专利名称：：一种牛蒡子苷元的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种牛蒡子苷元的制备方法，尤其是一种以黑曲霉CGMCCNo.2594发酵产生的(3-葡萄糖苷酶酶液为生物催化剂制备牛蒡子苦元的方法。(二)
背景技术：
：牛蒡子苷元((-)-Arctigenin)，分子式为C21H2406,分子量372.41。牛蒡子苷元具有治疗或预防慢性肾功能衰竭及肾纤维化、抗病毒、抗肿瘤等功效，在自然界存在于牛蒡子中。牛蒡子是菊科植物牛蒡(ArctiumLappaL.)的干燥成熟果实。牛蒡子发挥药效的有效成分为木质素类化合物——牛蒡子苷和牛蒡子苷元,其中牛蒡子苷必须先经过代谢转化为牛蒡子苷元才能被人体吸收。因此，牛蒡子苷元是可以被人体直接吸收的有效成分。牛蒡子苷元的制备主要有两种方法一种是从中药牛蒡子中分离提取。牛蒡子苷元在牛蒡子中的含量低于1%,因此牛蒡子苷元的产品得率较低。另一种是生物法合成。广州中医药大学胡英杰等人采用蜗牛酶成功地将牛蒡子苷水解为牛蒡子苷元，为牛蒡子苷元的酶法合成提供了思路，纯酶的分离提取过程工艺较为复杂成本较高。牛蒡子苷的糖苷键水解断裂可以产生牛蒡子苷元。P-葡萄糖苷酶(beta-Glucosidase)可以催化糖苦^T建的断裂。P-葡萄糖苦酶系统名称为(3-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase;EC3.2丄21)。广泛存在于植物、酵母、曲霉菌、木酶菌及细菌体内，利用(3-葡萄糖苷酶产生菌发酵产酶水解牛蒡子苷可以制备牛蒡子苷元。
发明内容本发明目的是提供一种利用黑曲霉CGMCCNo.2594发酵产生的卩-葡萄糖苷酶转化牛蒡子苷合成牛蒡子苷元的方法。本发明的技术方案是一种牛蒡子苷元的制备方法，所述方法包括在以牛蒡子苷为底物，以黑曲霉CGMCCNo.2594发酵产生的|3-葡萄糖苷酶酶液为催化剂的反应体系中，于20~50°C、100-200r/min摇床中转化4064小时，转化液经分离纯化得到所述牛蒡子苷元。所述发酵可在常规适用于黑曲霉发酵的培养基和操作条件下进行，所述(3-葡萄糖苷酶酶液用量以足以使底物牛蒡子苷全部转化为宜，亦可过量。黑曲霉CGMCCNo.2594,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCCNo.2594，保藏日期2008年7月15日。该菌林已在本申请人的在先申请CN200810120902.3中作为新菌种予以保护。所述黑曲霉CGMCCNo.2594是从浙江工业大学校园内运河附近的土壤中筛选得到。所述黑曲霉CGMCCNo.2594的菌落特征菌落在查氏培养基上25。C培养710天，直径5080mm。菌丝绒毛状，分生孢子结构呈黑色，无渗出液，无气味。菌落反面略带浅黄色，有同心圓褶皱2~3圈，辐射状褶皱5~6条。所述的底物牛蒡子苷在反应体系中的初始浓度为0.31.5mmol/L。所述反应体系中还可添加Mg"以提高反应产率，优选的，所述反应体系中添加100400mmol/L(优选200mmol/L)的MgS04。具体的，所述P-葡萄糖苷酶酶液由如下方法制备得到将黑曲霉CGMCCNo.2594接种至适用于黑曲霉的发酵培养基进行发酵培养，获得的发酵液过滤，取滤液调节滤液pH值为311,即为所述(3-葡萄糖苷酶酶200810液(制备得到酶液的酶活约为1075U/mL,牛蒡子苷浓度0.31.5mmol/L的底物溶液为10mL时，一般添加1030mL酶液即可)，所述P-葡萄糖苷酶酶液用量以酶液中P-葡萄糖苷酶总的酶活力计为5000250000U/mmol牛蒡子苦(此处酶活是以初始酶活计，因为在反应过程中，随条件的不同，酶活是变化的)。P-葡萄糖苷酶活力测定方法以对硝基苯酚-(3-D-葡萄糖苷(/NPG)为底物。测定时，取O.lml适当稀释的酶液与O.9ml、5mmol/LpNPG溶液混合(酶液稀释及/NPG的配制均采用50mmol/L、pH4.8柠檬酸-磷酸氢二钠緩冲液)，于50。