PolyLyse-HSP70融合蛋白膜修饰的肠癌细胞瘤苗及其制备方法

专利名称：PolyLyse-HSP70融合蛋白膜修饰的肠癌细胞瘤苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种可用于预防和治疗结直肠癌的聚赖氨酸-热休克蛋白 70 ( PolyLyse-HSP70 )融合蛋白膜修饰的肠癌细胞瘤苗及其制备方法。(二) 背景技术胂瘤的生物治疗特别是免疫治疗是肺瘤综合治疗的重要内容。近年肺 瘤临床免疫治疗获得重大进展某些免疫制剂如赫赛汀、美罗华等单抗与 化疗相结合可大幅度提高肿瘤治愈率和延长患者生存率。其机理是这些抗 体激活宿主免疫细胞与抗体/补体依赖的细胞毒作用，促进肺瘤细胞凋亡， 抑制肿瘤转移和提高肿瘤细胞对化疗药的敏感性。这些进展表明针对肿瘤 细胞的抗体在机体抗肺瘤免疫、提高化疗药的敏感性上发挥重要作用。免 疫治疗成为肺瘤治疗研究的重要方面，并出现与化疗结合形成化学-免疫 治疗的趋势。肿瘤细胞在突变过程中尤其经化疗后，存活的肿瘤细胞的细胞膜将产 生和暴露出更多的抗原决定蔟并多以半抗原形式存在，结合载体后形成完 全抗原，有可能产生有效的抗肿瘤抗体。这对抗肿瘤化学-免疫治疗具有 重要意义。另一方面，已知细胞毒淋巴细胞(CTL)作用在抗肿瘤免疫中 起重要作用。但诱导产生CTL的肿瘤抗原(CTL表位)在不同的肿瘤中 却不同，且分离困难，不具备通用性；肿瘤的抗原调变也影响瘤苗的CTL 作用。近年发现热休克蛋白(HSP)可通过独特机制诱导特异性抗肿瘤免 疫。HSP瘤苗可较好地解决肿瘤抗原调变，不必分离肺瘤抗原即可诱导 CTL,又无明显的毒副作用。此外，HSP本身具有免疫佐剂效应，应用性 强。大量实验和临床治疗也证明了 HSP瘤苗的诸多优越性。HSP抗肿瘤 应用研究已成为研究热点。而HSP全细胞瘤苗因包含全部肿瘤抗原而成 为重要研究内容。但是，目前的HSP全细胞瘤苗的抗肿瘤效应是基于HSP-抗原肽(诱导CTL的抗原成分)在瘤细胞裂解后释放的。这不利于HSP-抗原肽与抗原提呈细胞(APC)上的HSP受体结合，影响了其抗肿瘤效 应。研究发现用基因工程方法使胞浆中的HSP70表达到肿瘤细胞表面， 可促进抗肺瘤特异性和非特异性免疫；膜表达HSP70的瘤苗产生更强的 抗月中瘤效应。综合治疗是结直肠癌临床治疗的发展方向，化学-免疫治疗则具有独 特优势。
发明内容本发明目的是提供一种具有较强抗肿瘤效应的肠癌细胞瘤苗及其制 备方法。本发明采用的技术方案是一种聚赖氨酸-热休克蛋白70 ( PolyLyse-HSP70 )融合蛋白膜修饰的 肠癌细胞瘤苗，所述肠癌细胞瘤苗为跨膜表达PolyLyse-HSP70融合蛋白 的CT26肠癌细胞的灭活细胞，所述融合蛋白的PolyLyse端嵌入肠癌细 胞细胞膜、HSP70端游离在肠癌细胞膜之外；所述PolyLyse为长度为 60-100个的多聚赖氨酸肽段。本发明要点在于以肠癌细胞跨膜表达融合 蛋白的方式获得肠癌细胞瘤苗，将融合蛋白的PolyLyse端嵌入肠癌细胞 细胞膜、HSP70端游离在肠癌细胞膜之外，在已知这一蛋白表达方式的 前提下，本领域技术人员可根据常识进行基因序列的设计、载体的构建、 细胞的基因修饰、阳性克隆筛选，方便地获得本发明所述的肠癌细胞瘤苗。优选的，所述PolyLyse为长度为60个的多聚赖氨酸肽段。为增加空间活动性，以免融合蛋白中PolyLyse与HSP70相互影响功 能，所述PolyLyse肽段与HSP70之间可插入3~5个丙氨酸。所述肠癌细胞瘤苗优选为^夸膜表达PolyLyse-HSP70融合蛋白的 CT26肠癌细胞的灭活细胞，因为跨膜表达PolyLyse-HSP70融合蛋白的 CT26肠癌细胞瘤苗为所保藏的活细胞，而应用于作为瘤苗时必须经过灭 活处理才可以。所述^争膜表达PolyLyse-HSP70融合蛋白的CT26肠癌细胞瘤苗活细胞，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉 大学，430072,保藏日期2008年6月25日，保藏编号CCTCC NO: C200826。本发明还涉及所述肠癌细胞瘤苗的制备方法，所述方法包括以跨膜 型融合基因修饰肠癌细胞，使肠癌细胞跨膜表达PolyLyse-HSP70融合蛋 白，所述融合蛋白的PolyLyse端嵌入肠癌细胞细胞膜、HSP70端游离在 肠癌细胞膜之外，篩选阳性克隆，灭活细胞，得到所述肠癌细胞瘤苗。本发明以跨膜型融合基因修饰肠癌细胞，使之表达多聚赖氨酸 (PolyLyse)与热休克蛋白70 ( HSP70)的融合蛋白，在细胞膜上嵌入 具有较强的载体-半抗原效应的PolyLyse,其细胞膜外侧连着HSP70。那 么，PolyLyse可与细胞膜上的各种半抗原形成完全抗原，诱发强烈的抗肿 瘤体液免疫反应和抗体形成；HSP70则可将肿瘤抗原肽/人细胞内携带出 来，集中在细胞表面，促进APC的活化和特异性T细胞免疫；并且HSP70 与APC上的受体的结合，可促进PolyLyse进入APC，从而促进抗肿瘤体 液免疫和抗体形成。进一步，基因修饰的肠癌细胞经化疗药处理，制备的 瘤苗的免疫效应更强，并对体内化疗后残存的肠癌细胞有更好的针对性。