嵌合的新城疫病毒vlp的制作方法

专利名称：嵌合的新城疫病毒vlp的制作方法
嵌合的新城疫病毒VLP 相关申请本申请要求2007年2月21日提交的美国申请60/902，337的优先权，本文通 过提及而收录其全部内容用于所有目的。发明背景接种是基于一项简单的免疫原理 一旦暴露于传染原(infectious agent)， 动物便启动免疫防御，其能提供针对由同一媒介物(agent)所引起的疾病的终 身保护。接种的目标是诱导动物在感染之前启动防御。按照惯例，这已经经 由使用活体减毒或完全灭活形式的传染原作为免疫原而实现。这些方法的成 功取决于天然抗原的呈递，其可引发天然感染中获得的整个系列的免疫应 答。尽管它们相当地成功，但是常规的疫苗方法受到许多潜在的限制。灭活 不充分的疫苗可能引起它们被设计来预防的疾病。减毒林可以突变成更具毒 性或非免疫原性。另外，特别担忧能建立潜伏期的病毒，诸如疱疹病毒，因 为不知道减毒抹的潜伏性感染是否有任何长期的负面后果。最后，缺乏培养 许多类型的病毒的有效手段。重组DNA技术的进展提供了基于使用确定的抗原作为免疫原，而不是完 整传染原来开发疫苗的潜力。这些包括肽疫苗，其由化学合成的、免疫反应 性表位组成；亚基疫苗，其通过在重组异源细胞中表达病毒蛋白而生成；和 活病毒载体用于呈递一种或多种确定抗原的使用。肽和亚基疫苗都受到许多潜在的限制。主要的问题在于难以确保工程化 蛋白质的构象模拟抗原在其天然环境中的构象。必须使用合适的佐剂和(在 肽的情况中)载体蛋白来加强免疫应答。另外，这些疫苗主要引发体液应答， 如此可能不能引起有效的免疫。亚基疫苗对于其中可证明是由完全灭活病毒 提供保护的疾病通常是无效的。病毒样颗粒(virus like particle; VLP)极类似成熟的病毒体，但是它们不含 病毒基因组物质(例如病毒基因组RNA)。因此，VLP实质上是非复制性的，这使它们安全用于以免疫原性组合物(例如疫苗)形式施用。另外，VLP可以进行工程化改造以在其最天然的生理学构型的VLP表面上表达病毒包膜糖 蛋白。此外，因为VLP类似完整的病毒体而且是多价的颗粒结构，所以VLP 可能比可溶性包膜蛋白抗原更有效地诱导针对包膜糖蛋白的中和性抗体。进 一步，不像许多重组疫苗方法，VLP可以安全而重复地给所接种的宿主施用。许多有包膜RNA病毒的基质样蛋白质在病毒装配和释放中发挥枢要的 作用(Pornillos等(2002) Trends Cell Biol.， 12， 569-579)。这些蛋白质通常足够 用于释放颗粒。例如，逆转录病毒Gag前体蛋白在没有其它病毒成分的情况 下的表达导致Gag病毒样颗粒的装配和释放(Delchambre等(1989) EMBO J. 8,2653-2660)。来自依波拉病毒(Ebola virus)、疱渗性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)、和流感病毒的基质蛋白在单独表达时以VLP释方文(Jasenosky 等(2004) Virus Res. 106， 181-188; Jayakar等Vims Res. 106, 117-132; Gomez-Puertas等J. Virol. 74, 11538-11547)。单独表达的人副流感病毒l型 (PIV1)和仙台病毒(Sendai virus, SV) M蛋白诱导VLP的释放(Coronel等(1999) J. Virol. 73， 7035-7038; Sakaguchi等Virology 263， 230-243)。猿猴病毒5 VLP (SV5)形成也需要M蛋白的表达(Schmitt等(2002) J. Virol. 76， 3952-3964),尽 管还可能需要其它蛋白质。新城疫病毒(Newcastle disease virus) M蛋白在宿主细胞中表达时诱导 VLP的形成和释放(Pantua等(2006) J. Virol, 80, 11062-11073)。发明人利用了 NDVM蛋白的特性，并已经设计了新型VLP、抗原性配制剂和疫苗以帮助预 防、治疗、控制(manage)和/或改善脊推动物中的传染病。发明概述本发明包含嵌合病毒样颗粒(VLP),其包含新城疫病毒(NDV)核心蛋白 (M)和至少一种来自不同传染原的蛋白质。在一个实施方案中，所述来自传 染原的蛋白质是病毒蛋白。在另 一个实施方案中，所述病毒蛋白是包膜结合蛋白(envelope associated protein)。在另一个实施方案中，包膜结合蛋白在所述VLP的表面 上表达。在另一个实施方案中，所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白 包含与副流感病毒(PIV)蛋白融合的所述来自不同传染原的蛋白质。在另 一个 实施方案中，所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含与NDV蛋白融合的所述病毒蛋白。
本发明还包括一种生成嵌合的VLP的方法，其包括转染编码新城疫病毒 (NDV)核心蛋白(M)和至少 一种来自不同传染原的蛋白质的载体，并在容许 VLP形成的条件下表达所述载体。在一个实施方案中，所述来自传染原的蛋 白质是病毒蛋白。在另 一个实施方案中，所述病毒蛋白来自选自下组的病毒 流感病毒、登革病毒、黄病毒(yellow virus)、单纯疱渗病毒I和II、狂犬病病 毒、副流感病毒、水痘带状疱渗病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、人免 疫缺陷病毒、冠状病毒和肝炎病毒。
本发明还包括一种抗原性配制剂，其包含嵌合的VLP，所述嵌合的VLP 包含新城疫病毒(NDV)核心蛋白(M)和至少 一种来自不同传染原的蛋白质。 在一个实施方案中，所述病毒蛋白在所述VLP的表面上表达。在另一个实施 方案中，所述病毒蛋白包含会在脊推动物中产生保护性免疫应答的表位。在 另一个实施方案中，所述病毒蛋白的部分包含会在脊推动物中产生保护性免 疫应答的表位。在另一个实施方案中，所述抗原性配制剂包含佐剂。在另一 个实施方案中，所述佐剂是Novasomes。
本发明还包括一种疫苗，其包含嵌合的VLP，所述嵌合的VLP包含新城 疫病毒(NDV)核心蛋白(M)和至少一种来自不同传染原的蛋白质。在一个实 施方案中，来自传染原的蛋白质是病毒蛋白。在另一个实施方案中，所述病 毒蛋白包含会在脊推动物中产生保护性免疫应答的表位。在另一个实施方案 中，所述疫苗包含佐剂。在另一个实施方案中，所述佐剂是Novasomes。在 另 一个实施方案中，所述VLP被混合在一起以产生多价配制剂。
本发明还包括一种在脊推动物中诱导免疫的方法，包括给所述脊推动物 施用嵌合的VLP,所述嵌合的VLP包含新城疫病毒(NDV)核心蛋白(M)和至少 一种来自不同病毒的病毒蛋白。在一个实施方案中，来自传染原的所述蛋白 质是病毒蛋白。在另一个实施方案中，其中所述免疫应答是体液免疫应答。 在另一个实施方案中，所述免疫应答是细胞免疫应答。
附图简述
图l表示用于制备包含流感蛋白的嵌合NDV VLP的构建体。
发明详述定义
如本文中所使用的，术语"佐剂"指这样的化合物，在其与特定的免疫
原(例如VLP)在配制剂中组合使用时，会提升或以其它方式改变或修饰由此 所致的免疫应答。对免疫应答的修饰包括对抗体和/或细胞免疫应答的强化或 使其特异性增宽。对免疫应答的修饰还可以意味着降低或抑制某些抗原特异 性免疫应答。
如本文中所使用的，"有效剂量" 一般指足以诱导免疫、预防和/或改善 感染或减轻至少一种与感染症状、和/或增强另一剂VLP的功效的本发明VLP 的量。有效剂量可以指足以延迟感染发作或使之最小化的VLP的量。有效剂 量还可以指在感染的治疗或控制中提供治疗益处的VLP的量。此外，有效剂 量是就单独的或与其它疗法组合在感染的治疗或控制中提供治疗益处的本 发明VLP而言的量。有效剂量还可以是足以增强受试者(例如人)自己针对后 来向传染原暴露的免疫应答的量。免疫水平可以通过例如测量中和性分泌抗 体和/或血清抗体的量来加以监测，所述测量例如通过噬斑中和(plaque neutralization),补体结合(complement fixation),酶联免疫吸附、或樣t中和 (microneutralization)测定法来进行。在疫苗的情况中，"有效剂量"是预防疾 病和/或降低症状严重性的剂量。
如本文中所使用的，术语"有效量，，指实现想要的生物学效应所必需的 或足以实现想要的生物学效应的VLP的量。组合物的有效量将是达到选定结 果的量，并且该量可以由本领域技术人员按常规确定。例如，用于预防、治 疗和/或改善感染的有效量可以是引起免疫系统活化所必需的量，其导致在暴 露于本发明VLP时形成抗原特异性免疫应答。该术语也是"足够量"的同义 词。
如本文中所使用的，术语"多价"指具有针对多种媒介物(agent)类型或 毒抹的多种抗原性蛋白质的VLP。
如本文中所使用的，术语"免疫刺激物"指经由身体自身的化学信使(细 胞因子)增强免疫应答的化合物。这些分子包括具有免疫刺激、免疫强化和 促炎症活性的各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子，诸如白介素(例如IL-I、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL匿6、 IL-12、 IL画13);生长因子(例如粒细胞-巨噬细胞(GM) 集落刺激因子(CSF));及其它免疫刺激分子，诸如巨噬细胞炎性因子、Flt3 配体、B7.1; B7.2、 CD28等。免疫刺激物分子可以在与本发明VLP相同的配制剂中施用，或者可以分开施用。可以施用蛋白质或编码该蛋白质的表达载 体来产生免疫刺激效应。
如本文中所使用的，术语"保护性免疫应答"或"保护性应答"指由脊 推动物(例如人)所展现出的、由针对传染原的抗体所介导的免疫应答，其预
防或改善感染或减轻其至少一种症状。本发明的VLP可以刺激如下抗体的生
成，所述抗体例如中和传染原、阻断传染原进入细胞、阻断所述传染原的复 制、和/或保护宿主细胞免于感染和破坏。该术语还可以指由脊推动物(例如
人)所展现出的、由T淋巴细胞和/或其它白细胞介导的针对传染原的免疫应 答，其预防或改善RSV感染或减轻其至少一种症状。
如本文中所使用的，术语"传染原"指引起脊推动物中的感染的微生物。 通常，所述生物体是病毒、细菌、寄生物和/或真菌。
如本文中所使用的，术语"抗原性配制剂"或"抗原性组合物"指在向 脊推动物(例如哺乳动物)施用时会诱导免疫应答的制备物。
如本文中所使用的，术语"疫苗"指含有本发明VLP的配制剂，其处于 能够向脊推动物施用的形式，而且其诱导的保护性免疫应答足以诱导免疫以 预防和/或改善感染和/或减轻至少一种感染症状和/或增强另一剂VLP的功 效。通常，疫苗包含本发明组合物悬浮或溶解于其中的常规盐水或緩冲的水 溶液介质。处于这种形式，便可以方便地使用本发明的组合物以预防、改善 或以其它方式治疗感染。导入宿主中后，疫苗能够引起免疫应答，包括但不 限于抗体和/或细胞因子的生成和/或细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、辅助T 细胞、树突细胞的活化和/或其它细胞应答。
如本文中所使用的，术语"脊推动物，，或"受试者"或"患者"指脊推 动物亚门(subphylum cordata)的任何成员，包括但不限于人和其它灵长类， 包括非人灵长类，诸如黑猩猩(cgunoabzee)和其它猿类(apes)和猴物种 (monkey species)。 家畜(farm animal)(诸如牛、纟帛羊、猪、山羊和马)；家养 哺乳动物(domestic mammal)(诸如狗和猫)；实-验动物(包括啮齿动物，诸如小 鼠、大鼠(包括棉鼠)和豚鼠)；鸟类(包括家禽、野鸟和猎禽，诸如鸡、火鸡 及其它鹑鸡类鸟类、鸭、鹅)等也是非限制性例子。该定义中包括术语"哺 乳动物"和"动物"。意图涵盖成体和新生个体两者。具体地，婴幼儿是RSV 疫苗合适的受试者或患者。
