专利名称：牙鲆弹状病毒的快速检测试剂盒及其检测方法
W TO^毒的鹏检测i叙(J叙微测方法
狱领域
本发明属于水产动物病原的检则技术，具体是一种OT环介导^U扩增技术对fi^W^毒进 行鹏翻啲试齐l戯微测方法。 背景狱
M^t^毒(Kramerhabdovinjs,简称HRV)病毒粒子呈枪弹形，大小为80nmX 160-180nm， 1986
年日本首 対随。我国黄海、激海近岸等土 1的^1平已|^:现有此病症。魏季节为^^和轉，鱼 体鍋时，7iC温一鹏陈15。C以下。本病^^害 ， AX^^真鲷、黑鲷有弓敬啲致病性，从香 鱼和无針触中也分离至i此病毒，对虹鳟也有致病作用。幼苗期和ff^期的鱼储患此病。 状病毒的病鱼体表和鳍^ 出血，腹部膨胀，内有H7jc。解剖鱼体，肌肉、J^i占膜的固有层出血，生 鄉泉的结缔组织^^ 出血。鉴于3^钙糊病毒的严魏害性，中国国家质fi&督检验mg、局与韩国
海洋7fo^于2005年发布的《中韩进出口活水生动t應验^a协议》中规定'我国出口到韩国的舻鱼、
真鲷、大魏、a^^fe^K、须ja行^f^病毒的检验^g，以防，^i^割专播is，给本国
的7K产辭IMidtfig损失。因此，迫切需要粒M、灵敏、黼的 ^毒的检测方法，？ 国外 技术壁垒，为国家贸易服务。
目前^J^毒的检测旅錄包W胞学诊断技术、免疫学诊断技术、針生物学诊断狱三大类。 细胞学诊断技术主要包括細细胞±§#分离病毒、组织滴理切片及电徵见察，其謝^5贞，检测周期长，
且灵iiS低；被学诊断技术主要包括免疫荧^IM、 ^S^杂交，其射去具有特异性强、鹏性高的 优点，但方法相当繁琐，不;Sl:对大量样品进行检测；^T生物学诊断技术主要包括聚合WII式反应 (PCR),比较十魏、灵敏，{践需要昂贵的PCR仪器，另夕卜需要琼月^ISg电泳，溴化乙,^^见察 结果，溴化乙锭^ 1，对人術阿鴻有危害，^X污染问题比琉^重。
环介导等温扩增(Loop"Mediated Isothermal Amplification,简称LAMP)技术，是一种,性高、特 异性强的耙DNA 'I^S樹则方法'不需要昂贵的仪器，样品中含有少量的病原^就能检出。环介导^T
增目前已Mn2i^于检则水产^r病原，如 ^毒(鱼1#血自毒、传染l^ftif^毒、传染性 微器官顿病毒、锦鱼—醜疹病毒)、舰病毒(舰白珍微鶴毒、黄彌毒)、细菌(迟顿德华
氏菌)等。据驗，目前尚未ja^环介导^r增s^对邪^wi^i行^^检测mt。
发明内容
本发明的目的^f共一种禾蹄环介导等,增技^i测W^IM毒的检测淑嗆，^阪见有技术 的不足'以满足5^汤即日^i(j的要求。
本发明的另一目的^H^这禾t^测i微J盒的樹则方法，以方便妇l:产辭lik和国际錢贸易中对牙 蜊靴病毒进行'鹏樹则中的鹏。
本发明的主要原理为lamp S^劍吏核MiS^^环境中的循环置ifeT增实S^,鹏放
大，从而超啦测的目的。基本lim^f对蝶因的6个区域，设计2滩异性引物，同时可以设计l-2
3条环引物以加快反应速度，利用一种链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bacillus stearolhermophilus DNA polymerase,简称BstDNA聚彌)，在直温65。C左右Si^勺lh。 BstDNA聚^SIt两娥性 一是具 有5'-3'聚彌活性，能在度温枕态下扩增DNA核酷二是Bst隐聚彌具有驢换活性，能将新合 成的核酸单^A人釈，的DNA双&hS爽取代)下来，形成两条3拉的^K单链以开启下一轮的DNA 核M^成，进而免去了敏^f增前的DNA变性环节。LAMP^3i程中， 一对引物的5'《tt有一段 与下tW增7^勿互补的序列，因此，您朽嫩的单f^t)E可形成一个类似桠铃状的回文離，这种结 构JF好为下一i^^置對广增aSJif共了一个可l鯛而S^佣^ifc B汰DNA聚^HS^链置换活 性，后阶iam火的引物置换前面引物所形成的链，从而保证了扩增的擀卖进行LAMPR^^成一系列不
同长度的具M环结构的DNA，，可以m荧光染料进fi^测。
