专利名称：一种生物转化二醇型人参皂甙Rb1的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用真菌发酵转化人参皂甙的方法，属于生物制药领域。
技术背景人参是中国名贵中药。人参皂甙是人参重要的活性成分，具有多种生物活性。Rbl、Rd、Rg3均属于人参皂甙。Rbl的含量最多，其次是Rd，Rg3的含量最少。Rg3具有多种药理作用预防和治疗癌症，改善心脏血管功能，抗血小板凝集，保护脑神经细胞，提高集体免疫力，抗疲劳，抗血栓，保肝，降低胆固醇，且无依赖性，对正常组织无毒性；尤其是明显的抑制肿瘤复发和转移的功能，使其成为许多国家研究的热点。利用生物转化可以将Rbl转化成Rd或者Rg3。 发明内容本发明提供一种利用真菌将含量高的人参皂甙Rbl转化为含量低、药效高的人参皂甙Rd或者Rg3的方法。 本发明的技术解决方案是利用番茄叶霉(Cladosporium fulvum)高效转化Rb成Rd或者Rg3。包括以下步骤 a)活化菌种无菌操作接种于V-8汁固体培养基、90cm培养皿，25。C恒温暗培养5-10天; b)刮取孢子无菌条件下，刮下平板上的菌丝和孢子，用无菌水冲洗平板若干次，将菌丝及孢子全部转移到无菌水中。向含有菌丝及孢子的无菌水中加入玻璃珠，室温振荡l-2h，使孢子充分分散。四层纱布过滤，滤液离心，弃去上清，得到孢子(沉淀)；
c)液体培养将孢子加入到V-8液体培养基(不含琼脂)中，28°C 、 150r/min恒温振荡培养； d)滤取新生菌丝将液体培养48h-72h的孢子悬液用四层纱布过滤，得到新生菌丝； e)生物转化将新生菌丝加入到含有人参皂甙的醋酸缓冲液中，28t:恒温振荡培养。每隔24小时取出1组转化液离心，弃去菌体，取上清液加水饱和正丁醇终止反应，TLC检测。 f)回收皂甙用正丁醇终止反应，同时皂甙产物被萃取至有机层中。将有机层水浴蒸干，然后用乙睛(乙睛水=35 : 65)溶解，进行柱层析分离制备稀有人参皂甙纯品。
具体实施例方式
1.活化菌种无菌操作接种于V-8汁固体培养基，25°。恒温暗培养5-10天。
2.刮取孢子无菌条件下，刮下平板上的菌丝和孢子，用无菌水冲洗平板若干次，将菌丝及孢子全部转移到无菌水中。向含有菌丝及孢子的无菌水中加入玻璃珠，室温振荡l-2h， 200rpm，使孢子充分分散。
3.液体培养四层纱布过滤培养液，滤液离心，弃去上清，得到孢子；将孢子加入到200mL的V-8液体培养基中，稀释调整浓度为5 X 106个/ml， 28°C 、 150rpm恒温振荡培养。
4.扩大培养将液体培养48h-72h的孢子悬液用四层纱布过滤，得到新生菌丝。
5.生物转化将新生菌丝加入到400ml醋酸缓冲液(0. 2M， pH 5)中，调整其浓度
3为5X 106个/ml，加入人参皂甙Rbl，终浓度为0. 25mg/ml， ， 28"恒温振荡培养8天。
6.回收皂甙离心，6000rpm，20min，取上清液，按正丁醇与培养液体积比1 : 2的比例，加水饱和正丁醇，皂甙产物被萃取至有机层中。重复三次，合并有机液。将有机层水浴蒸干，然后用乙睛(乙睛水=35 : 65)溶解，进行HPLC分离制备稀有人参皂甙纯品，得到人参皂甙Rd 68mg。
权利要求
一种生物转化人参皂甙Rb1制备Rd或者Rg3的方法，其特征在于利用番茄叶霉(Cladosporium fulvum)水解人参皂甙Rb1，制备Rd或者Rg3。
2. 根据权利要求1所述的生物转化Rbl，制备Rd或者Rg3的方法，其特征在于包含以 下主要步骤a) 活化菌种将番茄叶霉(Cladosporium fulvum)无菌操作接种于V_8汁固体培养基， 25t:恒温暗培养5-10天。b) 刮取孢子无菌条件下，刮下平板上的菌丝和孢子，用无菌水冲洗平板若干次，将 菌丝及孢子全部转移到无菌水中；向含有菌丝及孢子的无菌水中加入玻璃珠，室温振荡 l-2h，使孢子充分分散；四层纱布过滤，滤液离心，弃去上清，得到孢子(沉淀)。c) 液体培养将孢子加入到V-8液体培养基(不含琼脂)中，28t:、150rpm恒温振荡培养。d) 滤取新生菌丝将液体培养48h-72h的孢子悬液用四层纱布过滤，得到新生菌丝。e) 生物转化将新生菌丝加入到含有人参皂甙的醋酸缓冲液中，28t:恒温振荡培养； 每隔24小时取出1组转化液离心，弃去菌体，取上清液加水饱和正丁醇终止反应。f) 回收皂甙用正丁醇终止反应，同时皂甙产物被萃取至有机层中；将有机层水浴蒸 干，然后用乙睛(乙睛水=35 : 65)溶解，进行柱层析分离制备稀有人参皂甙纯品。
全文摘要
本发明公开一种生物转化二醇型人参皂甙Rb1的方法，用番茄叶霉(Cladosporium fulvum)水解Rb 1，制备稀有人参皂甙Rd或者Rg3。具有选择性好、活性高，工艺简单，生产路线短，产品纯度高等优点。
文档编号C12P33/00GK101748183SQ20081005162
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月19日 优先权日2008年12月19日
发明者付玲, 台桂花, 周义发, 孙成新, 赵雪淞, 高娟 申请人:东北师范大学