C下保温10min。然后立即加入2ml的lmol/LNa2C03溶液终止反应，再加入IOml的蒸馏水摇匀，在400nm下测定吸光度。定义每分钟水解生成ljimol对硝基苯酚所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。所述发酵培养基为常规适用于黑曲霉的发酵培养基，本发明中所述发酵培养基组成如下稻草粉30~60g/L，麦麸10~20g/L,大麦粉1020g/L,(NH4)2S048~12g/L,KH2P040.20.6g/L,MgS04.7H200.2~0.6g/L，pH5.0。所述分离纯化方法可按照本领域常规方法进行，本发明中所述分离纯化方法如下反应结束后，取转化液加入体积为反应液体积8倍的甲醇终止反应，放置过夜，过滤取滤液减压蒸干，蒸干后的残留物加入氯仿溶解后，加无水硫酸钠脱水、过滤、减压蒸干得到主要含有牛蒡子苷元的混合物，所述混合物再用硅胶柱分离牛蒡子苷元，洗脱剂为氯仿、曱醇体积比100:095:5的混合液，洗脱液以曱醇重结晶，得到所述牛蒡子苷元。具体的，所述方法按如下步骤进行(1)斜面培养称取马铃薯200g,洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半小时，纱布过滤，加20g葡萄糖和20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，lx105Pa灭菌30min,摆放斜面、冷却，得到斜面培养基；斜面培养基接种黑曲霉CGMCCNo.2594，30。C培养7d,得到斜面菌种；(2)液体发酵培养基组成稻草粉50g/L，麦麸15g/L，大麦粉15g/L,(NH4)2S0410g/L,KH2PO40.5g/L，MgS04.7H200.5g/L,起始pH5.0;以生理盐水冲洗步骤(1)所得斜面菌种，得到孢子悬液接种至液体发酵培养基，30。C、150r/min摇床培养59d,得到的发酵液过滤，取滤液调节滤液pH值为311,得到(3-葡萄糖苦酶酶液；(3)底物牛蒡子苷溶解于无菌水中得到底物溶液，取P-葡萄糖苷酶酶液与底物溶液充分混合得到混合液，牛蒡子苷在混合液中初始浓度为0.31.5mmol/L，所述P-葡萄糖苷酶酶液用量以酶液中卩-葡萄糖苷酶总的酶活力计为5000~250000U/mmo1牛蒡子苷，并在混合液中添力。200mmol/L的MgS04;混合液置于30°C、150r/min的摇床中反应48h;(4)反应结束后，加入体积为转化液体积8倍的曱醇终止反应，放置过夜，过滤取滤液减压蒸干，蒸干后的残留物加入氯仿溶解后，加无水硫酸钠脱水、过滤、减压蒸干得到主要含有牛蒡子苷元的混合物，所述混合物再用硅胶柱分离牛蒡子香元，洗脱剂为氯仿、曱醇体积比100:095:5的混合液，洗脱液以曱醇重结晶，得到所述牛蒡子苷元。本发明直接采用黑曲霉CGMCCNo.2594发酵产生的p-葡萄糖苷酶酶液水解牛蒡子苷制备牛蒡子苷元，不需要(3-葡萄糖苷酶的分离提取与纯化，为牛蒡子普元的制备提供一条方便有效的途径，反应机理如图所示。反应液中牛蒡子苷和牛蒡子苷元含量的检测方法如下反应结束后，精密加入8倍体积的曱醇终止反应，放置过夜，过滤取滤液，经过0.45pm微孔滤膜过滤后得到的溶液用安捷伦高效液相色谱1200分析牛蒡子苦和牛蒡子苷元的含量。釆用如下方法对牛蒡子苷元进行分析;险测色谱柱为KromasilODSC18柱(4.6mmx250mm，5|im)。流动相为曱醇-乙腈-水-四氢呋喃(10:24:65:1至10:39:50:1线性梯度)，流速1ml/min,检观寸波长220nm，分4斤时间15min。本发明采用P-葡萄糖苷酶产生菌发酵产生的酶液用于生物转化制备牛蒡子苷元具有以下优点①反应条件温和、环境友好；②生物催化剂——P-葡萄糖苷酶酶液制备过程简单、不需要复杂的酶蛋白的分离纯化，成本低廉；③操作简便、生物转化效率较高；④生物转化过程易于放大，易于实现大规模工业化生产。