或者，所述方法为以跨膜型融合基因修饰肠癌细胞，使肠癌细胞跨 膜表达PolyLyse-HSP70融合蛋白，所述融合蛋白的PolyLyse端嵌入肠癌 细胞细胞膜、HSP70端游离在肠癌细胞膜之外，筛选阳性克隆用化疗药 模拟临床治疗进行处理，处理后的存活的细胞用丝裂霉素灭活，得到所述 肠癌细胞瘤苗。所述化疗药可采用本领域常规用于肠癌的化疗药(例如 氟尿嘧啶，奥沙利铂和伊利替康等等)，其用量为临床化疗常规用量，本 发明中所述化疗药优选为氟尿嘧啶，用量为0.01mg/mL细胞悬液。优选的，所述方法为克隆HSP70基因的全长cDNA,将HSP70基 因定向克隆接入真核表达载体pDisplay(其它可跨膜、真核表达载体也可) 中，得到膜表达载体pDisplay-HSP70，在载体pDisplay-HSP70中的HSP70 基因粘端连接编码4个丙氨酸和60个赖氨酸的DNA片段，得到融合蛋白膜表达载体pDisplay-mPolyLyse-HSP70 , 将载体 pDisplay-mPolyLyse-HSP70转染肠癌CT26细胞，G418筛选阳性克隆， 扩增后，以每毫升细胞悬液加入0.01mg5-Fu的量进行才莫拟临床化疗处理， 5-Fu处理后存活的CT26细胞以丝裂霉素灭活，得到所述肠癌细胞瘤苗。化疗后存活的肠癌的细胞膜可产生和暴露出更多、抗原性更强的半抗 原；但以全细胞瘤苗的细胞膜半抗原诱导强大的抗癌体液免疫，目前尚无 报道，具有创新性。同时，现有研究也表明膜表达HSP70可将抗原肽从 癌细胞内携带到膜表面，可明显促进抗肿瘤特异性CTL作用。按照本发明思路，经体液免疫和细胞免疫均可获加强的新型肠癌瘤 苗。同时，以5-Fu模拟化疗处理瘤苗细胞，使瘤苗的免疫原性增强，并 对体内化疗后残存的癌细胞有更强的针对性。肠癌是常见的恶性肿瘤，位居前三，近年来其发病又呈持续上升态势。 肠癌难点是癌细胞化疗耐药和转移复发；免疫治疗有其独特的优势，对化 疗后转移或耐药的癌细胞更为有效可靠。本发明所提供的新型肠癌瘤苗， 预期在治疗大肠癌和预防其复发上具有较好的应用价值，产生良好的经济 和社会效益。本发明的有益效果主要体现在提供了一种免疫原性更强、抗肿瘤效 应更高的肠癌细胞瘤苗，对化疗后转移或耐药的癌细胞更为有效，应用于 预防和治疗结直肠癌，具有重大应用前景。

图1为构建的跨膜型PolyLyse-HSP70融合蛋白基因表达载体结构示意图； 图2为pDisplay-polyLyse-HSP70表达的DNA电泳结果；Lane 1和 Lane l， CT26分别带HSP70和卩-actin的引物；Lane 2和Lane 2，: mock-CT26分别带HSP70和(3匿actin的引物；Lane 3和Lane3,:CT26-pDisplay陽polyLyse陽HSP70分别带HSP70和(3-actin的引物； 图3为膜表达并结合融合蛋白PolyLyse-HSP70后的肿瘤细胞激光共聚焦显微镜结果；A细胞膜表面表达并结合HSP70蛋白的，其膜表面呈绿色 荧光(FITC标记)；B细胞膜表面表达并结合癌基因c-myc表位的，其膜 表面呈红色焚光(TRITC标记)；C细胞膜表面结合HSP70蛋白和癌基因 c-myc表位的，则其细胞膜表面呈黄色荧光(红绿叠加色)，表明二段蛋 白(多肽)同时出现在同一细胞膜上；D同型匹配抗体(Ig2b)对照显 示细胞膜表面无二抗结合(黑色背景) 图4为HSP70扩增结果； 图5为PolyLysl扩增结果； 图6为PolyLys2扩增结果； 图7为HSP70-PolyLysl拼接结果； 图8为HSP70-PolyLysl-PolyLys2拼-接结果； 图9为pdisplay-HSP70-PolyLysl-PolyLys2质粒； 图10为pdisplay-HSP70-PolyLysl"PolyLys2质粒酶切鉴定图； 图11为pdisplay-HSP70-PolyLysl-PolyLys2质粒测序结果； 图12为各瘤苗免疫治疗作用中的NK活性； 图13为各瘤苗免疫保护作用中的NK活性； 图14为各瘤苗免疫治疗作用中的CTL活性； 图15为各瘤苗免疫保护作用中的CTL活性； 图16为各瘤苗免疫保护作用实验中IL-2水平； 图17为各瘤苗免疫保护作用实验中INF-y水平； 图18为各瘤苗免疫保护作用实验中IL-4水平； 图19为各瘤苗免疫保护作用实验中IL-10水平； 图20为各组瘤苗对荷瘤鼠的抑瘤作用； 图21为各组瘤苗对荷瘤鼠的生存延长作用； 图22为各组瘤苗免疫鼠的瘤体生长(瘤苗抗瘤攻击作用)； 图23为各组瘤苗免疫鼠瘤攻击后的生存(瘤苗抗瘤攻击作用)。 具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1: HSP70全长基因cDNA克隆 1.1鼠肝组织总RNA的提取BALB/c小鼠鲜活肝组织100毫克剪碎，42。C热处理20分钟后置于 研钵中加少许PBS研成浆。移入Eppendorf管，力。lmlTrisol试剂(Gibco, BRL)混匀后转移至专用Eppendorf管，25。C水浴，5 min。加入0.2ml 氯仿(上海生工公司)混匀后15 30。C温浴，2min。4。C离心12000r/minxl5 min，即出现分层。吸取上层水相500ul移入新的Eppendorf管，加入等 体积异丙醇，温和混匀。