如本文中所使用的，术语"病毒样颗粒"(VLP)指在至少一种属性上类
12似病毒但是已经证明其没有感染性的结构。依照本发明的病毒样颗粒不携带编码病毒样颗粒的蛋白质的遗传信息。 一般而言，病毒样颗粒缺乏病毒基因组，因此是非感染性的。另外，病毒样颗粒通常可以通过异源表达来大量生产，而且可以容易地纯化。
如本文中所使用的，术语"嵌合的VLP"指含有来自至少两种不同媒介
物的蛋白质或蛋白质的部分的VLP。通常，蛋白质之一衍生自能驱动VLP从宿主细胞形成的病毒。出于例示目的的例子是新城M和/或流感M蛋白。术语新城VLP和嵌合的VLP可以在适当时互换使用。
如本文中所使用的，术语"NDV基质"、"NDV M"或"NDV核心"蛋白指NDV膜蛋白，其在宿主细胞中表达时诱导有包膜VLP的形成。代表性NDVM蛋白是SEQIDNo. 1。所述术语还包括NDV M的任何变体、衍生物和/或片段，其在宿主细胞中表达时诱导VLP形成。该术语还涵盖编码NDV M和/或其任何变体、衍生物和/或片段的核苷酸序列，其在转染(或感染)入宿主细胞中时会表达NDV M蛋白，并诱导VLP形成。
本发明的VLP及制备VLP的方法
一般而言，病毒样颗粒缺乏病毒基因组，因此是非感染性的。另外，病毒样颗粒通常可以通过异源表达来大量生产，而且可以容易地纯化。病毒样颗粒("VLP，，)至少包含病毒核心蛋白。这种核心蛋白会驱动出芽，并从宿主细胞释放颗粒。此类蛋白质的例子包括RSVM、流感M1、 HIVgag、和疱疹性口炎病毒(VSV) M蛋白。最近，已经显示了，在新城疫病毒(NDV)的M蛋白在宿主细胞中表达时，形成并释放颗粒(Pantua等(2006) J. Virol, 80，11062-11073)。然而，作为免疫原的有用VLP通常会需要至少一种在VLP表面上的蛋白质。这些VLP对于诱导针对所述蛋白质的免疫应答或者对于将VLP靶向至特定细胞会是有用的。虽然包含来自相同病毒的核心蛋白和蛋白质的VLP是有用的，但是这种类型的VLP将限于特异性针对所迷病毒的疫苗和其它用途。会有用的是这样的平台，其中能够制备其表面上的蛋白质来自不同媒介物的VLP。就本发明而言，此类VLP称为"嵌合的VLP"。这些VLP对于设计针对由不同媒介物引起的疾病的疫苗等会是有用的。
如此，本发明包含嵌合病毒样颗粒(VLP),其包含新城疫病毒(NDV)核心蛋白(M)和至少一种来自不同传染原的蛋白质。在一个实施方案中，所述来自传染原的蛋白质是病毒蛋白。在另一个实施方案中，所述病毒蛋白是包膜结合蛋白。在另一个实施方案中，所述包膜结合蛋白是在VLP的表面上表达的。在另一个实施方案中，所述包膜结合蛋白包含会在脊推动物中产生保护性免疫应答的表位。
本发明的VLP对于制备疫苗和免疫原性组合物是有用的。VLP的一个重要特征在于呈递表面蛋白以使得脊推动物的免疫系统针对所述蛋白质诱导免疫应答的能力。然而，不是所有的蛋白质都可以在VLP的表面上表达或呈递。某些蛋白质不能在VLP的表面上表达或呈递，或者表达或呈递不佳可能有许多原因。 一种原因是所述蛋白质不定向于宿主细胞膜，或者所述蛋白质没有跨膜域。然而，病毒确实具有在其结构的表面上表达某些蛋白质的天然能力。
如此，在一个实施方案中，本发明包含含有嵌合蛋白的VLP,其中所述嵌合蛋白包含与NDV或副流感病毒(PIV)蛋白融合的来自传染原的蛋白质。PIV与NDV有关。如此，PIV成分可以容易地指向VLP的表面，因为NDV蛋白是定向的。用PIV或NDV病毒蛋白(诸如融合物(F)或血凝素(hemeagglutinin;HN)或其片段)构建嵌合蛋白是有利的，因为所述嵌合蛋白可以将细胞机器(cell machinery)指导成向VLP中掺入所述嵌合蛋白。在另一个实施方案中，所述PIV蛋白选自由PIV HN和F蛋白或其片段组成的组。在另一个实施方案中，所述来自传染原的蛋白质是病毒蛋白。在另一个实施方案中，所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所述PIV蛋白的一部分。在另 一个实施方案中，病毒蛋白的所述部分在VLP的表面上表达。在另一个实施方案中，病毒蛋白的所述部分包含会在脊推动物中产生保护性免疫应答的表位。在另一个实施方案中，PIV蛋白的所述部分直接或间接地与NDVM蛋白结合。
在另一个实施方案中，本发明包含含有嵌合蛋白的嵌合的VLP,其中所述嵌合蛋白包含与NDV蛋白融合的来自传染原的蛋白质。在另 一个实施方案中，所述来自传染原的蛋白质是病毒蛋白。在另一个实施方案中，所述NDV蛋白选自由NP、 F、和HN蛋白组成的组。在另一个实施方案中，所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所述NDV蛋白的一部分。在另 一个实施方案中，病毒蛋白的所述部分在VLP的表面上表达。在另一个实施方案中，病毒蛋白的所述部分包含会在脊推动物中产生保护性抗体应答的表位。在另一个实施方案中，NDV蛋白的所述部分直接或间接地与NDV M蛋白结合。在另一个实施方案中，所述嵌合NDVVLP包含这样一种嵌合蛋白，其中NDVHN 和/或F蛋白的跨膜和/或C末端域与传染原(诸如流感、VZV、 RSV和/或登革 病毒)蛋白质的外部域融合。在另一个实施方案中，所述嵌合NDVVLP包含 这样一种嵌合蛋白，其包含流感HA和/或NA蛋白的外部域和NDV HN和/或F 蛋白的跨膜和/或C末端域(参见例如SEQIDNO 10)。在另一个实施方案中， 所述嵌合的VLP包含SEQ ID NO 10。
传染原可以是病毒、细菌和/或寄生物。可在嵌合的NDV VLP的表面上 表达的蛋白质可以衍生自病毒、细菌和/或寄生物。自病毒、细菌和/或寄生
预防、治疗、控制和/或改善所述脊推动物中的传染病。
可以衍生所述传染原蛋白质的病毒的非限制性例子如下季候性流感、 禽流感或大流行性流感(pandemic influenza) (A和B,例如HA和/或NA)、冠状 病毒(例如SARS)、曱型、乙型、丙型、丁型和戊3型肝炎病毒、人免疫缺陷 病毒(HIV)、疱渗病毒l、 2、 6和7,巨细胞病毒、水痘带状疱渗、乳头瘤病 毒、i矣巴病毒(Epstein Barr vims)、富"t感病毒、A夂病毒、布尼亚病毒(bunya virus)(例如汉坦病毒(hanta virus))、柯萨奇病毒(coxsakie virus)、 小RNA病毒 (picoma vims)、 4仑^l犬病毒、鼻病毒、风渗病毒(mbella virus)、月思&,炎病毒、 麻渗病毒(measles virus)、风渗病毒(Rubella virus)、脊髓灰质炎病毒(多种类 型)、腺病毒(多种类型)、副流感病毒(多种类型)、禽流感(各种类型)、运输 热病毒(shipping fever virus)、 西方和东方马月卤脊髓炎(Western and Eastern equine encephalomyelitis)、 日本月卤脊ft炎(Japanese encephalomyelitis)、 鸡痘、 狂犬病病毒、月S十曼病毒(slow brain virus)、 劳#々肉瘤病毒(rous sarcoma virus)、 乳多空病毒科(Papovaviridae)、 细小病毒科(Parvoviridae) 、 'J 、 RNA病毒科 (Pkomaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)(诸如天花或牛痘)、呼肠孤病毒科 (Reoviridae)(例如轮状病毒)、逆转录病毒科(Retroviridae)(HTLV-I、 HTLV-II、 慢病毒属(Lentivirus))、披膜病毒科(Togaviridae)(例如风渗病毒属 (Rubivirus))、呼吸道合胞病毒(RSV)、西尼罗河热病毒(West Nile fever virus)、 蜱媒脑炎(Tick borne encephalitis)、黄热病、屈曲病毒(chikungunya virus)、和 登革病毒(所有血清型)。
在另一个实施方案中，来自病毒的特定蛋白质可以包含来自RSV的F 和/或G蛋白、来自流感病毒(包括禽流感病毒或大流行性流感病毒)的HA和/或NA、来自冠状病毒的S蛋白、来自HIV的gp160、 gpWO和/或gp41,来自水 痘带状疱疹的gpI至IV和Vp,来自黄热病毒的E和preM/M、登革病毒(所有血 清型)或任何黄病毒(flavivims)。还包括的是能在脊推动物中诱导免疫应答(细 胞的和/或体液的)的来自病毒的任何蛋白质，其可以预防、治疗、控制和/或 改善所述脊推动物中的传染病。

图1中显示了上文构建体的例子。
可以从中衍生所述传染原蛋白质的细菌的非限制性例子可以从下列各 项衍生百日咳杆菌(及/ eWww'j)、波摩那钩端螺旋体(丄e/ toi^/ra尸owo"")、 曱型和乙型副伤寒沙门氏菌(&para(y;^)、白喉棒杆菌(C. c^Mzen'ae)、破伤 风梭菌(C. tetom')、肉毒梭菌(C, 6o/w//""m)、产气荚膜梭菌(C. pe^7'"gms)、 费氏梭菌(C7^e〃')及其它气性坏疽细菌，炭疽芽孢杆菌C5. flw^rac&)、鼠疫 巴斯德氏菌CP / e幼'力、多杀巴斯德氏菌(P ww/tocWfl)、脑膜炎奈瑟氏球菌 (A^'Merz,a附em'"g/Z7.(i&s)、 淋病奈瑟氏王求菌(iV. go"o/r/7e"e)、 流感嗜血菌 (//emo/ /n7iw /"y7wewzae)、 》丈线菌属(Actinomyces)(例如i若卡氏菌属 (Norcardia))、不动杆菌属(v4c/"eto^ac&r)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)(例如炭疽 才干菌(fiac/〃ws aW/7rac&)) 、 #以4干菌属(Bacteroides)(例长口脆弱4以^干菌(BacterazVfes /rag/to))、芽生菌病(Blastomycosis)、博德特氏菌属(Bordetella)、疏螺旋体属 (Borrelia)(例如布氏疏螺旋体(^ 玎￡//" 6z^gdor/en'))、布鲁氏菌属(Brucella)、 弯曲杆菌属(Campylobacter)、 衣原体属(Chlamydia) 、 ^求孢子菌属 (Coccidioides)、斗奉才干菌属(Corywe6acfen'wm)(例^口白口娱才奉^干菌(Cor;yne6acten,Mm ^^/2en'ae))、大肠杆菌(五.co/Z)(例如肠产毒性大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌)、 肠杆菌属(Enterobacter)(例如产气肠杆菌(￡"/era6ac&r aeragew"))、肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)(克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如 4方寒沙、门氏菌(iSa/wo"e〃a (yp/n')、肠炎沙、门氏菌(5"a/mo"e/Za e",en'"(ifs))、沙、雷 氏菌属(Serratia)、耶尔森菌属(Yersinia)、志贺氏菌属(Shigella))、丹毒丝菌属 (Erysipelothrix)、 嗜血杆菌属(Haemophilus)(例如乙型流感嗜血属 (//aemo/ /H7w type B))、 螺片干菌属(Helicobacter)、 军团菌属
