专利名称：实时荧光定量PCR检测HCMV gBn的分型方法
技术领域：
本发明涉及基因的扩增与检测，特别涉及人巨细胞病毒的gBn的型别检测 方法。
背景技术：
人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)在人群中普遍感染。大多 数人原发感染无症状，成为无症状携带者，但若免疫缺损或免疫抑制可造成严 重后果，如白血球减少症，肺炎，胃肠疾病，移植物功能减弱及排异，脑炎， 视网膜炎等；在优生优育方面，若宫内HCMV感染，可致婴儿严重后遗症。gB是HCMV最重要的包膜糖蛋白之一，是HCMV编码的蛋白中最具有免疫原 性的一个，是中和抗体的关键靶目标并且参加细胞应答反应，是潜在的HCMV毒 力因素。HCMV亚型通常以gB的型别来分类。目前临床研究认为不同的gB基因 型与临床有着密切的联系，不同的gB基因型表现出不同的细胞趋向性，不同的 亚型也有着不同水平的神经亲和力；如感染体内外周血白细胞时，gBl亚型在 体内不感染淋巴细胞，而gB2和gB3亚型感染单核和淋巴细胞；中枢神经系统 是gB2的优先感染位点。另外，gBnl型阳性者有较好的临床转归，gBn2型的患 者易出现临床症状并伴有较高的抗原血症，gBn3型阳性者术后与移植物抗宿主 病的严重程度呈负相关。因此对于HCMV gB的分型技术的研究是十分必要的。目前，用于HCMV gB分型的技术大多数是限制性长度多态性分析和定性PCR， 它们可对HCMV gB做出分型，但不能对其DNA进行定量。发明内容本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种实时荧光定量PCR检 测HCMV gBn的分型方法，在PCR反应体系中加入荧光探针，利用荧光信号积累 实时监测PCR进程，进行定量定性分析确定HCMV gBn型，所用引物和探针为HCMV-gB1-1: 5，-cggttcagtctctcaacg-3，；HCMV-gBl-2: 5'-caccacatctccgtacttg-3'; 探针HCMV-gBl-3: FAM-ttcccaaacggtcagc-BHQ1-3;;HCMV-gB2-l: 5，-ctcgtacgacgtcgtctcaa-3，；HCMV-gB2-2: 5，-cacacgcgataggggtactt-3';探针HCMV-gB2-3: 5， -FAM-gagaatagactgac-BHQ1-3';HCMV-gB3-l: 5'-ctcgtacgacgtctgctcaa-3';HCMV-gB3-2: 5，-cacacgcgataggggtactt-3，；探针HCMV-gB3-3: 5， -FAM-tgagaagaaactga-BHQ卜3';HCMV-gB4-l: 5，-tatcgtctgtctgggtgctg-3，；HCMV-gB4-2: 5，-cgttggctctatgactgacg-3，；探针HCMV-gB4-3: 5' -FAM-tgagaggagattga-朋Q1-3，。所述的利用荧光信号积累实时监测PCR进程，其荧光通道检测选用F細通道。所述的方法用于检测HCMV-gBnl 、 HCMV-gBn2、 HCMV-gBn3或HCMV-gBn4。本发明具有以下有益效果1、 封闭反应，无需PCR后处理，避免污染。2、 特异性强，灵敏度高。3、 采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确。4、 实时荧光定量PCR技术既可对HCMV gB进行分型，又可对其进行定量， 且定量范围宽，可达到10个数量级。5、 仪器在线式实时检测，结果直观，避免人为判断。6、 可实现一管双检或多检。7、 操作安全，縮短时间，普通PCR约需要1 2天，本发明的方法一般3 4小时可完成，提高效率。8、 可用于临床检测HCMV感染人群gBn分型，预测其预后，并可用于观察 HCMV活动性感染，指导临床治疗。
图1是本发明的实施例的gBnl标准曲线; 图2是本发明的实施例的gBn2标准曲线; 图3是本发明的实施例的gBn3标准曲线； 图4是本发明的实施例的gBn4标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例来说明本发明的技术方案器材PCR仪SLAN (上海，宏石)，紫外分光光度计HP 8453 ( HP公司， 德国)，凝胶图象分析系统BioSenSC300 (上海山富科学仪器有限公司)，低温 高速离心机(Biofuge 28RS) (Heraeus公司，德国)，恒温水浴箱(Model DK-8D (上海森信实验仪器有限公司)。试剂TAQ酶(美国Promega公司)、核酸抽提液(上海之江生物)、引物 (美国Invitrogen公司)。核酸裂解液具体配比10mmol/L Tris-cl (pH8.0)， 0. lmol/L EDTA(pH 8. 0) ， 20ug/ml胰RNA酶，0. 5%SDS。 