专利名称：：转基因作物的抗性治理策略的制作方法转基因作物的抗性治理策略相关申请本申请要求2006年12月22日提交的美国临时申请系列号60/871,671的优先权，该临时申请的内容通过引用整体并入本文。发明领域本发明涉及治理抗性害虫的发展的方法。发明背景昆虫、线虫和相关的节^L动物每年在美国估计破坏15%的农作物，而在发展中国家破坏的比例更高。单单在美国，这些害虫每年造成的作物损害就超过1000亿美元。另外，与杂草及寄生性和腐生性植物的竟争也造成更多的潜在产量损失。这种损害有些是当植物病原体、昆虫和其他此类土传害虫(soilbomepest)在种子种植后攻击种子时在土i裏中发生的。例如在玉米的生产中，大部分的损害是由根虫(rootworm)(啃食或以别的方式损害植物的根的害虫)和由切根虫(cutworm)、欧洲玉米螟和其他啃食或损害植物的地上部分的害虫造成的。有关害虫攻击农作物的类型和机制的一般描述例如在以下文献中提供Metcalf(1962),DeWn^"vecmc//"犯c&,4thed.(McGraw-HillBookCo.,NY)和Agrios(1988),P/awZPfl^o/ogy,3ded.(AcademicPress,NY)。在与害虫进行的季节性斗争中，农场主们必须施用几十亿加仑的合成杀虫剂来抗击这些害虫。但是，合成杀虫剂会造成许多问题。它们昂贵，单单美国农场主每年就差不多花掉80亿美元。它们促使抗杀虫剂害虫的出现，而且它们会损害环境。8由于关注到杀虫剂对公众健康和环境健全的影响，人们已作出了极大的努力来寻找减少化学杀虫剂使用量的方法。最近，这个努力在很大程度上集中在开发经工程改造能表达衍自微生物的昆虫毒物的转基因作物。例如，Estruch等人的5，877,012号美国专利公开了将来自诸如芽孢杆菌属C8flcz7/w力、假单胞杆菌属(尸5ewAw2o朋力、棒形杆菌属(C/"v仏flcter)和根瘤菌属(W/^o&Mm)的微生物的蛋白质克隆到植物中并在植物中表达，以获得对诸如小地老虎(blackcutworm)、行军虫、几种钻心虫(borer)的害虫和其他昆虫害虫有抗性的转基因植物。Privalle等人的PCT出版物WO/EP97/07089教导了用编码过氧化物酶的重组DNA序列转化单子叶植物如玉米，以保护植物免遭玉米螟、穗虫(earworm)和切根虫的啃食。Jansens等人(1997)Oo/37(5):1616-1624报道了含有编码苏云金杆菌(S""7/w/力Mr/"g,'e朋z;y，&)结晶蛋白的基因的转基因玉米的产生，该玉米控制了两代的欧洲玉米螟(ECB)。Kozid等人的5，625，136号和5,859,336号美国专利报道说，用来自Bt的5-内毒素编码基因转化玉米产生了ECB抗性得到改进的转基因玉米。Armstrongda/.，inCra/5Wewce'35(2):550-557(1995)提供了表达Bt杀昆虫蛋白的转基因玉米的田地试验综合报告。对环境友好的害虫控制方法是使用衍自Bt这种土壤细菌的杀虫晶体蛋白，这种蛋白常称为"Cry蛋白"或"Cry肽"。Cry蛋白是球状蛋白质分子，在Bt孢子形成阶段的后期以结晶形式作为前毒素(protoxin)积累。晶体被害虫吞食后，在幼虫的碱性中肠环境中溶解释放出前毒素。前毒素(130kDa)被肠道蛋白酶转化成毒性片段(66kDaN末端区域)。许多这些蛋白质对特定的目标昆虫毒性很大，但对植物和其他非目标生物无害。已使一些Cry蛋白在作物中进行重组表达，以提供抗害虫转基因植物。在这些植物当中，Bt转基因棉花和玉米已得到广泛种植。有很多Cry蛋白已得到分离、表征和根据氨基S殳序列同源性进行了分类(Crickmore"a/"1998，A^cra&W.Afo/.及'o/.Tev.,62:807-813)。这个分类方案为新发现的Cry蛋白的命名和归类提供了系统性机制。Cryl分类法是已知最好的分类法，包含的cry基因数目最多，目前总数超过130个。西方玉米根虫(WCRW)会在大豆中产卯，也可能会在其他的作物产地中产卵，其有一种生物型(biotype)目前能够给第一年玉米(不计划在其后种植玉米(systematicallyfollowedcorn)的玉米)造成重大伤害。这个生物型常称为第一年玉米根虫或抗4M卡(rotation-resistant)玉米根虫。当根虫卵保留在土壤中超过一年时，第一年玉米也可能易受根虫伤害。在这个情况中，产在土地中的卯在随后一年中保持休眠，然后在第二年孵化，此时玉米可能在两年轮作周期中再被种植。这种根虫活动性被称为长期滞育(extendeddiapause),通常涉及北方玉米根虫(NCRW),特別是美国玉米带(ComBelt)的西北部地区的北方玉米根虫。此外，包括美国在内的大多数国家在使用转基因作物时都有详尽的注册要求，以使抗性害虫的发展减至最低，从而延长已知的生物杀虫剂的有用寿命。庇护区(RefUge)的一个最普通的实例是，在给定的作物中，所种植的种子有80%可含有能杀死目标害虫(如WCRW)的转基因事件，但20%的种子必须不含该转基因事件。这种庇护区策略的目的是防止目标害虫发展对转基因作物产生的特定生物杀虫剂的抗性。由于在80%转基因区域中达到成熟的目标昆虫很可能会对那里所用的生物杀虫剂有抗性，该庇护区能让对转基因种子中所用的生物杀虫剂没有抗性的成体WCRW昆虫发育。结果，非抗性昆虫与抗性昆虫交配，并且由于抗性基因通常是隐性的，非抗性昆虫使得下一代昆虫中的大部分抗性被消除。这个庇护区策略的问题是，为了产生易感昆虫，所种植的作物中有一些必须对害虫易感，从而会降低产量。如上所述，一个关注的问题是会出现抗性ECB、WCRW或其他害虫。对抗性的发展进行反击的一个策略是，选择表达高水平杀昆虫蛋白的重组玉米事件，使得害虫咬转基因玉米植林一口或几口就会造成该害虫至少完全停止啃食，并随后发生死亡，即使该害虫对于抗性性状是杂合的(即该害虫是抗性害虫与非抗性害虫交配的结果)。另一个策略是，在同一植物中或在接近的植物中，以重组事件的形式并入第二ECB或WCRW特异性杀昆虫蛋白，例如另一Cry蛋白或者别的杀昆虫蛋白如重组酰基脂质水解酶或其杀昆虫变体。参见例如WO01/49834。优选地，第二毒素或毒素复合物会具有与第一毒素不同的作用才莫式，且优选地，如果受体参与到昆虫对重组蛋白的毒性的话，同一植物或接近的植物中的两种或多种杀昆虫蛋白的每一种的受体会互不相同，使得如果某个受体发生功能变化或某个受体发生功能损失而造成对特定杀昆虫蛋白的抗性的话，那么该功能变化或功能损失不应且可能不会影响其余的毒素的杀昆虫活性，所述其余的毒素会被证实能结合与该造成克隆到植物中的两种杀昆虫蛋白之一的功能损失的受体不同的受体。因此，一个或多个第一转基因和一个或多个第二转基因优选对同一目标昆虫有杀虫作用，和无竟争地结合目标昆虫的肠膜中的不同结合位点。结合。这可以想到的做法是，用化学杀虫剂对重组种子进行处理，使得杀虫控制量的化学杀虫剂扩散到根部周围的区域，从而保护根部组织免受目标害虫侵扰，只要化学杀虫剂持续或根组织保持在分散到土壤中的杀虫剂的区域当中。杀虫剂常规应用形式的另一替代方案是用杀虫剂处理植物种子。使用杀真菌剂或杀线虫剂来保护种子、幼根和苗在种植和发芽后免受攻击，和使用低水平的杀虫剂来保护例如玉米种子免受线虫影响，这些用法已使用了相当长时间。用杀虫剂处理种子的优点是，在提供对种子的保护的同时，又使所需的杀虫剂量减至最低，和减少与杀虫剂的接触量和为达到在田地控制害虫所需的不同田地应用的次数。通过将杀昆虫剂直接应用到植物种子来控制害虫的其他实例在例如5,696,144号美国专利中l是供，该专利公开说，用1-芳基吡唑化合物以500g/公担(quintal)种子的比例处理种子，从中生长的玉米植株所遭受的ECB啃食损害比从未经处理的种子生长的对照植抹少。另外，Tumblad等人的5,876,739号美国专利(及其母专利5，849，320号美国专利)公开了控制土传昆虫的方法，所述方法涉及用含有一种或多种多聚体粘合剂和某种杀昆虫剂的涂料处理种子。这个参考文献提供了它确认为可用于这个涂料的候选杀昆虫剂的杀昆虫剂列表，还有多种潜在目标昆虫的名称。虽然植物遗传工程的最新进展已改进了不用化学杀虫剂就能保护植物免受害虫侵扰的能力，而且虽然诸如用杀虫剂处理种子的技术已减少了杀虫剂对环境的有害影响，但仍有很多问题限制着这些方法在实际田地条件下的成功应用。昆虫抗性治理(insectresistancemanagement,IRM)这个术语用来描述旨在减少昆虫害虫变成对杀虫剂有抗性的潜在可能的各种措施。BtIRM的保持是非常重要的，因为昆虫抗性会对掺入植物的Bt保护剂(Btplant-incorporatedprotectant)和作为一个整体的Bt#支术的未来4吏用造成威胁。特定的IRM策略如高剂量/结构化(highdose/structured)庇护区策略，能减轻昆虫对玉米、棉花和马铃薯中产生的特定Bt蛋白的抗性。但是，这些策略会导致要让一部分作物保持对一种或多种害虫易感，以确保有非抗性昆虫发育而可供与在受保护作物中产生的任何抗性害虫交配。因此，从农场主/生产商的观点出发，非常需要的是，具有尽可能小的庇护区，而又能治理昆虫抗性，使得在获得最大产量的同时，仍保持所用的害虫控制方法的功效，无论所用的方法是Bt、化学杀虫剂、某种其他方法或者它们的组合。目前最常用的IRM策略是高剂量和庇护区的种植(庇护区是总种植面积中用非Bt种子种植的那部分面积)，因为通常认为这会通过保持昆虫易感性而延迟昆虫发展对Bt作物的抗性。高剂量/庇护区策略假定认为，对Bt的抗性是隐性的，且由具有导致以下三个基因型的两个等位基因的单一基因座赋予易感纯合体(SS)、杂合体(RS)和抗性纯合体(RR)。它还假定认为，会有低的初始抗性等位基因频率，和抗性成虫和易感成虫之间会有广泛的随机交配。在理想的情形下，只有稀少的RR个体能幸免于Bt作物所产生的高剂量。SS个体和RS个体都将易感Bt毒素。结构化庇护区是种植者田地中的非Bt区域，或者允许产生易感(SS)昆虫的一批田地，该易感昆虫可与幸免于Bt作物的稀少抗性(RR)昆虫进行随机交配，产生会被Bt作物杀死的易感RS杂合体。这会将抗性(R)等位基因从昆虫群体清除，延迟抗性的进展。MON810和BT11是目前可供使用的据认为是"高剂量"的产品。高剂量/庇护区策略是目前优选的IRM策略。非高剂量策略目前是通过增加庇护区面积在IRM策略中使用。增加庇护区是因为高剂量的缺乏会让部分抗性的昆虫(即具有一个抗性等位基因的杂合昆虫)存活，从而增加抗性基因在昆虫群体中的频率。由于这个原因，许多IRM研究者和专家小組已一致认为，非高剂量Bt表达与高剂量表达相比会呈现很大的抗性风险(Roush1994,Gould1998,Onstad&Gould1998，SAP1998,ILSI1998,UCS1998,SAP2001)。但是，这种非高剂量策略通常对于农场主是不可接受的，因为庇护区面积越大，导致的产量损失越多。目前认为，庇护区的面积、位置和治理对于高剂量/结构化庇护区策略成功减少昆虫对玉米、棉花和马铃薯中产生的Bt蛋白的抗性是至关重要。通常要求结构化庇护区包括目标害虫的所有合适的非Bt宿主植物，这些植物由人进行种植和治理。可种植这些庇护区，以在害虫可接触到Bt作物的同时提供庇护区，或者在害虫不可接触到Bt作物的时候提供庇护区。这些类型的庇护区存在的问题包括要确保每个农场主都遵守要求。由于庇护区种植区域中的产量下降，一些农场主选择回避庇护区要求，其他人也不遵守面积和/或位置要求。这些不守要求的问题导致没有庇护区或者庇护区不够有效，相应地抗性害虫的发展增力口。欧洲玉米螟(ECB)ECB是美国大部分地区的主要玉米害虫。这个害虫每年有1-4代，其中一化(即每年一代)群体出现在远北(即北达科他州全州、南达科他州北部、明尼苏达州北部和威斯康星州北部)、二化(即每年两代)群体遍布美国玉米带的大部分地区，多化(3-4代)群体出现在南部(Mason等人l996)。以下概述与IRM有关的ECB生物学关键方面幼虫移动ECB幼虫能够在玉米田地中进行明显的植抹间移动。在非转基因玉米中进行的研究表明，绝大部分的幼虫的移动不会超过一行植株当中的两抹植林(Ross&Ostlie1990)。但是，在转基因玉米中，F.Gould(在Onstad&Gould1998中引用)的未发表数据(用于建模工作)表明，大约98。/。的易感ECB新生幼虫离开含有Bt的植林。Hellmich最近进行的多年研究(1996、1997、1998年)试图定量幼虫植林间移动的程度。观察到，第四龄幼虫能够在一行玉米植抹当中移动越过最多达六林植抹，和乂人释;故点5争4亍移动越过六4朱植4朱。^亍内移动的可能性比跨^亍移动高的多(这并不奇怪，因为与跨行植林相比，行内植林更可能"互相接触")。事实上，绝大部分的跨行移动局限于一个植株。这类信息对于最佳庇护区设计具有明显的意义。移动越过Bt行和非Bt行的幼虫可被暴露于亚致死剂量的蛋白质，从而增加抗性的可能性(Mallet&Porter1992)。鉴于ECB幼虫在植林之间的移动程度，占优势的意见是，种子混合区(seedmixes)是较次的庇护区选择(Mallet&Porter1992，SAP1998，Onstad&Gould1998)。成虫移动需要有关成虫ECB(化蛹后羽化)的移动的信息，来确定庇护区的适当接近度的指导方针。庇护区必须设立在新羽化成虫的飞行范围内，以有助于确保随机交配的潜在可能。美国内布拉斯加州大学进行了详尽的多年期项目，以研究ECB成虫扩散情况(Hunt等人1997,1998a)。在这些标记和再捕捉研究(用新羽化的交配前成虫进4亍)获得的14结果表明，大部分ECB成虫扩散所到之处离它们的羽化地点并不远。