专利名称：2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及2-甲基-6-叶绿基-1, 4-苯醌甲基转移酶及其编码基因与应用。
技术背景维生素E是一类人体所必需的脂溶性维生素，具有重要的生理功能。它能够清 除脂质过氧化所产生的自由基而稳定和保护生物膜的脂双层，使细胞免受过氧化物 的伤害(Brigeliusb-flohE R， 丁raber MG， Vitamin E: function and metablisra， The FASEB J， 1999,13， 1145-1155)。因而被作为一种有效的抗氧化剂广泛地应用 在医药、食品、饲料等行业中。大量动物实验证明，在每公斤饲料中添加40-100IU(国 际单位)的维生素E，具有提高动物免疫力，改善肉质，提高动物的繁殖性能，缓解 其应激反应等显著效果。另外，在饲料中添加维生素E能增加肉品的稳定性，防止 肉类腐败、变味、变色，并延长上架时间。近20年来的临床研究表明，维生素E对 于人体健康更具有重要作用。每天吸收100 — 1000IU的维生素E则可提高机体免疫 力，延缓人体衰老，降低或防治心血管疾病和癌症的发生。维生素E的生产主要通过化学合成和天然提取获得。化学方法合成的产品主要 以醋酸酯的形式存在，副产物多且生物活性低。天然维生素E主要从植物油或其精 炼副产物中提取获得。在生理活性和安全性上均明显优于合成维生素E，活性效力 约为合成维生素E的l. 3 1. 4倍，因而正逐渐代替合成产品成为主流。天然维生素E由8种生育酚异构体组成。根据侧链饱和度可分为生育酚 (tocopherol)和三烯生育酚(tocotrienol)两大类。每类依芳香环上甲基数目和位 置的不同又分别分为a、 P、 Y、 5生育酚和a、 P、 Y、 S三烯生育酚。其中 的a-生育酚的生物活性最高，a、 0、 Y、 S-生育酚的相对活性分别为100%、 50%、 10%、 3%，三烯生育酚的活性相比更低(Hosomi A， Arita M， Sato Y, Kiyose C， Ueda T， et al. 1997. Affinity for alpha-tocopherol transfer protein as a determinant of the biological activities of vitamin E analogs. F朋5"Ze". 409:105 -8)。在植物组织当中尿黑酸叶绿醇转移酶(HPT)是维生素E合成途径中 的关键酶，催化叶绿醇焦磷酸(phytyl-PP)与尿黑酸(HGA)縮合生成2—甲基一6 — 叶绿醇质体醌(MPBQ)。它是所有生育酚合成的公共中间前体，此产物由MPBQ甲基转移酶(MPBQMT)催化生成2， 3 — 二甲基一6 —叶绿醇苯醌(DMPBQ) 。 DMPBQ和MPBQ 在环化酶的作用下生成Y —生育酚和S —生育酚，二者再由Y —生育酚甲基转移酶 分别生成a —生育酚和P —生育酚，因此MPBQMT可以增加活性比较高的y —生育酚 禾口 a —生育酚的含量(De肌DellaPemm and Barry J. Pogson， Vitamin Synthesis in Plants: Tocopherols and Carotenoids. Armu. Rev. Plant Biol. 2006.57:711-738)。 发明内容本发明的目的是提供一种2-甲基-6-叶绿基-1，4-苯醌甲基转移酶及其编码基 因与应用。本发明提供的2-甲基-6-叶绿基-l， 4-苯醌甲基转移酶，是与生育酚的合成相关 的蛋白，该蛋白命名为MPBQMT，是如下a)或b)的蛋白a) 由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b) 在序列表中序列3的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸且与生育酚的合成相关由a)衍生的蛋白质。其中，序列表中序列2由342个氨基酸残基组成。为了使a)的MPBQMT蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列3所示的氨基 酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表l所示的标签。表l.标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6 (通常为5个)RRRRRPoly-His2-10 (通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述b)中的MPBQMT蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物 表达得到。上述b)中的MPBQMT蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1自5' 末端第128-1026位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或 进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标 签的编码序列得到。所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。