专利名称：核酸恒温同步放大检测方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术，具体涉及将核酸的恒温放大与检测同步进行的检验方 法，及其在临床检验、血液筛查、食品安全检査及环境监测中的核酸检测中的应用。
技术背景在核酸检测过程中，多数情况下样品中的核酸含量较低，为了使检测达到一定的灵敏度和准确度，需要对样品中的待检核酸片段进行扩增。1985年，聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction,简称PCR)技术的产生推动了核酸检测技术的发展，该 技术已成为核酸检测技术中的重要手段。随后，又衍生出诸如逆转录酶一聚合酶链反 应(Reverse Transcriptase—PCR，简称RT—PCR)、实时荧光定量聚合酶链反应(Real Time Fluorescent Quantified PCR， Real-time FQ PCR)，基于转录的扩增(Transcription Mediated Amplification, TMA) ， Nucleic Acid Sequence Based Amplification ( NASBA)等一系列核酸扩增检测方法，均可用于DNA样品或RNA样 品的扩增及定性、定量检测中。目前，除实时荧光定量PCR外，其余的核酸检测方法 都是采用"基因扩增+扩增子检测"的操作模式。目前，终点PCR或终点TMA/NASBA 检测方法还被广泛应用。由于这些方法在实际应用中易引起扩增物的污染，因此常造 成实验结果的假阳性或假阴性现象，从而使得该技术的实际应用尤其是临床检测具有 很大的局限性。实时荧光定量PCR虽然在技术上解决了上述难题，但设备昂贵、操作 复杂，阻碍了其在发展中国家的大规模推广使用。1991年，Corapton发明了基于核酸序列的扩增技术(Nucleic Acid Sequence Based Amplification,简称NASBA) (Nature, 350 (6313): 91-2,1991)。该技术是以RNA分 子的逆转录一转录为技术主线，无需进行类似于PCR过程的温度循环，可在恒定的温 度下，短时间内进行RNA扩增。但扩增产物常采用电泳、探针杂交、点杂交或化学发 光等方法来完成定性检测。此外，Gen—Probe公司也发明了与基于核酸序列扩增原理 完全类似的转录介导的扩增技术(Transcript ion Mediated Amplification简称 TMA) (Journal of clinical Microbiology, 35 (3) ， 676—8， 1997)，其与NASBA的核 酸扩增方法几乎完全相同，只不过用MMLV逆转录酶替代雄V逆转录酶。TMA的扩增结 果是通过杂交保护测定(Hybridization Protection Assay,简称HPA)技术进行定性 检测的。其它恒温扩增技术，如链置换扩增(SDA)、基于螺旋酶的扩增(HDA)等都是类似的等温扩增技术，这些技术所需的酶成本高昂，引物设计复杂，技术要求更高，相对应的，其反应检测成本也很高。因此，在目前的实验室研究及临床检测中所使用的核酸定量扩增检测方法主要以实时荧光定量PCR为主。该方法是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个反应进程，最后通过标准曲线进行定量分析。其荧光检测模式分为 TaqMan荧光探针、TaqMan MGB荧光探针(在荧光探针分子3'端连接非荧光淬灭剂及 MGB基团(Minor Groove Binder),亦称为MGB探针)、SYBR Green荧光染料、分子信 标(Molecular Beacon)探针禾口焚光共振能量转移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer,简称FRET)探针等。虽然实时荧光定量PCR方法的灵敏度和准确度较高， 但检测成本相对昂贵，且检测过程还需依赖特殊设备，因此，该技术在操作方法和检 测成本上都有很大的局限性。如果待测样品是RNA，还需将其利用反转录技术转z变成 cDNA才能进行后续的PCR反应，其试剂成本、技术要求和检测时间等都大大地提高或 延长，灵敏度也不如DNA样本检测高。所以，RT—PCR虽然是目前最常见的用于RNA 样本检测的技术，但大规模检测的推广困难很大。