再捕捉的成虫的百分数非常低(<1%),且再捕捉的成虫中大部分是在离释放地点1500英尺以内被捉到。在2000英尺以外捕捉到的蛾极少。这些结果已明确地导致得出了对庇护区接近度和布置的建议和指导方针。交配行为除了成虫移动的模式外，ECB交配行为也是确保易感蛾和潜在抗性蛾之间的随机交配的一个重要考虑因素。具体的说，重要的是确定新羽化的雌虫在哪里交配(即在羽化地点附近还是在一定的扩散之后)。已确知许多ECB利用玉米田地附近的群集地点(通常是杂草丛或草丛)进行交配。雌虫通常在蛹羽化后的第二天晚上交配(Mason等人19%)。一项最近的研究提示，可以假造群集地点，以增加易感ECB和潜在抗性ECB之间随机交配的可能性(Hellmich等人1998)。另一项由内布拉斯加州大学进行的最近研究(用新羽化ECB进行的标记/再捕捉研究)表明，移动出其羽化成为成虫的玉米田地的未交配雌虫相对较少(Himt等人1998b)。这在灌溉的(即有吸引力的)玉米田地尤为如此。另外，在靠近释放地点(10英尺以内)捕捉到的雌虫有相对较高的比例是交配过的。这个研究提示，雌虫交配地点非常靠近羽化地点，庇护区可能需要布置在非常靠近Bt田地的地方(或者作为田地内庇护区进行布置)，以使随机交配的可能性最大化。在雄虫交配行为方面，Showers等人(2001)进行的研究观察了雄虫扩散以探寻配偶的情况。该研究是采用标记-再捕捉技术，在释放地点200、800、3200和6400m处放置以信息素为斜的诱捕器来进行。结果显示，探寻配偶的雄虫在离释放地点200m处放置的诱捕器被诱捕的频率更高。但是，在离释放地点800m处或更远处也有很多雄虫被诱捕(Showers等人2001)。与Hunt等人的研究相似，这个研究提示庇护区可能需要布置在相对靠近Bt田地的地方，以使随机交配最大化。产卵行为ECB产卵行为对于庇护区设计也是重要的。例如，如果在玉米田地当中进行的产卯不是随机的话，某些类型的庇护区(即田地内地带)可能不会有效。在交配后(主要在群集地点进行)，雌虫会移动寻找合适的玉米宿主进行产卵。大部分的雌虫会在靠近群集地点的玉米田地产卵，z暇如那里有可接受的玉米宿主的话。产卵在交配后就开始，主要在晚上进行。卵是以最多六十个卵的卵群形式产下(每晚产下一个或多个卵群)(Mason等人l"6)。已知雌虫通常更喜欢长势较高和较旺盛的玉米田地来产卵(Beck1987)。这对庇护区设计具有意义。为避免产卵雌虫潜在地区分宿主，选用于庇护区的非Bt玉米杂交体应在生长、成熟、产量和治理措施(即种植日期、杂草治理和灌溉)方面与Bt杂交体相似。应指出的是，研究已证实当物候学特征和治理特征相似时，在Bt玉米和非Bt玉米(衍自同一近交系)之间的产卵偏好没有显著差异(Orr&Landis1997,Hellmich等人1999)。在适合产卵的玉米田地当中，认为产卵是随机的，并不限定于靠近群集地点的边界各行玉米(Shelton等人1986,Calvin1998)。宿主范围ECB是一种杂食性害虫，已知侵扰200多种植物。ECB植物宿主包括多种普通杂草，这使一些人想到杂草可以充当Bt玉米的ECB庇护区，这个概念常称为"非结构化庇护区"。与此相应，有很多最近的研究项目已研究了杂草作为庇护区的可能性。Hellmich进行的研究(1996、1997、1998年)已证实，杂草能够产生ECB，不过产生的数量不定而且太不一致，因而不能作为ECB庇护区的可靠来源。美国科学顾问小组1998年IRM分小组(1998SAPSubpanelonIRM)也得出这个结论。除了杂草外，还研究了多种粮食作物(例如小麦、高粱、燕麦)作为Bt玉米ECB庇护区的潜在可能(Hellmich1996,1997,1998,Mason等人1998)。在这些研究中，小的粮食作物所产生的ECB通常比玉米(爆花玉米(popcom)或饲料玉米(fieldcorn))少，因此认为不太可能产生足够的易感成虫昆虫而成为可接受的庇护区。因此，根据目前的技术现状，需要4十对ECB的改进的IRM。玉米穗虫(CEW)和ECB—样，1998SAP确定了多个需要对CEW进行额外研究的研究区域。除了对幼虫/成虫移动、交配行为和产卵行为有更多的认识外，还需要对玉米/棉花之间的移动和长距离迁飞有更好的了解(SAP1998)。自从1998年以来，出现了有关CEW生物学的额外研究。这些资料已作为研究年报的一部分进行提交，是这种Bt作物得到商业使用许可之前所必需的注册条件。该机构已审查了这些资料并断定，额外宿主范围和玉米间移动CEW是一种杂食性昆虫(每年3-4代)，除了杂草和其他野生宿主外，还啃食多种粮食和蔬菜作物。通常认为，CEW有两代啃食野生宿主和/或玉米(第一代啃食轮生期玉米，第二代啃食抽穗期玉米)。玉米衰老后，CEW移动到其他宿主，主要是棉花，再繁殖2_3代。由于CEW在同一生长季节中利用多个宿主，它给Bt抗性治理带来了挑战，因为对Bt玉米和Bt棉花中的Bt蛋白都有两次暴露的可能(在一些地区中潜在地最多达五代暴露)。越冬行为已知CEW在蛹期过冬。虽然已知CEW在生长季节往北迁飞到玉米生长地区(即美国玉米带和加拿大)，但CEW通常不能够在这些地区越冬。相反，已知CEW在南方过冬，往往是棉花田地过冬。温度、水分和耕作措施据认为都在CEW的过冬存活中起到一定的作用(Caprio&Benedict1996)。过冬是一个重要的因素，因为IRM抗性昆虫必须熬过冬天才能将他们的抗性基因传递到后代。例如在美国玉米带，不能够过冬的CEW应该不会造成抗性威胁。鉴于可根据在哪里CEW是一个抗性威胁来开17发不同的庇护区策略，准确的采样数据将有助于精确预测合适的CEW过冬地区。成虫移动和迁飞已知CEW是流动性非常高的害虫，能够进行很长距离的移动。标记/再捕捉研究已证实，CEW蛾能够扩散到0.5km(0.3英里)到160km(99英里)的距离；还记录到有些迁飞远达750km(化6英里)(Caprio&Benedict1996)。迁飞的一般模式是随着盛行风型向北移动，从南方过冬地点发源的蛾移动到美国北部和加拿大的玉米生长地区。已假定认为，CEW迁飞是随着生长季节过程逐渐地向北进行。但是，FredGould博士(美国北卡罗来那州立大学)进行的观察表明，CEW还可从玉米生长地区向南移动回南方的棉花地区(在i999EPA/USDAWorkshoponACropResistanceManagementinCotton,Memphis,TN8/26/99所作的评论中有描述)。如果这是真实的话，结果可能会是CEW再次暴露于Bt作物。另外，可能需要再回到关于CEW过冬的假定——据认为不能够熬过冬天(从而不构成抗性威胁)的蛾可能确实向南移动到合适的过冬地点。大部分的CEW飞行移动是局部性的而不是迁飞性的。玉米夜蛾(Heliothinemoth)主要在晚上移动，羽化后的蛾飞行距离通常是不到200111的短距离(0&『10&Benedict1996)。但是，如1998SAP所指出，额外的研究将是有用的，特别是与CEW和最佳庇护区设计有关的研究。另一方面，鉴于CEW通常能进行长距离移动和Bt玉米杂交体中没有高剂量，2000SAP指出这种害虫与其他害虫(例如ECB)相比，庇护区布置显得没那么重要(SAP2001)。交配/产卵行为MichaelCaprio博士(美国密西西比州立大学昆虫学家)已指出，雌虫的交配地点明显局部化(即离蛹羽化地点600m(1969英尺)之内)，通常是与在附近羽化的雄虫或在雌虫羽化前移动进来的雄虫交配(Caprio1999)。CEW雌虫通常将卵一个一个地产在宿主上。最近的研究(在棉花田地进行)发现，从被释放的CEW雌虫找到的卵中有20%是在释放地点的50-100m(164-328英尺)之内，这表明产卵有一定的局部化。但是，雄虫被证实能够移动超过350m(1148英尺)来与雌虫交配(Caprio2000)。这些数据表明，就CEW而言，庇护区可能不必布置在Bt田地当中或者仅靠Bt田地才能有效(不过数据并不排除这些选择方案)。在交配和产卯行为方面进行的额外研究会给CEWIRM提供有用的信息。幼虫移动CEW幼虫特别是晚龄幼虫能够进行植抹间移动。在SAP(1998)的推荐下，美国环保署(EPA)已取消了种子混合区作为CEW的可行Bt棉花庇护区选择方案。因此，也需要针对CEW的改进的IRM策略。西南玉米螟(SWCB)一些SWCB害虫生物学数据已作为研究年报的一部分提供给EPA，是必需的注册条件。但是，可利用的信息仍相对有限。1998SAP指出有关SWCB的信息相对缺乏，断定需要对SWCB进行必要的研究，包括短期移动、长距离迁飞、相对于移动的交配行为(即交配是在迁飞前进行还是在迁飞后进行)。由于这一点，在目前的技术现状下，不知道针对ECB(另一种玉米螟害虫)设计的IRM策略是否也会最佳地对SWCB起作用。SWCB是一些地区(即堪萨斯州西南、科罗拉多州东南部、得克萨斯州北部和俄克拉何马州西部)的玉米经济害虫，可能要求定期治理。和ECB—样，SWCB有2-4代和有相似的啃食行为。第一代幼虫啃食轮生组织(whorltissue),然后钻入茎秆后化蛹，而后面各代啃食抽穗组织(eartissue)后钻入茎秆。雌虫通常在羽化当晚交配，能产250-350个卵(Davis2000)。已启动了对SWCB移动模式的研究(Buschman等人1999)。在这个标记/再捕捉研究中，从1999年数据作出了以下关于SWCB的观察结论l)离释放地点较远的地方捕捉到的雄虫比雌虫多(与ECB相似)；2)19SWCB大部分是在离释放地点100英尺以内被再次捕捉，不过也有一些在1200英尺外再次捕捉到；3)ECB和SWCB的蛾移动模式似乎在大部分方面是相似的。鉴于这些结果，很可能IRM策略的这个部分(为ECB确立的庇护区接近度指导方针)也将适用于SWCB。但是，由于可供测试的SWCB数目少，1999年的结果受到了妨碍，作者已指出该项工作将在2000年的季节继续进行。有关其他次要害虫(例如BCW、FAW、SCSB等)的研究也缺乏，这类研究对于其中这些害虫可能令人格外关注的特定区域会是有用的。但是，1998SAP指出，在次要玉米害虫当中，CEW和SWCB应最优先进行生物学研究。根据农业害虫的这些特征和行为，最常用的庇护区策略称为"地块(block)，，庇护区或"地带(strip)，，庇护区。NC-205小组推荐了对于Bt玉米的三个庇护区布置选择方案靠近田地种植的地块、在田地当中种植的地块或者在田地当中种植的地带(Ostlie等人1997)。一般来说，庇护区可设置为田地边缘或畦头上的外部地块，或者为Bt玉米田地当中的地带。研究已证实，ECB幼虫能够在行中或行间移动越过最多六林玉米，大部分的移动出现在单行中。晚龄(第四龄和第五龄)ECB更有可能在行中移动而不是在行间移动(Hellmich1998)。这是备受关注的原因所在，因为杂合的(部分抗性的)ECB幼虫可能开始啃食Bt植抹，然后移动到非Bt植株(如果在附近种植的话)以完成发育，从而挫败高剂量策略和增加抗性的风险。由于这个原因，种子混合区(通过在播种机(hopper)中将种子混合而产生的庇护区)通常不是推荐的庇护区(Mallet&Porter1992,Buschman等人1997)。Buschman等人(l997)建议田地内庇护区是IRM计划的理想策略。由于ECB幼虫趋向于在行内移动，作者建议完整的玉米行作为可接受的庇护区。窄的地带(用非Bt玉米种子装播种机的一个或两个播种箱)或宽的地带(用非Bt玉米种子装整个播种机)可用作田地内庇护区。数据表明，田地内地带可为Bt玉米中产生的ECB提供最好的机会来与非Bt玉米的ECB交配。由于初步的数据提示庇护区离Bt玉米应该在100行以内，Buschman等人(1997)推荐交替种植96行非Bt玉米地带和192行Bt玉米地带。这会导致33%的庇护区离Bt玉米在100行以内。目前，田地内地带(作为完整的行种植)应延伸田地的整体长度，包括最少六行交替种植的非Bt玉米与Bt玉米杂交体。NC-205推荐当执行田地内地带庇护区策略时种植6-12行非Bt玉米(NC205Supplement1998)。2000SAP还一致同意，由于幼虫移动的缘故，较宽的保护区地带优于较窄的地带，尽管对于一些规才莫较小的种植者来说，播种机大小可能会限制地带大小(SAP2001)。田地内地带可4是供最大的潜在可能以确保易感成虫和抗性成虫之间的交配，因为这种地带能使成虫遗传混合(geneticmixing)最大化。建模表明，当使用20。/。庇护区时，至少6行宽的地带对于ECBIRM来说与邻近地块一样有效(Onstad&Guse1999)。但是，仅有两行宽的地带可以与地块一样有效，但危险性可能比地块或更宽地带高，因为我们对易感钻心虫和杂合钻心虫之间的存活差异了解不完全(Onstad&Goud1998)。鉴于目前关注的幼虫移动和随机交配需求的问题，外部地块或者田地内地带(横跨整个田地，至少6行宽)是可以使抗性发展的风险减至最低的庇护区设计。研究表明随机交配极有可能在田地内地带发生。但是如前所述，从作物损害和农场主是否遵守的角度，这个IRM策略会有问题。此外，根据现有的科学信念，目前必须设置庇护区，使得易感蛾(来自庇护区)和可能的抗性幸存者(来自Bt田地)之间的随机交配的潜在可能最大化。因此，当讨论庇护区接近度时，害虫飞行行为是一个关键的考虑因素。作为外部地块种植的庇护区应靠近或非常接近Bt玉米田地(Onstad&Gould1998，Ostlie等人1997b)。NC-205最初推荐庇护区应种植在/2地段(section)(320英亩)当中(NC-205Supplement1998)。随后，该推荐经修改规定非Bt玉米庇护区应布置在离Bt田地y2英里o英里将更好)以内(Oilman1999)。Hunt等人(1997)完成的研究提示，大部分ECB不会扩散到离它们的蛹羽化地点很远的地方。