所述蛋白的编码基因，是如下l)至4)中任一所述的基因；1) 其核苷酸序列是序列表中序列l;2) 其编码序列是序列表中序列1自5'末端第128-1026位；3) 在严格条件下与1)限定的DNA片段杂交且编码与生育酚的合成相关的蛋白 的DNA分子；4) 与l)的基因具有90%以上的同源性，且编码与生育酚的合成相关的蛋白的 DNA分子。所述步骤4)中的基因，与l)的基因最好有95%以上的同源性。 序列表中的序列1由1162个核苷酸组成，自5'末端第128-1026位为编码序列，编码序列表中序列2所示的蛋白。上述严格条件可为在6XSSC， 0.5y。SDS的溶液中，在68。C下杂交，然后用2XSSC, 0. 1% SDS和1XSSC， 0. 1% SDS各洗膜一次。扩增MPBQMT基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。 含有上述MPBQMT基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有MPBQMT基因的重组表达载体。所述植物表 达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、 pCAMBIA1300、 pBI121、 pBinl9、 pC扁IA2301、 pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表 达载体。携带有本发明的MPBQMT基因的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植 物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化 到植物细胞或组织中。使用MPBQMT基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任 何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(C層V) 35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它 的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用 增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或 邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确 翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是 合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基 因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标 记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。本发明的另一个目的是提供一种培育高Y-生育酚含量的转基因植物的方法。 本发明所提供的一种培育高？生育酚含量的转基因植物的方法，是将所述的重 组表达载体导入植物细胞中，得到高"生育酚含量的转基因植物。所述植物为油料作物，优选为油菜或大豆或花生或芝麻或向日葵。 本发明采用RT-PCR技术，从大豆中获得了MPBQMT基因，该基因编码342个氨基 酸，与拟南芥的VTE3基因同源性最高，二者的氨基酸同源性为80. 1%， DNA的同源性 为66.8%。同时，本发明构建了含有MPBQMT基因的重组表达载体，通过农杆菌介导 的方法转化烟草，并获得MPBQMT基因表达的转基因植株。经高效液相色谱分析结果 表明MPBQMT基因表达的转基因烟草种子中的高活性的生育酚的含量有明显提高， 在野生型烟草种子中y —生育酚与S —生育酚的比值平均为l. 16，而MPBQMT基因表 达的转基因烟草种子中二者的比值平均为2. 59，活性较高的y —生育酚含量得到显 著提高。表明本发明的2-甲基-6-叶绿基-1， 4-苯醌甲基转移酶可有效的增加y —生 育酚的含量，减少低活性的S —生育酚含量。本发明的2-甲基-6-叶绿基-1，4-苯醌 甲基转移酶与生育酚的合成相关，MPBQMT及其编码基因可用于培育富含y —生育酚 的植物。
具体实施方式
实施例l、大豆2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶(MPBQMT)基因的获得 选取生长20天大豆中油13,总RNA的提取按Promega公司的RNA gents Total RNAIsolation System kit进行。取5g的总RNA做反转录获得cDNA的一链，反应体系如下总RNA 10叱(5Pg)、 Oligo(dT) (20Mmol/L) 1. 5ML、 10Xbuffer 2. 5叱、dNTP mix(2. 5mmol/L) 2ML、灭菌7jC8142。C水浴lmin后向反应体系中加入l叱(200U) Superscript II RT，轻轻混合， 42。C保温50min; 7(TC水浴15min，终止该反应；获得cDNA的第一链。根据GenBank数据库中大豆EST序列经电子拼接获得的大豆2-甲基-6-叶绿基 -1,4-苯醌甲基转移酶基因序列，设计引物进行扩增，引物序列如下MPBQMT FL: 5' TCTAGAGCAAGTCTCCAACACACTTTC 3';MPBQMTRL: 5' GAGCTCTTAGATTGGCTGACCTTT 3'。