25。C温浴，10min。 4。C离心12000 r/minx 15 min， 吸去上清，管底沉淀加入1 ml 70%乙醇摇混后25。C温浴， 5 min。 再4。C 离心10000 r/minx 10 min，吸去上清，沉淀在空气中干燥数分钟。加经D EPC处理^7]<溶解RNA沉淀。转移RNA溶液至专用Eppendorf管。留5 |il用紫外分光光度计测定浓度为300(ig/ml。 1.2 RT-PCR法获取HSP基因cDNA根据试剂盒M-MuLV( Gibco, BRL)说明书，取RNA摸板10jal ( 3pg )， 加oligo (dT) 18 primer (试剂盒自带)lpl和去离子水10 pl， 70。C温浴 5 min。取出即放在冰上，顺序加入5xRT buffer (试剂盒自带)4^1; RNasin (试剂盒自带)20U); 10MmdNTPmix (试剂盒自带)2pl 。 短暂离心，37。C温浴5min。加逆转录酶(试剂盒自带)200U, 42°C温浴 1 h后70。C温浴10min。终止反应，短暂离心，获逆转录产品，作为下一 步PCR的模板。实施例2:膜表达HSP70的真核表达载体的构建 2.1载体的选才奪能在真核细胞中表达的载体pDisplay (Invitrogen公司，USA)，在多克隆酶切位点的上游有小鼠K链信号肽序列，多克隆酶切位点的下游有血小板来源的生长因子受体(PDGFR)跨膜序列。故其适合构建表达 HSP70蛋白嵌合于细胞膜表面的载体。 2.2目的基因的扩增根据GeneBank中的HSP70的基因序列，设计并合成(上海生工公 司)1对引物P1和P2，分别包含&cll和&311酶切位点。上游引物P1: 5'- GCCGCGGCATGGCCAAAGCCGCrGCAGTCGGCAT-3'(有下划线部 分为&cll酶切位点，第24位斜体r为突变后石威基)；下游引物P2: 5'-CGGTCGACATCTACCTCCTCAATGGTG -3'(有下划线部分为&11酶 切位点)。以此作为引物，以RT-PCR法获得的HSP70全长cDNA作为模 板，PCR扩增HSP70 cDNA。使用高保真酶Pfu, 95。C热变性3min,循 环条件94。C变性，45 s; 58。C退火，45 s; 72。C延伸3 min 50 s。 28个循 环后72。C延伸10 min。产物4。C保存备用，取少许凝胶电泳观察结果。 2.3目的基因定向克隆构建策略为分步酶切，定向克隆。将HSP70 DNA和载体pDisplay (购自美国invitrogen公司)分别进行分步酶切先以&cII酶(Fermentas, USA)切5"acII位点，DNA胶回收纯化后以&1 I酶(Fermentas， USA) 再作I位点酶切。已酶切好的，具有两个粘端的HSP70 DNA和载体 pDisplay各4.5 |il，力口 T4 DNA连才妄酶(Promega )、 2 x buffer, 4。C过^！ 后则载体构建完成。 2.4构建载体的证实将已构建好的载体转化大肠杆菌JM109 (浙江大学免疫学研究所保 存)，在氨千抗性培养亚筛选阳性菌落，扩增，提质粒。以质粒酶切产物 电泳和质粒DNA测序证实载体pDisplay-mbHSP70的构建完成。实施例3:膜型polyLyse-HSP70融合蛋白真核表达载体的构建在已构建好的pDisplay-HSP70载体的HSP70粘端连接3~5个丙氨酸和60个赖氨酸，构建策略将hsp70部分序列扩增与合成的片断拼接， 然后利用hsp70自身的酶切位点SmlI与其其余部分及载体pDisplay相连。 具体过程如下需要合成的氨基酸的序列208bpGGAGGTAGAT gcc gce ecg gcc aag aag aaa a犯aag aag鄉aaa a犯叫a犯a犯aag aaa aagHsp70粘端 4个丙氨酸 60个赖氨酸aag aag aag aag aag aag aag aag aag aag aaa aag a賜aag aag aag aag aag aag aag aaa aag aag犯g aag aag a犯aaa aag aag aag犯g aag: aag鄉aaa aag aag鹏糾g,脇g.站SJ^ig^ gtc鹏Acc I由于序列重复太多而导致无法合成，现在多聚赖氨酸中间插入酶切位点变成两段序列合成(1) 这段序列共118bp,其中包含4个丙氨酸以及30个赖氦酸的序列即90bp 序列(PolyLysl)GGAGGTAGAT gcc scg gcg gcc躲g.a雜.,鹏'與g aag aag aag a汰汰—aag…aag &ag a賜…aagL汰助.'