(Legionella)(例如4曼月申军团菌(Zeg/owe〃a /wewwo; /n7a))、 钩端螺S走体属 (Leptospira)、利斯特菌属(Listeria)(例如单核细胞增生利斯特菌("WeWfl mowoqytogewe力)、斗支^^、体属(Mycoplasma)、分才支斥干菌属(Mycobacterium)(l列^口 麻风分斗支#干菌(綺coZ)"cfen.ww /epr"e)和纟吉斗亥分斗支4干菌(踏cofe""en'ww m/ ercM/cw;y))、弧菌属(Vibrio)(例如霍乱弧菌(WZWo c/7o/erae))、巴斯德氏菌属OPoytewe〃acea)、变形菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假 单月包菌CPseMcfomowas aen/g/"oya))、 立克次氏体牙牛(Rickettsiaceae)、虫累体属 (Spirochetes)(例长口密虫累》走体(Treponema spp.)、 4勾端虫累i走体(Leptospira spp.)、 疏螺旋体(Borrelia spp.))、志贺氏菌(Shigella spp.)、脑膜炎球菌属 (Meningiococcus)、月申炎王求菌属(Pneumococcus)禾口《连3求菌属(Streptococcus)(1"列 如肺炎4连i求菌OS^eptococcw /7"ewmo"/ae)和A组、B组、和C组链3求菌)、尿枝 原体属(Ureaplasmas)、苍白密螺旋体(7 epo"emapo〃/血w)、金黄色葡萄球菌 (5Vop/^/ococcws ai/re—、溶血巴斯德氏菌(尸a他wre〃a /zae,/,'—、白喉棒杆 菌类毒素(Cbr_y"e6acten-Mw (iz^/zen'ae toxoid)、 脑月莫炎球菌多糖 (Meningococcal polysaccharide)、 百曰咳杆菌(Borafete〃a peWwwi)、肺炎链3求 菌(&re/ tococc ^ / we"wo"/"e)、石皮"f另风冲麦菌类毒素(C7o^〃W/wm feto"/ toxoid)、 和牛分枝杆菌(鄉coZ acte"'訓6ov/力。
可以从中衍生所述传染原蛋白质的寄生物的非限制性例子如下利什曼 病(leishmaniasis)(墨西哥热带利什曼原虫(丄e^/zmam'a /rap/ca mex/caw")、热带 利"f十曼原虫(丄e&Zzmam'a /ra/ /c")、石贞大利ff"曼原虫(丄e^/2mam'a wq/or)、 i矣塞 #1比亚利fl"曼原、虫(丄e/s/zmam-" ae^z/op/ca)、 巴西利4十曼原、虫(丄e^/zwaw'a 、杜氏利什曼原虫(丄e^/zmaw'a cfo"ova"0 、婴儿利什曼原虫 (丄ez^/zm(3W'(3 /w/a"/wm)、十合氏利ff"曼原虫(丄ez、/2ma"/a c/zagaw')) 、 4,虫病 (trypanosomiasis)(冈比亚布氏《,虫(7>_y/7a"osoma Z rwcez' gam6/erae)、 罗4寻西亚 布氏4,虫(7>_y/7(3mwoma 6race/ r/ odew'erae))、弓形体病(toxoplasmosis)(刚i也弓 开j体(7bxo/ /oym(3 gcwW/))、血吸虫病(schistosomiasis)(i矣及血吸虫(Sc/z/Wosoma Zz(3e附atoZu'w附)、日本血'吸虫((Sc/2Z.Wosoma 7."PO附'cw附)、曼森氏血吸虫 (5"c/n.Woyoma mawsom')、 湄公血吸虫(Sc/n.Wasoma weA:owg/)、 间4翁血吸虫 (Sc/7&tosowa /"&rca/a^/m))、疰疾(间曰疾原虫(尸/osmo^Y/m Wrax)、 恶寸生症原 虫(P/asmo(i/Mm y^/c7》(3n'Mm)、三日痴原、虫(尸/osTWO(i/MW ma/an.ae)和卵形疾原虫 (尸/aywoAMm ova/e))、阿米巴病(;容组织内阿米巴(五"towwek /^to(v〃ca))、巴 贝西虫病(Babesiosis)(田鼠巴贝西虫(^36ew'a^ wz'cra"))、 隐孑包子虫病 (Cryptosporidiosis)(农i小隐孑包子虫(CV7/ to5pon.&wm p"n;MW))、 双冲亥P可米巴病 (Dientamoebiasis)(脆弱双核阿米巴(Z)/ewtomoe6a yhs^'fc))、 贾第虫病 (Giardiasis)(兰氏贾第鞭毛虫(G/ani/a /amW/a))、蠕虫病(Helminthiasis)和毛滴 虫属(Trichomonas)(阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis))。上文所歹'J意图例示，决不意图将本发明局限于这些特定的细菌、病毒或寄生生物体。
本发明还涵盖本发明VLP之上或之中所表达的所述蛋白质的变体。所述 变体可含有在组分蛋白质的氨基酸序列中的变化。术语"变体"就蛋白质而
言指相对于参考序列改变了 一个或多个氨基酸的氨基酸序列。变体可以具有 "保守的"变化，其中用于替代的氨基酸具有类似的结构或化学特性，例如 用异亮氨酸替换亮氨酸。或者，变体可以具有"非保守的，，变化，例如用色 氨酸替换甘氨酸。类似的次要变化还可以包括氨基酸缺失和/或插入。使用本
领域公知的计算机程序，例如DNASTAR软件，可以找到确定哪些氨基酸残 基可供替代、插入或缺失而不消除生物学活性或免疫学活性的指导。
天然变体可由于蛋白质中的突变而发生。这些突变可能导致各组传染原 (例如流感)内的抗原变异性(antigenic variability)。如此，感染了流感毒抹的 人形成针对该病毒的抗体，在更新的病毒株出现时，针对较旧毒抹的抗体不 再识别较新的病毒，而可以发生再感染。本发明涵盖用于制备VLP的来自传 染原的所有抗原变异性和遗传变异性。
描述可应用于本发明的分子生物学技术(诸如克隆、突变、细胞培养等) 的通用孝丈牙+书包才舌Berger禾口Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods于Enzymology巻152 Academic Press, Inc., San Diego， Calif. (Berger); Sambrook等，Molecular Cloning—A Laboratory Manual (第3版),巻l-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y" 2000 ("Sambrook，，)和 Current Protocols in Molecular Biology, R M. Ausubel等编,Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., ("Ausubel")。这些教科书描述了诱变、载体的应用、启动子和许多其它 相关的题目，所述题目涉及例如RSV的F和/或G分子的克隆和突变等。如此， 本发明还涵盖使用已知的蛋白质工程和重组DNA技术的方法来改进或改变 在本发明VLP之上或之中表达的蛋白质的特性。可使用多种类型的诱变来产 生和/或分离编码蛋白质分子的变体核酸和/或进一步修饰/突变本发明VLP之 中或之上的蛋白质。它们包括但不限于定点诱变、随机点诱变、同源重组 (DNA改组)、使用含尿嘧咬模板进行的诱变、寡核苷酸指导的诱变、硫代磷 酸修饰的DNA诱变、使用缺口双链体DNA的诱变等。其它合适的方法包括 点错配修复(point mismatch repair)、使用修复缺陷的宿主抹的诱变，限制选 择和限制纯化、缺失诱变、通过全基因合成的诱变、双链断裂修复等。诱变
18(例如牵涉嵌合构建体的诱变)也包括在本发明中。在一个实施方案中，可通 序列比较、物理7生质、'晶体i构等)来指导诱变。 '、
活性(例如能够引发有效的抗体应答)的蛋白质变体。这样的变体包括缺失、 插入、倒位、重复、和替代，根据本领域已知的一般规则来选择它们，使得 其对活性基本没有影响。突变的实例是去除蛋白质中的切割位点。
克隆所述蛋白质的方法是本领域已知的。例如，编码特定新城蛋白的基 因可以作为合成基因以化学方法合成，或者可以从感染了所述病毒的细胞提
取多聚腺普酸化mRNA，通过RT-PCR从中分离出编码特定新城蛋白的基因。 所得的基因产物可以作为DNA插入物克隆入载体中。术语"载体"指可用于 扩增(propagate)核酸和/或在生物体、细胞、或细胞组分之间转移核酸的工具。 载体包括自主复制或可整合入宿主细胞的染色体中的质粒、病毒、噬菌体、 原病毒、噬菌粒、转座子、人工染色体等。载体还可以是非自主复制性的棵 RNA多核苷酸、棵DNA多核普酸、在同一条链内由DNA和RNA两者组成的 多核苷酸、聚赖氨酸缀合的DNA或RNA、肽缀合的DNA或RNA、脂质体缀 合的DNA等。在许多但不是所有的常见实施方案中，本发明的载体是质粒或 杆粒(bacmid)。
如此，本发明包括这样的核香酸，它们编码克隆入可在细胞中表达的表 达载体中的蛋白质(包括嵌合蛋白)，诱导本发明VLP的形成。"表达载体"是 能够促进掺入其中的核酸的表达以及复制的载体，诸如质粒。通常，要表达 的核酸与启动子和/或增强子"可操作连接"，并受该启动子和/或增强子的转 录调控。在一个实施方案中，所述核苷酸编码嵌合蛋白(例如如上文所讨论 的PIV或NDV嵌合蛋白)。在另一个实施方案中，所述载体包含编码NDV M 蛋白和至少一种来自传染原的蛋白质的核苦酸。在另一个实施方案中，所述 载体包含编码NDV M蛋白和与PIV或NDV或其部分融合的至少一种来自传 染原的蛋白质、或其部分。在另一个实施方案中，所述表达载体是杆状病毒 载体。
在一些实施方案中，突变含有这样的变化，其产生沉默的替代、添加或 缺失，但是不改变被编码蛋白质的特性或活性或者生成这些蛋白质的方式。 可以出于多种原因而产生核苷酸变体，例如为了针对特定宿主优化密码子表达(将密码子改变为昆虫细胞诸如Sf9细胞优选的那些密码子，参见SEQ ID NO 5、 6、 7和8)。参见美国专利公开文本2005/0118191,将其通过提述而完 整收录于本文中用于所有目的。
另外，可对核苷酸测序以确保正确的编码区得到克隆，且不含有任何不 想要的突变。可以将所述核苷酸亚克隆入表达载体(例如杆状病毒)中用于在 任意细胞中表达。上文仅仅是如何能够克隆用于嵌合的VLP的蛋白质的一个 例子。本发明技术人员理解，其它方法也是可用和可能的。
本发明还提供这样的构建体和/或载体，其包含编码NDV结构基因(包括 M、 F、 HN和/或NP)或其部分，和/或PIV F和/或HN或其部分，和/或上文所 述的任何嵌合蛋白的核苷酸。载体可以是例如噬菌体、质粒、病毒、或逆转 录病毒载体。构建体和/或包含上文构建体的载体应当与合适的启动子可操作 连接，诸如AcMNPV多角体蛋白启动子(或其它杆状病毒)、入噬菌体PL启动 子、大肠杆菌lac、 phoA和tac启动子、SV40早期和晚期启动子、和逆转录LTR 的启动子是非限制性例子。根据想要的宿主细胞和/或表达率，本领域技术人 员会知道其它合适的启动子。表达构建体将进一步含有转录起始位点、终止 位点、以及被转录区中用于翻译的核糖体结合位点。所述构建体所表达的转 录物的编码部分优选在要翻译的蛋白质的起始处包含翻译起始密码子，而在 该蛋白质末尾处的合适位置上含有终止密码子。
表达载体将优选包含至少一种选择标志。此类标志物包括用于真核细胞 培养的二氢叶酸还原酶、G418或新霉素抗性，以及用于培养大肠杆菌和其它 细菌的四环素、卡那霉素或氨千青霉素抗性基因。优选的载体包括病毒载体， 诸如杆状病毒、痘病毒(例如牛痘病毒、禽痘病毒(avipox virus)、金丝雀痘病 毒、禽痘病毒(fowlpoxvims)、浣熊痘病毒、猪痘病毒等)、腺病毒(例如犬腺 病毒)、疱渗病毒和逆转录病毒。可与本发明一起使用的其它载体包括用于 细菌的载体，包括pQE70、 pQE60和pQE-9， pBluescript载体、Phagescript载 体、pNH8A、 pNH16a、 pNH18A、 pNH46A、 ptrc99a、 pKK223画3、 pKK233-3、 pDR540 、 pRIT5 。优选的真核载体包括pFastBacl pWINEO 、 pSV2CAT、 pOG44 、 pXTl和pSG、 pSVK3、 pBPV、 pMSG、和pSVL。其它合适的载体是本领域 技术人员显而易见的。在一个实施方案中，包含NDV、 M、 F、 HN和/或NP 或其部分，和/或PIV F和/或HN或其部分，和/或上文所迷的任何嵌合蛋白的 所述载体是pFastBac。在一个实施方案中，基本上由NDV、 M、 F、 HN和/