PCR扩增条件为先94。C 3min; 然后94。C lmin， 55°C 45s， 72°C 2min， 30个 循环；最后72。C10rain。PCR扩增出约1200bp的片段，回收后连接到pGM-T Easy载体上，构建重组质粒 pT-GmMPBQMT，并转化大肠杆菌DH5 a ，提取酶切鉴定正确的阳性克隆的质粒进行测 序，测序结果表明，克隆的到的cDNA序列如序列表中序列l所示，序列表中的序列l 由1162个核苷酸组成，自5'末端第128-1026位为编码序列，编码序列表中序列2所 示的蛋白质。实施例2、转2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶(MPBQMT)基因植株的获得分别用J力aI、 5"scI对载体pBI121和重组质粒pT-MPBQMT进行双酶切，回收约 1200bp的MPBQMT基因片段及llkb的载体片段，进行连接，构建重组质粒 pBI121-MPBQMT，转化大肠杆菌，酶切鉴定。将酶切鉴定正确的重组质粒pBI121-MPBQMT电击转化农杆菌LBA4404的感受态 细胞，加入lml YEB液体培养基28i:培养3小时，取200 u 1涂YEB抗性平板(卡那 霉素50mg/l ，利福平50mg/l) ， 28'C培养。挑取单菌落提取农杆菌质粒，并通 过PCR和酶切鉴定获得含质粒pBI121-MPBQMT的农杆菌。挑取鉴定正确的含植物表达载体的农杆菌的单菌落，接种于5mL YEB (利福平 50mg/L，卡那霉素50mg/L)液体培养基中，28°C， 250rpm培养24h。按照1:200 转接至装有50mLYEB (利福平50rag/L,卡那霉素50mg/L)液体培养基的100mL三 角瓶中，28°C， 250rpm培养约8h，至OD,"l.O。然后5000rpm离心5 6min，所 收集的菌体用无菌的MS培养基重悬，离心。收集菌体，用MS培养基重悬菌体，使 菌液的0De。。^0. 6左右。选取长有8到10片叶的烟草的叶片，无菌条件下，沿叶脉将叶片剪成lcm2的 叶盘，浸入上述0D6。。"0.6左右的菌液3-5min，取出，在无菌滤纸上吸干菌液，放 入MS固体平板(含细胞分裂素6-BA 2mg/L，吲哚乙酸0.2mg/L)中暗培养2天。 取出叶盘，在无菌的MS液体培养基中浸泡10min，无菌滤纸吸干，转入含有抗性的 MS平板(含细胞分裂素6-BA 2mg/L，吲哚乙酸0. 2mg/L，卡那霉素50mg/L，羧苄 霉素500mg/L)上光照培养(25。C， 16h/8h光循环)，每20天更换一次平板，直至分 化出芽后，将芽尖移入含有抗性的MS (卡那霉素50mg/L)平板上，至芽长到lcm鉴定。PC財广增所用的引物如下MPBQMT RL: 5' GAGCTCTTAGATTGGCTGACCTTT 3'和 35S fw: TCTGCCGACAGTGGTCCCAA 。扩增条件为先94。C 3min;然后94。C lmin、 58°C 45s、 72°C 3min、 30个循 环；最后72。C10min。PC財广增出约l. 4kb片段的植株为转2-甲基-6-叶绿基-1， 4-苯醌甲基转移酶基 因阳性植株，PCR检测获得20株阳性转基因植株。提取20株阳性的转基因烟草总RNA进行Northern杂交鉴定2-甲基-6-叶绿基 -l， 4-苯醌甲基转移酶基因的表达。按照上述方法，将pPBI121导入烟草中，PCR鉴定结果表明28株T。代转pPBI121 烟草中有20株阳性转pPBI121植株。按Promega公司的RNA gents Total薩Isolation System kit进行总RNA的提 取。取约10y g的总RNA进行变性琼脂糖凝胶电泳[48.5mL DEPC水，15raL 5XM0PS/EDTA (0. 1M M0PS、 40mM NaAc、 5mM EDTA) ， 0. 9g琼月旨];电泳条件为 10v/cm， 45分钟。毛细管转移法将变性琼脂糖凝胶中的总RNA转移到尼龙膜上，转 移液用10XSSC溶液，转膜后进行紫外交联，将RNA固定到尼龙膜上，进行杂交。首 先预杂交，将膜置杂交瓶中，力tU5mL预杂交液(6XSSPE， 5XDenhardt， 0. 5g/100ml SDS， 50ml/100ml甲酰胺，100 u g/mL变性鱼精DNA) ， 42。C预杂交90分钟；用Promega 公司的Prime a gene kit进行探针标记；弃去杂交液，重新加15mL预杂交液及标记 好的变性探针，变形探针加入前先95-10(TC放置5min后立即置冰上5min， 42°。杂 交16hr以上。杂交结束后进行洗膜；用2XSSC、 0.5g/100mlSDS25。C下洗膜5分钟， 然后O. 5XSSC， 0. lg/100ml SDS 42。C下洗膜30分钟，再用O. 1XSSC， 0. lg/100ral SDS 42。C下洗膜30分钟。最后放射自显影。Northern杂交的结果表明，PCR为阳性的20株转基因烟草中有6株有较强的杂交 信号，说明2-甲基-6-叶绿基-l， 4-苯醌甲基转移酶基因在这6株中进行了较好表达。实施例3、转2-甲基-6-叶绿基-1, 4-苯醌甲基转移酶基因植株中生育酚含量的测定选取5株Northern杂交阳性植株(其名称为1#、 2#、 3#、 4柳5tt) 、 2株野生 型植株(其名称为WT1和WT2)和3株转pPBI121 (其名称为CK1、 CK2和CK3)的种子各100mg，用液氮研磨后转入含600y L甲醇-氯仿(2: 1)抽体液的l. 