴雷 申请人:雀巢产品技术援助有限公司