20或NP或其部分，和/或PIVF和/或HN或其部分，和/或上文所述的<壬何嵌合蛋 白组成的所述载体是pFastBac。在一个实施方案中，由NDV、 M、 F、 HN和/ 或NP或其部分，和/或PIVF和/或HN或其部分，和/或上文所述的4壬何嵌合蛋 白组成的所述载体是pFastBac。
接下来，上文所提及的重组构建体可以用来转染、感染、或转化，并且 可以在真核细胞和/或原核细胞中表达NDV M蛋白和NDV、 F、 HN和/或NP 或其部分，和/或PIV F和/或HN或其部分，和/或上文所述的任何嵌合蛋白。 如此，本发明提供了包含载体(或多个载体)的宿主细胞，所述载体含有的核 酸在容许形成VLP的条件下于所述宿主细胞中表达上文所述构建体。
真核宿主细胞包括酵母、昆虫、禽类、植物、秀丽隐杆线虫(C. e/egam) (或线虫)和哺乳动物宿主细胞。昆虫细胞的非限制性例子有草地夜蛾 OS; odc^era/n/g^e^G) (Sf)细i包、例如Sf9、 Sf21， 4分紋夜蛾(7Hc/zo; /ws/a 细胞，例如HighFive细胞，和果蝇(Z)myo/7/w7a)S2细胞。真菌(包括酵母)宿主 细胞的例子有酿酒酵母OS. cwevWae)、乳克鲁维酵母(幻z^wramyces /ac他；K. /acto)、假丝酵母属(Candida)物种包括白色假丝酵母(C. a/^c""力和光滑假丝 酵母(C g/"6rato)、构巢曲霉(A; erg/〃w "/tMara)、粟酒裂殖酵母 (Sc/n'zo^cc/2ara附yces尸函Z e; S. / 麵6e)、巴斯德毕赤酵母(尸/c/z/a; astoKs)、和 解脂西洋蓍霉(KwwWa/ipo/;^ca)。哺乳动物细胞的例子有COS细胞、幼仓鼠 肾细胞、小鼠L细胞、LNCaP细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK) 细胞和非洲绿猴细胞、CV1细胞、HeLa细胞、MDCK细胞、Vero和Hep-2细 胞。非洲爪蟾(Xe"o; w/aev&)卵母细胞，或两栖动物来源的其它细胞也可以 使用。原核宿主细胞包括细菌细胞，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(5. 和分枝一干菌。
本发明包括一种生成嵌合的VLP的方法，其包括转染编码新城疫病毒 (NDV)核心蛋白(M)和至少 一种来自不同病毒的病毒蛋白的载体，并在容许 VLP形成的条件下表达所述载体。在另一个实施方案中，所述病毒蛋白是包 膜结合蛋白。在另一个实施方案中，所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合 蛋白包含与副流感病毒(PIV)蛋白融合的所述病毒蛋白。在另一个实施方案 中，所述PIV蛋白选自由HN和F蛋白组成的组。在另一个实施方案中，所述 嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所述PIV蛋白的一部分。在另 一个实 施方案中，PIV蛋白的所述部分与NDVM蛋白结合。在另一个实施方案中，所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含与NDV蛋白融合的所述病毒 蛋白。在另一个实施方案中，所述NDV蛋白选自由NP、 F、和HN蛋白组成 的组。在另一个实施方案中，所述病毒蛋白来自选自下组的病毒流感病毒、 登革病毒、黄病毒、单纯疱渗病毒I和II、狂犬病病毒、副流感病毒、水痘带 状疱渗病毒、呼吸道合l包病毒、狂犬病病毒、人免疫缺陷病毒、冠状病毒和 肝炎病毒。
在另 一个实施方案中，所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所述 NDV蛋白的一部分。在另一个实施方案中，NDV蛋白的所述部分与NDV M 蛋白结合。在另一个实施方案中，所述病毒蛋白来自选自下组的病毒流感 病毒、登革病毒、黄病毒、单纯疱渗病毒I和II、狂犬病病毒、副;危感病毒、 水痘带状疱渗病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、人免疫缺陷病毒、冠状 病毒和肝炎病毒。在另一个实施方案中，所述流感病毒蛋白是HA和/或NA。 在另一个实施方案中，所述呼吸道合胞病毒病毒蛋白是F和/或G。在另一个 实施方案中，所述登革病毒病毒蛋白是E和/或preM/M。在另 一个实施方案中， 所述嵌合NDV VLP包含这样一种嵌合蛋白，其中NDVHN和/或F蛋白的跨膜 和/或C末端域与传染原(诸如流感、VZV、 RSV和/或登革病毒)的蛋白质的外 部域融合。在另 一个实施方案中，所述嵌合NDV VLP包含这样一种嵌合蛋白， 其包含流感HA和/或NA蛋白的外部域和NDV HN和/或F蛋白的跨膜和/或C末 端域(参见例如SEQIDNO 10)。在另一个实施方案中，所述嵌合的VLP包含 SEQIDNOIO。
可以依照本领域公知的方法将载体(例如包含编码上文构建体的多核苷 酸的载体)转染入宿主细胞中。例如，可通过磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微 注射、脂转染和利用多胺转染试剂的转染来将核酸导入真核细胞中。在一个 实施方案中，所述载体是重组杆状病毒。在另一个实施方案中，所述重组杆 状病毒被转染到真核细胞中。在一个优选的实施方案中，所述细胞是昆虫细 胞。在另一个实施方案中，所述昆虫细胞是Sf9细胞。
在另一个实施方案中，所述载体和/或宿主细胞包含这样的核苷酸，所述 核苦酸编码NDVM蛋白和NDVF、 HN和/或NP蛋白、或其部分，和/或PIVF 和/或HN蛋白、或其部分，和/或上文所述的任何嵌合蛋白。在另一个实施方 案中，所述载体和/或宿主细胞基本上由NDV M蛋白和NDV F、 HN和/或NP 蛋白、或其部分，和/或PIV F和/或HN蛋白、或其部分，和/或上文所述的任何嵌合蛋白组成。在一个进一步的实施方案中，所述载体和/或宿主细胞由
NDV M蛋白和NDV F、 HN和/或NP蛋白或其部分，和/或PIV F和/或HN蛋白 或其部分，和/或上文所述的任何嵌合蛋白组成。含有上文构建体的这些载体 和/或宿主细胞还可含有其它细胞组分诸如细胞蛋白、杆状病毒蛋白、脂质、 碳水化合物等，但不含有其它的NDV蛋白(除了上文所述构建体的片段之外)。
本发明还提供了会增加VLP生产效率的构建体和方法。例如，向上文所 述构建体添加前导序列可以改善蛋白质在细胞内转运的效率。例如，可将异 源信号序列与NDVM蛋白和NDVF、 HN和/或NP蛋白、或其部分，和/或PIV F和/或HN蛋白、或其部分，和/或上文所述的任何嵌合蛋白融合。在一个实 施方案中，所述信号序列可衍生自昆虫细胞的基因。在另一个实施方案中， 信号肽是几丁质酶信号序列，其可在杆状病毒表达系统中高效地工作。
蛋白和NDV F、 HN和/或NP蛋白、或其部分，和/或PIV F和/或HN蛋白、或 其部分，和/或上文所述的任何嵌合蛋白的核苷酸进行密码子优化。例如，为 在Sf9细胞中表达而对核酸进行密码子优化，参见SEQIDN0 5、 6、 7和8及 美国专利公开文本2005/0118191，本文通过提述而将其完整收录用于所有目的。
本发明还提供生产VLP的方法，所述方法包括在容许VLP形成的条件下 表达NDV M蛋白和NDV F、 HN和/或NP蛋白、或其部分，和/或PIV F和/或 HN蛋白、或其部分，和/或上文所述的任何嵌合蛋白。根据所选的表达系统 和宿主细胞，在表达重组蛋白和形成VLP的条件下通过培养用表达载体转化 的宿主细胞来产生VLP。在一个实施方案中，本发明包括一种生成VLP的方 法，其包括将至少编码NDVM蛋白的载体转染入合适的宿主细胞中，并在容 许VLP形成的条件下表达所述蛋白质。在另一个实施方案中，所述VLP包含 NDVM蛋白和NDVF、 HN和/或NP蛋白、或其部分，和/或PIV F和/或HN蛋 白、或其部分，和/或上文所述的任何嵌合蛋白。在另一个实施方案中，所述 真核细胞选自酵母细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、禽类细胞和哺乳动物细
在另一个实施方案中，所述方法包括制备包含NDVM蛋白和至少一种来 自另一传染原的蛋白质的VLP。在另一个实施方案中，所述来自另一种传染原的蛋白质是病毒蛋白。在另一个实施方案中，所述来自传染原的蛋白质是 包膜结合蛋白。在另一个实施方案中，所述来自另一种传染原的蛋白质在 VLP的表面上表达。在另一个实施方案中，所述来自传染原的蛋白质包含会 在脊推动物中产生保护性免疫应答的表位。在另一个实施方案中，所述来自
另一种传染原的蛋白质可与NDVM蛋白结合。
批、分批补料、连续和灌流(perfusion)细胞培养技术。细胞培养意思是在生 物反应器(发酵室)中使细胞生长和增殖，细胞在生物反应器中增殖并表达蛋 白(例如重组蛋白)以供纯化和分离用。典型地，细胞培养在生物反应器中无 菌、受控的温度和大气条件下进行。生物反应器是用于培养细胞的腔室 (chamber),其中可以监控环境条件诸如温度、大气、搅拌和/或pH。在一个 实施方案中，所述生物反应器是不锈钢室。在另一个实施方案中，所述生物 反应器是预灭菌的塑料袋(例如Cellbag⑧，Wave Biotech, Bridgewater， NJ)。在 其它实施方案中，所述预灭菌的塑料袋为约50 L至1000 L的袋子。
然后使用保持VLP完整性的方法来分离VLP,诸如通过梯度离心，例如 氯化铯、蔗糖和碘克沙醇(iodixanol)梯度离心，以及标准纯化技术，包括例 如离子交换和凝胶过滤层析。
下面是如何能够制备、分离和纯化本发明VLP的一个例子。通常VLP是 由重组细胞系产生的，所述细胞系经过工程化改造从而当所述细胞在细胞培 养(见上文)中生长时产生VLP。本领域技术人员将会理解，可以使用其它的 方法来制备和纯化本发明的VLP,如此本发明不限于所述的方法。
本发明VLP的生产可首先将Sf9细胞(未感染的)接种到摇瓶中，使细胞随 着生长繁殖而扩增和规模放大(例如从125ml烧瓶到50L Wave袋)。培养细胞所 用的培养基是为合适的细胞系配制的(优选无血清培养基，例如昆虫培养基 ExCell-420, JRH)。接着，用重组杆状病毒以效率最高的感染复数(例如每个 细胞约1个到约3个噬斑形成单位)感染所述细胞。 一旦发生感染，NDVM蛋 白和NDV F、 HN和/或NP蛋白、或其部分，和/或PIV F和/或HN蛋白、或其 部分，和/或上文所述的任何嵌合蛋白即从病毒基因组表达，自装配成VLP, 并在感染后大约24到72小时从细胞分泌。通常，在细胞处于生长的对数中期 (mid-logphase)(4-8x 106个细胞/1111)且至少约90%存活时，感染效率最高。
可以在感染后大约48到96小时，在细胞培养基中VLP水平接近最大值但在广泛的细胞溶解之前收获本发明的VLP。收获时的Sf9细胞密度和生存力可
以为约0.5 x 106个细胞/ml至约1.5 x 106个细胞/ml,生存力至少为20%,如 染料排除测定法所示。接着，取出培养基并将其澄清。可以向培养基添加NaCl 至浓度为约0.4至约1.0M，优选至约0.5M，以避免VLP聚集。可利用一次性 使用的预灭菌中空纤维0.5或1 .OOpm筒式滤器或类似的装置，通过切向流过
接着，可以使用一次性的、预灭菌的500，000分子量截留中空纤维筒通过 超滤来浓缩经过澄清的培养基中的VLP。可以将经过浓缩的VLP对10倍体积 的含0.5 M NaCl的pH 7.0至8.0的磷酸盐緩冲盐水(PBS)进行渗滤来除去残余