5mL离心管中， 充分震荡混匀，然后加入200uL氯仿和200uL无菌水，充分混匀。12000rpm离心 15min，取下层有机相转入新的离心管中，氮气吹干，溶于400ixL无水乙醇中进行 高效液相色谱分析。高效液相色谱分析结果如表l，表明转2-甲基-6-叶绿基-l， 4-苯醌甲基转移酶 基因烟草种子中的高活性的生育酚的含量有明显提高，在野生型的烟草种子中y — 生育酚与S —生育酚的比值平均为l. 16，而在转2-甲基-6-叶绿基-l， 4-苯醌甲基转 移酶基因烟草种子中二者的比值平均为2. 59，可以看出活性较高的y —生育酚含量 得到显著提高。表明转入2-甲基-6-叶绿基-1， 4-苯醌甲基转移酶基因可有效的增加 y—生育酚的含量，减少低活性的S—生育酚含量，表l中各值为三次重复的平均 值。表l野生植株与转基因植株生育酚含量的对比平均值1. 16烟草 生育酚S-生育酚Y-生育酚.植株(mg/g)(mg/g)s-生育酚WT1140.58692. 5741. 51WT280. 974100,9980. 811#151. 92567. 7462. 242ft119.08735. 6293. 343#110. 93441. 0542. 714#163. 58770.3462. 335#182.67377. 7082. 35CK185. 49798. 6950. 87CK289. 79493. 3450. 96CK3103. 25995. 4691. 052. 590. 96序列表〈110>中国农业科学院生物技术研究所<120> 2-甲基-6-叶绿基-l， 4-苯醌甲基转移酶及其编码基因与应用<130> CGGNARW81301 〈160〉2<210>1<211〉1162<212>丽<213〉大豆属大豆(Glycine max)<400>1gcaagtctccaacacactttcc"t犯tg3tggtattgtsgcgsgtggtga_g60caatttaatatatttttgtgaattcaatcaMg3ttg3tt120caattc肌tgggttcagtaatgctcagtggctcactctcagaaccctaac180cgggaacggcttaggtttcactggttcggatttgcatggtaag3acttcccaagagtgag240tttcgctgctaccsctagtgctaaagttcccaactttagaagcatagtagtacccaagtg300tagtgtctcggcttccaggccaagctcgcagccaaggttcattcagcacaaaaaagaggc360cttttggttctataggtttctctcaattgtgtatgaccatgtcattaaccctggccattg420gaccgaggacatgagggatgatgcccttgaacccgctgatctcaatgacaggaacatgat■tgtggtggatgttggtggcggcacgggtttcaccactcttggtattgtcaagcacgtgga540tgcc3Eig3atgtcaccattcttgaccagtc3ccccaccagctcgccaaggccaagcagaa600ggagcceictcaagg肌tgca肌eLtaatcgaaggggatgccgaggatctcccctttcgaac660tgattatgccgatagatatgtatccgcaggtactggccggatccacagcg720tggcatcaaggggttttgaaacttggaggcaaagcgtgtctaattggtcc780ggtctacccaacattttggttgtcacgtttctttgcagatgtttggatgcttttccccaa840gg郷3,gtatattgagtggtttcsga^ggcagggttt￡isgga_cgtccaactaaaaag■gattggcccaaaa_tggt3tcgtggggUcgccgtcatggcttgattatgggttgttcagt恥Ogaccggtgttaaacctgcatctggagattctcctttgcagcttggtccaaagg肌ga卿1020tgttg朋朋gcccgttaatccttttgtctttgcactgcgcttcgttttgggtgccttggc10803gCg3C3tggtttgtgttggttcctatttacatgtggctgaaagatc肌gttgttcccaa11403ggtcagcc33tct肌g3gctc1162<210> 2 〈211〉 342 <212> PRT 〈213〉大豆属大豆<400〉 2Met Gly Ser Val1Leu Thr Gly Asn 20Asn Phe Pro Arg 35Asn Phe Arg Ser 50Pro Ser Ser Gin 65Phe Tyr Arg PheHis Trp Thr Glu 100Asn Asp Arg Asn 115Thr Thr Leu Gly 130Leu Asp Gin Ser 145Leu Lys Glu CysArg Thr Asp Tyr 180Trp Pro Asp Pro 195Leu Gly Gly Lys 210Leu Ser Arg Phe 225Glu Tyr lie GluLys Arg lie Gly 260(Glycine max)Met 5GlyLeu LeuSer