国内杜蓬(专利申请号200410025890.8)等人于2004年提出了将等温放大与 TaqMan荧光探针或TaqMan MGB荧光探针结合的方法(QD1A)，但其提出的检测方法 依然使用终端检测，虽然整个过程中无须打开反应管，解决了其它方法所可能引起的 污染问题，但与实时荧光定量PCR相比，依然有很大的差距，而且该专利所提出的使 用TaqMan或TaqMan MGB作荧光探针，此类探针的设计需要特殊的软件和很高的专业 知识，该专利申请并没有提出具体的设计方法和探针序列实例。另外，该专利提出用 逆转录酶的外切酶酶活性来降解TaqMan荧光探针以产生荧光信号。但国内外的文献 中没有有关这方面的报道，也没有基于TaqMan或TaqMan MGB探针的利用恒温放大技 术的产品或文献报导。这是一个全新的思路。目前，在核酸诊断领域，还没有将等温 放大与检测同步进行的相关技术报道或发明。 发明内容本发明的目的是提供一种将核酸的恒温放大与检测同步进行的检验方法。 本发明所提供的核酸恒温同步放大检测方法，可包括以下步骤 1)将含有下列组分的反应物混合a. 待测核酸样品；b. 引物l:该引物的3'端可与待测核酸样品的3'端或靠近3'端处杂交， 5'端为启动子序列；C.引物2:该引物可与待测核酸样品负(一)链的3'端杂交；d. —种或多种荧光探针；e. 至少一种RNA依赖的DNA聚合酶(即反转录酶)；f. 至少一种可以识别所述启动子序列的RNA聚合酶；2)将反应物混合后，在密闭容器中进行恒温放大反应，并用检测仪同步检测反应体系中荧光信号的变化，根据荧光信号变化的时间和强度对核酸样品进行定量或定 性检测。在上述核酸样品的恒温同步放大检测方法中，步骤l)中的待测核酸样品为RNA (包括mRNA、 rRNA等)或DNA样品。所述启动子序列为T7启动子序列、T3启动子序列、M13启动子序列或SP6启动 子序列。若待测核酸样品为RNA,所述待测核酸样品的(一)链由反应中产生；若待测核 酸样品为双链DNA，所述待测核酸样品的(一)链己存在于待测核酸样品中，该(一) 链也可由反应中产生。所述荧光探针可根据已有的技术知识和实验条件选自以下一种或几种类型探针 的任意组合分子信标(MolecularBeacon)、荧光共振(iFret)、蝎子探针(scorpin probe)、荧光放大(Amplafluor)和分子火炬(molecular torch)。所述探针序列 可以根据待测核酸样品和按照本领域已知的常规方法进行设计。所述RNA依赖的DNA聚合酶(即反转录酶)，具休来讲可为画LV逆转录酶或旭V 逆转录酶。所述RNA聚合酶为T7、 T3、 M13或SP6 RNA聚合酶。所用的RNA聚合酶是与所述 启动子序列相对应的RNA聚合酶。所述反应物可分为第一阶段反应物(除了e和f反应酶之外的所有组分)和第二 阶段酶反应物(包含e和f反应酶)，所述第一阶段反应物中还可包含有Tris、 KC1、 MgCl2、NTPS、dNTPs、甘油和DMS0，所述第一阶段反应物的组分具体可为10-50mM Tris， 20-90mM KC1， 10-50mM MgCl2， 0. 1-lOmM NTPS，。.卜10mM dNTPs， 5-40% (V/V)甘 油(Glycerol) ， 0-25% (V/V) DMS0， 0.1-2uM引物1， 0. l-2uM引物2， 0.1-2 yM荧光探针；所述第二阶段酶反应物中还可包含有Tris、 Triton X-100、 KC1、 EDTA、 DTT和甘油，所述第二阶段酶反应物的组分具体可为100-9000U RNA依赖的DNA聚 合酶(即反转录酶)，100-5000URNA聚合酶，20-lOOmMTris， 0. 1-1% (V/V) Triton X-100， 30-300rnM KC1， 0. 01-0. 5mM EDTA， 0.卜2mM DTT， 20-50% (V/V) 甘油。步骤2)中的恒温放大反应条件可为先将除e和f反应酶外的第一阶段反应物 充分混合，在55-9(TC下温育2-30分钟后，再在42-55'C下温育2-30分钟，在此过程中加入第二阶段酶反应物，由此开始在42-55'C下继续温育30-120分钟，用检^J仪 同步记录荧光信号的变化，根据荧光信号产生的时间和强度对待测样品进行定量或定 性检测；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比可为1-50: 1。