专利名称：添加促进剂提高灰绿霉素a产量的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高灰绿霉素A产量的方法，特别是通过单独添加或者混 合添加促进剂实现灰绿霉素A产量提高的方法。属于代谢调控优化发酵过程技 术领域。
背景技术：
灰绿霉素A是中国海洋大学从海洋真菌灰绿曲霉(Asper^'W^^朋c^) HB1-19 (保藏日期2006.3.20，中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 206022)中分离出来的一种具有自主知识产权的、结构全新的具有抗癌活 性蒽酮内酯化合物，灰绿霉素A以9-蒽酮为母核，分子中C-10与C-4形成 六元内酯环。经中科院上海药物所评价，其对人肺癌A549细胞、人白血病 HL60细胞有较强的增殖抑制作用，其ICs(,分别为0. 13和0. 28 u M，有良好 的医药价值和开发应用前景。目前尚未有通过促进剂提高该新型9-蒽酮内酯 类化合物的报道。然而在灰绿曲霉"spe^"i77"s W加ciAs) HB1-19进行发酵培养时，灰绿 霉素A的产量比较低(< 15 mg/L)，这就给进一步的动物体内外活性评价及 药代药动等药理学研究带来困难，而通过规模化发酵及代谢调控研究提高灰 绿霉素A的产量可以有效的解决该问题。本发明旨在通过添加促进剂来对该菌 的代谢进行调控以实现灰绿霉素A产量的提高，为后续的大规模发酵以及将灰 绿霉素A开发为新药奠定基础。发明内容本发明的所要解决的技术问题在于克服灰绿霉素A发酵产量低的缺陷，提 供一种通过添加促进剂提高灰绿霉素A产量的方法。 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下一种通过添加促进剂提高灰绿霉素A产量的方法，其特征是利用海洋丝 状真菌灰绿曲霉HB1-19 CCTCC M 206022为生产菌株，在发酵培养基中单独 或混合添加辛伐他汀、邻苯二甲酸、柠檬酸或短链脂肪酸作为促进剂。上述促进剂的添加的初始时间为30小时一60小时。在发酵过程中添加的促进剂为辛伐他汀，初始添加时间为30小时，添加 方式为每隔24小时添加一次0.05-0.2mM辛伐他汀，连续加2-4次，使其最 终浓度达0. 1-0. 8 mM。在发酵过程中添加的促进剂为邻苯二甲酸，初始添加时间为30小时，添 加方式为每隔24小时添加一次2-6mM邻苯二甲酸，连续加2-4次，使其最终 浓度达4-24 mM。在发酵过程中添加的促进剂为柠檬酸，初始添加时间为30小时，添加方 式为每隔24小时添加一次2-6 raM柠檬酸，连续加2-4次，使其最终浓度达 4-24 mM。在发酵过程中添加的促进剂为乙酸，初始添加时间为60小时，添加方式 为每隔24小时添加一次l-3mM乙酸，连续加2-4次，使其最终浓度达2-12 mMo在发酵过程中添加的促进剂为丙二酸，初始添加时间为60小时，添加方 式为每隔24小时添加一次l-3 mM丙二酸，连续加2-4次，使其最终浓度达 2-12 mM。在发酵过程中添加的促进剂为丙酸，初始添加时间为60小时，添加方式 为每隔24小时添加一次2-6mM丙酸，连续加2-4次，使其最终浓度达4_24 mM。在发酵过程中添加的促进剂为乙酸与丙二酸，初始添加时间为48小时， 添加方式为每隔24小时添加一次0. 5-1. 5 mM乙酸与0. 5-1. 5 mM丙二酸混 合物，连续加2-4次，使其最终浓度分别为l-6 mM。在发酵过程中添加的促进剂为乙酸与丙酸，初始添加时间为48小时，添 加方式为每隔24小时添加一次1-3 mM乙酸与0. 5-1. 5 mM丙酸混合物，连 续加2-4次，使其最终浓度分别为2-12mM及1-6mM。