利用本发明方法生产的牛蒡子苷元摩尔产率可以达到94.7%,产品纯度可达到99.7%。(四)图1为本发明实施例1工艺流程图。(五)具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1:工艺流程图参见图1。斜面培养斜面培养基配制称取马铃薯200g,洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半小时，纱布过滤，加20g葡萄糖和20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，lxl()Spa灭菌30min,摆放斜面冷却，得到斜面培养基。将黑曲霉CGMCCNo.2594接种至斜面培养基30。C培养7d得到斜面菌种。液体发酵液体发酵培养基制备(终浓度组成)稻草粉50g/L，麦麸15g/L,大麦粉15g/L,(NH4)2S0410g/L,KH2PO40.5g/L，MgS04.7H200.5g/L,起始pH5.0。卩-葡萄糖苷酶酶液的制备将生理盐水沖洗CGMCCNo.2594斜面菌种得到的1ml(孢子数约为125个/ml)孢子悬液接种于盛有200ml发酵培养基的500ml三角瓶中30。C摇床振荡(150r/min)分别培养5、6、7、8禾口9d，得到的发酵液过滤，采用HCl和NaOH调节滤液的初始pH值为6.0,无菌水定容至250ml做为P-葡萄糖苷酶酶液备用。获得的(3-葡萄糖苷酶酶液的酶活分别为61、64、68、71和75U/ml。底物溶液的制备称取牛蒡子脊标准品溶解于100ml无菌水中，配置成0.6mmol/L的底物溶液。分别取不同培养时间获得的10ml酶液与10ml底物溶液充分混合，置于30。C、150r/min的摇床中反应48h,测定牛蒡子苷元摩尔产率，结果如表1所示。菌体发酵7、8和9d获得的酶液水解牛蒡子苷产率相差不大，说明发酵7dp-葡萄糖苷酶已经达到最佳水解活力，因此确定最佳的产酶时间为7d。表l:产酶时间对产率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例2:按照实施例1中所述方法获得CGMCCNo.2594菌体斜面，并配制液体发酵培养基。卩-葡萄糖苷酶酶液的制备将生理盐水沖洗CGMCCNo.2594斜面菌种得到的1ml(孢子数约为125个/ml)孢子悬液接种于盛有200ml发酵培养基的500ml三角瓶中30。C摇床振荡(150r/min)培养7d，得到的发酵液过滤，采用HCl和NaOH调节滤液的初始pH值为6.0,无菌水定容至250ml做为(3-葡萄糖苷酶酶液备用。获得的P-葡萄糖苷酶酶液的酶活为68U/ml。底物溶液的制备称取牛蒡子苷标准品溶解于100ml无菌水中，分别配置成0.6、1.2、1.8、2.4和3.0mmol/L的底物溶液。取10ml酶液分别与上述不同底物浓度的10ml底物溶液充分混合，使牛蒡子苷初始浓度分别为0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mmol/L,放置于30°C、150r/min的摇床中反应，每6h取平行样品分析牛蒡子苷元的摩尔产率，结果如表2所示。36h以前，随着反应时间的延长产率逐渐提高。36h以后，产率比36h获得的产率略有提高，确定最佳反应时间为36h。说明卩-葡萄糖苷酶水解活力在36h后降低，因而36h后产率提高幅度很小。表2:反应时间对初始浓度不同的牛蒡子苷水解产率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例3:按照实施例1中所述方法获得CGMCCNo.2594菌体斜面，并配制液体发酵培养基。卩-葡萄糖苷酶酶液的制备将生理盐水沖洗CGMCCNo.2594斜面菌种得到的1ml(孢子数约为125个/ml)孢子悬液接种于盛有200ml发酵培养基的500ml三角瓶中30。C摇床振荡(150r/min)培养7d，得到的发酵液过滤，采用HCl和NaOH调节滤液的初始pH值分别为3、4、5、6、7、8、9、lO和ll，无菌水定容至250ml做为p-葡萄糖香酶酶液备用。