PCR引物和探针 HCMV-gBl-l: 5' -cggttcagtctctcaacg-3' HCMV-gBl-2: 5' -caccacatctccgtacttg-3' 探针HCMV-gBl-3: FAM-ttcccaaacggtcagc-BHQl-3; HCMV-gB2-l: 5' -ctcgtacgacgtcgtctcaa-3' HCMV-gB2-2: 5' -cacacgcgataggggtactt-3' 探针HCMV-gB2-3: 5， -FAM-gagaatagactgac-BHQ1-3，； HCMV-gB3-l: 5'-ctcgtacgacgtctgctcaa-3' HCMV-gB3-2r 5' -cacacgcgataggggtactt-3' 探针HCMV-gB3-3: 5， -FAM-tgagaagaaactga-BHQ1-3， HCMV-gB4-1: 5' -tatcgtctgtctgggtgctg-3' HCMV_gB4_2: 5' -cgttggctctatgactgacg-3' 探针HCMV-gB4-3: 5， -FAM-tgagaggagattga-BHQ1-3，。(1) PCR模板制备取标本(血浆)50ixl于分装有50ul核酸裂解液的0.5mlEP管中，吹打 混匀，10(TC水浴10min处理，12000rpm离心10min，其上清做为PCR模板。(2) PCR反应取上述产物各4 u 1于40 u 1反应体积中进行PCR反应。 反应体积组成如下 HCMV-gBl: 10X Buffer(4 ii 1)、dNTP 10mmol/L (0. 8p 1)、MgC12 25,01几 (4 u 1) 、5U TaqDNA多聚酶(0. 3 u 1)、引物HCMV-gBl-l和HCMV-gB1-2各0. 5 u 1、 探针HCMV-gB1-3 0. 3ul、去离子水26.7ul。然后按下述热循环参数运行预 变性94X3min;变性94X20S，退火57X20S (采光)，延伸72X30S共40循环。HCMV-gB2 :10X Buffer(4p 1)、dNTP 10画1/L (0. 8u 1) 、MgC12 25咖ol/L (4. 8ul)、 5U TaqDNA多聚酶(0.3ul)、引物HCMV-gB2-1和HCMV-gB2-2各 0.5p1、探针HCMV-gB2-3 0. 3ul、去离子水25. 5ul。然后按下述热循环参数 运行预变性:94X3min;变性94X20S,退火+延伸57X60S (采光)，共40 循环。HCMV-gB3: 10X Buffer (4 ii 1)、d證10廳1/L (0. 8 u 1)、MgC12 25,ol/L (4. 8ul)、 5U TaqDNA多聚酶(O. 3nl)、引物HCMV-gB3-1和HCMV-gB3-2各 0. 5ul、探针HCMV-gB3-3 0. 3ul、去离子水25. 5ul。然后按下述热循环参数 运行预变性94X3min;变性94X20S，退火+延伸57X60S (采光)，共40 循环。HCMV-gB4: 10 X Buffer (4 y 1)、dNTP 10画1/L (0. 8 u 1) 、 MgC12 25咖ol/L (4. 8ul)、 5U TaqDNA多聚酶(O. 3p1)、引物HCMV-gB4-l和HCMV-gB4-2各 0. 5yl、探针HCMV-gB4-3 0. 3ul、去离子水25. 5nl。然后按下述热循环参数 运行预变性94X3min;变性94X20S，退火+延伸57X60S (采光)，共40 循环。仪器运行结束后，先对基线和阈值设定基线调整取5-15个循环的荧光 信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照的最高点。再点击"数据分析" 选项，仪器自动生成标准曲线(图l、图2、图3、图4)及检测标本病毒浓度。 阴性对照检测结果应NOCt.;标准曲线相关系数应《一0.98，否则实验视为无 效。仪器显示NOCt. (STRATAGENE荧光定量PCR仪)表示检测样品低于检测限， 报告为阴性；待检样本检测值显示<103 C叩ies/ml时，检测结果报告为阳性， 定量检测结果仅供参考；待检样品显示检测值在10topies/ml《HCMV《108 Copies/ml范围内，定量检测结果有效，可直接报告相应的定量检测结果。检 测样品中HCMV DNA 〉108Copies/ml，即可直接报告为>108 Copies/ml，也可 用阳性血清按10倍梯度做相应稀释，使其检测结果落在103COpieS/ml 10s Copies/ml范围内再重新测定，定量检测结果应根据稀释倍数进行校准。