所述用于检测荧光信号的检测仪的选择是多种多样的，优选为AB1 7000、 7300、 7500、 7700、 7900系列，Stratagen MPX3000系列和Bio-Rad IQ系列等。本发明的另一个目的是提供一种核酸恒温同步放大检测试剂盒。本发明的试剂盒，可包括以下作为反应物的组分a. 待测核酸样品；b. 引物l:该引物的3'端可与待测核酸样品的3'端或靠近3'端处杂交， 5'端为启动子序列；C.引物2:该引物可与待测核酸样品负(_)链的3'端杂交；d. —种或多种荧光探针；e. 至少一种RNA依赖的DNA聚合酶(即反转录酶)；f. 至少一种可以识别所述启动子序列的RNA聚合酶。在上述试剂盒中，所述反应物组分可分为第一阶段反应物(除了e和f反应酶之 外的所有组分)和第二阶段酶反应物(包含e和f反应酶)，所述第一阶段反应物中 还可包含有Tris、 KC1、 MgCl2、 NTPS、 dNTPs、甘油和DMS0，所述第一阶段反应物的 组分具体可为10-50mMTris， 20-90mMKCl， 10_50mMMgCl2， 0. 1-10mMNTPS， 0. 1-10mM dNTPs， 5—40% (V/V)甘油(Glycerol) ， 0-25% (V/V) DMS0， 0.1-2uM引物1， 0. 1-2uM引物2， 0. l-2uM荧光探针；所述第二阶段酶反应物中还可包含有Tris、 Triton X-100、 KC1、 EDTA、 DTT和甘油，所述第二阶段酶反应物的组分具体可为 100-9000URNA依赖的DNA聚合酶(即反转录酶)，100-5000U RNA聚合酶，20-100禮 Tris， 0.1-1% (V/V) TritonX-100， 30-300mMKCl， 0. Ol-O. 5mMEDTA， 0. l-2mMDTT， 20-50% (V/V) 甘油。本发明提供一种核酸的恒温同歩放大检测方法，是一种新的核酸同步等温扩增 (Simultaneous Amplification and Testing, 简称SAT)方法。该方法采用反转录 酶和RNA聚合酶与分子信标(molecular Beacon)、荧光共振(iFret， Fret)，蝎 子探针(Scorpion probe)、荧光放大(A即lifluor)或分于火炬技术(Molecular Torch) 等荧光检测技术相结合，将待测样品、两种引物、反转录酶、RNA聚合酶以及一种或 组合荧光探针混合共同反应，并在核酸恒温放大的同时，实现对核酸样本的同步定性 或定量检测。该方法的检测原理如图l所示，即将第一引物与待测核酸的3'端杂交， 第一引物的5'端含有RNA聚合酶启动子序列；第二引物与待测核酸样品的互补链(由第一引物利用待测核酸为模板，经过引物延伸而产生)杂交，利用该互补链为模t及进 行新一轮引物延伸，从而产生一条带有双链DNA顺序的启动子序列，以此为模板，由 RNA聚合酶转录更多的与第二引物互补的RNA产物，第二引物再以此为模板，经由第 二引物延伸产生与之互补的cDNA链；随后，第一引物再以此cDNA为模板进行新一轮 的引物延伸而形成带有启动子的双链DNA序列；然后，再以所产生的新的双链DNA为 模板进行新一轮转录反应，产生更多的负链RNA。在反应体系中，同时含有与此负链 RNA互补的荧光探针(如分子信标等)；随着负链RNA的增加，与之杂交的荧光探针 的数量也随之增加；最后，通过检测荧光量的变化，达到实时检测的目的，所有反应 在同一体系中、同一温度下同步进行。本发明的核酸检测方法明显优于现有的核酸检 测技术，主要优点如下-1. 低污染由于采用封闭式的恒温放大检测系统，整个过程中无须打开反应体 系，因而避免了扩增子的污染；2. 多种检测方法可供选择现有的荧光检测技术均适合于本发明的检测方法， 使用者可以根据自己的经验或已有的技术知识和实验条件，从多种荧光信号的检测方 法中任意选择；3. 快速检测将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，而且整个过程 中没有温度的升降温循环，因而所需时间大大縮短；4. 设备简单与实时荧光定量PCR相比，本发明所用的仪器无须升降温循环， 因而设计和生产成本大幅降低.综上所述，本发明的方法具有污染低、反应过程温度恒定、检测灵敏度高、检测 速度快、对仪器设备要求低和成本低的优点，适用于临床检验、血液筛査、食品安全 检査及环境监测等领域中的核酸检验，适合大面积推广和应用。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。 说明书附1为本发明核酸的恒温同步放大检测方法的原理图 图2为用本发明的方法对淋球菌RNA的检测结果 图3为用本发明的方法对艾滋病毒(HIV-1) RNA的检测结果 图4为用本发明的方法对乙肝病毒(HBV) DNA的检测结果具体实施方式