获得的(3-葡萄糖普酶酶液的酶活分别为38、49、56、68、65、61、56、45和35U/ml。底物溶液的制备称取牛蒡子苷标准品溶解于100ml无菌水中，分别配置成0.6mmol/L的底物溶液。分别取上述不同pH下的备用酶液10ml与10ml底物溶液混合，牛蒡子苷初始浓度为0.3mmol/L,混合液放置于30°C、150r/min的摇床中反应36h，测定摩尔产率，结果如表3所示。酶液初始pH为6时水解产率最高。表3:酶液初始pH对水解产率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例4:按照实施例1中所述方法获得CGMCCNo.2594菌体斜面，配制液体发酵培养基。卩-葡萄糖苷酶酶液的制备将生理盐水冲洗CGMCCNo.2594斜面菌种得到的1ml(孢子数约为125个/ml)孢子悬液接种于盛有200ml发酵培养基的500ml三角瓶中30。C摇床振荡(150r/min)培养7d，得到的发酵液过滤，采用HCl和NaOH调节滤液的初始pH值为6，无菌水定容至250ml做为(3-葡萄糖苷酶酶液备用。获得的p-葡萄糖香酶酶液的酶活为68U/ml。底物溶液的制备称取牛蒡子苷标准品溶解于100ml无菌水中，分别配置成0.6mmol/L的底物〉容液。取备用酶液10ml与10ml底物溶液混合，牛蒡子苷初始浓度为0.3mmol/L,分别放置于20、25、30、35、40、45和50。C的摇床中150r/min反应36h,测定不同反应温度条件下获得的摩尔产率，结果如表4所示。最佳水解温度为30。C。表4:反应温度对水解产率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例5:按照实施例1中所述方法获得CGMCCNo.2594菌体斜面，并配制液体发酵培养基。按照实施例4获得备用(3-葡萄糖苷酶酶液和底物溶液。取备用酶液10ml与10ml底物溶液混合，牛蒡子苷初始浓度为0.3mmol/L，在混合液中分别加入200mmol/LMgS04、CaCl2、FeS04、MnS04、ZnS04和CoCl2，；改置于30。C的摇床中150r/min反应36h,测定摩尔产率，结果如表5所示。Mg"的添加对水解反应产率的提高有一定促进作用，其他离子的添加对反应过程存在抑制作用。表5:金属离子添加剂对产率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例6:按照实施例1中所述方法获得CGMCCNo.2594菌体斜面，配制液体发酵培养基。按照实施例4获得备用P-葡萄糖苷酶酶液和底物溶液。将备用p-葡萄糖苷酶酶液放置于4"水箱中冷藏。每隔5d取10ml冷藏酶液与10ml底物溶液混合，牛蒡子苷初始浓度为0.3mmol/L，30°C的摇床中150r/min反应36h,测定摩尔产率，结果如表6所示。随着酶液保存时间的延长，产率逐渐降低，保藏15和30d的酶液的水解活力是新鲜酶液水解活力的81.4%和24.6%。因此保存15d以内的酶液还可以很好地水解牛蒡子苷，产率可以达到71.2%,酶液的冷藏时间越短，水解活力越高。表6:酶液冷藏时间对产率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求1.一种牛蒡子苷元的制备方法，所述方法包括在以牛蒡子苷为底物，以黑曲霉CGMCCNo.2594发酵产生的β-葡萄糖苷酶酶液为催化剂的反应体系中，于20～50℃、100-200r/min摇床中转化40～64小时，转化液经分离纯化得到所述牛蒡子苷元。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的底物牛蒡子苷在反应体系中的初始浓度为0.31.5mmol/L。3.