的培养基成分。
可以将经过浓缩、渗滤的VLP在含0.5MNaCl的pH7.2PBS緩冲液中 20%-60%不连续蔗糖梯度上，于约4。C至约IO'C以6,500 xg离心18小时来 进一步纯化。通常，VLP将在约30%到至约40%蔗糖之间或者在界面上(在 20%和60%的分步梯度中)形成显著可见的条带，可从该梯度中收集该条带并 保存。可稀释该产物使其包含200mMNaCl，以准备纯化过程的下一步。该 产物含有VLP,并可能含有完整的杆状病毒颗粒。
可以通过阴离子交换层析或者44%等密度蔗糖垫层(cushion)离心来实现 VLP的进一步纯化。在阴离子交换层析中，将来自蔗糖梯度(见上文)的样品 上样入含有带阴离子的介质(例如Matrix Fractogel EMD TMAE)的柱中，并经 由盐梯度(从约0.2 M至约l.O MNaCl)洗脱，该梯度可以将VLP与其它杂质(例 如杆状病毒和DNA/RNA)分开。在蔗糖垫层方法中，将包含VLP的样品添加 到44%蔗糖垫层，并在30，000g离心约18小时。VLP在44。/。蔗糖的顶部形成条 带，而杆状病毒沉淀于底部，其它污染蛋白停留在顶部的0%蔗糖层中。收 集VLP峰或VLP带。
若想要的话，可以将完整的杆状病毒灭活。可以通过化学方法，例如曱 醛或P-丙内酯(BPL)灭活。还可以使用本领域已知的选择性沉淀和层析方法， 如上文例示的，来大部分实现完整杆状病毒的除去和/或灭活。灭活方法包括 将含有VLP的样品在0.2。/。 BPL中于约25。C至约27。C温育3小时。还可以通过 将含有VLP的样品在0.05。/。BPL于4。C温育3天，然后在37。C温育1小时，来灭 活^N犬病毒。
灭活/除去步骤后，可使含有VLP的产物流过另 一渗滤步骤以除去任何来
25自灭活步骤的试剂和/或任何残余的蔗糖，并将VLP置入期望的緩冲液(例如
PBS)中。包含VLP的溶液可以通过本领域已知的方法(例如无菌过滤)灭菌，
并保存在冰箱或冷冻箱中。
上文的技术可以在多种规模上实施。例如，T形瓶(T-flasks)、摇瓶、转 瓶(spinnerbottle)、乃至工业尺寸的生物反应器。生物反应器可包括不锈钢槽 或预灭菌的塑料袋(例如，Wave Biotech, Bridgewater, NJ出售的系统)。本领域 技术人员会知道用于其目的的最佳选择。
杆状病毒表达载体的扩增和生产，以及用重组杆状病毒感染细胞以生产 嵌合NDVVLP,可以在昆虫细胞，例如前文所述的Sf9昆虫细胞中实现。在 一个实施方案中，所述细胞是用经工程化以生成嵌合NDVVLP的重组杆状病 毒感染的SF9细胞。
药物或疫苗配制剂和施用
本文中有用的药物组合物含有药学可接受的载体和本发明的VLP，其中 所述载体，包括任何合适的稀释剂或赋形剂，包括本身不诱导产生对接受该 组合物的脊推动物有害的免疫应答、并且可以不带有异常毒性地施用的任何 药剂。如本文中所使用的，术语"药学可接受的"指获得联邦或州政府监管 部门批准，或者在美国药典、欧洲药典或其它公认的药典中列出的用于哺乳 动物，更具体地用于人类中。这些组合物可以用作疫苗和/或抗原性组合物， 用于在脊推动物中诱导保护性免疫应答。
本发明的一个实施方案包括一种抗原性配制剂，其包含嵌合的VLP,所 述嵌合的VLP包含新城疫病毒(NDV)核心蛋白(M)和至少一种来自不同传染 原的蛋白质。在一个实施方案中，所述来自传染原的蛋白质是病毒蛋白。在 另一个实施方案中，所述病毒蛋白在所述VLP的表面上表达。在另一个实施 方案中，所述病毒蛋白包含会在脊推动物中产生保护性抗体应答的表位。在 另一个实施方案中，所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含与副流 感病毒(PIV)蛋白融合的所述病毒蛋白。在另一个实施方案中，所述PIV蛋白 选自由HN和F蛋白组成的组。在另一个实施方案中，所述嵌合蛋白包含所述 病毒蛋白的一部分和所述PIV蛋白的一部分。在另一个实施方案中，病毒蛋 白的所述部分在所述VLP的表面上表达。在另一个实施方案中，病毒蛋白的 所述部分包含会在脊推动物中产生保护性抗体应答的表位。在另一个实施方案中，PIV蛋白的所述部分与所述NDVM蛋白结合。在另一个实施方案中， 所述VLP包含嵌合嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含与NDV蛋白融合的所述 病毒蛋白。在另一个实施方案中，所述NDV蛋白选自由NP、 F、和HN蛋白 组成的组。在另一个实施方案中，所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分 和所述NDV蛋白的一部分。在另一个实施方案中，病毒蛋白的所述部分在所 迷VLP的表面上表达。在另一个实施方案中，病毒蛋白的所述部分包含会在 脊推动物中产生保护性抗体应答的表位。在另一个实施方案中，NDV蛋白的 所述部分与所述NDV M蛋白结合。
本发明的另一个实施方案包括一种疫苗，其包含嵌合的VLP,所述嵌合 的VLP包含新城疫病毒(NDV)核心蛋白(M)和至少 一种来自不同传染原的蛋 白质。在一个实施方案中，所述来自传染原的蛋白质是病毒蛋白。在一个实 施方案中，所述病毒蛋白在所述VLP的表面上表达。在一个实施方案中，所 述病毒蛋白包含会在脊推动物中产生保护性抗体应答的表位。在一个实施方 案中，所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含与副流感病毒(PIV) 蛋白融合的所述病毒蛋白。在一个实施方案中，所述PIV蛋白选自由HN和F 蛋白组成的组。在一个实施方案中，所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部 分和所述PIV蛋白的一部分。在一个实施方案中，病毒蛋白的所述部分在所 述VLP的表面上表达。在一个实施方案中，病毒蛋白的所述部分包含会在脊 推动物中产生保护性抗体应答的表位。在一个实施方案中，PIV蛋白的所述 部分与所述NDVM蛋白结合。在另一个实施方案中，所述VLP含有嵌合蛋白， 其中所述嵌合蛋白包含与NDV蛋白融合的所述病毒蛋白。在一个实施方案 中，所述NDV蛋白选自由NP、 F、和HN蛋白组成的组。在一个实施方案中， 所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所述NDV蛋白的一部分。在一个 实施方案中，病毒蛋白的所述部分在所述VLP的表面上表达。在一个实施方 案中，病毒蛋白的所述部分包含会在脊推动物中产生保护性抗体应答的表 位。在一个实施方案中，NDV蛋白的所述部分与所述NDVM蛋白结合。
本发明的一个实施方案包括一种抗原性配制剂，其包含嵌合的VLP,所 述嵌合的VLP包含NDV M蛋白和至少一种来自不同传染原的蛋白质。在一个 实施方案中，所述来自传染原的蛋白质是病毒蛋白。在另一个实施方案中， 其中所述病毒蛋白选自下组流感病毒、登革病毒、黄病毒、单纯疱疹病毒 I和II、狂犬病病毒、副流感病毒、水痘带状疱渗病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、人免疫缺陷病毒、冠状病毒和肝炎病毒。在另一个实施方案中，
所述流感病毒蛋白是HA和/或NA。在另一个实施方案中，所述呼吸道合胞病 毒病毒蛋白是F和/或G。在另一个实施方案中，所述登革病毒病毒蛋白是E 和/或preM/M。在另一个实施方案中，所述嵌合NDVVLP包含这样一种嵌合 蛋白，其中NDV HN和/或F蛋白的跨膜和/或C末端域与传染原(诸如流感、 VZV、 RSV和/或登革病毒)的蛋白质的外部域融合。在另一个实施方案中， 所述嵌合NDV VLP包含这样一种嵌合蛋白，其包含流感HA和/或NA蛋白的 外部域和NDV HN和/或F蛋白的跨膜和/或C末端域(参见例如SEQ ID NO 10)。在另一个实施方案中，所述嵌合的VLP包含SEQIDNO 10。
本发明的另 一个实施方案包括将不同的嵌合的VLP混合在一起以产生 多价配制剂。在另一个实施方案中，所述抗原性、疫苗和/或多价配制剂是给 脊推动物口服、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用的。
本发明的所述配制剂包括这样的配制剂，其包含上文所述的包含NDV M 蛋白和至少一种来自不同传染原的蛋白质的嵌合的VLP和药学可接受的载 体或赋形剂。药学可接受的载体包括但不限于盐水、緩冲盐水、右旋糖、水、 甘油、无菌等张緩沖水溶液，和它们的组合。对药学可接受的载体、稀释剂 和其它贝武开j剂的全面讨i仑呈J见于Remington，s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. N丄current edition)中。配制剂应当适合施用模式。在一个优选的实 施方案中，配制剂适于给人施用，优选制剂是无菌、非颗粒性(non-particulate) 和/或非热原性的。
若想要的话，组合物还可以含有小量的润湿剂或乳化剂，或pH緩冲剂。 组合物可以是固体形式，诸如适于重构的冻干粉末；液体溶液；悬液；乳液； 片剂；丸剂；胶嚢；持续释放配制剂；或粉剂。口服配制剂可包含标准的载 体，诸如药品级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳
酸镁等。
本发明还4是供药物包(pharmaceutical pack)或试剂盒，其包含一个或多个 容器，所述容器装有本发明疫苗配制剂的一种或多种成分。在一个优选的实 施方案中，所述试剂盒包含两个容器，其一装有VLP，另一个装有佐剂。所 述容器还可以伴有通告，该通告采取由监管药品或生物制品的生产、使用或 销售的政府部门规定的形式，反映该部门对于为了人体施用而生产、使用或 销售的许可。
28本发明还提供VLP配制剂包装在标示组合物量的密封容器诸如安瓿或
小药嚢(sachette)中。在一个实施方案中，VLP组合物作为液体提供，在另一 个实施方案中，作为密封容器中的干燥无菌冻干粉末或无水浓缩物提供，并 且可以用例如水或盐水重构为用于向受试者施用的合适浓度。
在一个备选的实施方案中，在标示VLP组合物的量和浓度的密封容器中 以液体形式提供VLP组合物。优选地，在密封容器中以至少约50pg/ml、更优 选至少约100吗/ml、至少约200pg/ml、至少500吗/ml、或至少lmg/ml提供液 体形式的VLP组合物。
一般而言，本发明的嵌合的NDV VLP以足以刺激针对一种或多种传染原 的免疫应答的有效量或数量(如上文定义的)施用。优选地，施用本发明的VLP 引发针对传染原的免疫。典型地，可以根据例如年龄、身体健康状况(physical condition),体重、性别、饮食、施用时间和其它临床因素，在该范围内调节 该剂量。预防性疫苗配制剂是全身施用的，例如通过使用针头和注射器或无 针头注射装置进行皮下或肌内注射来施用。或者，疫苗配制剂是鼻内施用的， 通过滴剂、大颗粒气溶胶(大于约10微米)、或喷雾入上呼吸道中。虽然上文 的任何递送途径均导致免疫应答，但鼻内施用还带来额外的益处，即在许多 病毒(包括RSV和流感)进入的部位引发粘膜免疫。
如此，本发明还包括诱导哺乳动物中针对感染或其至少一种症状的免疫 的疫苗或抗原性组合物的配制方法，包括向所述配制剂添加有效剂量的嵌合 的NDV VLP。
包含VLP的组合物(疫苗和/或抗原性配制剂)的施用方法包括，但不限 于，胃肠外施用(例如皮内、肌内、静脉内和皮下)、硬膜外、和粘膜(例如鼻 内和口腔或肺途径或通过栓剂)。在一个具体实施方案中，本发明的组合物 通过肌内、静脉内、皮下、透皮或皮内施用。组合物可以通过任何方便的途 径施用，例如通过输注或推注，通过经由上皮或粘膜皮肤衬里(例如口腔粘 膜、结肠、结膜、鼻咽、口咽、阴道、尿道、膀胱和肠粘膜等)的吸收，并 且可以与其它生物学活性剂一起施用。在一些实施方案中，含本发明VLP的 组合物的鼻内或其它粘膜施用途径所诱导的抗体或其它免疫应答可显著高 于其它施用途径。在另一个实施方案中，含本发明VLP的组合物的鼻内或其 它粘膜施用途径可诱导这样的抗体或其它免疫应答，所述抗体或其它免疫应 答会诱导针对引起感染的其它毒抹或生物体的交叉保护。例如，包含流感蛋白的嵌合的NDV VLP在给脊推动物施用时可以诱导针对数种流感毒抹的交 叉保护。施用可以是全身性的或者是局部的。
