专利名称：一种肠溶衣材料固定化纤维素酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及酶的固定化技术，尤其涉及一种肠溶衣材料固定化纤维素酶的 制备方法。
背景技术：
纤维素是自然界中最丰富的可再生资源之一，利用纤维素酶对其进行糖化并进而发酵生成乙醇，纯乙醇或与汽油混合可直接代替汽油、柴油等化石燃料， 能有效缓解人类化石能源日益短缺的困境。但是纤维素酶在水解纤维素的过程 中，其稳定性差、使用寿命短、催化效率较低，导致纤维素糖化过程中酶的生 产成本过高，影响其工业化推广应用。所以如何降低纤维素酶的生产成本，增 加其稳定性和使用寿命，是打通由纤维质原料到燃料乙醇技术路线的关键，也 是世界范围内所面临的一项共性关键技术。纤维素酶的固定化能有效提高其稳定性和使用寿命，从而为降低纤维素酶 的生产成本提供了可能。对它的研究已经成为纤维素酶学领域研究的一个热点， 大量的载体和固定化方法也已被人们陆续开发出来。而对固定化酶而言，其性能的优劣主要取决于所使用载体材料的性质和固定化方法。我国在20世纪90 年代开展纤维素酶的固定化研究，目前国内外已经有许多不溶性、可溶性载体和固定化方法被广泛用于纤维素酶的固定化。把纤维素酶固定在不溶性载体上， 固然有利于酶的回收，但缺点是不利于纤维素酶接近于不溶性纤维素底物，增 加了传质阻力；而采用可溶性聚合物作为纤维素酶固定化的载体，确实使酶促 反应容易进行，但是反应结束后，酶又不易回收，失去了固定化酶反复使用的 优点。为克服这些缺点，人们开发出了可溶(Soluble)-不可溶(Insoluble) (S-IS)互变载体系统。这种载体会随溶液pH值、温度、离子强度、光照等的不 同，而呈现出可溶和不可溶性状态，用其固定化纤维素酶就可避免单独使用不 溶性载体系统酶-底物的传质阻力问题，以及可溶性载体系统酶使用后不易回收 的缺陷。由于S-IS系统的种种优越性，对它的研究已成为近年来酶工程领域研 究的一个热点。但是以可溶-不可溶肠溶衣材料Eudragit L-100作为纤维素酶 固定化的载体，国内还未见有专利文献报道。发明内容本发明的目的在于提供一种肠溶衣材料固定化纤维素酶的制备方法。 本发明通过交联剂EDC的连接作用，把纤维素酶共价固定于pH值敏感型载 体肠溶衣材料Eudragit L-100上，通过溶液pH值的变化，可实现固定化纤维 素酶的快速回收，大大提高纤维素酶的稳定性和使用寿命，从而为降低纤维素 酶的使用成本提供了可能。 本发明的具体步骤如下1)将肠溶衣材料Eudragit L-100均匀地分散于pH值5. 5的醋酸-醋酸钠缓冲液中；2) 先后加入溶解于pH 5. 5的醋酸-醋酸钠缓冲液中的纤维素酶液和交联 剂EDC，室温下缓慢搅拌固定3 6小时；3) 用3M醋酸调节pH值为3. 8，在5000rpm下离心10min;4) 沉淀溶解于pH 5. 8的醋酸-醋酸钠缓冲液中，即得到所需的固定化纤 维素酶。所述的载体肠溶衣材料Eudragit L-IOO溶液浓度为质量体积比(W/V)浓 度2 5%。所述的交联剂EDC用量为0.3g/g载体。所述的固定化纤维素酶中蛋白质载量为10 100mg蛋白/g载体。 本发明的优点在于可通过溶液pH的变化方便地实现固定化酶的均相酶解 和异相回收，也能够确保固定化酶在均相状态下对不溶性纤维素材料的高效酶 解，以及酶解后副产物木质素的快速分离，具有反复使用多次，酶活保留率变 化不大的优点，制备过程简单方便，可大大降低纤维素酶的使用成本，具有较 好的推广应用价值。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合实施实例对本发明作进一步描述。本实施例采用德国罗姆公司生产的肠溶衣载体材料Eudragit L-100 (Eudragit L-IOO，德国罗姆公司(R5hm GmbH & Co. KG， Darmstadt, Germany) 生产，由甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯(1: 1)共聚而成，产品标准符合USP/NF/Ph. Eur.，深圳市优普惠实业发展有限公司代售)。将lg肠溶衣Eudragit L-100均匀地分散于pH值5. 5的0. 1M醋酸-醋酸钠缓冲液中，配置成2%的载体溶液;加入浓度为15mg/mL的纤维素酶液4mL和0. 3g的交联剂EDC，室温下缓慢搅拌固定3 6小时；用3M的醋酸调节pH值为3.8，5000rpm下离心10min;将沉淀溶解于pH 5. 8的醋酸-醋酸钠缓冲液中，即得到所需的固定化纤维素酶。以Whatman 1号定性滤纸为底物，在固定化酶溶解状态下测定纤维素酶的活力，该固定化酶的使用8次后活性回收率为60%，蛋白保留率为48. 71%。
权利要求
1、一种肠溶衣材料固定化纤维素酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤1)将肠溶衣材料Eudragit L-100均匀地分散于pH值5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中；2)先后加入溶解于pH5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中的纤维素酶液和交联剂EDC，室温下缓慢搅拌固定3～6小时；3)用3M醋酸调节pH值为3.8，在5000rpm下离心10min；4)沉淀溶解于pH5.8的醋酸-醋酸钠缓冲液中，即得到所需的固定化纤维素酶。
2、 如权利要求1所述的肠溶衣材料固定化纤维素酶的制备方法，其特征在于所 述的载体肠溶衣材料Eudragit L-100溶液质量体积比浓度为2 5%。
3、 如权利要求1所述的肠溶衣材料固定化纤维素酶的制备方法，其特征在于所 述的交联剂EDC用量为0. 3g/g载体。
4、 如权利要求1所述的肠溶衣材料固定化纤维素酶的制备方法，其特征在于所 述的固定化纤维素酶中蛋白质载量为10 100mg蛋白/g载体。
5、 如权利要求4所述的肠溶衣材料固定化纤维素酶的制备方法，其特征在于纤 维素酶液浓度为10 100mg/mL。
全文摘要
本发明提供了一种肠溶衣材料固定化纤维素酶的制备方法。其步骤包括1)将肠溶衣材料Eudragit L-100均匀地分散于pH值5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中；2)先后加入溶解于pH 5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中的纤维素酶液和交联剂EDC，室温下缓慢搅拌固定3～6小时；3)用3M醋酸调节pH值为3.8，在5000rpm下离心10min；4)沉淀溶解于pH 5.8的醋酸-醋酸钠缓冲液中，即得到固定化纤维素酶。本发明可通过溶液pH的变化方便地实现固定化酶的均相酶解和异相回收，也能够确保固定化酶在均相状态下对不溶性纤维素材料的高效酶解，以及酶解后副产物木质素的快速分离，具有反复使用多次，酶活保留率变化不大的优点，制备过程简单方便，可大大降低纤维素酶的使用成本，具有较好的推广应用价值。
文档编号C12N11/00GK101225380SQ200810026158
公开日2008年7月23日 申请日期2008年1月31日 优先权日2008年1月31日
发明者吕鹏梅, 庄新姝, 宇 张, 东 李, 袁振宏, 许敬亮 申请人:中国科学院广州能源研究所