专利名称：蕨菜多糖的提取分离方法
技术领域：
本发明涉及一种糖的提取分离方法，更具体地，本发明涉及一种 蕨菜多糖的提取分离方法。
背景技术：
蕨菜是可作食用的蕨类植物的统称。野生蕨菜自古以来就被用作 菜蔬和度荒的食品,我国最早的诗经中《诗召南草虫》记载:"陡彼南山， 言采其蕨"。北魏贾思勰的《齐民要术》及明代李时珍的《本草纲目》 均有较多的记载。由于野生蕨菜具有特殊的清香口味,又极少受到污 染，所以倍受人们青睐,已成为我国重要出口 土特产品之一,在国外享 有"山珍之王"的美称。蕨菜为传统野菜,营养极为丰富,含有大量的氨 基酸以及无机元素，其中有8种人体必需氨基酸，其胡萝卜素和维生素 C的含量均高于番茄、茄子和黄瓜。不仅蕨的嫩叶可供食用,其地下 根状茎富含淀粉,可提取食用。我国野生蕨菜资源丰富,极具开发价值, 但目前绝大多数尚未被利用。有关蕨菜化学成分的测定、药理作用的 特点、营养保健的价值，近年有一些报道，但对于蕨菜多糖的提取方 法和特别是分离纯化则尚未报道，有些方法提取出的蕨菜多糖含色素 很多，灰色粉末状的蕨菜粗多糖水溶性差，提取率不高，纯度也很低。 发明内容本发明的目的是为了克服上述存在的问题，提供一种科学地提取 蕨菜多糖，并能保持蕨菜多糖的生物活性，最大限度地提高蕨菜多糖 提取率的方法。本发明的多糖的提取分离方法是利用多糖、糖蛋白溶于水的特 性，用热水浸提法，并用乙醇沉淀的方法分离，最后用阴离子交换层 析和凝胶排阻层析纯化多糖。具体包括以下步骤 1)取蕨菜粉碎过40~80目筛，用2~4倍90%乙醇在80 100。C回流浸提0.5~2小时；2) 去掉乙醇后加水在60 90。C水洛上提取2-3次，每次2 4小时；3) 将上述浸提液离心4800rpm， 10min，弃沉淀，取上清液；4) 用Sevage方法脱去上清蛋白在上清液中加等体积的氯仿-正丁 醇，氯仿与正丁醇的体积比为4: 1，充分震荡后静置10分钟， 4000-6000 rpm离心IO分钟，反复多次直至完全脱去蛋白。5) 乙醇沉淀的方法分离将脱去蛋白的溶液在50'C 6(TC减压蒸馏 浓缩，加入2 3倍于该溶液体积的乙醇进行沉淀，离心收集沉淀，干 燥，得粗多糖；6) 阴离子交换柱和凝胶排阻层析纯化多糖取粗多糖溶于去离子水 或pH值为7~8,浓度为10~50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，制成饱和 溶液，4800rpm离心弃沉淀，将上清样于DEAE-Sepharose Fast Flow 柱，以上述的Tris-HCl为洗脱液，再用浓度为0.2 0.8mol/LNaCl梯 度洗脱，苯酚-硫酸法跟踪检测样品在490nm的吸收值，收集单一 峰，透析去离子后上样于SephacrylS-400HR或Sephadex G-100柱， 以去离子水进行洗脱。用苯酚硫酸法跟踪检测多糖，用紫外分光光度 计在280nrn测定吸收值，确定蛋白的含量，收集单一峰，冷冻干燥 得纯化的单一蕨菜多糖。本发明中，若釆用新鲜蕨菜，则新鲜蕨菜与蒸馏水以重量比1: 3的比例混合,若釆用干蕨菜粉，则干蕨菜与蒸馏水以重量比1: 15~25 的比例混合。步骤6)中所述的用于蕨菜多糖的检测苯酚-硫酸法为将0.2ml 样品用蒸馏水稀释到2 ml，加入6%的苯酚溶液lml，再加入5 ml浓 硫酸，反应30分钟后再用紫外分光光度计在490nm处检测OD值。优选地，本发明步骤2)中水的用量为20倍于样品的重量，温 度在60 75X:提取2次，每次2.5 3.5小时；优选地，提取温度是62 68 °。提取2次，每次2.5-3.5小时；更优选地，是65'C，提取2次，每次3小时。本发明步骤5)中在-6(TC真空冷冻干燥8 12小时 本发明步骤6)中采用流动水透析；Tris-HCl和去离子水洗脱的 流速控制在2ml/min 。本发明方法以干蕨菜为原料，提取、纯化各种蕨菜多糖、糖蛋白， 多糖的提取率高，经优化后的提取率为2.02%,经过纯化的多糖纯度 在98%以上；除色素彻底、水溶性好，并且能保持多糖和糖蛋白的 生物活性。本发明方法简单合理，适合于大规模生产，且能普遍应用 于各种蕨类植物多糖和糖蛋白的分离纯化。