在发酵过程中添加的促进剂为乙酸、丙二酸和丙酸，初始添加时间为48小时，添加方式为每隔24小时添加一次1-3 mM乙酸与0. 5-1. 5 mM丙二酸和 0. 5-1. 5 mM丙酸混合物，连续加2-4次，使其最终浓度分别为2-12mM， l-6mM， l-6mM。在发酵过程中添加的促进剂为乙酸与拧檬酸，初始添加时间为48小时，， 开始在发酵培养基中每隔24小时添加一次1-3 mM乙酸与2-6 mM拧檬酸混 合物，连续加2-4次，使其最终浓度分别为2-12 mM与4-24 mM。在发酵过程中添加的促进剂为乙酸与辛伐他汀，初始添加时间为48小 时，开始在发酵培养基中每隔24小时添加一次1-3 mM乙酸与0.05-0.2 mM 辛伐他汀混合物，连续加2-4次，使其最终浓度分别为2-12mM与0. 1-0. 8 mM。在发酵过程中添加的促进剂为乙酸与邻苯二甲酸，初始添加时间为48 小时，开始在发酵培养基中每隔24小时添加一次1-3 mM乙酸与2-6mM邻苯 二甲酸混合物，连续加2-4次，使其最终浓度分别为2-12mM与4-24mM。1 菌株灰绿曲霉HB1-19 (Aspergillosis glaucus HB1-19)(保藏编号是CCTCC M 206022)，由中国海洋大学提供。 2培养基固体种子培养基甘薯粉50 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g， K跳2. 5 g, MgS04 7H201.5 g，溶解于1L人工海水中。发酵培养基组成(g/l):麦芽糖20. 0，甘露醇20. 0，味精10. 0， KH2P04 0.5， MgS04 0. 3，酵母膏3.0，酵母粉3.0，加人工海水至1000 ml, pH6. 5。 其中人工海水配方NaCl， 24. 5g; MgCl2 6H20， 4. 98 g; NaS04， 3. 92 g; MgS04*7H20， 3.0 g; CaCl2*2H20 (无水CaCl2)， 1.60 g (1.20 g); KC1 ， 0.664 g; NaHC03， 0.192 g; KBr， 0.096 g; H3B03， 0.026 g; NaF， 0.0039 g;加蒸馏水至1000ml 。 3培养方法用无菌水将固体斜面培养4-5d的灰绿曲霉HB1-19的孢子洗下，制成孢 子悬浮液，接种到装有50 ml培养液的250ml锥型摇瓶中，接种密度约为3 6 Xl()7孢子/ml，在28 °C、 165 rpm条件下摇床培养约40 h后，再以15 %接 种量接种至250 ml的发酵培养基中(装液量50ml)，在28 °C、 170rpm条件下摇床培养约7 d。当培养进行到30—60h时，开始根据具体情况添加不 同浓度的各促进剂，但其添加方式都是每隔24h添加一次，共添加3次。然 后再培养约2天，收获菌体进行后续的提取分析。 4分析方法(1) 生物量的测定采用干重法测定菌体量。将发酵液用滤纸过滤后，再用去离子水洗涤过 滤后烘干至恒重。(2) 灰绿霉素A的分离粗提取。摇瓶发酵结束后，吸取发酵液20 ml加入到有适量玻璃珠的250 ml三角 瓶中并与等体积的乙酸乙酯萃取，汲取上层有机相萃取液减压蒸馏浓縮后， 用4 ml甲醇溶解后用RP-HPLC检测灰绿霉素A。(3) 灰绿霉素A的含量测定用HP 1100液相色谱仪，Kramasil C18 反相柱(250x4.6mm， 5 jim)，温度30 °C，进样量10pl，检测波长为304 nm， 流速lml/min，流动相为纯水乙睛=1: 1，然后在0~30 min用流动相洗脱。 进样分析前先将甲醇溶解液稀释5倍，再进行RP-HPLC分析，含量根据色谱 峰面积与标准品的峰面积对比以及浓縮倍数计算。本发明利用海洋丝状真菌灰绿曲霉HB1-19 (A Wa"c"sHB1-19)保藏编 号CCTCC M 206022为生产菌株，于菌体对数生长期在发酵培养基中添加辛伐 他汀、邻苯二甲酸、柠檬酸或短链脂肪酸来促进生产灰绿霉素A的产量提高。 最终产量可达到36.2mg/L，是原始水平的2.84倍；该发明对于海洋真菌灰绿 曲霉HB1-19 ( Aspergillus glaucus HB1-19)发酵研究及灰绿霉素A药理药 效学研究具有重要意义。