將g 4个丙氨酸 30个赖氨酸 稱g—翻g,巡g aag aag aag aag aau aag aag ;i;m ;1;1g ，ttcEcoRI(2) 这段序列共102bp,包含30个赖氨酸的序列90bp: (PolyLys2)gaattc aag aag aag aag aag aaa aag a犯aag aag aag aaa aag aag aag aag aag aag aag aaa aag aag aag aag aag aag aag aag aag gtcgacAcc I实验步骤 1、 PCR扩增①从pDisplay-HSP70载体中扩增部分HSP70序列 引物序列Length: 615 bpPrimer F: HSP70-4: 5'画GGTGCTGATCCAGGTGTAC-3' Primer R: HSP70國2: 5'-ATCTACCTCCTCAATGGTGG-3' PCR反应体系40ullOxBuffer 4.0 ulMg2+ (25mmol/L) 3.2 ul反应条件:dNTPs (各10mmo1/1)PrimerF (20pmol/ul) PrimerR ( 20pmol/ul) Taq酶(5U/ul) H20模板(100ug/ml)94 °C 3min94 °C 20s58°C 20s0.8 ul 0.5 ul 0.5 ul 0.3 ul 28.7 ul 2.0 ul72 °C 30s72 °C 5min3 5 cycles②从载体中扩增第一段序列(PolyLysl): 引物序列Length: 121 bpPrimerF: PolyLysl-1: 5'-GGAGGTAGATGCCGCGGC-3' PrimerR: PolyLys 1-3: 5'-ccgGAATTCCTTCTTCTTCTTTTTC隱: PCR反应体系40ul10xBuffer 4.0 ulMg2+(25mmol/L) 3.2 111dNTPs (各10 mmol/l) 0.8 ulPrimerF (20pmo歸) 0.5 ulPrimerR ( 20 pmol/ul) 0.5 ulTaq酶(5U/ui) 0.3 ulH20 28.7 ul才莫板(100ug/ml) 2.0 ul反应条件:94 °C 3min94 °C 15s58°C 20s72 。C 20s72 °C lOmin③扩增第二段序列(PolyLys2): 引物序列Length: 179 bpPrimer F: PolyLys2-l: 5'- CCGCTCTAGAACTAGTGGATC -3' Primer R: PolyLys2-2: 5'- CGACTCACTATAGGGCGAAT -3' PCR反应体系40ul10xBuffer 4.0 ulMg2+(25mmol/L) 3.2 uldNTPs (各10mmo1/1) 0,8 ulPrimerF (20pmol/ul) 0.5 ulPrimerR ( 20 pmol/ul) 0.5 ulTaq酶(5U/ul) 0.3 ulH20 28.7 ul模板(100ug/ml) 2,0 ul反应条件:94 °C 3min94 °C 15s58°C 20s72 °C 20s72 °C lOmin35cycles2、 PCR产物纯化(纯化试剂盒，购自QIAGEN， USA):① 用琼脂糖胶电泳，将目的DNA片断切下，放入1.5ml离心管中。② 加入500ul Solution SN液，置于65。C水浴中指月交完全融化，中途混 匀几次。胶融化后加入lOOul Solution B液，混匀。③ 将3S柱放入2ml收集管中，将融化后的胶溶液转移至3S柱中，室 温静置2min, lOOOOrpm离心lmin。④ 取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一收集管中，加入600ul Wash Solution, lOOOOrpm离心lmin。⑤重复步骤④(D取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一收集管中，10000rpm离心2min。 ⑦将3S柱放入一新的1.5ml离心管中，在3S柱膜中央加入30ul水， 室温放置2min, 10000rpm离心lmin,离心管中液体即为回收的 DNA片断。 3、 PCR拼接拼接HSP70和PolyLysl: 引物序列Length: 726 bpPrimer F: HSP70-4: 5'-GGTGCTGATCCAGGTGTAC画3' PrimerR: PolyLysl-3: 5'-ccgGAATTCCTTCTTCTTCTTTTTC-3 PCR反应体系40ul BufferMg2+ (25mmol/L) dNTPs (各10mmo1/1)PrimerF (20pmol/ul)PrimerR (20pmoi/ul) Taq酶(5U/ul) H20模板l(100ug/ml) 模板2(100ug/ml)反应条件:94 °C 3min94 °C 20s58°C 20s4.0 ul 3.2 ul 0.8 ul 0.5 ul 0.5 ul 0.3 ul 26.7 ul 2.0 ul 2.0 ul72 °C 40s72 °C 5min40cycles4、酶切对HSP70-PolyLysl拼接产物和PolyLys2进行EcoRI酶切10x Buffer 2ul EcoRI酶(10U/ul) lul模板(ioug/ui)_^hL37。C水浴3h5、 连接对酶切后的HSP70-PolyLysl拼接产物和PolyLys2用T4 DNA 连接酶连接25ul连接体系T4 ligase Buffer 2.5ul T41igase(10U/ul) lul HSP70-PolyLysl (50ng/ui) 10ul PolyLys2(40ngM) 11.5ul放置过夜6、 PCR扩增HSP70-PolyLysl-PolyLys2:以连接产物为模板，用HSP70-4 上游引物和PolyLys2下游引物进行扩增。