GlyGly PheVal Ser Phe Ala 40lie Val Val Pro 55Pro Arg Phe lie 70Leu Ser lie Val 85Asp Met Arg AspMet lie Val Val 120lie Val Lys His 135Pro His Gin Leu 150Lys lie lie Glu 165Ala Asp Arg TyrGinAlaPheTrp 245 ProArgCysAla 230 PheLysGlyLeu 215 AspGinTrplie 200 lieValLysTyrThrThr25AlaLysGinTyrAsp 105 AspValAlaGlyVal 185 LysGlyTrpAlaArg 265Glu10GlyThrCysHisAsp90AlaValAspLysAsp 170 SerGluProMetGly 250 GlyLysSerThrSerLys75HisLeuGlyAlaAla 155 AlaAlaAlaValLeu 235 PheValLeuAspSerVal60LysValGluGlyLys 140 LysGluGlyTyrTyr 220 PheLysArgThrLeuAla45SerGlulieProGly 125 AsnGinAspSerArg 205 ProProAspArgLeuHis30LysAlaAlaAsnAla 110 ThrValLysLeulie 190 ValThrLysValHis 270Arg Thr 15Gly LysVal ProSer ArgPhe Trp80 Pro Gly 95Asp LeuGly PheThr lieGlu Pro 160 Pro Phe 175Glu TyrLeu LysPhe TrpGlu Glu 240 Gin Leu 255Gly Leulie Met Gly Cys Ser Val Thr Gly Val Lys Pro Ala Ser Gly Asp Ser275 280 285Pro Leu Gin Leu Gly Pro Lys Glu Glu Asp Val Glu Lys Pro Val Asn290 295 300Pro Phe Val Phe Ala Leu Arg Phe Val Leu Gly Ala Leu Ala Ala Thr 305 310 315 320Trp Phe Val Leu Val Pro lie Tyr Met Trp Leu Lys Asp Gin Val Val325 330 335Pro Lys Gly Gin Pro l'le 340
权利要求
1. 一种蛋白质，是如下a)或b)的蛋白a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与生育酚的合成相关由a)衍生的蛋白质。
2、 权利要求1所述蛋白的编码基因。
3、 根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下l)或2)或3) 或4)的基因1) 其核苷酸序列是序列表中序列l;2) 其编码序列是序列表中序列1自5'末端第128-1026位；3) 在严格条件下与l)或2)或3)限定的DNA片段杂交且编码与生育酚的合成 相关的蛋白的DNA分子；4) 与l)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性，且编码与生育酚的合成相关 的蛋白的DNA分子。
4、 含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。
5、 根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体的出 发载体为pPBI121。
6、 含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系或重组菌。
7、 一种培育高Y-生育酚含量的转基因植物的方法，是将权利要求4或5所述的 重组表达载体导入植物细胞中，得到Y-生育酚含量提高的转基因植物。
8、 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述植物为油料作物，优选为油 菜或大豆或花生或芝麻或向日葵。
9、 扩增权利要求2或3所述基因的全长及其任意片段的引物对。
10、 权利要求l所述蛋白、权利要求2或3所述基因、权利要求4或5所述重组 表达载体、权利要求6所述转基因细胞系或重组菌在培育Y —生育酚含量提高的植物 中的应用。
全文摘要
本发明公开了2-甲基-6-叶绿基-1，4-苯醌甲基转移酶及其编码基因与应用。该酶是如下a)或b)的蛋白a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质，b)在序列表中序列3的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与生育酚的合成相关由a)衍生的蛋白质。本发明还公开了所述蛋白的编码基因。本发明的2-甲基-6-叶绿基-1，4-苯醌甲基转移酶与生育酚的合成相关，MPBQMT及其编码基因可用于培育富含γ-生育酚植物。
文档编号C12N1/15GK101275123SQ200810111628
公开日2008年10月1日 申请日期2008年5月15日 优先权日2008年5月15日
发明者兰 张, 磊 王, 范云六 申请人:中国农业科学院生物技术研究所