图1辛伐他汀对灰绿霉素A合成及菌体生长的影响； 图2邻苯二甲酸对灰绿霉素A合成及菌体生长的影响； 图3柠檬酸对灰绿霉素A合成及菌体生长的影响； 图4添加乙酸对灰绿霉素A合成及菌体生长的影响； 图5添加丙二酸对灰绿霉素A合成及菌体生长的影响；图6添加丙酸对灰绿霉素A合成及菌体生长的影响；图7短链脂肪酸组合添加对灰绿霉素A合成及菌体生长的影响；图8乙酸与辛伐他汀、邻苯二甲酸和拧檬酸组合添加对灰绿霉素A合成及菌体生长的影响灰绿曲霉HB1-19 Us; erg7'iA/s^ai/c"s)保藏日期2006. 3. 20，中国典 型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20602具体实施方式
实施例l辛伐他汀对灰绿霉素A合成及菌体生长的影响如图1所示，通过添加O. 15mM、 0.3mM、 0. 45 mM终浓度的辛伐他汀，考 察其对灰绿霉素A合成以及灰绿曲霉菌体生长的影响。结果发现终浓度为3 mM 的辛伐他汀对灰绿霉素A的生物合成促进作用最大，可使其产量达到20. 8 mg/L，比没有任何添加物的对照组提高了63 %。该物质的添加对灰绿曲霉 朋1-19的菌体生长几乎没有什么影响。根据少量多次的原则以及实际实验确 定辛伐他汀的最佳添加方式为每隔24 h添加一次O. 1 mM辛伐他汀，共添加3 次(即连续添加3d)，最终浓度0.3mM，初始添加时间为30 h。 实施例2邻苯二甲酸对灰绿霉素A合成及菌体生长的影响如图2所示，添加不同终浓度为6mM、 12mM及24mM的邻苯二甲酸，其灰 绿霉素A的产量分别为对照(没有添加物)的l. 12倍、1.59倍和1.55倍。其中 12 mM的邻苯二甲酸可使得灰绿霉素A的产量达20. 2 mg/L，比没有任何添加物 的对照组提高了59%。邻苯二甲酸的添加对灰绿曲霉HB1-19的菌体生长也没有什么影响。根据少量多次的原则以及实际实验本发明人确定邻苯二甲酸的 最佳添加方式为每隔24 h添加一次4 mM邻苯二甲酸，共连续添加3次，最终 浓度12mM，初始添加时间为30 h。实施例3添加柠檬酸对灰绿霉素A合成及菌体生长的影响如图3所示，添加柠檬酸的促进作用更为明显，其中分3次添加终浓度为 12mM的柠檬酸可使得灰绿霉素A的产量提高至对照(没有任何添加物)的2. 79 倍，产量达35.5mg/L。柠檬酸的添加对灰绿曲霉HB1-19的菌体生长也没有什 么影响。根据少量多次的原则以及实际实验确定柠檬酸的最佳添加方式为每隔24h添加一次4mM柠檬酸，共连续添加3次，最终浓度12mM，初始添加时间为灰绿曲霉HB1-19发酵到30 h。实施例4乙酸添加对灰绿霉素A合成及菌体生长的影响实验过程中首先初步考察了乙酸添加对灰绿霉素A产量的影响，发现随 着所添加乙酸浓度的提高(终浓度从3mM至12mM)，灰绿曲霉的产量也有所 提高，从最初的4. lmg/L提高至20. 9mg/L。随后按照最优添加乙酸的量(6 mM)以少量多次的原则考察了乙酸添加对 灰绿霉素A产量的影响，发现分3次添加终浓度6mM的乙酸添加浓度对提高灰绿 霉素A产量效果最好，可使对灰绿霉素A的产量达到30.0mg/L，比没有任何添 加物的对照组提高了135% (如图4所示)。 