根据这个标记-再捕捉研究，大部分ECB扩散可能不超过1500-2000英尺。大部分的(70-98。/。)被再次捕捉的ECB在离释放地点1500英尺以内被诱捕。但是，在1997年的研究的补遗中，作者告诫说1500英尺距离未必代表ECB的最大扩散距离(Hunt等人1998a)。另一个标记-再捕捉ECB项目专注研究羽化ECB(特别是未交配雌虫)的田地内移动(Hunt等人1998b)。再捕捉到的未交配雌虫相对较少(整个试验中有10只)，不过它们大部分是在离释放地点85英尺以内找到。这提示未交配雌虫可能不会扩散到离蛹羽化地点很远的地方(这在灌溉田地中尤为如此)。另外，在灌溉田地中有相对较高比例的已交配雌虫(31%)在离释放地点10英尺以内的地方被诱捕，这提示交配发生在非常靠近羽化地点的地方。这两个观察结论都表明，许多羽化的ECB雌虫可能不扩散到它们发源田地以外的地方。就抗性治理和庇护区接近度而言，这些结果提示庇护区应布置在非常靠近Bt玉米田地的地方(或者作为田地内庇护区布置)，以增加随机交配的机会(特别是对于灌溉田地)。在雄虫ECB扩散方面，Showers等人(2001)进行的另一标记-再捕捉研究显示，为寻找配偶而扩散的雄虫可移动很长的距离(>800m)。但是，更大比例的雄虫是在离释放地点较近的距离(200m)被诱捕。根据这项研究，作者提出就雄虫移动而言，目前的/2英里的庇护区接近度指导方针应当足以确保易感蛾和来自Bt田地的任何抗性幸存者之间的交配。虽然清楚知道ECB扩散随着远离蛹羽化地点而降低，但还没有完全确知ECB的定量扩散行为。但是，就最佳庇护区布置而言，在目前接受的标准下，庇护区接近度选定成使得随机交配的潜在可能最大化被认为是关键的。根据Hunt等人的数据，庇护区离Bt玉米越近，抗性的风险越低。由于最大数量的ECB是在离田地1500英尺以内的地方被捕捉，且大部分的雌虫可在离田地10英尺以内的地方交配，将庇护区布置在尽可能靠近Bt田地的地方应当能增加随机交配的机会和减少抗性的风险。目前，Bt玉米的接近度要求是'/2英里(在过去用过杀昆虫剂处理ECB和SWCB的地区是W英里)(EPA致Bt玉米注册人的信函，2000年1月31日)。2000SAP同意这个指导方针，指出庇护区应设置在离Bt玉米田地不超过半英里的地方(如果可能的话/4英里以内)(SAP2001)。当然，这些庇护区选择方案的每一个(地块、地带等)在其执行中会带来另外的难题。如前所述，这些方法要让农场主的田地的一些部分对昆虫侵扰易感，以确保有易感昆虫发展并可供与田地中的任何抗性害虫交配。这导致很大的产量损失，因为目前这种庇护区必须占至少20%的田地。由于庇护区部分的转基因抗害虫作物导致产量下降，如前所述还存在农场主是否遵守庇护区要求的问题。时间和空间庇护区采用时间和空间镶嵌方案(temporalandspatialmosaics)作为结构化庇护区的替代策略来延迟抗性，已得到了一定的关注。时间庇护区在理论上将是通过使Bt部分的作物在这种作物最会吸引ECB的时间里得到种植，来操纵ECB的生活周期。例如，会在种植常规玉米几个星期前种植Bt玉米田地。由于ECB据认为优先在长势较高的玉米植林上产卵，希望是被侵扰的会是Bt玉米而不是长势较低吸引力较差的常规玉米。但是，田地专家们指出，时间庇护区是结构化庇护区的劣等替代方案(SAP1998)。研究已证实，不能用种植日期来准确预测和操纵ECB产卯率(Calvin等人1997,Rice等人1997,Ostlie等人1997b,Calvin1998)。当地气候对玉米物候现象的影响使得种植日期成为操纵治理ECB的一个困难因素。将不得不在多种多样的条件下进行另外的研究，以完全回答这个问题。另外，时间镶嵌方案可导致类聚交配(assortivemating),其中来自Bt玉米的抗性蛾会互相交配，因为它们的发育时间与从庇护区羽化的易感蛾不同(Gould1994)。空间镶嵌方案涉及到种植具有不同作用模式的两个单独的Bt玉米事件。想法是，昆虫群体会暴露于多种蛋白质，从而减少对任何一种蛋白质的抗性的可能性。但是，目前注册的产品仅表达一种蛋白质，而玉米的主要害虫(ECB、CEW、SWCB)在整个幼虫啃食期通常保持在同一植抹上，昆虫个体只会暴露于其中一种蛋白质。在产生易感昆虫的结构化庇护区不存在下，抗性仍可能具有在这种系统中发展的潜在可能，就像它会在单一蛋白单作区(monoculture)中发展那样。因此，目前接受的观点与本文公开的庇护区策略的类型相背离。已知在生长季节中，CEW从南方越冬地点向北迁移到美国玉米带的玉米生长地区。但是，已记录到CEW从北到南迁飞(从玉米生长区到棉花生长区)的观测结果。虽然需要更多的研究来确证，但这个现象会导致对Bt作物有额外暴露和对CEW抗性的选才奪压力增加。以下事实还^^吏这个影响复杂化Bt棉花或任何注册的Bt玉米事件对CEW而言都不含高剂量。由此，可能有必要考虑额外的针对CEW的减轻措施。考虑到这个问题，2000SAP指出CEW庇护区最好在地区规模上加以考虑(而不是单个农场规模上的结构化庇护区)，因为这种害虫通常能够进行长距离迁移(即庇护区接近度对于CEW来说没那么重要)。根据SAP，^。/。庇护区(每个农场)对于CEW将是足够的，如果该地区中的Bt玉米的数量不超过总玉米作物的50%的话。但是如果地区性价玉米作物超过50%，可能需要额外的结构化庇护区(SAP2001)。但是，SAP没有定义"地区"应是怎样的地区(即国家、州还是其他区域)。根据最近可获得的Bt玉米英亩面积数据，应指出的是美国玉米带中的许多县超过2000SAP所确认的50。/。阈值。因为这一点，可能有CEW抗性的额外风险。在Bt玉米超过50。/。的地区中额外增加结构化庇护区，可减轻这个风险。但是，可能需要进行额外的研究，来完全确定CEW从北到南迁移的风险和适当的减轻措施。24目前公认的庇护区选择方案高剂量事件；MON810、BT11和TC1507(饲料玉米)不定期喷洒杀昆虫剂的非棉花地区这个地区涵盖高地平原(HighPlains)东部的玉米带的大部分区域。最初的USDANC-205庇护区推荐意见包括20-30。/。不经处理的结构化庇护区或者可用非Bt杀昆虫剂处理的40%庇护区(Ostlie等人l997a)。在ECB(美国大部分地区的主要玉米害虫)的情况中，已知平均不到10%的种植者使用杀昆虫剂处理来控制这种害虫(美国食品与农业政策中心，NationalCenterforFoodandAgriculturePolicy1999)。由于许多种植者没有定期处理ECB，NC-205在1999年5月24日致JanetAndersen博士(BPPD主任)的信函中修正了他们的立场。在这个信函中，NC-205将他们的推荐修订为，20。/。非Bt玉米庇护区可用杀昆虫剂处理，且应布置在离Bt玉米!/2英里以内('/4英里更好)。信函中具体的推荐意见如下l)对庇护区的杀昆虫剂处理应基于侦察研究和公认的经济阈值，2)处理应在不含Bt或Cry毒素的产品上进行，3)应对受处理的庇护区进行记录并与EPA共享，4)应紧密监测被喷洒的庇护区的潜在影响并每年进行评估，和5)在较高风险区域例如用杀昆虫剂处理的庇护区应最频繁地监测抗性(Ortman1999)。由于大部分的种植者通常不用杀昆虫剂处理饲料玉米以控制ECB，如果ECB密度超过经济阈值的话可用非Bt杀昆虫剂喷洒的20%非Bt玉米的庇护区，对于美国玉米带应当是可行的。庇护区可按需用非Bt杀昆虫剂或其他适当的IPM措施进行处理，以控制鳞翅目茎秆钻心昆虫。杀昆虫剂的使用应基于使用经济阈值作为IPM计划的一部分的侦察工作。一些实验室研究证明，在BollgardII中表达的单独Cry2Ab蛋白和Cry2Ab+CrylAc蛋白在BollgardI棉花中产生功能性"高剂量，，以供控制CBW、TBW和PBW。这些研究将在下文讨论。EPA之前断定，在目前的Bollgard林系中有中等非高剂量的CrylAc产生以控制CBW,有功能性高剂量的CrylAc产生以控制TBW和PBW(USEPA1998,2001)。下表将帮助读者认识昆虫害虫的首字母缩略词。注意，表中列出的是作为转基因害虫抗性策略的目标的最常见害虫，但本发明并不仅限于这些害虫。表l首字母缩略词普通名称学名作物BCW小地老虎々,oto扭z'/o打(Hufnagel)玉米CBW棉铃虫//e/z'cowrpazea(Boddie)棉花CEW玉米穗虫//e/z'cov邵azea(Boddie)玉米CPB科罗拉多马铃薯甲虫Le_p"'wotaraflflfecem/z'weato(Say)马铃薯CSB普通茎秆钻心虫Papa—ma恥^7'i1(Guenee)玉米ECB欧洲玉米钻心虫(9w"'w'fl肌&7"fo(Huebner)玉米FAW秋天行军虫S/^o/tera/rag—z-Ja(JESmith)玉米PBW棉红铃虫尸ec""op/zoragas\s>^z'e//a(Saunders)棉花SCSB南方玉米茎秆钻心虫￡h'afraeacr画&'cfcu'cfes(Grote)玉米SWCB西南玉米螟Z)/aZraeagra"cfZcwe〃a(Dyar)玉米TBW烟草坊虫HWo^u'sv('rescews(Fabricius)棉花因此，仍需要治理抗害虫作物的田地中的害虫抗性的方法。要是能提供保护植物特别是玉米植物免受害虫的啃食损害的改进方法，将是有益的。如果这种方法会减少常规化学杀虫剂的所需施用频率的话，还有如果它会减少作物种植和栽培所需的单独田地搡作数量的话，将是特别有益的。发明概述本发明因此涉及减少田地中抗性害虫发展的方法，所迷方法的做法是，将第一转基因抗害虫作物的种子与第二转基因抗害虫作物的种子混合，以提供其中所述第一抗害虫作物和所述第二抗害虫作物对同26一目标害虫有杀虫作用、但杀虫作用的模式不同的种子混合物；和种植该种子混合物。所述种子还可掺入除草剂抗性基因。本发明还涉及减少转基因抗害虫作物的田地中抗性害虫发展的方法，所述方法的做法是，将第一类型的种子和第二类型的种子混合以产生种子混合物，其中第一类型的种子是包含第一转基因和第二转基因而对第一目标害虫和第二目标害虫具有杀虫活性的转基因抗害虫作物的种子，且其中第二类型的种子对第一目标害虫或第二目标害虫没有杀虫活性，其中所述种子混合物包含约90%至约99%的第一类型的种子和约10%至约1%的第二类型的种子；和种植所述种子混合物。所述种子还可掺入除草剂抗性基因。本发明还涉及治理抗害虫作物的田地中的害虫抗性的方法，所述方法的做法是，提供第一转基因抗害虫作物的种子，该第一转基因抗害虫作物表达第一转基因和第二转基因，该第一转基因提供对至少一种鞘翅目害虫的增加的耐受性或抗性，该第二转基因提供对至少一种鳞翅目害虫的抗性；提供第二转基因抗害虫作物的种子，该第二转基因抗害虫作物表达第三转基因，该第三转基因提供对相同的至少一种鳞翅目害虫的抗性，但杀虫作用的模式不同于该第二转基因；和在田地中种植该第一转基因抗害虫作物的种子和该第二转基因抗害虫作物的种子。所述种子还可掺入除草剂抗性基因。发明详述在以下描述中，以广义方式使用到多个术语。提供以下定义是为了帮助理解本发明。本文用到的名词形式上是单数，但有复数含义(即指代至少一个对象)。举例说，"要素"是指一个或多个要素。本文所用的术语"包含"是指"包括但不限于"。"田地，，意指其中种植作物的区域，无"i仑其大小如何。本文所用的术语"转基因抗害虫作物"是指衍自被转化的植物细胞或原生质体的植林或其后代(包括种子)，其中该植抹DNA含有引入的异源DNA分子，该DNA分子原先不存在于相同株系的天然、非转基因植株中，能赋予对一种或多种玉米才艮虫的抗性。该术语指包含异源DNA的原始转化林和该转化抹的后代。该术语还指通过该转化林和另一包含该异源DNA的品种之间的有性远交产生的后代。还要认识到，两林不同的转基因4直林还可进行交配，产生含有两个或多个独立分离、加入的异源基因的后代。适当的后代的自交可产生该两个所加入的异源基因的纯合植林。还设想到与亲本植林的回交和与非转基因植抹的远交，还有无性繁殖。有关其他常用于不同性状和作物的育种方法的描述，可在几个参考文献之一找到，例如Fehr(1987),in5厂eecfegMeAodsCW/zVa厂Deve/o戸ew(ed.J.Wilcox(AmericanSocietyofAgronomy,Madison,WI)。育种方法还可用来将任何天然抗性基因转移到作物中。本文所用的术语"玉米"是指学名为玉米(Zeamfl，)，包括可与玉米交配的所有植物品种，包括野生玉米品种在内。在一个实施方案中，所公开的方法可用于治理抗害虫玉米的田地中的抗性问题，该田地在玉米种植后有计划地种植玉米(即连作玉米)。在另一个实施方案中，所述方法可用于治理第一年抗害虫玉米的田地中的抗性问题，即该田地在两年轮作周期中第一年种植玉米后跟着种植另一作物(例如大豆)。在本发明中还设想到了其他的轮作周期，例如种植玉米后接着多年种植一种或多种其他作物，以防止在其他滞育期长的害虫中可能随时间推移而发展的抗性。某作物如果它具有或产生的杀虫剂(例如Bt蛋白)的浓度为杀死易感幼虫所需的杀虫剂浓度的至少约25倍，则认为它具有"高剂量"的杀虫剂。例如，在Bt作物的情形中，Bt栽培种(cultivar)必须产生足够高的毒素浓度才能杀死几乎所有的抗性杂合昆虫，当然是々i定单个基因能赋予对特定Bt蛋白或其他毒素的抗性。目前，如果通过以下五个方法中的至少两个得到验证，那么掺入植物的Bt保护剂通常被认为能提供高剂量l)用来自非Bt植物的组织作为对照，用含有Bt植物的冻干组织的人工食物(artificialdiet)进行的系列稀释生物测定；2)用经定量ELISA或一些更可靠的技术测定其表达水平比商业栽培种大约低25倍的植抹进行的生物测定；3)对田地中的大量商业植林进朽-观测，以确信该栽培种在LD，或以上，以确保95%的杂合体会被杀死(参见Andow&Hutchison1998);4)与以上3)相似，但用具有与田地品系类似的LD^值的实验室害虫品系进行控制侵扰；和5)确定在比新生幼虫的LD^高约25倍的LD^下是否可找到被靶向害虫的较后幼虫龄。