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明，但本发明并不局限于此实施例。实施例1:1. 蕨菜粗多糖的制备取干蕨菜粉100g，粉碎过后过40目筛，加入100ml90%乙醇在 90。C回流浸提l小时。去掉乙醇后，加入2000ml水，在65。C水洛上 提取2次，每次3小时。离心后取上清液，加入等体积的氯仿-正丁 醇，氯仿与正丁醇的体积比为4: 1，充分振荡，静置10分钟，4500 rpm离心10分钟。重复以上步骤，直至无沉淀。上清在55。C减压蒸 馏浓縮，取上清液，然后用2.5倍体积乙醇沉淀，直至无沉淀析出。 最后沉淀在-60'C真空冷冻干燥IO小时后得粗多糖。再用苯酚-硫 酸法在490nm检测多糖，用紫外分光光度计在280nm测定吸收值， 确定蛋白的含量。2. 蕨菜多糖的精制将上述500mg粗多糖溶解于20mlpH值为7.5，浓度为40 mmol/L 的Tris-HCl中，4800 rpm离心10分钟弃沉淀。将上清上样于 DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH值为7.5的Tris-HCl作洗脱液，以浓度为0.5mol/L的NaCl作梯度洗脱，流速控制在2ml/min。收集 的产物用本发明所述的苯酚-硫酸法在490nrn处检测光吸收值，得 到三个吸收峰。分别收集三个吸收峰(组分I 、 II、 III),并在去离 子水中透析脱盐。将透析后溶液浓縮，再分别上样于SephacrylS-400 HR柱，以去离子水作洗脱液，流速控制在2ml/min,同样用苯酴硫 酸法跟踪检测多糖，在280nm检测蛋白质，确定蛋白的含量。结果 表明，组分I、 II、 in过SephacrylS-400HR后是一个对称峰，说明 此组分为单一组分，将组分I冷冻干燥后得白色蓬松的蕨菜多糖，易 溶于水。 实施例21. 蕨菜粗多糖的制备取干蕨菜粉100g,粉碎过后过80目筛，加入100ml90%乙醇在 IO(TC回流浸提2小时。去掉乙醇后，加入2500ml水，在90。C水洛 上提取3次，每次4小时。离心后取上清液，加入等体积的氯仿-正 丁醇，氯仿与正丁醇的体积比为4: 1，充分振荡，静置10分钟，4500 rpm离心10分钟。重复以上步骤，直至无沉淀。上清在5(TC减压蒸 馏浓缩，取上清液，然后用2倍体积乙醇沉淀，直至无沉淀析出。最 后沉淀在-6(TC真空冷冻干燥12小时后得粗多糖。再用苯酚-硫酸 法在4卯nm检测多糖，用紫外分光光度计在280nm测定吸收值，确 定蛋白的含量。2. 蕨菜多糖的精制将上述500mg粗多糖溶解于20mlpH值为8.0，浓度为50 mmol/L 的Tris-HCl中，4800 rpm离心10分钟弃沉淀。将上清上样于 DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH值为8.0的Tris-HCl作洗脱液， 以浓度为O.8mol/L的NaCl作梯度洗脱，流速控制在2ml/min。收集 的产物用本发明所述的苯酚-硫酸法在490nrn处检测光吸收值，得 到三个吸收峰。分别收集三个吸收峰(组分I 、 II、 III)，并在去离子水中透析脱盐。将透析后溶液浓缩，再分别上样于SephacrylS-400 HR柱，以去离子水作洗脱液，流速控制在2ml/min，同样用苯酚硫 酸法跟踪检测多糖，在280nm检测蛋白质，确定蛋白的含量。结果 表明，组分I、 II、 ni过SephacrylS-400HR后是一个对称峰，说明 此组分为单一组分，将组分I冷冻干燥后得白色蓬松的蕨菜多糖，易 溶于水。 实施例31. 蕨菜粗多糖的制备取干蕨菜粉100g，粉碎过后过60目筛，加入100ml90%乙醇在 80。C回流浸提0.5小时。去掉乙醇后，加入1500ml水，在75。C水洛 上提取2次，每次3.5小时。离心后取上清液，加入等体积的氯仿-正丁醇，氯仿与正丁醇的体积比为4: 1,充分振荡，静置10分钟， 4500rpm离心IO分钟。