本检测标本分别进行HCMV-gBn各个型别检测后，得到如下数据:基因型标准曲线相关系数定量值HCMVgBn-1-0. 9999124521.31copies/mlHCMVgBn-2-O. 99885NOCt.HCMVgBn-3-O. 99998NOCt.HCMVgBn-4-0. 99995NOCt.标准曲线相关系数皆《一0. 98，定量值HCMVgBn-2 、HCMVgBn-3、 HCMVgBn-4型检测体系检测结果都为NOCt. ， HCMVgBn-1型检测体系检测结果为 24521.31copies/ml 。判定00042826标本为HCMVgBn-1型且浓度值为 24521. 31copies/ml。取其他标本，应用本方法，还可以检测HCMVgBn-2或HCMVgBn-3， HCMVgBn-4 目前未被检测到。计算方法定量值为PCR仪器软件运行计算得出，其数学原理描述如下 Rn=RB+X。(l+E)nRs (Rn:第n个循环时的信号总量；RB:起始PCR管中信号量； Rs:单位信号强度；XQ:起始DNA浓度；E: PCR扩增效率) 当循环次数n二Ct值时，RT=RB+X。(1+E) eTRsLOG (R'厂RB) =LOGX。+Ct*LOG(l+E)+LOGRs Ct*LOG(l+E) = -LOGX0+LOG (RT- RB) -L0GRs Ct= (-L0GX0)/L0G(l+E)+( LOG (RT-RB) -L0GRs) / L0G(1+E) 艮口 Ct=-k LOGXo + b (线性方程) 做标准曲线后，可以求得k、 b的值，故可以根据Ct值求得X。即起始DNA 的浓度。图l、图2、图3、图4的曲线的相关参数相关系数斜率检测灵敏度HCMV-gBnl0.99991-3.292081000copies/mlHCMV-gBn20.99885-3.1823410copies/mlHCMV-gBn30.99998-3.89234100copies/ml HCMV-gBn40.99995-3.61816100copies/ml应用建立的实时荧光定量技术测定移植术后患者gB糖蛋白，能够准确定量 1、 2、 3型gB表达，并且发现混合I型和III型gB糖蛋白表达，IV型没有测到， 与定性测定的结果相符。取经nest-PCR测定阳性59份标本进行实时荧光定量 技术测定，gBnl型表达的拷贝数波动范围1.07X103copies 9.64X104copies， 阳性率88.1%; gBn2型表达的拷贝数波动范围4.39X 103 copies 2.21XKfcopies ，阳性率3.8%; gBn3型表达的拷贝数波动范围 2 . 02X103copies 8. 16 X105copies，阳性率37.3%; gBn3型阳性常伴有gBnl 型阳性，单独gBnl型阳性率有50. 8% 。实施例2根据上述实验步骤，选取1207份样本进行实时荧光定量PCR测定移植受体 术后HCMVgBnl、 2、 3基因型，其中肝移植受体40例，标本366份、肾移植受 体120例，标本350份、骨髓移植受体55例，标本481份，结果表明gBnl 型阳性率5.3%、 2型阳性率1.0%、 3型阳性率2.7%， 4型未测到；阳性样本 之间的拷贝数无差异(p〉0. 05)，gBnl、3型的混合感染占到gBnl型阳性的42. 3%; 阳性标本中不同移植类型的分布无差异。由于做到对HCMV gB的定量，既可检 测HCMV的感染状况，又可以判断患者预后情况，如1型感染预后一般较好； 混合感染有更高的病毒载量、更高的HCMV患病率、更高的器官排异机率，跟实 质器官移植受者治疗时血液中病毒的延迟清除可能有关，意味着抗病毒治疗时 发生耐药的风险很高。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然， 本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从 本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范 围。
<110〉浙江大学<120〉实时荧光定量PCR检测HCMV gBn的分型方法〈160〉 12<210〉 1 <211〉 18 <212〉 DNA <213〉人工序列<220>〈223〉引物HCMV-gBl-1 〈400〉 1cggttcagtc tctcaacg 18〈210〉 2 <211〉 19 <212> DNA 〈213〉人工序列〈220>〈223> HCMV-gBl-2 <■〉 2caccacatct ccgtacttg 19〈210〉 3 〈211> 16 <212> DNA