如果是这样的话，可将该较后期幼虫在Bt作物上进行测试，以确定是否95%或更多的较后期幼虫被杀死。下表总结了目前对于高剂量表达的知识基础表2<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>本文所用的术语"多肽，'、"肽"和"蛋白质"在本文中可互换使用，指由氨基酸残基组成的聚合物。这些术语不仅适用于天然氨基酸聚合物，也适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物。本文所用的术语"杀虫活性"和"杀昆虫活性"同义使用，指某生物测量的活性害虫死亡率、害虫发育的迟緩、害虫体重减轻、害虫排斥性以及害虫在啃食和暴露适当时间长度后出现的其他行为和身体变化。照这样，杀虫活性往往影响害虫健康状况的至少一个可测量参数。例如，杀虫剂可以是多肽，以降低或抑制昆虫啃食和/或增加昆虫在摄食多肽后的死亡率。评估杀虫活性的测定法是本领域公知的。参见例如6,570,005号和6,339,144号美国专利。本文所用的术语"杀虫基因"或"杀虫多核苷酸"指编码显示杀虫活性的多肽的核苷酸序列。本文所用的术语"杀虫多肽"、"杀虫蛋白"或"昆虫毒素"意指具有杀虫活性的蛋白质。本文所用的术语"杀虫(的)"是用来指针对害虫(例如CRW)的毒性作用，包括外部供应的杀虫剂和/或作物产生的杀虫剂之一或两者的活性。本文所用的术语"不同的杀虫作用模式"包括一种或多种抗性性状的杀虫作用，不管这些抗性性状是通过转化还是通过传统育种方法引入到作物中，所述杀虫作用例如该作物产生的杀虫毒素与玉米根虫肠膜中的不同结合位点(即不同的毒素受体和/或同一毒素受体上的不同位点)的结合。就杀虫作用模式而言，各杀虫化合物如果它们在害虫中具有相同的结合位点，而没有一种化合物会结合而另一种化合物不会结合的结合位点，则它们"竟争地"进行结合。例如，如果化合物A仅使用结合位点1和2,而化合物B也仅使用结合位点1和2，则化合物A和B"竟争地，，进行结合。各杀虫化合物如果它们在害虫中具有至少一个共同的结合位点，但也有至少一个不共同的结合位点，则它们"半竟争地，，进行结合。例如，如果化合物C使用结合位点3和4，而化合物D仅使用结合位点3,则化合物C和D"半竟争地"进行结合。各杀虫化合物如果它们在害虫中没有共同的结合位点，则它们"非竟争地"进行结合。例如，如果化合物E使用结合位点5和6，而化合物F使用结合位点7,则化合物E和F'非竟争地"进行结合。本文所用的术语"杀虫有效量，，意^^未着某物质或生物当在害虫的环境中存在时具有杀虫活性的量。对于每种物质或生物，杀虫有效量是对在特定环境中受影响的每种害虫进行经验确定。同样，"杀昆虫有效量"可用来指当害虫为昆虫害虫时的"杀虫有效量"。"杀昆虫组合物"意指本发明各实施方案的組合物具有对植物昆虫病原体的活性(所述昆虫病原体包括同翅目的昆虫害虫)，A^而能够抑制、控制和/或杀死侵入的昆虫。本发明各实施方案的杀昆虫组合物会减少昆虫攻击所造成的症状至少约5%至约50%,至少约10%至约60%,至少约30%至约70%，至少约40%至约80%，或者至少约50%至约90%,或者更高。因此，本发明各实施方案的方法可用来保护生物特別是植物免受侵入的昆虫影响。本文所用的术语"改进的杀昆虫活性"表征的是相对于其相应的野生型蛋白质的活性而言具有提高的抗鞘翅目杀虫活性的S-内毒素，和/或表征的是对较广范围的昆虫有效的内毒素或获得对不对野生型蛋白毒性易感的昆虫的特异性的内毒素。提高的杀虫活性的判定要求证明相对于对同一昆虫目标测定的野生型内毒素的杀昆虫活性来说，抗昆虫目标的毒性增加至少30%,更优选增加35%、40%、45%或50%。本文所用的术语"转基因(的)"包括其基因型已因异源核酸的存在而-皮改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，既包括最初这样被改变的转基因植物，也包括从最初的转基因植物通过有性杂交或无性繁殖产生的转基因植物。本文所用的术语"转基因(的)，，并不涵盖通过常规植物育种方法或通过自然事件造成的基因组(染色体或染色体夕卜)变更，所述自然事件例如随机杂交-授精、非重组病毒感染、非重組细菌转化、非重组转座或自发突变。本文所用的术语"植物"包括整抹植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞、植物原生质体、从中可再生植林的植物细胞组织培养物、植物愈伤組织、植物团块(plantclump)和在植物或植物部分及它们的后代中完好的植物细胞。转基因植物的部分在本发明的范围内应理解为包括例如发源于之前用本发明DNA分子转化的转基因植物或其后代，因此至少部分上由转基因细胞组成的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚胎以及花、花粉、胚珠、种子、枝、仁、穗、穗轴、壳皮、秆、茎、果实、叶子、根、根尖、花粉嚢等等，它们也是本发明的目标。粮食意指商业种植者为了栽培或繁殖物种之外的目的所生产出的成熟种子。再生的植物的后代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，条件是这些部分包含引入的多核苷酸。31本文所用的术语"植物细胞"包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤組织、叶子、根、芽苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可用于本发明方法的植物的类别通常与适于转化技术的高等植物的类别一样宽广，包括单子叶植物和双子叶植物在内。本文所用的术语"产生或增强抗虫性"意指已按本发明的方法进行了遗传修饰的植物，相对于除了本文描述的遗传修饰以外具有相似遗传成分的植物来说，具有"f是高了的对一种或多种昆虫害虫的抗性。本发明的遗传修饰植物能够能够表达至少一种杀昆虫脂肪酶和至少一种Bt杀昆虫蛋白，该脂肪酶和蛋白的組合当影响植物的昆虫害虫时能保护植物免受昆虫害虫侵扰。"保护植物免受昆虫害虫侵扰"意指通过例如抑制昆虫害虫生长、啃食和/或繁殖的能力或者通过杀死昆虫害虫，来限制或消除昆虫害虫相关的对植物的损害。本文所用的"影响植物的昆虫害虫"包括但不限于制止昆虫害虫进一步啃食该植物，通过例如抑制该昆虫生长、啃食和/或繁殖的能力来伤害该昆虫害虫或杀死该昆虫害虫。本文所用的术语"杀昆虫脂肪酶"是以其最广义的含义使用，包括但不限于对昆虫具有毒性或抑制作用的脂质酰基水解酶的家族的任何成员。同样，术语"Bt杀昆虫蛋白，，是以其最广义的含义使用，包括但不限于对昆虫具有毒性或抑制作用的苏云金杆菌蛋白家族的任何成员，如本文描述和本领i或公知的Bt毒素，包括例如才直物杀昆虫蛋白和5-内毒素或cry毒素。它进一步地包括Bt毒素的任何修饰形式，如嵌合毒素、改组毒素(shuffledtoxin)等。因此，如本文所述，可通过将编码杀昆虫脂肪酶的核苷酸序列与编码Bt杀昆虫蛋白的序列一起引入到某生物(例如植物或其植物部分)中，或者通过将包括但不限于杀昆虫蛋白在内的杀昆虫物质施加到该生物，来赋予该生物抗虫性。本文所用的"混合"种子是指例如将至少两种类型的种子在袋子中进行的混合(例如在包装、生产或销售过程中混合)，将至少两种类型的种子在田地中进行的混合，或者任何其他能导致至少两种类型的种32子被引入到田地中的方法。种子混合物可导致种子在田地中的随机安排，或者可在某些类型的结构化庇护区的情形中(例如地块庇护区或地带庇护区)。当使用结构化庇护区时，本文所用的"田地，，可以但不一定包括这种结构化庇护区。本领域技术人员会认识到，并不是所有的化合物都对所有的害虫同等有效。各实施方案的化合物显示对昆虫害虫的活性，这些昆虫害虫可包括经济上重要的农艺害虫、森林害虫、温室害虫、苗圃害虫、观赏植物害虫、食物和纤维害虫、公共健康和动物健康害虫、家庭和商业设施害虫、居室害虫和仓储害虫。昆虫害虫包括选自以下各目的昆虫鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptem)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthoptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、氛目(Anoplura)、圣目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，特別是鞘翅目和鳞翅目。值得关注的是鞘翅目的幼虫和成虫，包括长角象鼻虫科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)和象曱科(Curculionidae)的象鼻虫(包4舌^f旦不卩艮于J"决owowMgrawA'sBoheman(牙帛冲予象鼻虫)；Z^sorAo/^n^o厂;;zo//n7wKuschel(K牙舀？K象鼻虫)；5Vto/^'/Msgrawan'MSLinnaeus(谷象鼻虫)；&o^yzaeLinnaeus(7jc牙舀象鼻虫)；场jera戸wctotoFabricius(三叶草象鼻虫)；Qy/zWroco^wms1ac^era^sLeConte(向日葵茎象鼻虫)；5Vm'cra"，/w/msLeConte(红葵花籽象鼻虫)；<S.sorcfe/usLeConte(灰葵花4予象鼻虫)；5^/zewo//onChittenden(玉米象鼻虫))；金花虫科(Chrysomelidae)中的跳甲、黄瓜曱虫、根虫、叶子曱虫、马铃薯甲虫和潜叶蝇(包括但不限于丄ep^otor^decew/z'"ea/"Say(科罗拉多马铃薯甲虫)；Z)/"6rci,/cflWrg^/ferav/rg7^feraLeConte(西部玉米冲艮虫)；AZ^r6en'Smith&Lawrence(北部玉米才艮虫)；Z).wwfife"'w/tmcto!toAovran^'Barber(南部玉米才艮虫)；鞘翅目C力ae/ocwewa/w/z'c"r/aMelsheimer(玉米5兆甲)；i^少/Zo^etocrMci/eraeGoeze(玉米跳曱)；Cb/asp^6nw打eaFabricius(葡萄肖叶曱)；附e/cmo/usLinnaeus(谷p十曱虫)；Zygogra附附aexc/amc^'om'sFabricius(向日葵甲虫))；瓢虫科(Coccinellidae)的曱虫(包括但不限于五;z7flc力"flv"hva^'5Mulsant(墨、西哥豆抓虫))；金龟子详牛(Scarabaeidae)的金龟子和其他甲虫(包4奮但不限于尸o^'战"乂^ww'c"Newman(日本金龟子)；C>c/ocep/fl/a6oreafoArrow(北方圆头犀金龟，虫齐虫曹)，'C.z>wmaci//atoOlivier(南方圆头犀金龟，矫螬),'肠.zo加giwm一foRazoumowsky(欧洲金龟子)；P/^〃o//wgacn'm'toBurmeister(虫齐螬)；Zj.gyr"sg^^wwsDeGeer(胡萝卜金龟子))；皮蠹科(Dermestidae)的地逸甲虫；。卩甲科(Eiateridae)的线虫，￡7eo"&yspp.，Afe/awo似sspp.;Co打ocfen^spp.;Z4.mow/wsspp.;乂gn.ofesspp.;CVe打('ceraspp.;乂eo/wsspp.;小蠹科(Scolytidae)的树皮曱虫和拟步行虫科(Tenebrionidae)的甲虫。双翅目值得关注的是双翅目的成虫和未成熟虫体，包括潜叶蝇AgromyzaparvicomisLoew(玉米J寇';脊叶虫菱)；癭虫丈(包括]旦不限于ContariniasorghicolaCoquillett(高梁瘿蚊)；MayetioladestructorSay(小麦瘿蚊)；SitodiplosismosellanaG6hin(麦吸，jt虫)；NeolasiopteramurtfeldtianaFelt,(葵花籽瘿蚊))；果蝇(实蝇科)，OscinellafritLinnaeus(果蝇)；蛆(包括叶旦不限于DeliaplaturaMeigen(种蝇)；D.coarctataFallen(麦秆虫黾)；和其他Deliaspp.,MeromyzaamericanaFitch(麦秆绳)；MuscadomesticaLinnaeus(家虫亂)；FanniacanicularisLinnaeus,F.femoralisStein(專交小的家錄)；StomoxyscalcitransLinnaeus(厩錄))；《火家錄、角绳、丽錄、Chrysomyaspp.;Phormiaspp.;和其他小实虫黾(muscoidfly)害虫、马虫黾Tabanusspp.;月夫虫乾Gastrophilusspp.;Oestrusspp.;牛皮虫乾Hypodermaspp.;鹿虫黾Chrysopsspp.;MelophagusovinusLinnaeus(羊乱)；和其他短角亚目(Bra勿cera)，蚊子Aedesspp.;Anophelesspp.;34Culexspp.;黑竭Prosimuliumspp.;Simuliumspp.;蠓、沙绳、尖目艮蕈虫丈和其^f也长角亚目(Nematocera)。膜翅目膜翅目的昆虫害虫也值得关注，包括锯绳如Cep/!船c!'