重复以上步骤，直至无沉淀。上清在6(TC减 压蒸馏浓缩，取上清液，然后用3倍体积乙醇沉淀，直至无沉淀析出。 最后沉淀在-6(TC真空冷冻干燥8小时后得粗多糖。再用苯酚-硫酸 法在490nm检测多糖，用紫外分光光度计在280nm测定吸收值，确 定蛋白的含量。2. 蕨菜多糖的精制将上述500mg粗多糖溶解于20mlpH值为7.0,浓度为20 mmol/L 的Tris-HCl中，4800 rpm离心10分钟弃沉淀。将上清上样于 DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH值为7.0的Tris-HCl作洗脱液， 以浓度为0.6mol/L的NaCl作梯度洗脱，流速控制在2ml/min。收集 的产物用本发明所述的苯酚-硫酸法在4卯nm处检测光吸收值，得 到三个吸收峰。分别收集三个吸收峰(组分I 、 II、 III)，并在去离 子水中透析脱盐。将透析后溶液浓缩，再分别上样于SephacrylS-400 HR柱，以去离子水作洗脱液，流速控制在2ml/min,同样用苯酚硫 酸法跟踪检测多糖，在280nm检测蛋白质，确定蛋白的含量。结果表明，组分I、 II、 ni过SephacrylS-400HR后是一个对称峰，说明此组分为单一组分，将组分I冷冻干燥后得白色蓬松的蕨菜多糖，易溶于水。实施例41. 蕨菜粗多糖的制备取干蕨菜粉100g,粉碎过后过60目筛，加入100ml90。/。乙醇在 80。C回流浸提2小时。去掉乙醇后，加入1800ml水，在68t:水浴上 提取2次，每次3小时。离心后取上清液，加入等体积的氯仿-正丁 醇，氯仿与正丁醇的体积比为4: 1,充分振荡，静置10分钟，4500 rpm离心10分钟。重复以上步骤，直至无沉淀。上清在58t:减压蒸 僧浓缩，取上清液，然后用2倍体积乙醇沉淀，直至无沉淀析出。最 后沉淀在-60°C真空冷冻干燥9小时后得粗多糖。再用苯酚-硫酸法 在490nm检测多糖，用紫外分光光度计在280nm测定吸收值，确定 蛋白的含量。2. 蕨菜多糖的精制将上述500mg粗多糖溶解于20ml去离子水中，4800 rpm离心 IO分钟弃沉淀。将上清上样于DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH 值为7.6,浓度为20mmol/L的Tris-HCl作洗脱液，以浓度为0.4mol/L 的NaCl作梯度洗脱，流速控制在2ml/min。收集的产物用本发明所 述的苯酴-硫酸法在490nm处检测光吸收值，得到三个吸收峰。分 别收集三个吸收峰(组分I 、 II、 III),并在去离子水中透析脱盐。 将透析后溶液浓縮，再分别上样于S印hacrylS-400HR柱，以去离子 水作洗脱液，流速控制在2ml/min,同样用苯酚硫酸法跟踪检测多糖， 在280nm检测蛋白质，确定蛋白的含量。结果表明，组分I 、 II、 III过Sephacryl S-400HR后是一个对称峰，说明此组分为单一组分， 将组分I冷冻干燥后得白色蓬松的蕨菜多糖，易溶于水。 实施例51. 蕨菜粗多糖的制备取干蕨菜粉100g,粉碎过后过60目筛，加入100ml90%乙醇在 8(TC回流浸提2小时。去掉乙醇后，加入2200ml水，在62。C水洛上 提取2次，每次3.5小时。离心后取上清液，加入等体积的氯仿-正 丁醇，氯仿与正丁醇的体积比为4: 1,充分振荡，静置10分钟，4500 rpm离心10分钟。重复以上步骤，直至无沉淀。上清在53t:减压蒸 馏浓缩，取上清液，然后用3倍体积乙醇沉淀，直至无沉淀析出。最 后沉淀在-60'C真空冷冻干燥11小时后得粗多糖。再用苯酴-硫酸 法在490nm检测多糖，用紫外分光光度计在280nm测定吸收值，确 定蛋白的含量。2. 蕨菜多糖的精制将上述500mg粗多糖溶解于20mlpH值为7.8，浓度为20 mmol/L 的Tris-HCl中，4800 rpm离心10分钟弃沉淀。