下述实施例中所用试剂和方法如无特别说明均为常规试剂和方法。所有引物、分 子信标及荧光探针序列均由美国ValueGene，BioNeer和Allele Biotech公司合成。 实施例1、细菌RNA的检测以淋球菌RNA的检测为例，用本发明的方法对细菌RNA进行定量检测，具体方法 包括以下步骤-一、 淋球菌RNA的提取取淋球菌(ATCCNO. 19424)的过夜(12-24小时)培养物，用Invitrogen公司 的Trizol试剂盒提取淋球菌RNA。二、 引物l、引物2及分子信标的设计根据淋球菌U^'"eria w/ orr/ oa3e)的16s rRNA序列(LOCUS #X07714，序列 表中的序列l)设计了一个5'端为T7启动子序列的引物1和不带启动子的引物2， 以及分子信标的序列，序列如下引物1: 5' — AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATCTCAGACCCGCTACTGATCGTCGCCTTG一 3 ， (带下划线碱基为T7启动子序列，可更换为T3启动子序列、M13启动子序列或SP6 启动子序列，相应地下述第二阶段酶反应物组分中的RNA聚合酶也应更换为T3 RNA 聚合酶、M13 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶)； 引物2: 5， — CCTTCGGGCCTTGCGCTATCCGAG—3，;分子信标5， 一GCACCGGCCGAUAUa]GAUUAGCUGGUUGGCGGUGC—3' ， 5，端标记的荧光 基团为(F雄6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein) ) ， 3'端标记的淬灭基团为 Dabcy]4 (4-甲基氨基苯基偶氮)-苯甲酸(非荧光基团)。三、 反应体系第一阶段反应物的组分50raMTris， 35mMKCl， 20mMMgCl2, 4mMNTPS， lmMdNTPs， 10% (V/V)甘油，5% (V/V) DMS0， 0.5uM引物1， 0.5uM引物2， 0.5wM分子信标。第二阶段酶反应物的组分2000U丽LV反转录酶(美国RD Biosciences公司)， 2000U T7 RNA聚合酶(美国RD Biosciences公司)，20mMTris， 0.5% (V/V) Triton X-100， 30rnM KC1， 0. lmM EDTA， 0. 3mM DTT， 25% (V/V) 甘油。四、 检测先将除反应酶外的第一阶段反应物充分混合，再将50 u 1第一阶段反应物混合液 加入到200ul的PCR反应管(平行做四管)中，然后按设计稀释度分别加入不同量的 淋球菌RNA (lug、 10ng、 100fg、不加RNA(O))充分混合，在6(TC (55-9Q。C均可) 下温育5min (2-30min均可)后，再在42°C (42-55。C下)下温育5min (2-30min)， 在此过程中加入10ul第二阶段酶反应物，由此开始在42'C (42-55"C均可)下继续温 育60min (30-120min均可)，用上海宏石实时荧光定量PCR (Slan)仪同步检测，荧 光信号每隔1分钟收集一次，记录荧光信号的变化量。五、结果荧光信号的检测结果如图2所示(横坐标为反应时间，纵坐标为相对荧光吸收值)，加入不同浓度的淋球菌RNA在不同时间(Ct)产生高于背景的荧光信号，稀释度越高(浓 度越低)，则产生高于背景的荧光信号所需反应时间(Ct)越长，即待测样本的浓度与 Ct(产生高于背景的荧光信号所需的反应时间)成反比。未加入淋球菌RNA的样品(阴性 对照)在反应结束时(Ct〉60分钟)，没有产生高于背景的荧光信号,只有背景荧光〗言号。 