〈213>人工序列 〈220><223〉探针HCMV-gB卜3， 5端有带FAM， 3端带BHQ1; 〈400〉 3ttcccaaacg gtcagc 16<210> 4 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列<220><223〉引物HCMV-gB2-1 〈400〉 4ctcgtacgac gtcgtctcaa 20〈210〉 5 <211〉 20 <212> DNA 〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物HCMV-gB2-2 〈400> 5cacacgcgat aggggtactt 20 〈210> 6<211〉 14 〈212〉瞧 <213〉人工序列<220〉<223>探针，5端带有FAM， 3端带有朋Q1 <400〉 6gagaatagac tgac 14<210〉 7〈211〉 20 <212〉腿 <213〉人工序列<220>〈223〉引物HCMV-gB3-l 〈400〉 7ctcgtacgac gtctgctcaa 20<210〉 8 <211> 20 〈212〉腿 <213〉人工序列〈220〉〈223〉引物HCMV-gB3-2 〈400〉 8cacacgcgat aggggtactt 20
〈210〉 9 〈211〉 14 〈212〉 DNA <213>人工序列〈220〉〈223〉探针HCMV-gB3-3， 5端有FAM， 3端有BHQ1 <400〉 9tgagaagaaa ctga 14<210> 10 〈211〉 20 <212〉 DNA 〈213〉人工序列〈220〉〈223>引物HCMV-gB4-l <■〉 10tatcgtctgt ctgggtgctg 20〈210> 11 〈211〉 20 〈212> DNA 〈213〉人工序列〈220〉
<223〉引物HCMV-gB4-2 〈400〉 11cgttggctct atgactgacg 20〈210〉 12 〈211〉 20 <212> DNA 〈213〉人工序列<220〉〈223〉引物HCMV-gB4-2 <400> 12cgttggctct atgactgacg 20〈210〉 12 〈211〉 14 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈220〉〈223〉探针HCMV-gB4-3， 5端有FAM， 3端有BHQl <400〉 12tgagaggaga ttga 1权利要求
1、一种实时荧光定量PCR检测HCMVgBn的分型方法，其特征在于在PCR反应体系中加入荧光探针，利用荧光信号积累实时监测PCR进程，进行定量定性分析确定HCMV gBn型，所用引物和探针为HCMV-gB1-15’-cggttcagtctctcaacg-3’；HCMV-gB1-25’-caccacatctccgtacttg-3’；探针HCMV-gB1-3FAM-ttcccaaacggtcagc-BHQ1-3；；HCMV-gB2-15’-ctcgtacgacgtcgtctcaa-3’；HCMV-gB2-25’-cacacgcgataggggtactt-3’；探针HCMV-gB2-35’-FAM-gagaatagactgac-BHQ1-3’；HCMV-gB3-15’-ctcgtacgacgtctgctcaa-3’；HCMV-gB3-25’-cacacgcgataggggtactt-3’；探针HCMV-gB3-35’-FAM-tgagaagaaactga-BHQ1-3’；HCMV-gB4-15’-tatcgtctgtctgggtgctg-3’；HCMV-gB4-25’-cgttggctctatgactgacg-3’；探针HCMV-gB4-35’-FAM-tgagaggagattga-BHQ1-3’。
2、 根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测HCMVgBn分型方法，其特征 在于所述的利用荧光信号积累实时监测PCR进程，其荧光通道检测选用FMf通 道。
3、 根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测HCMVgBn分型方法，其特征 在于..所述的方法用于检测HCMV-gBnl、 HCMV-gBn2、 HC雨-gBn3或HCMV-gBn4。
全文摘要
本发明公开了提供一种实时荧光定量PCR检测HCMV gBn的分型方法，在PCR反应体系中加入荧光探针，利用荧光信号积累实时监测PCR进程，进行定量定性分析确定HCMV gBn型。本发明封闭反应，无需PCR后处理，避免污染；特异性强，灵敏度高采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确；实时荧光定量PCR技术既可对HCMV gB进行分型，又可对其进行定量；仪器在线式实时检测，结果直观，避免人为判断；可实现一管双检或多检；操作安全，缩短时间，普通PCR约需要1～2天，本发明的方法一般3～4小时可完成，提高效率；可用于临床检测HCMV感染人群gBn分型，预测其预后，并可用于观察HCMV活动性感染，指导临床治疗。
文档编号C12Q1/68GK101397591SQ20081012185
公开日2009年4月1日 申请日期2008年10月30日 优先权日2008年10月30日
发明者旋 张, 李兰娟, 杨美芳, 胡建华, 骏 范, 宏 赵, 陈晓明, 马伟杭, 高海女 申请人:浙江大学