打"usNorton(麦秆锯錄)；蚂蚊(包括但不限于C膽/owo加/e簡一潔Fabricius(纟工木工蚊)；C*.pewisy/vawf'cus"DeGeer(,紫、木工虫义)；A/owcwwn^附//wra麵'sLinnaeus(法老蚊)；,纖朋m'aawraptmc加aRoger(小火虫义》5bfe"o/w^gew/wfl/"Fabricius(火蚊》51.附o/astoSay(贝泉议)；5".z'wWctoBuren(红进口火虫义)；iWc/omyrmex/wm"^Mayr(阿才艮廷虫义)；尸ara,rec/w'"fl/owgicow^1Latreille(狂议)；T^rawon.訓cae—似mLinnaeus(铺道蚁)；a/^wtwFdrster(玉米田虫义)；r—wo,化^Z/eSay(有味家蚁))；蜜蜂(包括木蜂)、大黄蜂、小黄蜂和黄蜂。鳞翅目鳞翅目的幼虫包括但不限于夜蛾科(Noctuidae)中的行军虫、切根虫、4艮纟丈夜虫爽禾口玉米夜虫我(heliothine):Spocfopterayh/gi^eniaJESmith0火4亍军虫)；61.exz'gwHiibner(舌牙菜4亍军虫)；S./"wraFabricius(烟草切才艮虫、存斗紋夜蛾(clustercaterpillar));Mamastraco"ygwratoWalker(贝莎行军虫)；Af.hmsw'c"eLinnaeus(小菜喊)；^grato—Hufnagel(小地老虎)；AoW/ogom'"Morrison(浅色西切才艮虫)；Ast/Zte厂raweaFabricius(粒状切冲艮虫)；J/a6flma"rg77/"ceaHiibner(棉叶虫)；7Wc/o//M^flm'Hiibner(甘蓝4艮纟丈夜虫爽)；尸ww(iop/whafwc/wcfem1Walker(大豆4艮纟丈夜虫我)；JwA'caraz'agemmato/^Hiibner(纟戎毛豆毛虫)；iify/e;wisca6raFabricius(纟录色三p十草虫)；//e/Zo^nSw'rescewsFabricius(烟草虫牙虫)；Pset^a/e&atm^wwctoHaworth(4亍军虫)；yl^ietomzWaraBarnesandMcdunnough(糙皮切才艮虫)；￡kxoaHarris(黑边切才艮虫)；z'"幼/awaBoisduval(多刺螟虫令)；v"fe〃aFabricius(衫王点螟虫令)；/fe"cover;0！arm/geraHiibner(美国螟虫令)；ze<aBoddie(玉米穗、虫或才帛螟虫令)；Me/<2wc/ra"'etaHarris(扭王马毛虫)；(X}/omj;g^)cwn'afoGrote(柑橘切根虫)；草螟科(Crambidae)的钻心虫、鞘蛾、结网毛虫、木>果虫和斑蛾C^hm'a""Z)z7afoHtibner(欧洲玉米4占心虫)；CAi/osw//rewa/^Walker(牙舀秆钻心虫)；C.，We〃tw，(高粱钻心虫)；Cra附6^sca/Zg/waseZ/wsClemens(玉米根结网毛虫)；C.teterra7i^Zincken(蓝草结网毛虫)；￡>ww'"yimeratoHiibner(葡萄巻叶虫)；Z)z.ap/z(2m.aLinnaeus(老甘瓜野螟)；Z).m'/油fcStoll(泡菜虫)；i)z'a加eagrawcfewe〃aDyar(西南玉米钻心虫),D.sacc/wrafoFabricius(甘蔗钻心虫)；^brew附a/q/h'm.Dyar(墨西哥水稻钻心虫)；//e/7^/0gramma//carw'加foWalker(草》也结网毛虫)；ZoxostegeWi'c"cafe1Linnaeus(舌才菜纟吉网毛虫)；Geyer(豆荚钻心虫)；C/c/earwZ)ZgafcGuen6e(芽菜巻叶蛾)；螟蛾科(Pyralidae)Jw，/o&/ra5"e〃"Walker(騰樣虫)；v4w"go5toA:we/mz'e〃aZeller(地中海粉蛾)；Cadrac"wte〃"Walker(粉斑螟蛾)；OwyracepAc^o打icaStainton(米虫我)；CViap/ia/ocroc^附ed/wa/z'51Guen6e(纟从巻口十螟)；E/AeWae/wte〃aHiibner(烟草(可可豆)虫我)；GW/m."卿〃owe〃aLin雄us(大蜡蛾)；//麵o咖圃ae/e"e〃画Hulst(向曰葵螟)；￡7a5mo/"//n^/7:g"ase〃twZeller(小玉米茎4i心虫)；Jc/zroZaFabricius(小蜡蛾)；(9rAaga^^ktoWalker(茶树织网蛾)；尸/o^'fl&ter;iwcfe//aHiibner(印度谷螟)；和巻蛾科(Tortricidae)的纵巻叶螟、虫牙虫、种子虫(seedworm)禾口果实虫(fruitworm):Jc/en'sg/cverawaWalsingham(西黑头虫牙虫)；A簡'画Femald(东部黑头虫牙虫)；乂rc—sargyra—/aWalker(果树纵巻叶螟)；A簡朋aLinnaeus(欧洲纵巻叶螟)；和其他的Jrc/njw虫种，yWoxo/A戸FischervonR6sslerstamm(夏天水果巻叶蛾)；Coc/^foAos戸Walsingham(带紋向日葵蛾)；C-'fl/"映rm2""Walsingham(filbertworm);C.;譜owe〃crLinnaeus(codingmoth);P/a(ywota_/7ave<iaw<3Clemens(杂色纵巻叶螟)；尸.Ww/towaWalsingham(杂食纟从巻"十螟)；丄c^es7.(36o^^waDenis&SchiffermUller(欧洲葡萄藤蛾)；S/^/owotooce〃a加Denis&Schiffermiiller(苹果芽小巻叶蛾)；￡Vzc/o/^av"e朋aClemens(葡萄巻叶蛾)；￡"w/oecW"鍵Z一e〃"股bner(葡萄蛾)；》cwflgotasa/w6"'co/flMeyrick(巴西苹果纵巻叶螟)；Oa//w"tomo/e^aBusck(东方果蛾)；6WdmaAe/zVmA朋aRiley(向日葵丁贞芽巻叶蛾)；^4，rCaem'"s，.；鳞翅目中的特选的其他农艺害虫包括但不限于J&o/7/7a/ometan'aHarris(-大尺虫复)；Jwar^a/z>zeate//aZeller(冲兆芽钻心虫)；^4m'sotasewatohaJ.E.Smith(检色斑纟丈樹缺)；Gu6rin-M6neville(一乍委)；J5owZ_yxmon.Linnaeus(蚕)；Bwccw/a,Wxf/mrZenW/aBusck(4帛p十穿孑L虫)；Co/Z"sew^y/AemeBoisduval(紫花苜蓿毛虫)；Z)ata"af'Mtege/77'maGrote&Robinson(胡4兆毛虫)；Dewc/ra/z'wMsw如Wci/sTschetwerikov(西伯利亚香虫我)，jwZw/gw"/7'aHiibner(elmspanworm);5Vawm'sri/z'an'aHarris(lindenlooper);五w;roctoc—sorMoeaLinnaeus(棕尾斌)；//am.57'"fl證en'c朋aGu6rin-M6neville(grapeleafskeletonizer);//e腿7ewcaoh由eCockrell(草原毛虫)；cw打eaDrury(美国白虫我)；尺e'/en'a(ycopw:ce〃aWalsingham(番痴虫尧虫)；,ce〃語'"/^ce〃""'"Hulst(Easternhemlocklooper);厶/Isre〃fln'fl/wgwZ^oMHulst(Westernhemlocklooper);丄ewcomasa/Zc^sLinnaeus(浙卩毒虫我)；Z^ma"/"n'at/^/7tirLinnaeus(舞毒虫我)；Mawcfwcagw仏gwemacM/a似Haworth(五斑天虫我,番茄天虫爽)；Af.sextoHaworth(番茄天虫我，烟草天虫我)；Zr讓fl,aLinnaeus(冬尺械)；尸a/eacn'tovemfl^/Peck(春尺獲)；i3—/"cr邵/zowtoCramer(长翅凤蝶，orangedog);P/irygamWiacaZ(/bm,caPackard(力口州才斛虫我)；P/^Z/ocm^^sc"re〃aStainton(才吉';昝虫我)；i^〃owo，Zer6/awcanie〃aFabricius(spottedtentiformleafminer);朽e"、bmwicaeLinnaeus(大菜粉蝶)；P.m_paeLinnaeus(菜粉蝶)；RLinnaeus(greenveinedwhitebutterfly);P/a妙础acaniw油,/aRiley(artichokeplumemoth);尸/wte〃a砂/c)We〃aLinnaeus(小菜蛾)；37Pe"iwop/ioragos观ie〃aSaunders(棉红铃虫)；Boisduval&Leconte(南方菜青虫)；^Woiieyaegrato/"Guen6e(杂食尺獲)；6Wn'2^raco""'朋aJ.E.Smith(redhumpedcaterpillar);5"淑rag"cem/e〃aOlivier(麦娥)；7Tw麵e鄉oeaXvoca，aSchiffermuller(松树列队毛虫)；77"eo/c(Z^e/Z/e〃aHummel(负袋夜蛾)；afco/w似Meyrick(番痴潜錄)；印ow謹e她戸必/aLinnaeus(巢蛾)；sw^/ZexaGuen6e;Ma/accwmas，.和Orgy/a^s^p。食毛目食毛目的昆虫害虫也i"直4寻关、注，包4舌Pec/i'cw/ws/iKmarn^capffcDeGeer(头虱)；尸.Z謂朋wjLinnaeus(体氛)；Mewac"威us"Wramz'wetwNitzsch(小鸡体IL);7Wc/oc/ectoc歸、DeGeer(狗喷毛虱)；(om'ocotes1DeGeer(线毛虱)；Bov/co/a頻'sSchrank(绵羊体虱)；/foem她—MNitzsch(短鼻牛氛)；她og"(^/n^v"w"Linnaeus(长鼻牛虱)；和其他攻击人类和动物的吸吮性和咀嚼寄生虱子。同翅目和半翅目半翅目和同翅目的成虫和蛹虫也是值得关注的昆虫，例如但不限于球蚜科(Adelgidae)的球蚜，盲蝽科(Miridae)的盲蝽，蝉科(Cicadidae)的虫举，叶虫举牙牛(Cicadellidae)的叶虫举五m/oflwcflspp.，菱飞虱牙牛(Cixiidae)、蛾蜡蝉科(Flatidae)、蜡蝉总科(Fulgoroidea)、圆飞虱科(Issidae)和飞虱科(Delphacidae)的飞虱，角蝉科(Membracidae)的角蝉，木虱科(Psyllidae)的木虱，粉虱科(Aleyrodidae)的粉虱，虫牙科(Aphididae)的虫牙虫，根瘤蚜科(Phylloxeridae)的根瘤虫牙，粉介壳虫科(Pseudococcidae)的粉介，链介壳虫科(Asterolecanidae)、软介壳虫科(Coccidae)、胭虫介科(Dactylopiidae)、盾介壳虫科(Diaspididae)、毡虫介科(Eriococcidae)、族虫介科(Ortheziidae)、刺葵介壳虫科(Phoenicococcidae)和硕介壳虫科(Margarodidae)的介壳虫，网才春科(Tingidae)的网蝽，虫畚详牛(Pentatomidae)的椿象，麦长蝽5fc5wspp.;以及长蝽科(Lygaeidae)的其他瓜子虫(seedbug),沬蝉科(Cercopidae)的沬蝉，缘椿象科(Coreidae)的南瓜缘蝽和(Pyrrhocoridae)的恙螨和污棉虫。同翅目的在农业经济上重要的成员还包括^f旦不限于phwmHarris(!宛豆虫牙虫)；yl;/^craccz'voraKoch(i工豆虫牙虫)；A/a6aeScopoli(黑豆虫牙虫)；J.gawy;/ZGlover(棉虫才虫，瓜虫牙虫)；J.ma^z'ra(i^^Forbes(玉米冲艮虫牙虫)；Apo/m'DeGeer(苹果虫牙虫)；爿.spiraeco〖aPatch(绣纟戋菊虫牙虫)；Jii/acoW/jwmso/am'Kaltenbach(毛i也黄虫牙虫)；CAae,os7>/z。"y^aga咖〃z'Cockerell(草莓虫牙虫)；i)/wrfl//n'i1"ox/oKurdjumov/Mordvilko(<我罗斯小麦虫牙虫)；Z^as"//^//flwtagiweczPaaserini(苹果3欠3鬼虫牙虫)；五n'oy。ma/am'gen/mHausmami(苹纟帛虫牙)；5rev/co，e6mw7'caeLinnaeus(巻心菜虫牙虫)；场fl/o/tems/mm'Geoffroy(桃大尾虫牙);丄z^//u'5e^s7'm/Kaltenbach(芜菁坊虫)；Afeto/o/op/n'wmc^'/rAo<ii/mWalker(谷类虫牙虫)；A/acrc^^/wmew//orbiaeThomas(马铃薯虫牙虫)；A/>zmsperw'caeSulzer(冲兆-马铃薯虫牙虫，绿桃对虫)；7V^cw0W"r沾^w'g/々Mosley(莴苣虫牙虫)；尸ew/力igwspp.(才艮虫牙虫和五倍子虫牙虫)；i/wpa/o^》/wwmai'cfcFitch(玉米叶虫牙虫)；凡Linnaeus(禾谷缢管虫牙)；Sc/ziza//n、gra附i"卿Rondani(麦二忿坊)；5Vp/2(3/7crwForbes(甘蔗黄虫牙)；5Vtoh'cwave朋eFabricius(麦长管虫牙)；rAen.oa卢s聽cw/"toBuckton(苜蓿斑虫牙)；Jbxo,raBoyerdeFonscolombe(桔二叉財)；和71.c"n'c油Kirkaldy(褐色桔虫牙)；爿de/gesspp.