上述检测结果表明本发明的方法可用于细菌RNA的扩增与定性或定量的同步检测。实施例2、病毒RNA的检测以艾滋病毒(HIV-1) RNA的检测为例，用本发明的方法对病毒RNA进行定量检测， 具体方法包括以下步骤一、 艾滋病毒(HIV-1) RNA的获得提纯的艾滋病(H工V-1)病原体RNA的体外转录产物由美国RD Biosciences公司 提供，其产品说明书同时提供了RNA的含量和序列。二、 引物l、引物2及荧光探针的设计根据艾滋病病原体(HIV-1) RNA的体外转录产物序列设计了一个5'端含有T7 启动子序列的引物1和不带启动子的引物2，以及荧光探针的序列，序列如下 引物l: 5' — AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCATCTGTTTTCCATAATCCCTAATGATC—3， (带下划线碱基为T7启动子序列，可更换为T3启动子序列、M13启动子序列或SP6 启动子序列，相应地下述第二阶段酶反应物组分中的RNA聚合酶也应更换为T3 RNA 聚合酶、M13 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶)； 引物2: 5， 一ACAGAGATCCACTTTGGAAAGG—3，；荧光探针5' Fara-GCACCAAACUACUCUGGAAAGGUGAAGGUGC-Dabcyl-3， ， 5， 端标记的 荧光标记基团为6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein， 6-FAM) ， 3，端标记有 Dabcyl(即4(4-甲基氨基苯基偶氮)-苯甲酸(非荧光基团)。三、 反应体系第一阶段反应物的组分25fflMTris, 20mMKCl， 10mMMgCl2， 5mMNTPS， lmMdNTPs， 5% (V/V)甘油，0. lyM引物l， 0. luM引物2， 0. lyM分子信标。第二阶段酶反应物的组分2000U應LV反转录酶(美国RD Biosciences公司)， 2000U T7 RNA聚合酶(美国RD Biosciences公司)，20raMTris， 0.1% (V/V) Triton X-100， 30rnM KC1， 0. OlmM EDTA， 0. lmM DTT， 50% (V/V) 甘油。四、检测先将除反应酶外的第一阶段反应物充分混合，再将30 H 1第一阶段反应物混合液 加入到200ul的PCR反应管(平行做四管)中，然后按设计稀释度分别加入不同量的 艾滋病病原体UIIV-1) RNA的体外转录产物(lug、 10ng、 100fg、不加RM(O))充 分混合，在55。C (55-90'C均可)下温育30min (2-30min均可)后，再在42°C (42-55 。C下)下温育30min (2-30min)，在此过程中加入10ul第二阶段酶反应物，由此开 始在42。C (42-55。C均可)下继续温育120min (30-120min均可)，用AB1 7500实时 荧光定量PCR仪同步检测，荧光信号每隔1分钟收集一次，记录荧光信号的变化量。 五、结果荧光信号的检测结果如图3所示(横坐标为反应时间，纵坐标为相对荧光吸收《直)， 加入不同浓度的艾滋病病原体(HIV-1) RNA的体外转录产物在不同时间(Ct)产生高 于背景的荧光信号，稀释度越高(浓度越低)，则产生高于背景的荧光信号所需反应 时间(Ct)越长，即待测样本的浓度与Ct(产生高于背景的荧光信号所需的反应时间) 成反比。未加入艾滋病病原体(HIV-1) RNA的体外转录产物(阴性对照)的样品在反 应结束时(Ct〉60分钟)，只有背景荧光信号。上述检测结果表明本发明的方法可用于 病毒RNA核酸的扩增与定性或定量的同步检测中。实施例3、 DNA的检测以乙肝(HBV)病毒DNA的检测为例，用本发明的方法对DNA进行定量检测，具 体方法包括以下步骤一、 HBV病毒DNA的获得带有克隆的HBV病毒DNA的质粒由美国RD Biosciences公司提供，其产品说明 书同时提供了质粒DNA的含量和克隆的HBV病毒DNA序列(序列表中的序列3)。