在又一个实施方案中，所述疫苗和/或抗原性配制剂以这样的方式施用， 使得其靶向粘膜组织，以在免疫部位引发免疫应答。例如，可以通过采用含 有具备特定粘膜靶向性质的佐剂的组合物的口服施用，来靶向粘膜组织例如 肠相关淋巴样组织(GALT)进行免疫。还可以耙向其它粘膜组织，例如鼻咽淋 巴样组织(NALT)和支气管相关淋巴样组织(B ALT)。
本发明的疫苗和/或抗原性配制剂还可以按照剂量日程表(dosage schedule)来施用，例如用疫苗组合物进行一次初次施用，随后进行多次加强 施用。在具体的实施方案中，第二剂组合物在初次施用后大约两周至一年的 任何时间，优选约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月到约6个月 施用。另外，可以在第二剂之后，且在距初次施用后约3个月至约两年甚至 更长时间，优选约4个月、约5个月、或者约6个月、或者约7个月至约1年施 用第三剂。在第二剂后在受试者的血清和/或尿或者粘膜分泌物中没有检测到 或者检测到低水平的特异性免疫球蛋白时，可任选地施用第三剂。在一个优 选的实施方案中，第二剂在第一次施用后约l个月施用，而第三剂在第一次 施用后约6个月施用。在另一个实施方案中，第二剂在第一次施用后约6个月 施用。在另一个实施方案中，所述本发明的VLP可用作为联合疗法的一部分 施用。例如，本发明的VLP可以与其它免疫原性组合物、抗病毒剂和/或抗生 素一起配制。
技术人员可以容易地确定药物配制剂的剂量，例如通过首先鉴定可有效 引发预防性或治疗性免疫应答的剂量，例如通过测量病毒特异性免疫球蛋白 的血清效价或通过测量血清样品或尿样品或粘膜分泌物中抗体的抑制比。所 述剂量可以由动物研究确定。用于研究疫苗功效的动物的非限制性目录包括 豚鼠、仓鼠、雪貂(ferret)、小鼠和棉鼠。大多数动物不是传染原的天然宿主， 但仍可用于该疾病的各个方面的研究。例如，可以对任何上文的动物定量给 予疫苗候选物，例如本发明的VLP,以部分地表征所诱发的免疫应答，和/ 或确定是否生成了任何中和性抗体。例如，已经在小鼠模型中进行了许多研 究，因为小鼠体型小，而且它们的成本低使得研究者可以进行更大规模研究。
另外，技术人员可以进行人体临床研究来确定用于人的优选有效剂量。 这样的临床研究是常规的，且为本领域公知。要使用的确切剂量还将依赖于施用途径。可以从源自体外或动物试验系统的剂量-应答曲线外推得到有效剂量。
如本领域中还公知的，可以使用免疫应答的非特异性刺激物来增强特定 组合物的免疫原性，这样的刺激物称为佐剂。实验上已经使用佐剂来促进针
对未知抗原的免疫的普遍增力口(例如美国专利号4,877,611)。免疫规程使用佐 剂来刺激应答已有多年，因此，本领域普通技术人员对佐剂是熟知的。有些 佐剂影响抗原呈递的方式。例如，在蛋白抗原被明矾沉淀时，免疫应答增加。 抗原的乳化也可延长抗原呈递的持续时间。本发明的范围意图涵盖Vogel等， "A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients(第2片反),，，(本文通过才是述 收录该文献全部内容用于所有目的)中所述任何佐剂的引入。
例示性的佐剂包括完全弗氏佐剂(一种免疫应答的非特异性刺激物，含 有已杀死的结核分枝杆菌(聊cc^a"eWwm /w6ercM/cw》)、不完全弗氏佐剂和 氢氧化铝佐剂。其它佐剂包括GMCSP、 BCG、氢氧化铝、MDP化合物诸如 thur-MDP和nor-MDP、 CGP (MTP-PE)、脂质A和单磷酰脂质A (MPL)。还设 想使用RIBI，其在2。/。角鲨烯/Tween 80乳液中含有从细菌提取的3种成分 MPL、海藻糖二霉菌酸(TDM)和细胞壁骨架(CWS)。还可以使用MF-59、 Novasomes 、 MHC抗原。
在本发明的 一 个实施方案中，所述佐剂是少片层(paucilamellar)脂质d 、 泡，其具有大约2到10个双层，它们排列成多个基本呈球形的壳的形式， 其由水性层隔开，所述水性层围绕着不含脂质双层的无定形中心大空腔。少 片层脂质小泡可以通过数种方式起作用来刺激免疫应答作为非特异性刺激 物、作为抗原载体、作为其它佐剂的载体，以及这些方式的组合。例如，在 通过混合抗原与预先形成的小泡，使得抗原相对于小泡保持在胞外的方法制 备疫苗时，少片层脂质小泡起非特异性免疫刺激物的作用。通过将抗原包嚢 在小泡的中心空腔中，小泡起到免疫刺激物和抗原载体两方面的作用。在另 一个实施方案中，小泡主要由非磷脂小泡构成。在其它实施方案中，小泡是 Novasomes。 Novasomes⑧是约100nm到约500nm范围的少片层非磷脂小泡。 它们包含Brij 72 、胆固醇、油酸和角篁烯。Novasomes已被证明是流感抗原 的有效佐剂(参见美国专利5，629,021、 6,387,373和4,911,928，本文通过提述 收录它们的全部内容用于所有目的)。
31-1、
IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-12、 IL-13);生长因子(例如粒细胞-巨噬细胞(GM)集落 刺激因子(CSF));和其它免疫刺激性分子，诸如巨噬细胞炎性因子，Flt3配 体、B7.1、 B7.2等。免疫刺激性分子可以与RSVVLP在同一配制剂中施用， 或者可以分开施用。可以施用蛋白质或者编码该蛋白质的表达载体来产生免 疫刺激效应。如此，在一个实施方案中，本发明包括包含佐剂和/或免疫刺激 物的抗原性配制剂和疫苗配制剂。
如此，本发明的一个实施方案包括这样的配制剂，其包z含、嵌合的VLP和 佐剂和/或免疫刺激物，所述嵌合的VLP包含新城疫病毒(NDV)核心蛋白(M), 至少一种来自传染原的蛋白质。在另一个实施方案中，所述佐剂是 Novasomes。在另一个实施方案中，所述配制剂适用于人施用。在另一个实 施方案中，所述配制剂是给脊推动物口服、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静 脉内或皮下施用的。在另一个实施方案中，将不同的嵌合的VLP混合在一起 以产生多价配制剂。
虽然优选用单剂刺激免疫，但是可以通过相同或不同路径施用额外的剂 量，以达到想要的效果。例如在新生儿和婴儿中，可能需要多次施用来引发 足够的免疫水平。按照维持足够水平的抗感染保护的需要，可以在整个儿童 期以一定间隔继续进行施用。类似地，特别容易受到反复或严重的感染的成 年人，例如卫生保健工作者、日间护理工作者、幼儿的家人、老年人、以及 心月申功能受4员的个体(individuals with compromised cardiopulmonary flmction) 等，可能需要进行多次免疫来建立和/或维持保护性免疫应答。可以通过例如 测量中和性分泌和血清抗体的量来监测诱导产生的免疫的水平，并按照S1发 和维持期望的保护水平的需要来调整剂量或重复接种。
刺激免疫应答的方法
如上文所提及，本发明的VLP可用于制备刺激免疫应答的组合物，所述 免疫应答赋予针对传染原的免疫或实质的免疫。粘膜免疫和细胞免疫均可贡 献于针对传染原和疾病的免疫。在上呼吸道中局部分泌的抗体是针对自然感 染的抗性中的主要因素。分泌型免疫球蛋白A (slgA)参与上呼吸道的保护，而血清IgG参与下呼吸道的保护。感染所诱导的免疫应答:fe御同一病毒或抗 原性类似的病毒抹的再次感染。例如，流感经历频繁而不可预测的变化，因 此，自然感染后，针对人群中流行的新病毒抹，宿主免疫提供的有效保护期 可能仅有少数几年。
本发明的嵌合的NDV VLP在施用于脊推动物(例如人)时可以在所述脊 推动物中诱导实质的免疫。实质的免疫由针对本发明的VLP的免疫应答导 致，在所述脊推动物中保护或改善感染或者至少减轻感染的症状。在一些情 况下，如果所述脊推动物被感染，所述感染将是无症状的。所述应答可能不 是完全保护性的应答。在此情况下，如果所述脊推动物感染了传染原，该脊时间。
在一个实施方案中，本发明包括诱导受试者体内针对感染或其至少一种 症状的实质免疫的方法，包括施用至少一个有效剂量的嵌合的NDVVLP。在 另 一个实施方案中，本发明包括一种针对RSV对哺乳动物进行接种的方法， 包括给所述哺乳动物施用诱导保护的量的包含嵌合NDV VLP的VLP。在一个 实施方案中，所述方法包括施用这样的VLP，其包含NDVM蛋白和NDVF、 HN和/或NP蛋白、或其部分，和/或PIV F和/或HN蛋白、或其部分，和/或上 文所述的任何嵌合蛋白。
在另一个实施方案中，本发明包括一种在受试者中诱导针对感染或其至 少一种症状的保护性抗体应答的方法，包括施用至少一个有效剂量的嵌合的 NDV VLP,其中所述VLP包含NDV M蛋白和NDV F、 HN和/或NP蛋白、或 其部分，和/或PIV F和/或HN蛋白、或其部分，和/或上文所述的任何嵌合蛋 白。
如本文所使用的，术语"抗体"是包含一个或多个基本上或者部分地由 免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽的蛋白质。公认的免疫球 蛋白基因包括k、 x、 a、 y、 S、 s和ia恒定区基因和众多免疫球蛋白可变区基 因。轻链分为K或人。重链分为y、 p、 a、 S或s，它们继而分别定义了免疫球 蛋白的类型IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(抗体)结构单 位包含四聚体。每个四聚体由同样的两对多肽链组成，每对具有一条"轻" (大约25kD)链和一条"重"(大约50-70kD)链。每条链的N末端定义一个约 100-110个或更多氨基酸的可变区，它主要负责抗原识别。抗体作为完整的免
33疫球蛋白存在，或者作为若干通过各种肽酶消化而产生的、已充分表征的片 段存在。
在另 一个实施方案中，本发明包括一种在受试者中诱导针对感染或其至 少一种症状的保护性细胞应答的方法，包括施用至少一个有效剂量的嵌合的
NDVVLP,其中所述VLP包含NDV M蛋白和NDV F、 HN和/或NP蛋白、或 其部分，和/或PIV F和/或HN蛋白、或其部分，和/或上文所述的任何嵌合蛋 白。细胞介导的免疫也在从感染的恢复中起作用，并可以预防别的并发症， 并有助于长期免疫。
如上文所提及，本发明的VLP预防或减轻受试者中感染的至少 一种症 状。大多数感染的大多数症状是本领域公知的。如此，本发明的方法包括预 防或减轻与感染有关的至少 一种症状。症状的减轻可以主观地或者客观地确 定，例如通过受试者的自我评估、由内科医生评估、或通过实施合适的测定 或测量(例如体温)，包括例如生活质量评1^介、RSV感染或其它症状的进展减 慢、RSV症状的严重程度降低或者合适的测定法(例如抗体效价和/或T细胞活 化测定法)。客观评价包括动物和人的评价。
通过下面的实施例进一步例示本发明，这些实施例不应解释为限制性 的。本文通过提述收录本申请中引用的所有参考文献、专利和已公开的专利 申请，以及附图和序列表用于所有目的。
实施例
实施例l
包含流感蛋白的嵌合的NDV VLP
构建来自新城疫病毒的膜(M)蛋白和/或核蛋白(NP)蛋白的构建体，和包 含与NDV HN和/或F的跨膜和/或C末端域融合的流感HA和/或NA蛋白序列外 部域的嵌合蛋白(参见例如SEQ ID NO 10)。图l中显示了这些构建体。对构 建体进行密码子优化，然后经由一系列步骤(如上文所述的)而克隆入杆粒载 体中，接着通过噬斑分离来挽救重组杆状病毒。然后感染昆虫细胞，并在容 许VLP形成的条件下培养。对VLP进行分离和纯化，如上文所述的。
实施例2嵌合的NDVVLP