如权利要求l所述的方法，其特征在于所述(3-葡萄糖苷酶酶液由如下方法制备得到将黑曲霉CGMCCNo.2594接种至适用于黑曲霉的发酵培养基进行发酵培养，获得的发酵液过滤，取滤液调节滤液pH值为3~11，即为所述(3-葡萄糖苷酶酶液，所述酶液用量以P-葡萄糖苷酶酶活力计为5000250000U/mmol牛蒡子芬。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵培养基组成如下稻草粉3060g/L，麦麸1020g/L,大麦粉10~20g/L,(NH4)2S04812g/L，KH2PO40.2~0.6g/L,MgS04.7H200.20.6g/L，pH5.0。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的反应体系中还添加有100400mmol/L的MgS04。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述分离纯化方法如下反应结束后，取转化液加入体积为反应液体积8倍的曱醇终止反应，放置过夜，过滤取滤液减压蒸干，蒸干后的残留物加入氯仿溶解后，加无水硫酸钠脱水、过滤、减压蒸干得到主要含有牛蒡子苷元的混合物，所述混合物再用硅胶柱分离牛蒡子苷元，洗脱剂为氯仿、曱醇体积比100:0~95:5的混合液，洗脱液以曱醇重结晶，得到所述牛蒡子苦元。7.如权利要求l所述的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行(1)斜面培养称取马铃薯200g,洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半小时，纱布过滤，力卩20g葡萄糖和20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，lxl()Spa灭菌30min,摆放斜面、冷却，得到斜面培养基；斜面培养基接种黑曲霉CGMCCNo.2594,30。C培养7d,得到斜面菌种；(2)液体发酵培养基组成稻草粉50g/L,麦麸15g/L,大麦粉15g/L,(NH4)2S0410g/L,KH2PO40.5g/L,MgS04.7H200.5g/L,起始pH5.0;以生理盐水冲洗步骤(1)所得斜面菌种，得到孢子悬液接种至液体发酵培养基,30。C、150r/min摇床培养59d,得到的发酵液过滤，取滤液调节滤液pH值为3~11，得到(3-葡萄糖香酶酶液；(3)底物牛蒡子苷溶解于无菌水中得到底物溶液，取(3-葡萄糖苷酶酶液与底物溶液充分混合得到混合液，牛蒡子苷在混合液中初始浓度为0.3-1.5mmol/L,所述酶液用量以(3-葡萄糖苦酶酶活力计为5000~250000U/mmol牛蒡子苷，并在混合液中添加200mmol/L的MgS04;混合液置于30。C、150r/min的摇床中反应48h;(4)反应结束后，加入体积为反应液体积8倍的曱醇终止反应，放置过夜，过滤取滤液减压蒸干，蒸干后的残留物加入氯仿溶解后，加无水硫酸钠脱水、过滤、减压蒸干得到主要含有牛蒡子苷元的混合物，所述混合物再用硅胶柱分离牛蒡子苷元，洗脱剂为氯仿、曱醇体积比100:0~95:5的混合液，洗脱液以曱醇重结晶，得到所述牛蒡子苷元。全文摘要本发明提供了一种牛蒡子苷元的制备方法，所述方法包括以牛蒡子苷为底物，以黑曲霉CGMCCNo.2594发酵产生的β-葡萄糖苷酶酶液为催化剂，于20～50℃、100-200r/min摇床中转化40～64小时，转化液经分离纯化得到所述牛蒡子苷元。本发明的有益效果主要体现在①反应条件温和，环境友好；②生物催化剂——β-葡萄糖苷酶酶液制备过程简单、不需要复杂的酶蛋白的分离纯化，成本低廉；③操作简便、生物转化效率较高；④生物转化过程易于放大，易于实现大规模工业化生产。利用本发明方法生产的牛蒡子苷元摩尔产率可以达到94.7％，产品纯度可达到99.7％。文档编号C12P17/02GK101392279SQ200810121888公开日2009年3月25日申请日期2008年10月21日优先权日2008年10月21日发明者应国清,杨根生,欧志敏申请人:浙江工业大学