二、 引物l、引物2及荧光探针的设计根据HBV病毒的DNA序列设计了一个5'端为T7启动子序列的引物1和不带启动 子的引物2，以及荧光探针的序列，序列如下-引物1: 5' — AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCACGTGTCCTGGCCAAAATTCGCA一 3 ， (带下划线碱基为T7启动子序列，可更换为T3启动子序列、M13启动子序列或SP6 启动子序列，相应地下述第二阶段酶反应物组分中的RNA聚合酶也应更换为T3 RNA 聚合酶、M13 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶)； 引物2: 5， 一CAGCGATAGCCAGGACAAATTGGAGGAC—3';荧光探针5， Fam-GCACCAAGAGGUUGGUGAGUGAUUGGAGGUUGGUGC-Dabcyl-3' ， 5' 端标记的荧光标记基团为6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein， 6-FAM) ， 3'端标记有 Dabcyl(即4(4-甲基氨基苯基偶氮)-苯甲酸(非荧光基团)。三、 反应体系第一阶段反应物的组分30mMTris， 50mMKCl， 50mMMgCl2, lmMNTPS， 10mMdNTPs， 40% (V/V)甘油，1.5nM引物l， 1.5uM引物2， 0. 5uM分子信标。第二阶段酶反应物的组分9000U丽LV反转录酶(美国RD Biosciences公司)， 5000U T7 RNA聚合酶(美国RD Biosciences公司)，100mMTris， 1% (V/V) Triton X-100， lOOmM KC1， 0. 5 mM EDTA， 2mM DTT, 50% (V/V) 甘油。四、 检测先将除反应酶外的第一阶段反应物充分混合，再将40ii 1第一阶段反应物混合液 加入到200ul的PCR反应管(平行做四管)中，然后按设计稀释度分别加入不同量的 HBV病毒DNA (lug、 10ng、 100fg、不加薩(O))充分混合，在90。C (55-9(TC均可) 下温育2min (2-30min均可)后，再在55°C (42-55。C下)下温育2min (2-30min)， 在此过程中加入10ul第二阶段酶反应物，由此开始在55'C (42-55'C均可)下继续温 育30min (30-120min均可)，用ABI 7500实时荧光定量PCR仪同步检测，荧光信号 每隔1分钟收集一次，记录荧光信号的变化量。 五、结果荧光信号的检测结果如图4所示(横坐标为反应时间，纵坐标为相对荧光吸收值)， 加入不同浓度的HBV病毒DNA在不同时间(Ct)产生高于背景的荧光信号，稀释度越 高(浓度越低)，则产生高于背景的荧光信号所需反应时间(Ct)越长，即待测样本的 浓度与Ct (产生高于背景的荧光信号所需的反应时间)成反比。未加入HBV病毒DNA(阴 性对照)的样品在反应结束时(Ct〉60分钟)，只有背景荧光信号。上述检测结果表明 本发明的方法可用于DNA耙标的扩增与定性或定量的同步检测中。序列表<160〉 3〈210〉 1<211〉 1544〈212〉 腿<213〉 淋球菌(Afej.weWs ^o"orr力oese)〈400〉 1ugaacmiaagaguuugauccuggcucagau卿acgcuggcggcaugcuuuaca^caugca60agucggacggcagcacaggg犯gcuugcuucucggguggcg卿ggcgaacggguga,gtm120已canaucggaacgimccggg卿cgggggau肌cugaucga^agaucagc180uacgucuugagaggga犯gccgggccuugcgcuauccgagcggccgauan240cugauua.gcugguuggcgggguaaaggcccaccaeiggcgacgaucaguagcggguc卿g300已gg肌gauccgccacacugggscugagacacggcccagacuccimcgggaggcagcagug360ggg纖u皿gg3camigggcgcaagccugauccagccmigccgcgugucug犯g肌ggcc420uucggguuguaaaggacuuuuguc鄉ga^gaaaaggcuguugccaaimucggcggccga480ugacgguaccgcaccggcuaacimcgugccagcagccgcg540gggugcg,gUU犯UCgg3auuacugggcguaaagcgggcgcagacgguuscuuaagca.600uccccgggcuca^cccggg3MUgCgUUCUg犯cugggugacucgagugu660guc卿gg印gguggaauuccacguguagc3gugaaaugcguagagauguggaggaauac720ggcagccucccugacguucauguccga^agcguggguagc780aaax:agg8uuagauacccuggimguccacgcccima^cgaugucaammgc卿ugggca8403cuugaxmg-cuuggimgcguagcuaacgcgugaaauugaccgccuggggsguacggucgc900cucaaaggaauugacggggacccgcacaagcggugg肌gauguggaim犯960uucgaugcaacgcgaag￡Laccuimccugguuuugacaugugcggaauccuccgg卿cgg10203gg卿gCCUucgggagccgua^cacaggugcugcauggcugucgucagcUCgUgllCgllg1080卿uguuggguua^gucccgcaacgagcgc3acccuuguca皿aguugccaucauucggu1140ugggc已cucuaaugagacugccggugaca3gccggagg犯acgucaeigiic1200cucauggcccuuaugdcca.gggcuucacacggucgguacagaggg卿cc1260aagccgcgaggcggagccaaccgancguaguccggauugcscucugcaax:.1320ucg3gugcaugaagucggsaucgcuaguaaucgcaggucagcauacugcggugaaimcgu1380ucccgggucuuguacacaccgcccgucacaccaugggaguggggg扁ccagaaguaggu1440鄉gu獄cgca^ggaguccgcuuaccacggimugcuuca卿cuggggugaagucguaa1500c犯gguagccgusgggg認cugcggcuggauc3ccuccuuucu1544<211> 9732<212〉 RNA<213〉艾滋病毒(HIV-1)〈400〉 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1、核酸的恒温同步放大检测方法，包括以下步骤1)将含有下列组分的反应物混合a.待测核酸样品；b.引物1该引物的3’端可与待测核酸样品的3’端或靠近3’端处杂交，5’端为启动子序列；c.引物2该引物可与待测核酸样品负链的5’端杂交；d.一种或多种荧光探针；e.RNA依赖的DNA聚合酶；f.至少一种可以识别所述启动子序列的RNA聚合酶；2)将反应物混合后，在密闭容器中进行恒温放大反应，并用检测仪同步检测反应体系中荧光信号的变化，根据荧光信号产生的时间和强度对样品进行定量或定性检测.。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤l)中的待测核酸样品为RNA或DNA。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤l)中的启动子序列为T7启动子序列、T3启动子序列、M13启动子序列或SP6启动子序列。
4、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤l)中的荧光探针选自以下一种或几种类型探针的任意组合分子信标、荧光共振、蝎子探针、荧光放大和分子火炬。
5、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤l)中的所述RNA依赖的 DNA聚合酶为丽LV逆转录酶或AMV逆转录酶。
6、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤l)中的RNA聚合酶为 T7、 T3、 M13或SP6 RNA聚合酶。