将上清上样于 DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH值为7.8的Tris-HCl作洗脱液， 以浓度为O.lmol/L的NaCl作梯度洗脱，流速控制在2ml/min。收集 的产物用本发明所述的苯酚-硫酸法在490nrn处检测光吸收值，得 到三个吸收峰。分别收集三个吸收峰(组分I 、 II、 III),并在去离 子水中透析脱盐。将透析后溶液浓缩，再分别上样于SephacrylS-400 HR柱，以去离子水作洗脱液，流速控制在2ml/min,同样用苯酚硫 酸法跟踪检测多糖，在280nm检测蛋白质，确定蛋白的含量。结果 表明，组分I、 II 、 ni过SephacrylS-400HR后是一个对称峰,说明 此组分为单一组分，将组分I冷冻干燥后得白色蓬松的蕨菜多糖，易 溶于水。 实施例6l.蕨菜粗多糖的制备取干蕨菜粉100g，粉碎过后过60目筛，加入100ml90%乙醇在 80'C回流浸提2小时。去掉乙醇后，加入1600ml水，在62""C水洛上提取2次，每次2.5小时。离心后取上清液，加入等体积的氯仿-正丁醇，氯仿与正丁醇的体积比为4: 1，充分振荡，静置10分钟，4500 rpm离心10分钟。重复以上步骤，直至无沉淀。上清在52"减压蒸 馏浓缩，取上清液，然后用3倍体积乙醇沉淀，直至无沉淀析出。最 后沉淀在-60'C真空冷冻干燥IO小时后得粗多糖。再用苯酚-硫酸 法在490nm检测多糖，用紫外分光光度计在280nm测定吸收值，确 定蛋白的含量。2.蕨菜多糖的精制将上述500mg粗多糖溶解于20ml去离子水中，4800 rpm离心 IO分钟弃沉淀。将上清上样于DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH 值为7.8,浓度为30mmol/L的Tris-HCl作洗脱液，以浓度为0.2mol/L 的NaCl作梯度洗脱，流速控制在2ml/min。收集的产物用本发明所 述的苯酚-硫酸法在4卯nm处检测光吸收值，得到三个吸收峰。分 别收集三个吸收峰(组分I 、 II、 III)，并在去离子水中透析脱盐。 将透析后溶液浓缩，再分别上样于SephacrylS-400HR柱，以去离子 水作洗脱液，流速控制在2ml/min,同样用苯酚硫酸法跟踪检测多糖， 在280nm检测蛋白质，确定蛋白的含量。结果表明，组分I 、 II、 III过Sephacryl S-400 HR后是一个对称峰，说明此组分为单一组分， 将组分I冷冻干燥后得白色蓬松的蕨菜多糖，易溶于水。 实施例7l.蕨菜粗多糖的制备取新鲜蕨菜粉100g，粉碎过后过60目筛，加入100ml卯。/。乙醇 在80'C回流浸提2小时。去掉乙醇后，加入300ml水，在65T水洛 上提取2次，每次3小时。离心后取上清液，加入等体积的氯仿-正 丁醇，氯仿与正丁醇的体积比为4: 1,充分振荡，静置10分钟，4500 rpm离心10分钟。重复以上步骤，直至无沉淀。上清在55匸减压蒸 馏浓缩，取上清液，然后用2.5倍体积乙醇沉淀，直至无沉淀析出。最后沉淀在-6(TC真空冷冻干燥IO小时后得粗多糖。再用苯酴-硫 酸法在490nm检测多糖，用紫外分光光度计在280nm测定吸收值， 确定蛋白的含量。2.蕨菜多糖的精制将上述500mg粗多糖溶解于20mlpH值为7.5,浓度为30 mmol/L 的Tris-HCl中，4800 rpm离心10分钟弃沉淀。将上清上样于 DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用pH值为7.5的Tris-HCl作洗脱液， 以浓度为0.4mol/L的NaCl作梯度洗脱，流速控制在2ml/min。收集 的产物用本发明所述的苯酚-硫酸法在490nrn处检测光吸收值，得 到三个吸收峰。分别收集三个吸收峰(组分I 、 II、 III),并在去离 子水中透析脱盐。将透析后溶液浓缩，再分别上样于SephacrylS-400 HR柱，以去离子水作洗脱液，流速控制在2ml/min,同样用苯酴硫 酸法跟踪检测多糖，在280nm检测蛋白质，确定蛋白的含量。结果 表明，组分I、 II、 in过SephacrylS-400HR后是一个对称峰，说明 此组分为单一组分，将组分I冷冻干燥后得白色蓬松的蕨菜多糖，易 溶于水。