本发明的技术方案如下
3Wt^毒的环介导等显扩增'l^i检测i錄[)盒，包括鄉^^、须的BstDNA聚铺、^ 、 反应缓冲液、环介导離扩增混合液、引物混合液和荧腿色剂，以及衞共一种鹏该湖纖测錢 样品中 # 毒的方法，以实S^寸M^M毒^^^测的标准化，为鱼IW^M毒的检测提 供一种鹏、简便人高效、实用的检测方法。
本发明的W TOi毒的环介导^^扩增fe)I樹则淑!j盒的配别口下
i叙i」A: BstDNA聚^H (8U/|oL);
湖B:逆$| (200U/pL);
淑i」C: S^Z缓冲液，BstDNA聚，Q)^^;gS作用所必须的物质，其中含有200 mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、 100 mmol/L氯化钾(KC1)、 100 mraol/L硫酸铵 ((NH4》S04)、 80mmol/L硫^t美(MgS04)禾口1W曲矛顿X-100 (TritonX-100);
试剂D:环介导^M扩增混合液，其中含有4.0nL2.5mmol/LdNTP、 2.0ML10moI/L甜魏、0.5pL 200U/mLRNA iWS挤胖P4-5^肝生物学^^^;
淑廿E:弓l物混合液,其中含有2 mL20 nmol/L正向内弓物、2 ^iL20 ^mol/L反向内弓|物、1 pL 5nmol/l 正向外引物、lpL5Mmol/L反向外引物、1[iL20Mmol/L正向环引物和lnL20Mmol/L反向环引物；其中引 物序列分别如下
正向内引物5'-TTGGCCCCCAAAGAACCCTGTnTGGGGGAATACGTCCACAAG -3'; 反向内引物5'- GAGATGAAACTGGCCCCCAGGTnTAGTACAGTGCTGAGGCTGT-3'; 正向外引物5'-GGGAACAATCTTGGGGACAT-3': 反向外引物5'-CATTGGCACCTTGGAGCT-3'; 正向环弓嫩5'- AACATGTGGTTCGGTAAAGGAC -3'; 反向环引物5'-GTGGGAGTGTATGACACCACG。
鄉F:荧3tM色剂，成分为膨的荧微料S豐GREEN I 。 翻雅鹏毒的环介导織广谱腿齒则试剂盒的检贝仿法如下 (1)待检样品的RNA的提取
用商业化的i^i」盒^t传统的方 SI取待检样品的RNA，用核M^析仪测定RNA，保证其OIWOD2so在1.7-2.0范围内，调整S^S 100-200ng4iL之间。
(2) 进行3^fBTO毒的环介导離扩增鹏
取一个0.2 mL的聚丙烯塑料管，力口入1-2 mL的步骤(1)提取的待泖脾品的RNA，再加入1 试 剂A， lpL试剂B， 25nL试剂C， 10.5-1 L5pL试剂D， 8mL拭剤E，使得ffi^、^R为25pL。其中引
物序列分别如下
正向内弓胸.-5'- TTGGCCCCCAAAGAACCCTGTnTGGGGGAATACGTCCACAAG -3'; 反向内引物5'-GAGATGAAACTGGCCCCCAGGTnTAGTACAGTGCTGAGGCTGT-3'; 正向外弓l物5'- GGGAACAArCTTGGGGACAT -3'; 反向外引物5'-CAITGGCACCT^GGAGCT-3,; 正向环弓l物5'- AACATGTGGTTCGGTAAAGGAC -3'; 反向环引物5'-GTGGGAGTGTATGACACCACG。
将战塑料管置于師。C的恒 滞呙中，艘翻min謝诉介导織扩增鹏；之后将水温 再调到80-95'C，鹏3-5min以终ihSiS，取出塑料管待检。
(3) 扩增 的鶴
在步骤(2)的待鹏料管中加入lMLi叙l」F，混合购，肉目歐见察^的Mfe。如果为^fe，则 判定待检样品含有 # 泰如果为跪'则判定待检样品不含有3^l^毒。
本发明te的，TOS毒的环介导^a扩增检测i叙iJ^S检测方法，可(M各种^^UM^、 大,、體、真鲷等样品进行'喊检测。
与现有^7WB比，本发明的有M^繊
第一，本发明不需要ft^的仪器，不需對 ^|〗，只需—亘定Mf赠,，能满足鹏5及日微 测的要求'操作简单简便。