为了形成具有NDV核心的用于其它靶物的VLP,将天然和/或嵌合分子克隆入杆状病毒中。通过表达来自NDV的M和NP基因及包含与来自传染原 (诸如VZV、 RSV、登革病毒)的蛋白质的外部域融合的NDVHN或F蛋白跨膜 和C末端域的嵌合蛋白来制备嵌合的VLP。对此类构建体进行密码子优化， 并经由一系列步骤(上文所述的)而克隆入杆粒中，接着通过噬斑分离来挽救 重组杆状病毒。
如上文所述，通过借助于重组杆状病毒的共感染来挽救这些靶物中每一 个的VLP，所述重组杆状病毒(l)表达用于VLP核心形成的NDV M和/或NP， 并(2)表达如上所述的嵌合蛋白。下文是可以在制备嵌合NDV VLP中使用的 代表性NDV蛋白序列。 NDV M蛋白(SEQ ID NO : 1 )
mdssrtIGL YFDSALPSSNliLAFP IVLRDVGDGKKQ ITPQY'R I服LDSWTDSKEDSVF ittygfIFQVGNEEVTV cmindnpkrei,L,SA腦LCLGSVPWVGDPVEI,ARACLTMWTC鹏ATNTERMVFSWQAPRVLQSCRWADKYSS VNAVKHVKAPEKIPGSETLEYKVNFVSLTWPKKDVYKIPTAVLKVSGSSLYNLALNVTIDVEVDPKSPLVKSLS RSDSGYYAMljFMIGLiMSTVDKRGKKyTFDOljERKTRRLD.LSVGljSDVTjGPSVLVKARGARTRLLAPFFSNSCTA CYPIANASPQVAKILWSQTACIjRSVKIIIQAGTQRAVAVTADHEVTSTKIEKRHTIAKYNPFKK*
NDV F蛋白 (SEQ ID NO : 2)
mgprsstripvplmljtiritijalsyvrltssldgrpliaaagiwtgdkavniytssargsiivklijpnmpkdkka cakapleaynrtlttli/tplgdsirriqesvttsggrrqrrfigaiigsvalgvataaqitaasaliqanqnaan ilrlkesiaatneavhevtgglsqiavavgkmqqftoidqfnntaqeldcikiaqqtovelnlyltemtvfgpqi tspmjqijtvqalymlaggnvdyixltklgvgnnqljssligsgijitgnpifydsqtqlligiqvtusvgnlninmra ty:lst:lsvsitkgpasalvpkwtgvgsvieelotsyctem);ldIjYctr.ivtfpmspgiysclsgntsacmyskt
EGAL,TTPYMTIjKGSWANCQMTTCRCADPPGIISONYGEAVS:LIDKHSCNWSLDGIT:LRLSGEFDATYQKNISI mykqkaqrktllwlgnntldqmrattkm*
对ND V—F的跨膜区预测
开始 结束 外部 1 502
跨膜螺旋 503 525
内部(胞质的) 526 553
NDV HN蛋白 (SEQ ID NO: 3)
YLALGVLRTSATGRVFFSTLRSINLDDAQNRKSCSVSATPLGCDMLCSKITETEEEDYKSVIPTSMVH
NDTCPDEQDYQIRMAKSSYKPGRFGGKRVQQAIIiSIKVSTSLGEDPVLTVPPNTVALMGAEGRVLTVG
TSi!
IAEISNTLFGEFRIVPLLVEILKDGGV*
NDV NP蛋白 (SEQ ID NO: 4)
MSSVFDEYEOLLAAQTRPNGAHGGGEKGSTLKVEVPVFTLNSDDPEDRWNFAVFCLRIAVSEDANKPLRQGALIS LLCSHBQVMRNHVALAGKQNEATLAVLEIDGFTNSVPQFNNRSGVSEERAQRFIjMIAGSLPRACSNCTPFTTAGV EDDAPEDITDTLERIISIQAQVWVTVAKAMTAYETADESETORINKYMQQGRVQKKYIIjHPVCRSAIQIjTIRQSIjavriflvselkrgrkrtaggsstyyslvgdidsyirntgltaffltlkygintktsalalsslagdigkmkqlmrl '/rmkgdnapymtllgdsdqmsfapaeyaqlysfamgmasvldkgtgkyqfardfmstsfwrlgveyaraqgssin
edmaae.lkltpaar:rg:laaaaq:raseetgsmdiptqqagv:ltgls;dggpqapqgglnrsqgqpdagdgetqfld.l mravansmreapnsvqnttqqeppstpgpsqdkiotdwgy*
经过密码子优化的NDV M蛋白(SEQ ID NO : 5)
atggactcttctagaaccatcggtttgtacttcgactctgctttgccatcttctaacttgttggctttcccaatc gttttgagagacgttsgtgacggtaagaagcaaatcaccccacaatacagaatcagaagattggactcttggacc
gactctaaggaagactctgttttcatcaccacctacggtttcatcttccaagttggtaacgaagaagitaccgtt GGTATGATCAACGACAACCCAAACmGAGAATTGTTGTCTGCTCCTATGTTGTGTTraGGTTCTGTTCCAAACGTT G:S.rGACCCAGTTGAATTGGCTAGAGCTTGTTTGACCATGGTTGTTACCTGTAAGAAGTCTGCTACCAACACCGAA ASAATGGTTTTCTCTGTTGTTCAAGCTCCAAGAGTTTTCCAATCTTGTAGAGTTCTTGCTGACAAGTACTCTTCT
G1TTCTTTC3ACCGTTGTTCCAAAGAAGGACGTTTACAAGATCCCAACCGCTGTTTTGAAGGTTTCTGCTTCTTCT TTG'tacaacttggctttgaacgttaccatcgacgttgaagttgacccaaagtctccattggttaagtctttotct agatctgactctggttactacgctaacttgttcttgcacatcggtitgatgtctaccgttgacaagagaggtaag AAC;gttaccttcgaccaattcgaaagaaagatcagaagattggacttgtctgttggtttgtctgacgttttgggt CCATCTGTTTTGSGTTAAGGCTAGAGGTGCTAGAACCAffiVTTGTTGGCTCCMTCTTCTCTAACTCTGGTACCGCT ■TGTTACCCAATCGCTAACGC'rTCTCCACAAGrraCTAAGATCTTCTGGTCTCAAACCGCTTCTTTGAGATCTGTT
GAAAAGAGACACACCATCGCTAAGTACAACCCATTCAAGAAGTC3A
经过密码子优化的NDV F蛋白(SEQIDNO: 6)
ATGGGTCCAAi3ATCTTCTACC'agaatcccagttccatt(3ATGTTGACCATCAGAATCACCTTGGCTTTGTCTTAC gttagattgacctcttctttogacggtagaccattggctgctgctggtatcgttgttaccggtgacaaggctgtt aacatctacacctcttctcaaaccggttctatcatcgttaagttgttcccaaacatgccaaaggacaaggaagct tgtgctaaggctccattggaagcttacaacagaaccttgaccaccttgttgaccccattggctgactctatcaga AGAATCCAAGAATCTGTTACCACCTCTGGTGGITAGAAGACAAAGAAGATTCATCGGTCCTATCATCGGTTCTGTT GCTTTGGGTGT3'GCTACC(3CTGCTCAAATCACC(3CTGCTTCTGCTTTGA'rCCAAGCTAACCAAAACGCTGCTAAC ATCTTGAGATTGAAGGAATCTATCGCTGCTACCAACGAAGCTGTTCACGAAGT'mCCGGTGGTTTCTCTCAATTG GCTGTTGCTGirGGTAAGATGCAACAATTCCTTAACGACCAATTCAACAACACCGCTCAAGAATTGGACTGTATC aagatcgctcaacaagttggtgttgaattgaacttgtacttgaccgaattgaccaccgttttcggtccacaaatc
accaagttgggtgttggtaacaaccaattgtcttctttgatcggttctggtttgatcaccggtaacccaatcttc TACGACTCTCAAACCCAA:ttgttgggtatccaagttaccttgccatctgttggtaacttgaacaacatgagagct ACCTACTTGGAAACCTTGTC'tgttoctaccaccaagggtttcgcttctgctttggttccaaaggttgttacccaa STTGCTTCTGTTATCGAAGAATTGGACACCTCTTACTGTATCGAAGCTGACTTGGACTTGTACTGTACCAGAATC G'rrACCTTCCCAATGTCTCCAGGTATCTACTCTTGTTTGTCTGGTAACACCTCTGCTTGTATCTACTCTAAGACC C;AAGGTG(二T工'TGACCACCCCATACM'gaccttgaaggcttctgttgttgctaactgtcaaatgaccacctgta(3a tgtgctgacccaccaggtatcatctctcaaaactacgctgaagctgtttctttgatcgacaagcactcttgtaac cttgtttctttggacggtatcaccttgagattgtctgctgaattcgacgctacctaccaaaagaacatctctatc ttggactctcaagttttgcttaccggtaacttggacatctctaccgaattgggtaacgttaaccactctatctct aacgotttggacaagttggaagaatctaactctaagttggacaaggitaacgttagattgacctctacctctgct ttgatcacctacatcgttttgaccgttatctcttt03ttttgggtatgttctctttggttttggcttgttacttg
经过密码子优化的NDV HN蛋白(SEQ ID NO: 7)
ATC;gactctgctgtttctcaagttgctttggaaaacgacagaagagaagctaaggacacctggagattgcttttc AGAATCGCTGCTTTCT'tgttgatggttatcaccttggctgtttctgctgttgctttggcttactctatggaagct tctaccccaggtgacttggtttctatcccaaccgctatctacagagctgaagaaagaatcacctctgctttgggt 'rCTAACCAft(3acgttgttgacagaatctacaagcaagttgctttggaatctccattggctttgttgaacaccgaa TCTATCATCATGAACGCTATCACCTCTTTGTCTTACCAAATCAACGGTGCTACCAACAACTCTGGTTGTGGTGCT CCAGTTCACGACCCAGAC'tacatcggtggtatcgotaaggamtgatcgttgacgacacctctgacgttacctct ttctacccatctgctttccaagaacacttgaacttcatcccagctccaaccaccggttctggttgtaccagsatc ccatctttcgacatgtctgctacccactactgttacacccacaacgttatcttgtctggttgtagagaccactct cactctcaccaatacttggctttgggtgttttgagaacctctgctaccggtagagttttcttctctaccttgaga rC'rATCAACTTGGACGACGCTCAAAACAGAAAGTCTTGTTCTCTTTCTGCTACCCCATTGGGTTGTGACMGTTG tgttctaagatcaccgaaaccgaagaagaagactacaagtctgtttvtcccaacctctmggttcacggtagattg ggtttcgacggtcaataccacgaaaaggacttggacgttaccaccttgttcagagactgggttgctaactaccca ::;stgttsgtggtggttctttcatcaacaacagagtttggttcccagtttacggtggtttgaagccatcttctcca