一次性加入6mM，非但对灰绿霉素A 的产量无促进作用，反而使其产量减少为对照的78%，根据以上实验确定乙酸 的最佳添加方式为每隔24h添加一次2mM乙酸，共连续添加3次，最终浓度6 mM，初始添加时间为该菌发酵进行到60 h。 实施例5丙二酸的添加对灰绿霉素A合成及菌体生长的影响如图5所示，本发明人又考察了丙二酸的添加对灰绿霉素A产量的作用效 果，其中的最优添加方式可使灰绿霉素A产量达到24.9 mg/L，为没有任何添 加物的对照组的1.95倍。添加丙二酸时对灰绿曲霉的生长没有影响。根据少 量多次的原则以及实验确定丙二酸盐的最佳添加方式为每隔24 h添加一次2 mM丙二酸，共连续添加3次，最终浓度6 mM,初始添加时间为灰绿曲霉 HB1-19培养至60 h。实施例6丙酸添加对灰绿霉素A合成及菌体生长的影响如图6所示，考察了丙酸的添加对灰绿霉素A产量的作用效果，当发酵60 h 时，在发酵培养基中每隔24h添加一次4mM丙酸，连续加3d，使其最终浓度 达12mM时，灰绿霉素A产量达到19.9 mg/L，比没有任何添加物的对照组提高 了56%。添加丙酸时对灰绿曲霉的生长也没有影响。根据本发明人的实验情况 确定丙酸的最佳添加方式为每隔24h添加一次4mM丙酸，共连续添加3次，最 终浓度12mM,初始添加时间为该菌发酵进行到60h。 实施例7短链脂肪酸的组合添加对灰绿霉素A合成及菌体生长的影响如图7所示，几种短链脂肪酸盐的组合添加效果则更明显，而且添加这些短链脂肪酸盐对灰绿曲霉的生长状况也基本没有影响。其中组合添加乙酸与丙二酸混合物时，灰绿霉素A产量达到26. 6mg/L，比没有任何添加物的对照组 提高了109%。根据本发明人的实验操作条件确定组合添加乙酸与丙二酸的最 佳方式为每隔24h添加一次lmM乙酸与lmM丙二酸混合物，连续添加3次，最终 浓度分别为3mM，初始添加时间为该菌发酵进行到48h。此实施例中，组合添加乙酸与丙酸混合物时，灰绿霉素A产量达到 26.0mg/L,比没有任何添加物的对照组提高了104%。由实验操作条件确定组 合添加乙酸与丙酸的最佳方式为每隔24 h添加一次2mM乙酸与l mM丙二酸混 合物，连续添加3次，最终浓度分别为6 mM和3 mM,初始添加时间为该菌发酵 进行到48h。另外如图7所示，组合添加乙酸、丙二酸和丙酸混合物时，灰绿霉素A产 量达到24.8mg/L，比没有任何添加物的对照提高了95%。由实验操作条件确 定组合添加乙酸、丙二酸和丙酸混合物的最佳方式为每隔24 h添加一次2mM 乙酸、lmM丙二酸与lmM丙酸混合物，连续添加3次，最终浓度分别为6mM、 3mM 和3mM，初始添加时间为该菌发酵进行到48h。实施例8乙酸与与辛伐他汀、邻苯二甲酸和柠檬酸组合添加对灰绿霉素A合 成及菌体生长的影响乙酸作为灰绿霉素A的前体物质，提高了灰绿霉素A的合成效率，提高 了灰绿霉素A的产量;其它类促进剂的添加也有效促进了灰绿霉素A的合成。 如图8所示，当混合添加乙酸与辛伐他汀时，最优效果使灰绿霉素A产量达 到18.6mg/L，比没有任何添加物的对照提高了 46 %。由实验实际操作条件 确定组合添加乙酸与辛伐他汀的最佳方式为每隔24 h添加一次2 mM乙酸与 0.1 mM辛伐他汀混合物，共连续添加3次，最终浓度分别为6 raM与0.3mM， 初始添加时间为48 h。而当混合添加乙酸与邻苯二甲酸酸时，最优效果使灰绿霉素A产量达到 20.8 mg/L，比没有任何添加物的对照提高了 63 %。由实验实际操作条件确 定组合添加乙酸与邻苯二甲酸的最佳方式为每隔24 h添加一次2 mM乙酸与 4 mM邻苯二甲酸混合物，共连续添加3次，最终浓度分别为6 mM与12 mM， 初始添加时间为48 h。如图8所示，当混合添加乙酸与柠檬酸时，所得到的促进效果最佳，可 使灰绿霉素A产量达到36.2 mg/L，比没有任何添加物的对照提高了 184 %。 由实验实际操作条件确定组合添加乙酸与柠檬酸的最佳方式为每隔24h添加 一次2 mM乙酸与4 mM柠檬酸混合物，共连续添加3次，最终浓度分别为6 mM 与12 mM，初始添加时间为48 h。