(球虫牙)；P/ij^foxerac/evas加r"Pergande(pecanphylloxera);5e/w'i7'aGemiadius(烟粉虱，甘薯粉虱)；及"厂gew争/"Bellows&Perring(白粉虱)；jDZa/ewrai/as1c""'Ashmead(甜桔4分II);7h'a/ew厂0(ias1"6w"/owei^(bandedwingedwhitefly)和71.vaporan'orwnWestwood(;显室白4分虱)；EVwpocwca々ZaeHarris(马铃著叶虫芈)；丄aoc/e/;/wxWn'a,e〃twFallen(斑飞H);JWacro/estes《W(2cH"we(3加Forbes(紫苑叶蝉)；7Ve/7A0城/xc滅c，Uhler(绿叶虫举)；iV.m'grop!'cfwsSdl0舀p十虫举)；A^7aparvata/Mge似SH10曷飞ll);附"W^Ashmead(玉米飞虱)；S(9g"fe/Z"/wr"y^r"Horvath(白背飞虱)；5bgfltocfeso".zz'co/aMuir(稻飞虱)；7)^/i/oqy6a/o扁n'aMcAtee(苹果白叶蝉)；￡>^/TO"^wraspp.(葡萄叶蝉)；A/ag/cico^a鄉,em/ec/mLinnaeus(周期蝉)；/ce，戶n:A肌，Maskell(吹纟帛介壳Comstock(圣琼斯介壳虫)；尸/朋ococct^Risso(桔粉虫介)；尸seiWococctwspp.(其他mealybugcomplex);G3c。/w_y//fl"n'co/aFoerster(梨木虱)；7Wozflrfiosp".Ashmead(柿木H)。半翅目的农业经济上重要的虫种包括^f旦不限于Jcroter"w附MareSay(绿棒)；Jwasa/"WsDeGeer(南瓜虫)；/ewco/,ems1/ewc一emsSay(麦长棒)；Qo^/mc"goy观/iFabricius(棉网虫春)；tope/to脂cfestoDistant(tomatobug);Z);;油rcmHerrich-Schaffer(污对帛虫)；^kycA^/wjserw^Say(茶翅虫春)；五^sc/n'Ww5v(3r油由PalisotdeBeauvois(—斑棬象)；Graptostethusspp.(盾蝽复合体)；Z印tog7。肌wcorcwtoSay(左腿松子虫)；Z_xgw//weo/aKyPalisotdeBeauvois(变色盲才春)；丄yg船//espenwKnight(西变色盲椿)；丄y炉prate"""Linnaeus(普通草地臭虫)；丄y，r，/Zpe顧'sPoppius(S欠沐l变色盲才春)；Z^gocohsLinnaeus(普通纟录盲虫畚)；iVezarav/n'^w/"Linnaeus(南纟录墙)；(9eZ"/"5/wgwoxFabricius(牙舀黑蝽)；Ocope"ws/osda^sDallas(大马利筋长椿)；i^ewcfafomoscefo■sm.atoReuter(棉花盲捲》此外，本发明的各实施方案可有效对抗例如以下的半翅目昆虫G2/dc0n's朋n^g7'cwsGmelin(草莓臭虫)；O/Ao/wc簡/es^lsLinnaeus;尸/asz'occ^nigz'co/foFallen(苹盲棒)；Cjr鄉e/tomcxiastoDistant(番痴臭虫)；Cy"ope/towototoDistant(suckfly);jS^朋ag師'cwa仿q/ks"'a加Reuter(白斑盲棒)；i^ap/mocon'sc/i/on'omiSay(急荚盲蝽)；Z/a6o/7f'(^'co/"Knight(;羊i^、盲虫春)；尸5ewda/o附05ce/^sen'"^wReuter(棉花盲棒)；^4t/e妙ocon'51rop油5Say(快盲蜂)；尸oe"7ocajwws//"e她jFabricius(四线纟丈盲漆)；A^y^Schilling(假麦长漆)；,w'i^厂"—awwsHoward(假麦长漆)；脸2aravzV油/aLinnaeus(南绿漆)；J5"w;^gus^ers，.；Coraic/ae^/p.;尸,r/oco"'c/ae;T7w油e5，.；5/os"tom",/iiaes/t/.;i^iww'W"e和s，.。直翅目直翅目昆虫的成虫和未成熟虫体值得关注，包括坤蜢、蝗虫和蟋蜂Me/朋o//us5朋gw'm》e5Fabricius(迁徙虫乍虫孟)；Md參m2riflfcThomas(differentialgrasshopper);Lyfe附Mrrw&謹DeGeer，(红腿虫,虫孟)；5"c/n、^cerc"amen'ca打aDrury(美国虫,虫孟)；S.gregan.aForskal(沙、;莫虫皇虫)；locustom^raton'flLinnaeus(迁4走虫皇虫)；^4c/etodome^ictwLinnaeus(屋内戈悉虫率)；andO^/oto/pflspp.(蝼虫古)。缨翅目缨翅目的成虫和不成熟虫体值得关注，包括J7zn)w^^"cz'Lindeman(洋葱蓟马)；力wap/io决n)wo6sm/，Miiller(草蓟马)；Fn2w/^'7'e//aykycaHinds(步因草莉马)；尸;^"/://"/6〃<3oc"'t/ewto//sPergande(西花蓟马)；iVeo/z_y<iatoAn>s"ran'aZn'foBeach(大豆蓟马)；S"WAo决厂i/wMoulton(柑橘蓟马)；和其他啃叶蓟马。革翅目革翅目的成虫和幼虫也是值得关注的昆虫，包括蠼叟科(Forficulidae)的蠼螋，For力cwZaat/n'aJahaLinnaeus(欧洲蠼螋)；C7efooc/iasmon'oFabricius(黑蠼虫臾)。毛翅目其他值得关注的昆虫包括蜚蠊目(Blattodea)的若虫和成虫，包括姬蜚蠊科(Blattellidae)和蜚蠊科(Blattidae)的蟑螂，别a加on'ewtatoLinnaeus(东方蜚蠊)；她"e〃fl幽/n'願'Mizukubo(亚洲蟑,)；S/a〃e〃a！ge削am'caLinnaeus(德国小嫌)；—Fabricius(brownbandedcockroach);_Pen》/awetaamen'ccmaLinnaeus(美国蟑41(browncockroach);丄ewco/AcreamfloferaeFabricius(Madeira蜂螂)。还包4舌蜱螨目(Acari)(螨类)的成虫和幼虫，如爿cen'atow'c/ie〃aKeifer(小麦巻叶螨)；/WraZn'a/a/msMiiller(棕色小麦螨)；叶螨科(Tetranychidae)的虫知蛛虫莴和红錄口蛛，尸"wo"jc力wjKoch(欧洲叶螨)；re的，/mswWcaeKoch(二斑叶虫禹)；(r.mcc/amWMcGregor(McDaniel螨)；T"."'wwaZ"n'做sBoisduval沐砂叶螨)；ZfwrA:es,聽'Ugarov&Nikolski(草莓叶螨)；伪叶螨科(Tenuipalpidae)的短须螨，5rev^a/pws/evWw.McGregor(才计才禹#豆须虫葛)；癭虫离-牛(Eriophyidae)的4秀螨和瘤螨及其他啃叶螨和对人类和动物健康重要的螨虫，即Epidermoptidae科的锈螨，蠕形螨科(Demodicidae)的毛嚢虫，嗜甜蟎牙牛(Glycyphagidae)的谷虫葛，石更虫皁-牛(Ixodidae)的扁H了义odayscopw/an'sSay(鹿虱)；/xoc/esAo/ocyc/twNeumann(Australianparalysistick);Dermacewtorvan.aZ/Z!\sSay(美国3句氛)；乂m6(yom附aamen'omwwLinnaeus(孤星壁虱)；痒螨科(Psoroptidae)、蒲螨科(Pyemotidae)和疥螨科(Sarcoptidae)的*癣和齊螨。缨尾目(Thysanura)的昆虫害虫倡—-彈关注，如丄ep&wa^ccAan'"aLinnaeus(蠹虫)；7Te"woZz'adomes"'cflPackard(家衣鱼)。本发明的各示例性实施方案利用不同的杀虫作用模式来避免在例如玉米根虫中发展抗性。对根虫的抗性可通过本领域^^知的任何方法引入到作物中。在一些实施方案中，不同的杀虫作用模式包括毒素与玉米根虫肠膜中的不同结合位点的结合。本发明的可用于抵抗根虫的转基因包括但不限于编码Bt蛋白的转基因。其他的适合其他害虫的转基因在本文中也有讨论，在本领域中是公知的。在本发明的一些实施方案中，引入抗性的方法包括将杀虫基因引入到植物中。这种基因的非限制性实例是编码Bt毒素如已知的Cry毒素的同源物的基因。"Bt毒素"意指在各种Bt菌株中存在的类别广泛的毒素，包括诸如植物杀昆虫蛋白和S-内毒素的毒素。参见例如Crickmore等人(1998)M/c&o/.Mo/ec.说o/.Wev.62:807-813;Crickmore等人(2004)5acz7/w;51T7Mn'wgiie/w^roxi/7Vomewc/atore,见lifesci.sussex.ac.uk/Home/Neil一Crickmore/Bt。才直物杀昆虫蛋白(例Jj口VIP1类、VIP2类或VIP3类的成员)是分泌性杀昆虫蛋白，由昆虫中肠液进行蛋白水解加工。它们对广谱的鳞翅目昆虫具有杀虫活性。参见例如5,877,012号美国专利。BtS-内毒素对多种昆虫害虫的幼虫有毒性，包括鳞翅目、双翅目和鞘翅目的成员。这些昆虫毒素包括但不限于Cry毒素，包括例如Cryl、Cry3、Cry5、Cry8和Cry9在内。在某些实施方案中，植物例如通过基因堆积(genestacking)能产生一种以上的毒素。例如，各实施方案的植物中的DNA构建物可包含各目的堆积核苷g良序列的任何组合，以产生具有期望的性状的植物。本文所用的"性状，，指衍自特定序列或序列群组的表型。单一表达盒可含有编码目的杀虫蛋白的核苷酸和至少一个另外的基因，如用来增加或改进转基因植物的期望性质的基因。或者，另外的基因可在多个表达盒上提供。所产生的组合也可包括任何一个感兴趣的多核苷酸的多个拷贝。例如，各实施方案的植物中的基因堆积可含有一个或多个编码具有杀虫和/或杀昆虫活性的多肽如Bt毒蛋白(描述于例如美国专利5,188,960;5,277,905;5,366,892;5,593,881;5,625,136;5,689,052;5，691，308;5，723，756;5,747,450;5,859,336;6,023,013;6,114,608;6,180,774;6,218,188;6,342,660和7，030，295;美国公开说明书US20040199939和US20060085870;WO2004086868;和Geiser等人(1986)Gene48:109)及Cry34类和Cry35类的Bt结晶蛋白(参见例如Schnepf等人(2005)v^p/.￡>m>o".Mkro&o/.71:1765-1774)的多核苷酸。还设想用于基因堆积的有植物杀昆虫蛋白(例如VIP1类、VIP2类或曹3类的成员)。参见例如美国专利5,849,870;5，877,012;5风174;5,990,383;6,107,279;6,137,033;6,291，156;6,429,360;美国公开说明书US20050210545;US20040133942;US20020078473。可用于基因堆积的BtS-内毒素或Cry毒素是本领域公知的。参见例如美国公开说明书US20030177528。这些毒素包括Cry1至Cry42,Cytl和2，Cyt样毒素和二元Bt毒素。目前已知有250多种具有广泛特异性和毒性的Bt5-内毒素。详尽的列表参见Crickmore等人(1998)Afz'croh'o/.Mo/.所o/.Tev.62:807-813，通过互联网biols.susx.ac.uk/Home/Neil—Crickmore/Bt/index可获4寻定期更新的1言息。列入这个列表的标准是，蛋白质与该目录当中的一种或多种毒素具有显著的序列相似性，或者是显示杀虫活性的苏云金杆菌类芽孢内含蛋白，或者它对目标生物具有一定的实验上可证实的毒性作用。在二元Bt毒素的情况中，本领域技术人员会认识到，两个Bt毒素必须进行共表达以诱导Bt杀昆虫活性。值得关注的BtCry毒素的具体、非限制性实例包括Cryl(如CrylA、CrylA(a)、CrylA(b)、CrylA(c)、CrylC、CrylD、CrylE、CrylF)、Cry2(如Cry2A)、Cry3(如Cry3Bb)、Cry5、Cry8(参见GenBank登录号CAD57542、CAD57543，另参见美国专利申请系列号10/746,914)、Cry9(如Cry9C)和Cry34/35，以及它们的功能片段、嵌合修饰和改组修饰或者其他变体。各实施方案的植物中的堆积基因还可编码Bt毒蛋白之外的具有杀昆虫活性的多肽，如植物凝血素(VanDamme等人(l994)尸/a^Afo/.淑.24:825)、pentin(描述于5，981，722号美国专利)、脂肪酶(脂质酰基水解酶，参见例如6,657,046号和5，743，477号美国专利中所公开的脂肪酶；另参见WO2006131750A2)、链霉菌属G^印tom少c")的胆固醇氧化酶，和》f自Xenork^cks属和尸Aotor/w6t/t^属各种细菌、万ac"/w/ateras;on^和5ac〃/tw印A"en'cws等的杀虫蛋白。