权利要求
1.一种蕨菜多糖的提取分离方法，包括以下步骤1)取蕨菜粉碎过筛，用乙醇回流浸提；2)去掉乙醇后用水浴上提取；3)将上述浸提液离心、弃沉淀，取上清液；4)将上清液脱去蛋白；5)乙醇沉淀的方法分离在脱去蛋白的溶液中加入乙醇进行沉淀，离心收集沉淀，干燥，得粗多糖；6)阴离子交换柱和凝胶排阻层析纯化多糖。
2. 根据权利要求1所述的蕨菜多糖的提取分离方法，其特征在 于，包括以下步骤1) 取蕨菜粉碎过筛，用2~4倍卯％乙醇在80 100。C回流浸提0.5-2 小时；2) 去掉乙醇加水，在60 90。C水浴上提取2 3次，每次2 4小时；3) 将上述浸提液离心、弃沉淀，取上清液；4) 用Sevage方法脱去上清蛋白；5) 乙醇沉淀的方法分离在脱去蛋白的溶液中加入2 3倍于该溶液 体积的乙醇进行沉淀，离心收集沉淀，干燥，得粗多糖；6) 阴离子交换柱和凝胶排阻层析纯化多糖取粗多糖溶于去离子水 或Tris-HCl缓冲液，制成饱和溶液，离心弃沉淀，将上清样于阴离子 交换柱DEAE-Sepharose Fast Flow,以上述的Tris-HCl为洗脱液，再 用NaCl梯度洗脱，苯酚-硫酸法跟踪检测，收集单一峰，透析去离 子后上样于凝胶排阻层析柱，以去离子水进行洗脱。用苯酴硫酸法跟 踪检测，收集单一峰，冷冻干燥得纯化的单一蕨菜多糖；步骤l)中的样品可以是干蕨菜或新鲜蕨菜；步骤2)中水的用 量是干蕨菜样品重量的15 25倍或新鲜蕨菜样品重量的3倍。
3. 根据权利要求1或2所述的蕨菜多糖的提取分离方法，其特征在于，步骤2)中水的用量是干蕨菜样品重量的20倍，在60 75。C 提取2.5~3.5小时。
4. 根据权利要求3所述的蕨菜多糖的提取分离方法，其特征在 于，提取温度在62 68'C。
5. 根据权利要求3所述的蕨菜多糖的提取分离方法，其特征在 于，提取温度是65'C，提取2次，每次3小时。
6. 根据权利要求1所述的蕨菜多糖的提取分离方法，其特征在 于，步骤5)中在-6(TC真空冷冻干燥8 12小时。
7. 根据权利要求1或2所述的蕨菜多糖的提取分离方法，其特 征在于，步骤6)中的阴离子交换柱是DEAE-SepharoseFastFlow柱； Tris-HCl缓冲液pH值为7 8，浓度为10~50mmol/L; NaCl梯度洗脱 液浓度为0.2~0.8 mol/L。
8. 根据权利要求1所述的蕨菜多糖的提取分离方法，其特征在 于，凝胶排阻层析柱是Sephacryl S-400 HR或Sephadex G-100柱。
9. 根据权利要求1所述的蕨菜多糖的提取分离方法，其特征在 于，步骤6)中釆用流动水透析；Tris-HCl和去离子水洗脱的流速控 制在2ml/min。
10. 根据权利要求l所述的蕨菜多糖的提取分离方法，其特征在 于，步骤4)中的Sevage方法是在上清液中加等体积的氯仿-正丁 醇，氯仿与正丁醇的体积比为4: 1,充分震荡后静置10分钟， 4000 6000rpm离心IO分钟，反复多次直至完全脱去蛋白；步骤6) 中所述的苯酚-硫酸法为将0.2ml样品用蒸馏水稀释到2ml，加入 6。/。的苯酚溶液lml，再加入5 ml浓硫酸，反应30分钟后再用紫外 分光光度计在490nm出检测OD值。
全文摘要
本发明公开了一种蕨菜多糖的提取分离纯化方法，旨在解决现有方法提取出的蕨菜多糖含色素多、水溶性差、提取率不高、纯度低的问题。为解决上述问题，本发明采用热水浸提法浸取，并用乙醇沉淀的方法分离，最后用阴离子交换柱和凝胶排阻层析纯化多糖。本发明方法适合于大规模生产，且能普遍应用于各种蕨类植物多糖、糖蛋白的分离纯化。
文档编号A23L1/212GK101228949SQ20081005786
公开日2008年7月30日 申请日期2008年2月19日 优先权日2008年2月19日
发明者张方方, 罗云波, 许文涛, 黄昆仑 申请人:中国农业大学