第二，本发明包括DNA提取、环介导^T增自、产trft测3^i程，在不到3小时内即可完 成，检测时间短。
第三，本发明的扩增禾鎌可仅为10拷贝甚至更少，产量可超1」109-101()个拷贝，灵驗高。 第四，本发明扩增IC^列的六个区段，并Ji^A个区段的IKM有规定，因此具有高度特异性。 第五，本发明的LAMP的扩增7^tl可以与荧^^料结合，剛默见察就可以进4豫默啶，简鹏效。
TM结合具体鄉例对本发明i腿一步的详细说明，但不作为淋发明的限制。 鄉例l
按照下列配方制作牙辦W^毒的环介导離扩增鹏銜则试剂盒。 试剂A: l早BstDNA聚^H (8U/pL); 縱JB: 1.0nL逆^t^ (200U/|iL);
试剂C: 2.5pL ffi缓冲液，其中含有200mmol/LpH8.8的三l速甲基錢甲烷-盐酸(Tris-HCl)、 100讓ol/L氯化钾(KC1)、 100mmol/L硫M ((NH4)zS04)、 80mmol/L硫^l美(MgS04)和1%曲拉淑!JD:环介导^a扩增混合液'其中含有4.0nL2.5mmol/LdNTP、 20fjL10mol/L甜繊、0.5pL 200 U /jjLRNA WWffe脐诉口 4jjL ^生物^M^7jC，共计10.5 ^L;
微UE:引物混合液，其中含有2ML20MmoI/L正向内弓胸、2ML20nmo]/L反向内引物、1 nL5Mmol/L 正向外引物、lML5pmol/L反向夕卜引物、lnL20pmol/L正向环引物和1^L20pmol/L反向环引物；共计8
ML。其中引物序列分别如下
正向内引物5'- TTGGCCCCCAAAGAACCCTGTnTGGGGGAATACGTCCACAAG -3'; 反向内引物5'- GAGATGAAACTGGCCCCCAGGTTTTAGTACAGTGCTGAGGCTGT-3'; 正向外弓l物5'- GGGAACAATCTTGGGGACAT -3'; 反向外引物5'-CATTGGCACCTTGGAGCT-3'; 正向环引物5'-AACATGTGGTTCGGTAAAGGAC-3'; 反向环引物5'-GTGGGAGTGTATGACACCACG。
i微!jF: l.OML荧舰色剂，戯为100x的荧^^料SYBRGREENI。
按照以下辦进行检测
(1) 待检样品RNA的提恥 待检样品为某养殖场劍lM^W^^毒的ffl，体表和鳍 ，腹部膨胀，内有膨K
^ffi^fe生物:^呈公司的核^^^憶，按照说明书进行样品rna的提取。用核m^析仪测
^ff样品的RNA OEWOD2so为1.8， il^RNA、皿为100ng/nL。
(2) 謝亍胸TOi毒的环介导繊广增鹏
首先取一个02mL的聚丙烯塑料管，加入步骤(1)提取的3^样品的RNA2,0nL，再加入lnL试 剂A， lnL试剂B, 2.5nLi凝!]C， 10.5nLi叙!jD， 8nL试剂E，使得感&#^只为25^iL。
将战塑料管置于60，亘 辦呙中，體40min謝两介导等尉广增鹏；之后餘條 § 再调到80'C，放置5min以终止g，取出含扩增;^的塑料管待检。
(3) 扩增,的銜则
在步骤(2)的待检的塑料管中加入lpL翻F，混合均匀，肉隱察，的鹏o a^t/鹏 为^fe，据此判定该待检样品ffl中含有W Wi毒。 鄉例2
按照下歹鹏己方制作W3TO^毒的环介导^T增鹏翻脇蠄。 微lj A、试剂B、试剂c、淑y E同^M例1 。
微UD:环介导^T增混合液，其中含有4,0ML2.5mmol/LdNTP、 2.0nL10mol/L甜魏、0.5mL 200U4iLRNA ,制剂、5pL好生物学M^7jC;共计11单。 湖E:同实施例l。 按照以下禾聘进行检测 (1)样品RNA的提取
样品为i^国进口的大^i平样品，夕卜观正常。