还i爻想到〗吏用嵌合(杂合)毒素(参见例如Bosch等人(1994)祝o/Tec/wo/ogv12:915-918)。这种转化体可含有衍自同一类别毒素(例如超过一种5-内毒素、超过一种杀虫脂肪酶、超过一种二元毒素等)的转基因，或者可衍自不同类别的毒素(例如5-内毒素与杀虫脂肪酶或二元毒素的组合)的转基44因。例如，具有表达^"自Bt的杀昆虫S-内毒素(如CrylF)的能力的植物，也具有表达至少一种不同于Cry1F蛋白的其他5-内毒素如Cry1A(b)蛋白的能力。同样，具有表达衍自Bt的杀昆虫S-内毒素(如CrylF)的能力的植物，也具有表达杀虫脂肪酶如脂质酰基水解酶的能力。在实践中，根据杀虫作用的性质和某些害虫对某些毒素的易感性，之前描述的不同Bt基因和其他基因的某些堆积组合(stackedcombinations)最适合于某些害虫。例如，一些转基因组合特別适用于对抗不同类型的玉米根虫(CRW)，包括WCRW、北部玉米根虫(NCRW)和墨西哥玉米根虫(MCRW)在内。这些組合包括至少Cry34/35和Cry3A及Cry34/35和Cry3B。对于其他的害虫，也已知有其他的组合。例如，适合用于抵抗ECB和/或西南玉米钻心虫(SWCB)的组合包括至少CrylAb和CrylF、CrylAb和Cry2、CrylAb和Cry9、CrylAb和Cry2/Vip3A堆积、CrylAb和CrylF/Vip3A堆积、CrylF和Cry2、CrylF和Cry9以及CrylF和Cry2/Vip3A堆积。适合用于抵抗玉米穗虫(CEW)的组合包括至少CrylAb和Cry2、CrylF和Cry2、CrylAb和CrylF、Cry2和Vip3A、CrylAb和Cry2/Vip3A堆积、CrylAb和CrylF/Vip3A堆积以及CrylF和Cry2/Vip3A堆积。适合用于抵抗秋行军虫(FAW)的組合包括至少CrylF和CrylAb、CrylF和Vip3A、CrylAb和CrylF/Vip3A堆积、CrylF和Cry2/Vip3A堆积及CrylAb和Cry2/Vip3A堆积。适合用于抵抗小地老虎(BCW)和/或西部豆切根虫(WBCW)的组合包括CrylF和Vip3A、CrylF和Cry2以及CrylF和Cry2/Vip3A堆积。而且，这些不同的组合还可进一步互相组合，以提供对多种害虫的抗性治理。各实施方案的植物也可含有含各基因的组合的基因堆积(genestack),以产生具有多种期望的性状组合的植物，所述性状包括但不限于合乎动物饲料需要的性状如高油基因(例如6,232,529号美国专利)、平衡的氨基酸(例如hordothionin(5，990,389、5,885,801、5，885，802、5,703,049号美国专利)；大麦高赖氨酸(Williamson等人(19S7)历oc/zem.165:99-106;WO98/20122)和高曱硫氨酸蛋白质(Pedersen等人(1986)CAe附.261:6279;Kirihara等人(1988)71:359;Musumum等人(1989)户/a^il^/.说o/.lm3));可消化性提高(例如经修饰的贮藏蛋白(6,858,778号美国专利)和硫氧还蛋白(7,009,087号美国专利))。各实施方案的植物也可含有包含如下的基因的基因堆积导致产生合乎抗病性需要的性状的基因(例如烟曲霉毒素解毒基因(5,792，931号美国专利)；无毒性(avirulence)和抗病性基因(Jones等人(1994)Sck打ce266:789;Martin等人(1993)5Wewce262:1432;Mindrinos等人(1994)Ce〃78:1089)。在更多的实施方案中，第一和/或第二抗害虫作物还含有能提供除草剂耐受性的除草剂抗性基因，例如抗草甘磷-N-(膦酰基甲基)甘氨酸(包括这种除草剂的异丙胺盐形式)的基因。示例性的除草剂抗性基因包括草甘磷N-乙酰转移酶(GAT)基因和5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因，包括在美国专利申请公开说明书US20040082770以及WO02/36782和WO03/092360中公开的那些基因在内。除草剂抗性基因通常编码对除虫剂不敏感的经修饰目标蛋白，或者编码能在除草剂起作用之前将植物中的该除草剂降解或解毒的酶。参见例如DeBlock等人(1987)￡MB<9丄6:2513;DeBlocke,"/.(1989)尸/朋,尸/^wo/,91:691;Fromm等人(1990)历。:Tec/mo/ogy8:833;Gordon-Kamm等人(1990)P/"WCW/2:603和Frisch等人(1995)尸/朋fM/.編.27:405-9。例如，使用编码突变的目标酶EPSPS和乙酰乳酸合酶(ALS)的基因，已获得了对草甘磷或磺酰脲除草剂的抗性。通过使用编码草丁膦(phosphinothricin)乙酰转移酶、腈水解酶或2,4-二氯苯氧基乙酸单加氧酶的细菌基因，已获得了对草铵膦、溴苯腈和2,4-二氯笨氧基乙酸(2，4-D)的抗性，所述三种酶分别解毒这三种除草剂。还设想到的是谷氨酰胺合酶的抑制剂如草丁膦或basta(例如bar基因)。各实施方案的其他植物可含有包含合乎加工产品或过程产物(processingorprocessproducts)需要的'l"生讶大的i焦禾只(stack),所述寸生^J口经修饰的油(例如脂肪酸去饱和酶基因(5,952,544号和6,372,965号美国专利))；经修饰的淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE));和聚合物或生物塑料(例如5,602,321号美国专利；p-酮基^5克解酶、聚羟基丁g臾合酶和乙酰乙酰基-CoA还原酶(Schubert等人(1988)丄Ba"eWo/.170:5837-5847))。还可将各实施方案的多核苷酸与提供农艺性状或转化技术性状的多核苷酸进行组合，所述农艺性状如雄性不育(例如参见5,583,210号美国专利)、茎秆强度、开花时间，所述转化技术性状如细胞周期调节或基因靶向(例如WO99/61619;6，518，487号和6,187,994号美国专利)。这些堆积组合可通过任何方法产生，包括但不限于通过任何常规方法或顶交(TopCross)方法进行的杂交育种，或者遗传转化。如果各序列是通过遗传转化植物来堆积的，各个目的多核苷酸序列可在任何时间和以任何顺序进行组合。例如，可将包含一个或多个期望的性状的转基因植物用作目标，以通过随后的转化引入更多的性状。可用通过转化盒(transformationcassette)的任何组合提供的各目的多核苷酸，按共转化方案同时引入各性状。例如，如果要引入两个序列，该两个序列可各自含在单独的转化盒(反式(trans))中，或者可含在同一个转化动。在某些情况下，可能需要引入能抑制目的多核苷酸的表达的转化盒。这可与其他抑制盒或过量表达盒的任何组合进行组合，以在植物中产生期望的性状组合。还认识到，可^^用位点特异性重组系统，将各个多核苷酸序列堆积在期望的基因组位置。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853。鉴于目前公认的认识，即20%庇护区对于单一高剂量抗昆虫蛋白表达是适当的，至少出于管制的原因，可能优选的是采用差不多近似于第一和第二转基因抗害虫种子的80%-20%混合物的方案。由于取决于所产生的杀虫蛋白的特性，不同的混合物对于特定害虫可能是最佳47的，但一般来说当杀虫蛋白被转基因植物高剂量产生时，80-20混合物据认为在许多情况中是合理的，不过本文公开的本发明不受这样的限制。但是，通过另一杀虫作用模式靶向同一害虫的种子的混合物，不太可能产生抗性昆虫，因为昆虫很不可能会对两种不同的作用模式具有抗性。结果，这些情况有不同的分配比例，而不是80-20混合物比例(不过应理解，本发明并不限于特定的实施或比例)。另外，通过处理植物繁殖材料，也可赋予抗虫性。在植物繁殖材料(果实、块茎、鳞茎、球茎、谷粒、种子)——但尤其是种子——^乍为商业产品出售之前，它通常用这样的保护性涂料进行处理，所述保护性涂料包含除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或者这些制品中的几种的混合物，如果需要的话还进一步加上制剂领域常用的载体、表面活性剂或促应用辅料(application-promotingadjuvant),以^是供对抗细菌、真菌或动物害虫造成的损害的保护。为了处理种子，可这样将保护性涂料施涂到种子用液体制剂浸渍块茎或谷粒，或者干湿制剂相结合对种子进行涂敷。另外，在特殊的情况中，也可采用其他的方法来应用到植物，例如针对芽或果实进行处理。此外，天然抗性基因也可用于本发明，如玉米的可凝性球蛋白(maysin)(Waiss,etal.，J.Econ.Entomol.72:256-258(1979));玉米半胱氨酸蛋白酶如MIR1-CP(Pechan,T.etal.,PlantCell12:1031-40(2000));DIMBOA(Kkm,J.A.etal.,J.Econ.Entomol.60:1529-1533(1967》；和苞叶紧贴度(husktightness)基因(Rector,B.G.etal"J.Econ.Entomol.95:1303-1307(2002))。这些基因可用于存在它们的植物中，或者通过本领域公知的和/或本文讨论的转基因方法插入到其他植物中。提供了在抗害虫作物田地中治理害虫抗性的方法。一种这样的方法包括在一个种植周期中在田地中种植第一抗害虫作物，和在第二种植周期中在同一田地中种植第二抗害虫作物，其中第一和第二抗害虫作物对目标害虫具有杀虫作用，但杀虫作用的模式不同。应认识到，抗性性状可通过转化方法(即转基因方法)或传统育种方法引入到作物中。或者，可将外部杀虫剂如种子处理或化学杀虫剂用作一个或两个抗虫性来源。该方法通过在第二种植周期杀死在第一种植周期被选定的抗性害虫，避免了抗性在目标害虫中的发展。这是通过在第二种植周期使用其作用模式与第一种植周期的抗虫性来源不同的抗虫性来源来实现的。结果，可能的情况是，任何依靠对第一抗虫性来源的抗性在第一种植周期幸存下来的抗性害虫，在第二种植周期将被杀死，因为对第一抗虫性来源的抗性并不赋予对第二抗虫性来源的抗性，原因是两种抗虫性来源的杀虫作用模式不同。因此，与目前公认的庇护区要求不同的是，在第二种植周期中可产生足够的庇护区，这使得从IRM的观点出发，可以在每个种植周期完全收获抗害虫作物，同时又能治理害虫中抗性的发展。使用本发明的这个方法，种植者可以在某田地中种植玉米之后的种植周期在同一田地种植玉米作物。在本发明之前，这样做是不明智的，因为存在根虫对作物的损害的风险。此外，由于最近在其他的作物中已有根虫活动，所述方法提供了控制根虫扩散的方法和针对根虫的抗性治理策略。在又一个实施方案中，提供了使田地中结构化庇护区的必要性减至最低或消除这个必要性的方法，结构化庇护区如前所述目前是要求的。这是通过在田地中种植以不同作用模式对目标害虫具有抗性特性的种子的混合物来实现。举个非限制性实例，在玉米中，鳞翅目和鞘翅目的害虫往往值得关注，特别是诸如CRW和ECB的害虫以及之前描述过的其他害虫。同样如前所述，对农场主有利的是，使尽可能多的作物对特定地区流行的害虫具有抗性，以使产量最大化。为了具有尽可能多的抗害虫植物，同时仍能治理害虫的抗性，给田地中的植物提供对至少一种害虫的超过一种的抗虫机制。例如，如果需要减少或消除对ECB的结构化庇护区的必要性，可给田地中的植物提供至少两种形式的不同作用模式的抗ECB抗虫性。在这点上，抗性ECB害虫的发展的可能性大为减少，因为特定害虫会具有必要的随机突变从而提供对两种杀虫作用模式的抗性的可能性将很微弱。可用于本发明情形的抗虫性来源的组合的非限制性实例，在前文中已对ECB和其他害虫进行了描述，可包括产生不同Bt蛋白(或其他提供这种抗性的蛋白)的转基因、化学杀虫剂、种子处理或它们的组合。具有不同作用模式的具体的各对Bt蛋白在上文已作描述。因此，显示这种第一和第二杀虫抗性模式的植物很可能不会要求单独的结构化庇护区，或者至少所要求的庇护区会小得多。较小的庇护区会是可接受的，因为通常对于每一个暴露于抗性作物后能幸免的抗性昆虫，庇护区应产生约500只易感昆虫。由于二元作用模式作物如果会产生存活的抗性昆虫的话，产生的数量也将是非常少，因此需要的来自庇护区的易感昆虫的数量也会相应地少得多。因此，这个方法是减少或消除在作物田地中对庇护区的需求，同时又能有效治理抗性昆虫的发展的有效方法。另外，相同的方法可应用于同一田地中的多种害虫。例如，通过以上所列的类似组合，植物可通过两种作用模式具有对ECB和CRW的抗性。如果某田地包括具有对两种目标害虫的抗性的植物，而对每种害虫的抗性是通过两种不同的作用模式，则应能够消除或减少针对这两种害虫的每一种的庇护区。结果，农场主不再需要牺牲一部分种植地中的产量来防止昆虫抗性发展。另外，这个方法还防止出现前文讨论过的遵守问题，这个问题是农场主可能为了增加产量或仅仅通过不完善的种植程序，而不种植足够的庇护区来治理抗性害虫的发展。所公开的方法可例如用来延迟鳞翅目和鞘翅目的抗性昆虫害虫的发展，在增加田地的总面积的同时仍能提供针对这些害虫造成的作物损害的保护作用。在抗害虫植物的田地中，这可通过多种方式来实50现。例如，该田地可掺入至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的能产生CrylA(b)、CrylF和Cry34/35蛋白的植物，其余的植物产生CrylA(b)和CrylF蛋白。这导致该田地中100%的植物具有对鳞翅目中的至少一种害虫的抗性，而且具有对鞘翅目中的至少一种害虫的抗性的植物的百分数增加。