引物序列Length: 862 bpPrimer F: HSP70-4: 5'-GGTGCTGATCCAGGTGTAC-3' Primer R: PolyLys2-2: 5'- CGACTCACTATAGGGCGAAT陽3' PCR反应体系40ul10xBuffer 4.0 ulMg2+ (25mmol/L)3.2 uldNTPs (各10mmo1/1)0.8 ulPrimerF (20pmol/ui)0.5 ulPrimerR ( 20pmol/ul)0.5 ulTaq酶(5U/ul)0.3 ulH2026.7 ul模板l(100ug/ml)2.0 ul模板2(100ug/ml)2.0 ul反应条件94°C 94°C 58°C 72°C 72°C 3min 20s 20s 45s 5min40cycles7、 酶切将pDisplay-HSP70载体、HSP70与第一4殳序列的拼接产物进行Blpl酶和 ACCI酶切10xM Buffer 2ul ACC I酶(10U/ul) lul模板(10ug/ul)_17ul37。C水浴3h NEB4 Buffer 2ul Blp I酶(10U/ul) 0.5ul模板(10ug/ul)_17.5ul37"C水浴3h8、 连接转化连接25ul连接体系T4 ligase Buffer 2.5ul T4 ligase(10U/ul) lul DNA(10ug/ul) 15ul质粒(10ug/ul)_6.5ul放置过夜转化取10ul连接产物加入感受态细胞中 丄水浴30min 丄42。C热激90s丄冰浴3min 丄加入lmlLB培养基丄150转,摇lh丄均匀平铺到LB培养皿上，37。C放置3h丄吸干残液，将平板倒置，37"C过4艾 丄挑取克隆加入到加有1%。抗生素的培养基中，摇菌过夜 9、质粒抽提(质粒抽提试剂盒，购自QIAGEN， USA )① 将过夜培养的2ml细菌高速离心lmin，彻底去除上清。② 加入100ul Solution I ,用才&头充分悬浮细菌。③ 加入200ul Solutionll,立即上下颠倒混匀，使细菌裂解，室温放置2min 至溶液变成澄清。④ 加入400ulSolutionin,立即上下颠倒5-10次，使之充分中和，室温放 置2min。⑤ 15000rpm,离心10min。⑥ 将3S柱放入2ml收集管中，将上清转移到3S柱，室温放置2min， 12000rpm离心lmin。⑦ 取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一收集管中，加入 700ul Wash Solution, 12000rpm离心lmin。⑧ 重复步骤⑦⑨ 取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一收集管中， 12000rpm离心2min。⑩ 将3S柱放入一新的1.5ml离心管中，在3S柱膜中央加入50ul水，室 温》文置2min, 12000rpm离心lmin,离心管中液体即为质粒。
Agarose电;永4企测。10、测序实验结果1、 PCR扩增结果图4~图6分别为HSP70、PolyLysl和PolyLys2的PCR 电泳4全测图。2、 PCR拼接结果对HSP70和PolyLysl进行拼接，目的片段约726bp, HSP70-PolyLysl拼 接结果见图7; HSP70-PolyLysl-PolyLys2拼接产物见图8，经电泳4企测， 目的片4爻约810bp。3、 质粒提取及酶切鉴定将HSP70-PolyLys 1 -PolyLys2拼接产物构建到pdisplay质粒中后，用 电泳;险测所抽质粒的完整性，pdisplay-HSP70-PolyLysl-PolyLys2质粒电 泳结果见图10, M为lkb marker; 1为抽取的质4立。为了鉴定HSP70-PolyLysl-PolyLys2拼接产物是否成功构建到pdisplay 质粒中，首先用Blpl和ACCI酶切鉴定，pdisplay-HSP70-PolyLys1-PolyLys2 质粒酶切鉴定图见图11， M为Marker; 1、 2、 3分别为质粒双酶切、未 酶切和单酶切。在双酶切的质粒中，在750bp以上有目的带。4、 测序结果将提取的质粒进行测序鉴定，pdisplay-HSP70-PolyLysl-PolyLys2质 粒测序结果见图11，拼接基本正确，其中共有58个赖氨酸，前30个赖 氨酸中1个突变为精氨酸(AGG),缺失3个碱基GAA导致1个赖氨酸 缺失。实施例4:融合基因表达载体转染肠癌CT26细胞及阳性克隆鉴定已构建成的表达膜型融合基因的载体pDisplay和空pDisplay,转染鼠 肠癌细胞CT26。经G418抗性筛选，获得并扩增阳性克隆。具体过程如 下转种CT26细胞24孔板3孔中，常规培养。次日，l(ig欲转染的质粒DNA，加无血清、蛋白或抗生素的RPMI-1640细胞培养液稀释至60 |_il。 混合数秒钟。力。