6禾佣传统的恵OL别St行大^l 样品的RNA的提取，参照好克隆实验指南(第二版)。具体 步骤为取50mg大魏脑、肾、脾等组织进行匀浆，力口入600inLTRIZOL^m，颠倒混勻，再加入200 ^iL氯仿，混匀器上震荡混匀5sec。于4'C 12000 ipm离心15min。吸^Lt清液500nL，加入400^异丙 醇，-20"放置30併中。12000 ipm离心15min，倒去上清；然后加入600^L75。/。乙醇，洗涤沉淀，于12000 ipm离心5min，轻招到去上清。将RNA沉^S温千燥3min后，力口入20iaL7K，雜混匀，溶解管HJ: 的RNA。 2000ipm离心5sec，在冰上保#&用。用核酸分析仪测定大^fF样品的RNA OEWOD^为 2.0，调整RNA浓度为100ng/VL。
(2) 进行溯WS毒的环介导離扩增破
取—0.2 mL的聚丙烯塑料管，力口A^骤(1)提取的大^f样品的RNA 1.0 ^L，再加入1 pL试剂 A， lpL试剂B， 2.5jjL淑!JC， 11.5ML试剂d， 8tiL淑!jE，使得鹏^#|只为25&。
将战塑料管置于63。C的度&K鹏中，方爐60min进《诉介导織广增鹏；之后将水辦鹏 再调到85"，方燈3min以终ihSi5Z，取出塑料管待检。
(3) 扩增，的翻!l
在步骤(2)的待1^料管中力nA 1& i微U F，混合均匀，肉目歐见察rt的Mfe。 Si^t/M为 fe,据此判定待检样品大，中不含有牙解TOi毒。 鄉例3
按照同实施例2的配方制作ffi^WS毒的环介导^^扩增l^i樹则i凝!J盒。 按照以下辦进行检测
(1) 样品RNA的提取 样品为某難场采集的跳外观正常。
取50mgl^fl^且织，样品的RNA6^J^取方法同^M例2。用核酸分析仪测定舻鱼样品的RNA OEWOD280为1.8，调整RNA,为100n^nL。
(2) 逝節,病毒的环介导離扩增鹏
取一个0.2mL的聚丙烯塑料管，加入步骤(1)提取的IS^样品的RNA1.0^L'其它 &分同实 施例2。
将J^塑料管置于65。C的恒&[KM中，體50min进fi^介导^f增aS;之后将水滞驢 度再调到82'C， ，3min以终lhSiS，取出塑料管待检。
(3) 扩增^的樹则
在步骤(2)的待检塑料管中力RA 1mL Wfl」F，混合i^J，肉目歐见察j^的颜色。Si^tl^为
鹏，据鹏定待检样品舻鱼中不含有ffi3TOi毒。核苷酸序列表
<110>山东出入^t验l&S^检验1t3Mi术中心 <120> 3^M毒的'腿检测湖叙離则旅 <160> 6
〈10> 1 〈11> 43 <212> DNA <213> AI)^列 <220>
<221> primer—bind <222> (1)…(43)
<223>根据环介导等显扩增鹏要求设计，用于扩增^fRWi毒的正向内引物。 <400> 1
ttggccccca aagaaccctg ttttggggga atacgtccac aag 43
<210> 2 ，> 44 <212> DNA <213> AW列 <220>
<221> primer—bind <222> (1)…(44)
<223> 环介导 _扩增^^要求设计，用于扩增3^K病毒的反向内引物。 <400> 2
gagatgaaac tggcccccag gttttagtac agtgctg鄉 ctgt 44
<210> 3
<211> 20
<212> D風
<213> AI序列 〈20><221> primer—bind
〈23>根据环介导^a扩增^giS要求设计，用于扩增W5W^毒的正向外引物。 <400> 3
鹏aacaate t^gggacat 20
<210> 4
《1> 18
<212> DNA
《3> AX/^列 <220>
《22> (1)...(18)
〈23> 根据环介导諧i增S^要求设计，用于扩增3^1^i毒的反向外引物。
400> 4
cattggcacc ttggagct
《10> 5 <211> 22 《2> DNA <213> AI)^列 <220>
<221> primer一bind <222> (1)…(22)
〈23>根据环介导離扩增鹏要求设计，
<400> 5
aacalgtggt toggtaaagg ac
<210> 6 dl> 21 <212> DNA <213> AXi^列