7、 根据权利要求1一6任一项所述的方法，其特征在于所述步骤l)中的反应 物分为第一阶段反应物和第二阶段酶反应物，所述第一阶段反应物中还包含有Tris、 KC1、 MgCl2、 NTPS、 dNTPs、甘油和DMS0，所述第一阶段反应物的组分具体为10_50mM Tris， 20-90mM KC1， 10-50mM MgCl" 0. 1-10函NTPS， 0. 1-IO慮dNTPs， 5-40%甘 油，0-25% DMSO， 0. l-2nM引物1， 0.卜2yM引物2， 0. l-2 y M荧光探针；所述 第二阶段酶反应物中还包含有Tris、 Triton X-100、 KC1、 EDTA、 DTT和甘油，所述 第二阶段酶反应物的组分具体为100-9000U RNA依赖的DNA聚合酶，100-5000U RNA聚合酶，20-100mM Tris， 0.1-1% Triton X-100， 30-300rnM KC1， 0. 01-0. 5mM EDTA， 0. 1-2mM DTT， 20-50%甘油。
8、 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤2)中的恒温放大反应条 件为先将第一阶段反应物充分混合，在55-9(TC下温育2-30分钟后，再在42-55'C 下温育2-30分钟，在此过程中加入第二阶段酶反应物，由此开始在42-55'C下继续温 育30-120分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化，根据荧光信号产生的时间和强 度对待测样品进行定量或定性检测；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积 比为1-50: 1。
9、 根据权利要求1 —6任一项所述的方法，其特征在于所述检测仪为AB1 7000、 7300、 7500、 7700、 7900系列，Stratagen MPX3000系列或Barad iQ系列。
10、 权利要求1一9任一项所述的方法在临床检验、血液筛查、食品安全检查及 环境监测中的核酸检测中的应用。
11、 一种核酸恒温同步放大检测试剂盒，包括以下作为反应物的组分a. 待测核酸样品；b. 引物l:该引物的3'端可与待测核酸样品的3'端或靠近3'端处杂交， 5'端为启动子序列；C.引物2:该引物可与待测核酸样品负(一)链的3'端杂交；d. —种或多种荧光探针；e. 至少一种RNA依赖的DNA聚合酶(即反转录酶)；f. 至少一种可以识别所述启动子序列的RNA聚合酶。
12、 根据权利要求ll所述的试剂盒，其特征在于所述反应物组分分为第一阶 段反应物和第二阶段酶反应物，所述第一阶段反应物中还包含有Tris、 KC1、 MgCl2、 NTPS、 dNTPs、甘油和匿SO,所述第一阶段反应物的组分具体为10-50raM Tris， 20-90mM KC1， 10-50mMMgCl2， 0. 1-lOmMNTPS， 0. 1-lOmM dNTPs， 5-40%甘油，0-25% DMSO， 0. l-2uM引物l， 0. l-2uM引物2， 0. 1-2uM荧光探针；所述第二阶段酶反应物中 还包含有Tris、 Triton X-100、 KC1、 EDTA、 DTT和甘油，所述第二阶段酶反应物的 组分具体为100-9000U RNA依赖的DNA聚合酶，100-5000U RNA聚合酶，20-100mM Tris， 0. 1-1% TritonX-100， 30-300慮KC1， 0. Ol-O. 5raMEDTA， 0. 1-2mMDTT， 20-50%甘 油。
全文摘要
本发明公开了一种核酸的恒温同步放大检测方法及其应用。该方法包括以下步骤1)将含有下列组分的反应物混合a.待测核酸样品；b.引物1该引物的3’端可与待测核酸样品的3’端或靠近3’端处杂交，5’端为启动子序列；c.引物2该引物可与待测核酸样品负链的5’端杂交；d.一种或多种荧光探针；e.至少一种RNA依赖的DNA聚合酶；f.至少一种可以识别所述启动子序列的RNA聚合酶；2)将反应物混合后，在密闭容器中进行恒温放大反应，并用检测仪同步检测反应体系中荧光信号的变化，根据荧光信号变化的时间和强度对核酸样品进行定量或定性检测。本发明具有污染低、反应过程温度恒定、检测灵敏度高、检测速度快、对仪器设备要求低和成本低的优点，适用于临床检验、血液筛查等领域中的核酸检验。
文档编号C12Q1/68GK101333565SQ200810111479
公开日2008年12月31日 申请日期2008年6月26日 优先权日2007年6月27日
发明者张常娥 申请人:上海仁度生物科技有限公司