权利要求
1、一种通过添加促进剂提高灰绿霉素A产量的方法，其特征是利用海洋丝状真菌灰绿曲霉HB1-19CCTCC M 206022为生产菌株，在发酵培养基中单独或混合添加辛伐他汀、邻苯二甲酸、柠檬酸或短链脂肪酸作为促进剂。
2、 根据权利要求l所述的方法，其特征是所述的促进剂的添加的初始 时间为30小时一60小时。
3、 根据权利要求l所述的方法，其特征是在发酵过程中添加的促进剂 为辛伐他汀，初始添加时间为30小时，添加方式为每隔24小时添加一次 0.05-0.2 mM辛伐他汀，连续加2-4次，使其最终浓度达O. 1-0. 8 raM。
4、 根据权利要求l所述的方法，其特征是在发酵过程中添加的促进剂 为邻苯二甲酸，初始添加时间为30小时，添加方式为每隔24小时添加一次 2-6mM邻苯二甲酸，连续加2-4次，使其最终浓度达4-24 mM。
5、 根据权利要求l所述的方法，其特征是在发酵过程中添加的促进剂 为拧檬酸，初始添加时间为30小时，添加方式为每隔24小时添加一次2-6mM 柠檬酸，连续加2-4次，使其最终浓度达4-24 mM。
6、 根据权利要求l所述的方法，其特征是在发酵过程中添加的促进剂 为丙二酸，初始添加时间为60小时，添加方式为每隔24小时添加一次l-3 mM 丙二酸，连续加2-4次，使其最终浓度达2-12 mM。
7、 根据权利要求l所述的方法，其特征是在发酵过程中添加的促进剂 为乙酸、丙二酸和丙酸，初始添加时间为48小时，添加方式为每隔24小时添 加一次l-3 mM乙酸与O. 5-1.5 mM丙二酸和O. 5-1. 5 mM丙酸，连续加2-4次， 使其最终浓度分别为2-12mM, 1-6mM， 1-6mM。
8、 据权利要求l所述的方法，其特征是在发酵过程中添加的促进剂为 乙酸与辛伐他汀，初始添加时间为48小时，，开始在发酵培养基中每隔24小 时添加一次1-3mM乙酸与0.05-0.2mM辛伐他汀混合物，连续加2-4次，使其 最终浓度分别为2-12mM与0.1-0. 8mM。
9、 根据权利要求l所述的方法，其特征是在发酵过程中添加的促进剂 为乙酸与邻苯二甲酸，初始添加时间为48小时，开始在发酵培养基中每隔24小时添加一次l-3mM乙酸与2-6mM邻苯二甲酸混合物，连续加2-4次，使其最 终浓度分别为2-12 mM与4-24 mM。
10、根据权利要求l所述的方法，其特征是在发酵过程中添加的促进剂 为乙酸与柠檬酸，初始添加时间为48小时，开始在发酵培养基中每隔24小时 添加一次l-3mM乙酸与2-6mM拧檬酸酸混合物，连续加2-4次，使其最终浓度 分别为2-12 mM与4-24 mM。
全文摘要
一种通过添加促进剂提高灰绿霉素A产量的方法，属于代谢调控优化发酵过程技术领域。本发明是利用海洋丝状真菌灰绿曲霉HB1-19(Aspergillus glaucus HB1-19)CCTCC M 206022为生产菌株，通过在发酵培养基中单独添加辛伐他汀、邻苯二甲酸、柠檬酸或添加短链脂肪酸如乙酸、丙酸、丙二酸作为促进剂，或混合添加以上促进剂，来促进生产灰绿霉素A的合成效率。最终产量可达到36.2mg/l，是原始水平的2.84倍。该发明对于灰绿霉素A的药理药效学研究具有重要意义。
文档编号C12R1/66GK101402980SQ200810202518
公开日2009年4月8日 申请日期2008年11月11日 优先权日2008年11月11日
发明者周祥山, 孙学谦, 张元兴, 蔡孟浩, 陶可敬 申请人:华东理工大学