5(^1 SuperFect-Transfection-Reagent (QIAGEN, USA) 到DNA溶液中混合。室温孵育10 min，形成转染复合体。同时以PBS 洗培养板中细胞一遍。将350 fxl RPMI-1640细胞培养液(含血清、蛋白 或抗生素)加到含转染复合体的管中。吹吸两次即转移到24孔板中的细 胞中。常规孵育2—3h后，以PBS洗细胞一遍，加新鲜配置的RPMI-1640 培养液(含血清、蛋白或抗生素)孵育。48h后，转染的基因开始表达。 消化、转种细胞，分别加入含G418 700、 800、 900、 1000、 1100、 1200|ig/ml 的培养基0.5ml，设对照，筛选G418抗性克隆。2 4d换液一次，当对照 组细胞大部分死亡时，G418浓度降为200 jig/ml维持。4周后发现含 1200吗/mlG418的培养孔，CT26细胞全部死亡，而1100吗/ml G418的培 养孔，少量CT26细胞存活，有限稀释抗性克隆转入96孔板，抗性克隆 扩增后供检测。在阳性克隆，即细胞膜表面表达polylyse-HSP70的CT26肿瘤细胞 100nl悬液中，加入使用浓度(200吗/ml)的鼠抗HSP70单抗和鼠抗血凝 素A单抗各2|il,室温共孵育1 h; PBS离心洗涤后，加入二抗Goat anti-mouse IgG/FITC。 4。C共孵育1 h; PBS离心洗涤，调整细胞的浓度 为lx106/ ml,留200jil送流式细胞术检测。取1滴滴于载玻片，盖玻片 轻盖后四周用指甲油粘封固定。制作3张供免疫荧光激光共聚焦显微镜观 察。以上各组均设立无修饰B16细胞、用PBS代替一抗等作空白抗体对 照。经RT-PCR、激光共聚焦显微镜和流式细胞术检测证实细胞的表面修 饰膜表达并结合融合蛋白PolyLyse-HSP70。结果如图2、图3。实施例5:肠癌细胞的5-Fu处理经抗性筛选的基因或空载体转染的CT-26细胞阳性克隆在扩增后， 即以肠癌常用化疗药氟尿嘧啶(5-Fu)加入细胞培养基中，使每毫升细胞悬液含O.Olmg 5-Fu ,进行常规培养5天，洗涤去除细胞悬液中的5-Fu 后培养， 一月后重复上述过程1次。丝裂霉素lOOpg/ml在37。C处理0.5h 灭活细胞即成2组肠癌瘤苗Polylyse-HSP70的CT26 (即CCTCC NO: C200826的灭活细胞)和mock-CT26各lxl0 个细胞。实施例6:新型肠癌瘤苗的免疫效应 1)瘤苗的细胞增殖刺激效应刺激原为lxl06/ml灭活的各种修饰细胞和对照细胞；增殖细胞为 lxl06/ml正常的BALB/c小鼠脾细胞。两者各取50|lU混合加入96孔板常 规培养3天，用MTT比色法测定吸光值(A),以增殖指数PI表示细胞 增殖效应；PI=实^r组A值/对照组A值。结果如下表表l:瘤苗的体外细胞增殖刺激效应与淋巴细胞共培养PIl.PBS0.522.AntiHSP十CT隱26-polylys-HSP700. 403. CT-260.764. CT-26画polylysHSP701.06结论体外淋巴细胞增殖刺激效应实验显示所研制的瘤苗热休克蛋 白70和多聚赖氨酸的融合蛋白修饰的CT26瘤苗(CT-26-polylysHSP70 ) 具有强大的淋巴细胞增殖刺激效应。这种作用有赖于热休克蛋白70与受 体作用。2) NK细胞活性的检测YAC-1细胞作为靶细胞；处死免疫鼠，常规取脾分离淋巴细胞作为 效应细胞。乳酸脱氯酶释放法(LDH法)检测NK细胞活性按试剂盒 要求将輩巴细胞、效应细胞、1640和NP-40分别加入各孔100|il (耙细胞 和效应细胞均为2xl(^个)，常规培养。1000转/分离心取上清至新孔，加 入酶底物。置于37 。C 10 min后加终止液，酶标仪测定其OD值(A)。杀伤活性=(A杀伤孔-A靶细胞释放孔)/ ( A靶细胞最大释放孔-A耙 细胞释放孔)xl00%。结果见图12、图13。结论NK细胞活性的检测实验显示所研制的瘤苗热休克蛋白70 和多聚赖氨酸的融合蛋白修饰的CT26瘤苗(CT-26-polylysHSP70 )具有 强大的诱导NK淋巴细胞活性的免疫学效应。3) CTL杀伤活性的测定将免疫鼠的脾细胞与瘤苗细胞,按1:2的细胞数比例加入96孔板(各 孔细胞数为lxlO6, lOOjil)各孔细胞数一致，孵育7天，收集悬浮细胞作 为CTL效应细胞。以活CT26细胞作为靶细胞进行4-h 51Cr释放杀伤实 验CT26细胞用200 uCi Na51Cr04标记2 h,然后细胞用无血清培养基洗 3遍，靶细胞按不同的效耙比(E: T)与效应细胞共育。取上清于y 计数仪上测cpm值。BALB/c小鼠B淋巴瘤A20细胞作为对照把细胞。 最大释放组为靶细胞加1%SDS;自发释放组为靶细胞加培养基。杀伤活 性=(实验组cpm -自发释放组cpm )/(最大释放组cpm -自发释放组cpm) xl00%;各瘤苗免疫治疗作用中的CTL活性见图14,各瘤苗免疫保护作用中 的CTL活性见图15。结论CTL细胞活性的检测实验显示所研制的瘤苗热休克蛋白70 和多聚赖氨酸的融合蛋白修饰的CT26瘤苗(CT-26-polylysHSP70 )具有 强大的诱导CTL淋巴细胞活性的免疫学效应。即具有诱导特异性细胞免 疫的作用。