18
用于扩增^# 毒的正向环弓物。 22<220>
<221> primer_bind <222> (1)…(21)
<223>鹏环介导等^f增鹏要求设计，用于扩增雅l^毒的反向环引物。 <400> 6
gtgggagtgt atgacacca cg 2权利要求
1. 一种牙鲆弹状病毒的快速检测试剂盒，其特征在于试剂盒中包括试剂A-F试剂ABst DNA聚合酶，8U/μL；试剂B逆转录酶，200U/μL；试剂C反应缓冲液，其中含有200mmol/LpH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、80mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；试剂D环介导等温扩增混合液，其中含有4.0μL 2.5mmol/L dNTP、2.0μL 10mol/L甜菜碱、0.5μL200U/μL RNA酶抑制剂和4-5μL分子生物学级超纯水；试剂E引物混合液，其中含有2μL 20μmol/L正向内引物、2μL 20μmol/L反向内引物、1μL 5μmol/L正向外引物、1μL 5μmol/L反向外引物、1μL 20μmol/L正向环引物、1μL 20μmol/L反向环引物；其中引物序列分别如下正向内引物5′-TTGGCCCCCAAAGAACCCTGTTTTGGGGGAATACGTCCACAAG-3′；反向内引物5′-GAGATGAAACTGGCCCCCAGGTTTTAGTACAGTGCTGAGGCTGT-3′；正向外引物5′-GGGAACAATCTTGGGGACAT-3′；反向外引物5′-CATTGGCACCTTGGAGCT-3′；正向环引物5′-AACATGTGGTTCGGTAAAGGAC-3′；反向环引物5′-GTGGGAGTGTATGACACCACG-3′。试剂F荧光显色剂，成分为100×的荧光染料SYBR GREEN I。
2.利用权利要求l中戶湖的^I检测微^S行ffl^病毒的检测方法，^mE在于检测禾im如下(1) 待检样品的RNA的提取提取待检样品的RNA，保证RNAOIWOD28o在1.8-2.0范围内，调整浓鹏100"200ng/nL之间；(2) 进行糊TOt毒的环々导^^增鹏首先取一个0.2 mL的聚丙烯塑料管，力口入1-2 mL的步骤(1)提取的待测样品的RNA，再加入1 i叙UA， lpL试剂B， 2.5ML试剂C， 10.5-11.5nL淑!jD， 8ML试剂E，使得ffig、ftf只为25ML。然后 将J^fe塑料管置于60-65。C的ll^7K辦呙中，總40"60min;之后将7乂温再调到80-95。C，艘3-5min以终JLbR应，取出含扩增 ^J的塑料管待检。(3) 扩增;^的检测在步骤(2)的待检塑料管中加入lpL试剂F，混合均匀，肉目歐il察，的Mfe，如果为纟絶，则 判定待检样品含有牙^^毒；如果为gfe，贝鹏定待检样品不含有3^fBTO^毒。
全文摘要
本发明公开一种牙鲆弹状病毒的快速检测试剂盒及其检测方法。本发明包括由Bst DNA聚合酶、逆转录酶、反应缓冲液、环介导等温扩增混合液、引物混合液和荧光显色剂共6种试剂组成的试剂盒，以及使用该试剂盒检测鱼类样品中牙鲆弹状病毒的一套检测操作程序，以实现对牙鲆弹状病毒快速检测的标准化，为鱼类的健康养殖和国际鱼类贸易的发展提供科学依据。本发明具有特异性好、灵敏度高、操作简便、高效等优点，可广泛的应用于水产养殖场以及进出口鱼类贸易中的现场即时检测，并可以为相关基础研究提供技术支持，具有广泛应用前景。
文档编号C12Q1/70GK101445835SQ20081016060
公开日2009年6月3日 申请日期2008年11月19日 优先权日2008年11月19日
发明者凌宗帅, 荭 刘, 卢体康, 涛 孙, 孙颖杰, 岳志芹, 彪 徐, 朱来华, 叶 李, 琼 李, 梁成珠, 辛学谦 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心