这是有可能的，因为CrylA(b)和CrylF对抗鳞翅目害虫的作用模式不同，故此，具有两种针对这些害虫的作用模式意味着只有极少数的对这两种模式具有抗性的害虫能在田地中存活。这意味着需要极少的庇护区或不需要庇护区就能防止抗性害虫的发展，因为抗性害虫的数量已经非常少。故此，在田地中种植的全体作物都显示对至少一种鳞翅目害虫的抗性。如本文所述，可使用各种蛋白质的不同组合，来靶向会在目的区域造成问题的特定鳞翅目害虫。另外，极大部分的田地面积也受到保护而免遭至少一种鞘翅目害虫侵扰。害虫对Cry34/35蛋白的反应的特性(参见美国临时申请60/977,477)使得田地有比公认的80%面积更大比例的面积表达这些蛋白质，同时仍对所关注的鞘翅目害虫具有足够的庇护区。结果，在这种系统中，种植者的全部田地受到保护而免遭至少一种所关注的鳞翅目害虫的侵扰，且极大部分的田地面积也受到保护而免遭至少一种所关注的鞘翅目害虫的侵扰。在要求对于鳞翅目害虫的庇护区的情况下，田地还可掺入第三种子类型，该种子类型掺有对鞘翅目害虫的耐受性，但没有对鳞翅目害虫的耐受性。这仍能在给定田地的更大比例的面积上提供免遭害虫侵扰的保护作用，但还能提供一些庇护区昆虫，以使任何幸存的鳞翅目抗性昆虫受到稀释。虽然本发明主要是用影响玉米的害虫的实例进行描述的，但本文所述的发明也可应用于在其他作物的情形中需要抗性治理的田地，所述其他作物包括大豆、小麦、大米、高粱、棉花等。本发明还可进行组合使用，使得多种害虫在应用所述方法的过程中得到控制，无论是通过转基因手段还是其他手段。在一些实施方案中，将一种或两种抗害虫作物进一步用杀虫剂或杀昆虫剂处理。"杀虫剂"是在外部供应到作物或作物种子的杀虫剂。术语"杀昆虫剂"具有与杀虫剂相同的含义，例外的是它的使用是针对害虫属昆虫的那些情况。适用于本发明的杀虫剂包括除虫菊酯和合成的拟除虫菊酯；噁二溱衍生物(参见例如5,852,012号美国专利)；氯烟酰类(chloronicotinyls)(参见例如5,952,358号美国专利)；硝基胍衍生物(参见例如5,633,375号、5,034,404号和5,245,040号美国专利);三唑类；有机磷酸酯类；吡咯类、吡唑类和苯基吡唑类(参见例如5,952,358号美国专利)；双酰肼类；氨基甲酸酯类和生物/发酵产物。这些类別当中的已知杀虫剂列举在例如T7e尸e幼'dcfeMawwa/,llthed.,(1997)ed.C.D.S.Tomlin(BritishCropProtectionCouncil,Famham，Surrey,UK)中。在本文中当描述某种杀昆虫剂时，应理解的是，该描述意在包括能显示与所描述的杀昆虫剂形式相同的杀昆虫活性的该杀昆虫剂的盐形式以及该杀昆虫剂的任何异构形式和/或互变异构形式。可用于本发明方法的杀昆虫剂可以为任何在商业交易中被批准用作这种杀昆虫剂的等级或纯度。在还其他的实施方案中，第一和/或第二抗害虫作物任选用杀螨剂、杀线虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、除草剂和它们的组合进行处理。就使用转基因或天然抗性基因来说，还可采用本领域公知的各种启动子，来增加或减少目标蛋白的表达，从而影响仍需要的庇护区的数量。如果目标是对于某害虫而言庇护区更少或不用庇护区，则通常需要更高的表达来产生"高剂量，，的被表达蛋白。但是，在一些情况中，可能最好有更多数量的成体害虫，以监测抗性的发展或对一种害虫产生更大的庇护区，在这种情况中降#<表达可能是适当的。虽然已出于清楚理解的目的通过举例说明和实例的方式，对前述的各个实施方案进行了一定程度的详细描述，但显而易见的是可在所附权利要求书的范围内实施某些变化和修改方案。本说明书中提到的52所有出版物和专利申请是表示本发明各实施方案所属的
技术领域：
的技术人员的水平。所有出版物和专利申请都通过引用并入本文。权利要求1.一种减少转基因抗害虫作物的田地中抗性害虫发展的方法，所述方法包括以下步骤a)将第一转基因抗害虫作物的种子与第二转基因抗害虫作物的种子混合以提供种子混合物，其中所述第一抗害虫作物和所述第二抗害虫作物对同一目标害虫具有杀虫作用，但通过不同的杀虫作用模式起作用，其中所述种子混合物由约99％至约1％的所述第一转基因抗害虫作物和由约1％至约99％的所述第二转基因抗害虫作物组成；和b)种植所述种子混合物。2.权利要求l的方法，其中所述害虫选自西部玉米根虫、北部玉米根虫、墨西哥玉米根虫、南部玉米根虫和它们的组合。3.权利要求l的方法，其中所述害虫是西部玉米根虫。4.权利要求1的方法，其中所述不同的杀虫作用模式包括半竟争性或非竟争性结合在所述同一目标害虫的肠膜中。5.权利要求1的方法，所述方法进一步包括用杀虫剂处理所述第一转基因抗害虫作物种子和/或所述第二转基因抗害虫作物种子。6.权利要求5的方法，其中所述杀虫剂选自杀昆虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、除草剂或它们的组合。7.权利要求6的方法，其中所述杀虫剂是杀昆虫剂。8.权利要求7的方法，其中所述杀昆虫剂选自除虫菊酯、合成的除虫菊酯、噁二溱类、氯烟酰类、硝基胍类、三唑类、有机磷酸酯、吡咯类、吡唑类、酚吡唑类、双酰肼类、生物/发酵产物、氨基曱酸酯类或它们的组合。9.权利要求1的方法，其中所述第一转基因抗害虫作物产生Cry34/35蛋白，所述第二转基因抗害虫作物产生Cry3蛋白。10.权利要求1的方法，其中所述第一转基因抗害虫作物产生Cry34/35蛋白，所迷第二转基因抗害虫作物产生CrylF蛋白。11.权利要求1的方法，其中所述第一转基因抗害虫作物产生CrylA(b)蛋白，所述第二转基因抗害虫作物产生CrylF蛋白。12.权利要求1的方法，其中所述第一转基因抗害虫作物产生CrylA(b)蛋白，所述第二转基因抗害虫作物产生Cry9蛋白。13.权利要求1的方法，其中所述笫一转基因抗害虫作物产生CrylA(b)蛋白，所述第二转基因抗害虫作物产生Cry2蛋白。14.权利要求1的方法，其中所述第一转基因抗害虫作物产生CrylF蛋白，所述第二转基因抗害虫作物产生Cry2蛋白。15.权利要求1的方法，其中所述第一转基因抗害虫作物产生CrylA(b)蛋白，所述第二转基因抗害虫作物产生Cry2蛋白和Vip3A蛋白。16.权利要求1的方法，其中所述第一转基因抗害虫作物产生CrylF蛋白，所述第二转基因抗害虫作物产生Cry2蛋白和Vip3A蛋白。17.权利要求1的方法，其中所述第一转基因抗害虫作物产生CrylA(b)蛋白，所述第二转基因抗害虫作物产生CrylF蛋白和Vip3A蛋白。18.权利要求i的方法，其中所述第一转基因抗害虫作物和/或所述第二转基因抗害虫作物还含有选自以下的除草剂抗性基因草甘磷N-乙酰转移酶(GAT)、5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、草丁膦N-乙酰转移酶(PAT)或它们的组合。19.一种减少转基因抗害虫作物的田地中抗性害虫发展的方法，所述方法包括以下步骤a)将第一类型的种子和第二类型的种子混合以产生种子混合物，其中第一类型的种子是包含第一转基因和第二转基因的转基因抗害虫作物的种子，该第一类型的种子具有对第一目标害虫和第二目标害虫的杀虫活性，且其中第二类型的种子对笫一目标害虫或第二目标害虫没有杀虫活性，其中所述种子混合物包含约90%至约99%的第一类型的种子和约10%至约1%的第二类型的种子；和b)种^L所述种子混合物。20.权利要求19的方法，其中所述第一目标害虫选自西部玉米根虫、北部玉米根虫、墨西哥玉米根虫、南部玉米根虫和它们的组合。21.权利要求19的方法，其中所述第一目标害虫是西部玉米根虫。22.权利要求19的方法，其中所述第一类型的种子通过至少两种不同的杀虫作用模式对至少一种害虫有杀虫作用，该不同的杀虫作用模式包括半竟争性或非竟争性结合在至少一种害虫的肠膜中。23.权利要求19的方法，所述方法进一步包括用杀虫剂处理第一类型的种子和/或第二类型的种子。24.权利要求23的方法，其中所述杀虫剂选自除虫菊酯类和合成的除虫菊酯类、嚼二嗪类、氯烟酰类、硝基胍类、三唑类、有机磷酸酯、吡咯类、吡唑类、酚吡唑类、双酰聘类、生物/发酵产物和氨基曱酸酯类。25.权利要求19的方法，其中所述转基因抗害虫作物产生选自以下的蛋白质Cry34/35、CrylF、CrylA(b)、Cry2、Cry3、Cry9蛋白或它们的组合。26.权利要求19的方法，其中所述转基因抗害虫作物产生CrylF蛋白和CrylA(b)蛋白。27.权利要求19的方法，其中所述转基因抗害虫作物产生Cry34/35蛋白、CrylA(b)蛋白和CrylF蛋白。28.权利要求19的方法，其中所述种子混合物包含约95%的第一类型的种子和约5%的第二类型的种子。29.权利要求19的方法，其中所述第一转基因抗害虫作物或所述第二转基因抗害虫作物还含有选自以下的除草剂抗性基因草甘磷N-乙酰转移酶(GAT)、5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、草丁膦N-乙酰转移酶(PAT)或它们的组合。30.—种治理抗害虫作物的田地中的害虫抗性的方法，所述方法包括a)提供第一转基因抗害虫作物的种子，该第一转基因抗害虫作物表达第一转基因和第二转基因，该第一转基因提供对至少一种鞘翅目害虫的增加的耐受性或抗性，该第二转基因提供对至少一种鳞翅目害虫的抗性，b)提供第二转基因抗害虫作物的种子，该第二转基因抗害虫作物表达第三转基因，该第三转基因提供对相同的至少一种鳞翅目害虫的抗性，但杀虫作用的模式不同于该笫二转基因，和c)在田地中种植该第一转基因抗害虫作物的种子和该第二转基因抗害虫作物的种子。31.权利要求30的方法，其中所述至少一种鞘翅目害虫选自西部玉米根虫、北部玉米根虫、墨西哥玉米根虫、南部玉米根虫或它们的组合。32.权利要求30的方法，其中所述至少一种鳞翅目害虫选自欧洲玉米钻心虫、西南玉米钻心虫、玉米穗虫、秋行军虫、小地老虎、西部豆切根虫或它们的组合。33.权利要求30的方法，所述方法进一步包括用杀虫剂处理所述第一转基因抗害虫作物种子和/或所述第二转基因抗害虫作物种子。34.权利要求30的方法，其中所述杀虫剂选自杀昆虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、除草剂或它们的组合。35.权利要求30的方法，其中所述杀虫剂是杀昆虫剂。36.权利要求30的方法，其中所述杀昆虫剂选自除虫菊酯类、合成的除虫菊酯类、嚼二溱类、氯烟酰类、硝基胍类、三唑类、有机磷酸酯、吡咯类、吡唑类、酚吡唑类、双酰肼类、生物/发酵产物、氨基甲酸酯类或它们的组合。37.权利要求30的方法，其中所述第一转基因抗害虫作物和/或所述第二转基因抗害虫作物还#^入选自以下的除草剂抗性基因草甘磷N-乙酰转移酶(GAT)、5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、草丁膦N-乙酰转移酶(PAT)或它们的组合。38.权利要求30的方法，其中所迷第一转基因的表达造成Cry34/35蛋白在植物中的表达。39.权利要求30的方法，其中所述第二转基因的表达造成CrylF蛋白在植物中的表达。40.权利要求30的方法，其中所述第三转基因的表达造成蛋白质在植物中的表达，其中所述蛋白质选自CrylA(b)、CrylF、Cry2和Cry9蛋白。41.权利要求40的方法，其中所述蛋白质是CrylA(b)蛋白。42.权利要求40的方法，其中所述蛋白质是CrylF蛋白。43.权利要求30的方法，其中所迷第一转基因抗害虫作物表达第四转基因和第二转基因抗害虫作物表达第五转基因，且其中第一转基因的表达造成Cry34/35蛋白在植物中的表达，第二转基因的表达造成CrylF蛋白在植物中的表达，第三转基因的表达造成CrylF蛋白在植物中的表达，第四转基因的表达造成Cry1A(b)蛋白在植物中的表达，第五转基因的表达造成CrylA(b)蛋白在植物中的表达。44.权利要求43的方法，其中所述第一转基因抗害虫作物的种子占田地中种植的总作物的至少约卯％。45.权利要求30的方法，所述方法还包括提供第三转基因抗害虫作物的种子，所述第二转基因抗害虫作物表达第四转基因，该第四转基因提供对相同的至少一种鞘翅目害虫的抗性，但不提供对相同的至少一种鳞翅目害虫的抗性。46.权利要求45的方法，其中所述第四转基因和第二转基因包含相同的转基因。47.权利要求45的方法，其中所述第四转基因的表达造成蛋白质在植物中的表达，其中所迷蛋白质选自Cry34/35和Cry3蛋白。48.权利要求45的方法，其中所述第一转基因抗害虫作物占田地中的总作物的至少约85%。49.权利要求45的方法，其中所述第一转基因抗害虫作物占田地中的总作物的至少约90%。50.权利要求45的方法，其中所述第一转基因抗害虫作物占田地中的总作物的至少约95%。全文摘要描述了治理昆虫抗性发展的昆虫庇护区策略。本发明主要涉及控制通过其啃食活动导致根部损害而对作物特别是对玉米作物造成损害的害虫，更具体的说涉及通过使目标害虫暴露于具有多种不同作用模式的种子或种子混合物来控制这种植物害虫。第一的一种或多种转基因和第二的一种或多种转基因各自分别对相同的目标昆虫具有杀昆虫作用，但作用模式不同，且半竞争性地或非竞争性地结合目标昆虫中的不同结合位点。另外，还公开了在种植种子之前用化学杀虫剂或肽相关杀虫剂处理这种种子。文档编号C12N15/82GK101568641SQ200780047522公开日2009年10月28日申请日期2007年12月26日优先权日2006年12月22日发明者D·J·科斯格罗夫,P·M·达维斯,R·C·伊维希申请人:先锋高级育种国际公司