4) 细胞因子的检测各组鼠脾细胞与瘤苗细胞共孵育48 h,收集培养上清，按ELISA试 剂盒说明，检测上清中IFN-y、 IL画2、 IL-4和IL-10的水平。各瘤苗免疫保护作用实验中IL-2水平见图16,各瘤苗免疫保护作用 实验中INF-Y水平见图17,各瘤苗免疫保护作用实验中IL-4水平见图18， 各瘤苗免疫保护作用实验中IL-10水平见图19。结论细胞因子活性的检测实验显示，所研制的瘤苗热休克蛋白 70和多聚赖氨酸的融合蛋白修饰的CT26瘤苗(CT-26-polylysHSP70 )具 有强大的诱导IFN-Y、 IL-2、 IL-4等细胞因子活性的免疫学效应。5) T细胞亚群体内删除实验在瘤苗治疗前5天开始，于鼠腹腔注射相应的阻断抗体，l次/2天， 共5次。小鼠共分为4组，分别为IgG2b抗-CD4组；IgG2b抗-CD8组； 大鼠IgG对照组；PBS对照组。这一过程经流式细胞术检测证实，确认 鼠外周血和脾脏中特定亚群>98%被删除。6) 热休克蛋白功能阻断实验瘤苗在免疫小鼠之前加鼠anti-HSP70MAb至4iig/m1,室温共孵育1 h,离心洗涤后接种到治疗模型中的实验鼠，设立对照。具体免疫学效应 结果详见上述图12 图19中相应瘤苗组。结论各免疫学实验显示所研制的瘤苗热休克蛋白70和多聚赖氨 酸的融合蛋白修饰的CT26瘤苗(CT-26-polylysHSP70 )具有强大的特异 性和非特异性免疫刺激效应。这种作用有赖于热休克蛋白70作用；阻断 热休克蛋白70与受体作用，可阻断瘤苗免疫刺激效应。实施例7:瘤苗抗肺瘤的动物实验以化疗药5-Fu处理后存活的CT26肠癌细胞建立移植瘤才莫型。分别 在种植移植瘤之前和之后，给予瘤苗免疫接种。观察瘤体生长和荷瘤鼠的 平均生存期。研究瘤苗对荷瘤鼠的治疗作用和抗瘤攻击的保护作用。具体 方法1)抗肿瘤攻击的免疫保护作用小鼠分成4组，分别在皮下注射以下灭活的癌细胞或PBS，每周1 次，共3次1、 CT26-mPolyLys-HSP70 (表示膜表达融合蛋白的CT26 细胞，其它组类推)，2、空pDisplay-CT26 (空pDisplay转染的CT26细 胞)，3、 PBS， 4、同组1 (供无关肺瘤A20攻击)。免疫结束后，第4组用A20淋巴瘤细胞其余用CT26攻击(野生型，5-Fu处理后存活细胞)。 1周后每组取3只处死取脾，测NK和CTL活性。余5只检测瘤体大小 并观察小鼠生存期。各组瘤苗对荷瘤鼠的抑瘤作用见图20,各组瘤苗对 荷瘤鼠的生存延长作用见图21。结论所研究的瘤苗比较未修饰瘤苗，具有较强的抗瘤攻击的保护作 用，即有较强的抗肿瘤复发作用。这种作用具有特异性(只对同种肺瘤细 胞)。2)对荷瘤鼠的免疫治疗作用于小鼠右后肢皮下注射5xl()S个5-Fu处理后存活的CT26细胞第5 天将荷瘤鼠分成4组。分别注射上述4组制剂。3天1次，共4次。l周 后每组取3只鼠处死取脾，LDH释》文法测NK活性，51Cr释放法测CTL 活性。余5只检测瘤体大小并观察小鼠生存期。各组瘤苗免疫鼠的瘤体生 长(瘤苗抗瘤攻击作用)见图22,各组瘤苗免疫鼠瘤攻击后的生存(瘤 苗抗瘤攻击作用)见图23。结论所研究的瘤苗比较未修饰瘤苗，具有较强的对荷瘤鼠的治疗作 用，这种作用具有特异性(只对同种肿瘤细胞有作用)。序列表—ST25SEQUENCE LISTING<110〉常新，黄〈120〉 PolyLyse-HSP70融合蛋白膜修饰的肠癌细胞瘤苗及其制备方法<130〉<160> 11<170> Patentln version 3.4<210> 1<211> 34<212〉 DNA<213〉 Unknown<220〉<223〉人工序列 <400〉 1gccgcggcat ggccaaagcc gctgcagtcg gcat 34<210> 2<211〉 27<212>_ DNA<213> Unknown<220〉<223〉 人工序列<■〉 2cggtcgacat ctacctcctc aatggtg 27<210> 3<211> g08<212' DM''<213> Unknown〈220><223>人工序列 〈400〉 3ggaggtagat gccgcggcgg ccaagaagaa Mag33ga3g aags肪3aga agaagaag3a 60 gaaaa3g3ag aagsagasga agaagaagaa g33g33ga幼aagaagsaga agaagMgsa 120 g33gaag333 33g3agaaga agaagaagaa aa3gaag肪g肌g肪g3ag3 3gaaa肪g33 180 gaagaagaag aa.gaagaaga aggtcgac 208〈210> 4<211> 118<212> DNA<213> Unknown<220〉<223〉人工序列 <400> 4ggaggtagat gccgcggcgg cc3agaaga3 3aagaagaag aaga肪33ga agaagaag3a 60 gas3朋g38g 33gasgaag3 3g朋g朋g33 g33g朋g3a3 aagaageiaga 3gg肪ttc 118<210> 5<211> 102<212> DNA<213> Unknown<220〉<223〉人工序列序列表—ST25<400〉 5gaattcaag3 3gMgaag肪gaa肪agasg 33gasgMg3 3ga33ei3g33 g33gaagaag 60 33gaaga紛a sgasgaagas gaag朋g紛g Mgaaggtcg sc 102<210〉 6<211> 19<212〉 腿<213〉 Unknown<220〉<223>人工序列 <柳〉6ggtgctgatc caggtgtac 19<210〉 7<^1〉 20<212> 腿<213〉 Unknown〈220〉<223>人工序列<400> 7atctacctcc tcaatggtgg 20〈210〉 8<211> <212〉18 腿<213> Unknown <220〉〈223>人工序列 <400> 8ggaggtagat gccgcggc 18<210〉 9<211〉 25〈212> 脆〈213〉 Unknown<220><223〉人工序列<400> 9ccggaattcc ttcttcttct ttttc 25<210〉 10〈211〉 21<212〉 腿<213〉 Unknown〈220><223>人工序列<400> 10ccgctctaga actagtggat c 21<210> 11〈211> 20<212> DNA<213> Unk膽n<220><223〉人工序列序列表—ST25<400〉 11cgactcacta tagggcgaat 20
权利要求
1.一种聚赖氨酸-热休克蛋白70(PolyLyse-HSP70)融合蛋白膜修饰的肠癌细胞瘤苗，所述肠癌细胞瘤苗为跨膜表达PolyLyse-HSP70融合蛋白的CT26肠癌细胞，所述融合蛋白的PolyLyse端嵌入肠癌细胞细胞膜、HSP70端游离在肠癌细胞膜之外；所述PolyLyse为长度为60～100个多聚赖氨酸肽段。
2. 如权利要求1所述的肠癌细胞瘤苗，其特征在于所述PolyLyse为长度 为60个的多聚赖氨酸肽段。
3. 如权利要求2所述的肠癌细胞瘤苗，其特征在于所述PolyLyse肽段与 HSP70之间插入有3~5个丙氨酸。
4. 如权利要求1所述的肠癌细胞瘤苗，其特征在于所述肠癌细胞瘤苗为 跨膜表达PolyLyse-HSP70融合蛋白的CT26肠癌细胞的灭活细胞，所 述跨膜表达PolyLyse-HSP70融合蛋白的CT26肠癌细胞，保藏于中国 典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，430072,保藏曰期 2008年6月25日，保藏编号CCTCCNO: C200826。
5. 制备如权利要求1 3之一所述肠癌细胞瘤苗的方法，所述方法包括 以跨膜型融合基因修饰肠癌细胞，使肠癌细胞跨膜表达 PolyLyse-HSP70融合蛋白，所述融合蛋白的PolyLyse端嵌入肠癌细胞 细胞膜、HSP70端游离在肠癌细胞膜之外，筛选阳性克隆，灭活细胞， 得到所述肠癌细胞瘤苗。
6. 如权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法为以跨膜型融合基 因修饰肠癌细胞，使肠癌细胞跨膜表达PolyLyse-HSP70融合蛋白，所述融合蛋白的PolyLyse端嵌入肠癌细胞细胞膜、HSP70端游离在肠癌 细胞膜之外，筛选阳性克隆用化疗药模拟临床治疗进行处理，处理后 的存活的细胞用丝裂霉素灭活，得到所述肠癌细胞瘤苗。
7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于所述化疗药为氟尿嘧啶，用量 为0.01mg/mL细胞悬液。
8. 如权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法为克隆HSP70基因 的全长cDNA,将HSP70基因定向克隆接入真核表达载体pDisplay中， 得到膜表达载体pDisplay-HSP70，在载体pDisplay-HSP70中的HSP70 基因粘端连接编码4个丙氨酸和60个赖氨酸的DNA片段，得到融合 蛋白膜表达载体 pDisplay-mPolyLyse-HSP70 , 将载体 pDisplay-mPolyLyse-HSP70转染肠癌CT26细胞，G418筛选阳性克隆， 扩增后，以每毫升细胞悬液加入0.01mg5-Fu的量进朽-才莫拟临床化疗处 理，5-Fu处理后存活的CT26细胞以丝裂霉素灭活，得到所述肠癌细胞 瘤苗。
全文摘要
本发明提供了一种聚赖氨酸-热休克蛋白70(PolyLyse-HSP70)融合蛋白膜修饰的肠癌细胞瘤苗及其制备方法，所述肠癌细胞瘤苗为跨膜表达PolyLyse-HSP70融合蛋白的肠癌细胞，所述融合蛋白的PolyLyse端嵌入肠癌细胞细胞膜、HSP70端游离在肠癌细胞膜之外；所述PolyLyse为长度为60～100个多聚赖氨酸肽段。本发明所提供的新型肠癌瘤苗，提供了一种免疫原性更强、抗肿瘤效应更高的治疗肠癌的细胞型瘤苗，对化疗后转移或耐药的肠癌细胞更为有效，应用于预防和治疗结直肠癌，具有重大应用前景。
文档编号C12N15/85GK101402942SQ20081012193
公开日2009年4月8日 申请日期2008年10月23日 优先权日2008年10月23日
发明者黄常新 申请人:黄常新