36TCTGACACCGCTCAAGAAGGTAGATACGTTATCTACAAGAGATACAACGACACCTGTCCAGACGAACAAGACTAC CflAATCAGaATGGCTAM3TCTTCTTACAAGCCAGGTAGATTCGGTGCTAAGAGM31TCAACAAGCTATCTTGTCT ATCAAGGTTTCTACCTCTTTGGGTGAAGACCCAGTTTTGACCGTTCCACCAAACACCGTTGCTTTGATGGGTGCT GAAGGTAGAG'TTTTOACCGTTGGTACCTCTCACTTCTTGTACCAAAGAGGTTCTTCTTACTTCTCTCCAGCTTTG TTGTACCCAATG'ACCGTTAACflACAAGACCGCTACCTTOCACAACCCATACACCTTCAACGCTTTCACCM3ACCA GGTTCTGTTCCAT(3TCAAGCTTCTGCTAGATGTCCAAACTCTTGTCTTACCGGTGTTTACACCC3ACCCATACCCA TTGGTTTTCCACAGAAACCACACCTTGAGAGGTGTTTTCGGTACCATGTTGGACGACAAGCAAGCTAGATTGAAC CCAGTTTCTGCTGTTTTCGACAACATCTCTAGATCTAGAATCACCAGAGTTTCTTCTTCTTCTACCAGAGCTGCT TACACCAC'CTCTACCTGTTTCAAGGTTGTTAAGACCAACAAGACCTACTGTTTGTCTATCGCTGAAATCTCTAAC ACCTTC3TTCGGTGAATTCAGAATCGTTCCMTGTTGGTTGAAATCTTGAAGGACGGTGGTGTTTGA
经过密码子优化的NDV NP蛋白(SEQ ID NO : 8)
ATGTCTTCTGTTTTCGACGAATACGAACAATTGTTGGCTGCTCAAACCAGACCAAACGCTGCTCACGGTGGTGCT gaaaagggttctaccttgaaggttgaagttccagttttcaccttgaactctgacgacccagaagacagatggaac TTCGCTGTTTTCTGTTTGAGAATCGCTCTTTCTGAAGACGCTAaCAAGCCATTGAGACAAOSTGCTTTGATCTCT TTGTTGTC3TTCTCACTCTCAAGTTATGAGAAACCACGTTGCTTTGGCTGGTAAGCAAAAC(3AAGCTACCTTGGCT GTTTTGGAAA'rCGACGGTTTCACCAACTCTGTTCCACAATTCAACAACAGATCTGGTGTTTCTGAAGAAAGAGCT CAAAGATTCTTGATGATCGCTGGTTCT1TGCCAAGAGCTTGTTCTAACGGTACCCCATTCACCACCGCTGGTGTT GAAGACGACGCTCCAGAAGACATCACCGACACCTTGGAAAGAATCATCTCTATCCAAGCTCAAGTTTGGCTTACC GTTGCTAAGGCTATGACCGCTTACGAAACCGCTGACGAftTOTGAAACCAGAAGAATCAACAAGTACATGCAACAA GGTAGAGTTCAAAAGA船mCATCTTGCACCCACTTTCTAGATCTGCTATCCAATTGACCATCAGACAATCTTTG GCT'GTTAGAA'rCTTCTTGGTTTCTGAATTGAAGAGAGGTAGAAACACCGCTGGTGGTTCTTCTACCTACTACTCT TT.SGTTGGTGACATCGACTCTmCATCAGAAACACCGGTTTGACCGCTTTCTTCTTGACCTTGAAGTACGGTATC aacaccaagacctctgctttggctttgtcttctttggctgctgacatccaaaagatoaagcaattgatgagattg TACAGAATGAAGGGTGACAACGCTCCATACATGACCTTGTTGGGTGACTCTGACCAAATCTCTTTCGCTCCAGCT GflATACGCTCAATTGTACTCTTTCGCTATGGCTATGGCTTCTCTTTTGGACAAGGCTACCGGTAAGTACCAATTC GCTAGAGACTTCATGTCTACCTCTTTCTGGAGATTGGGTGTTGAATACGCTAGAGCTCAAGGTTCTTCTATCAAC GAA:GACATGGCTGCT(5AATTG皿G1TGACCCCAGCTGCTAGAAGAGGTTTGGCTGCTGCTC5CTCAAAGA0CTTCT gaagaaaccggttctatcgacatcccaacccaacaagctggtgttttgaccggtttctctgacggtggtccacaa GCTCCACM(3GTGG'rrre緒CAGATCTCAAGGTCAACCAGACGCTGGTGACGGTGAAACCCAATTCTTGGACTTG
ACCCCAGGTCCATCTCAAGACAACGACACCGACTGGGGTTACTGA
流感HA序列(SEQ ID NO 9)
EVTNATEIjVG DIjFVERSKAY TSSACK皿SN
TIVKPGDIIxL NGSIPNDKPF IAGFIE眼ffi IGKTNEKFHQ ■HTIDIjTDSEM TTOHDVYRDE
IjCIjVFAQKLP SSSTGGICDS SNCYPYDVPD KSFFSKLNWIi YAQASGRITV INSTGNIjIAP GN聰MTYGA GMVDGWYGFR 工EKEFSEVEG NKLFERTKKQ ALN服FQIKG RCNICI*
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FliLCTALiliGF
对曱型流感H3N2 (福建毒抹)HA蛋白的跨膜区预测
开始 结束 外部 1 529
TM (跨膜)螺旋 530 552
内部(胞质的) 552 566
提议的嵌合[流感HA]-[NDV F]蛋白(SEQ ID NO 10)MKTimLSYI .LCLVFAQKLP GNDNSTATLC LGHHAVPNGT iwtitmdqi evtnatelvq ssstggicds phqildgenc tlidallgdp 。cdgf。nkkw dlf'vsrskay sncypyt'TOD Yfl^RS'LVAS SGTLEFNNES FNWTGVTQNG tssackrrsn ksffsri週i—, THI..,kykypal; NVTMP,EKF DKLYIWGVLH
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氨基酸残基
1-529 福建HA
530-580NDVF(跨膜螺旋加双下划线，而胞质域加单下划线)
本文通过提及而收录所有出版物和专利申请，其程度就像明确且单独指 明通过提及而收录每篇单独的出版物或专利申请一样。
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权利要求
1.一种嵌合的病毒样颗粒(VLP)，其包含新城疫病毒(NDV)核心蛋白(M)和至少一种来自不同传染原的蛋白质。
2. 权利要求1的VLP，其中所述来自传染原的蛋白质是病毒蛋白。
3. 权利要求2的VLP，其中所述病毒蛋白是包膜结合蛋白。
4. 权利要求3的VLP,其中所述包膜结合蛋白在所述VLP的表面上表达。
5. 权利要求3的VLP，其中所述包膜结合蛋白包含会在脊推动物中产生保护性免疫应答的表位。
6. 权利要求1的VLP，其中所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含与副流感病毒(PIV)蛋白或其片段融合的所述来自不同传染原的蛋白质。
7. 权利要求6的VLP，其中所述来自不同传染原的蛋白质是病毒蛋白。
8. 权利要求6的VLP，其中所述PIV蛋白选自由PIVHN和F蛋白组成的组。
9. 权利要求7的VLP，其中所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所述PIV蛋白的一部分。
10. 权利要求9的VLP，其中病毒蛋白的所述部分在所述VLP的表面上表达。
11. 权利要求10的VLP，其中病毒蛋白的所述部分包含会在脊推动物中产生保护性免疫应答的表位。
12. 权利要求9的VLP，其中PIV蛋白的所述部分与NDVM蛋白结合。
13. 权利要求2的VLP,其中所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含与NDV蛋白或其片段融合的所述病毒蛋白。
14. 权利要求13的VLP，其中所述NDV蛋白选自由NP、 F、和HN蛋白组成的组。
15. 权利要求13的VLP，其中所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所述NDV蛋白的一部分。
16. 权利要求15的VLP，其中病毒蛋白的所述部分在所述VLP的表面上表达。
17. 权利要求15的VLP，其中病毒蛋白的所述部分包含会在脊推动物中产生保护性免疫应答的表位。
18. 权利要求15的VLP,其中NDV蛋白的所述部分与NDVM蛋白结合。
19. 权利要求2的VLP，其中所述病毒蛋白来自选自下组的病毒流感病毒、登革病毒、黄病毒、单纯疱渗病毒I和II、狂犬病病毒、副流感病毒、水痘带状疱渗病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、人免疫缺陷病毒、冠^)犬病毒禾P肝炎病毒。
20. 权利要求19的VLP，其中所述流感病毒蛋白是HA和/或NA。
21. 权利要求19的VLP，其中所述呼吸道合胞病毒病毒蛋白是F和/或G。
22. 权利要求19的VLP,其中所述登革病毒病毒蛋白是E和/或preM/M。
23. —种生成嵌合的VLP的方法，其包括转染编码新城疫病毒(NDV)病毒核心蛋白(M)和至少 一种来自不同传染原的蛋白质的载体，并在容许VLP形成的条件下表达所述载体。
24. 权利要求23的方法，其中所述来自传染原的蛋白质是病毒蛋白。
25. 权利要求24的方法，其中所述病毒蛋白是包膜结合蛋白。
26. 权利要求24的方法，其中所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含与副流感病毒(PIV)蛋白或其片段融合的所述病毒蛋白。
27. 权利要求26的方法，其中所述PIV蛋白选自由HN和F蛋白组成的组。
28. 权利要求26的方法，其中所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所述PIV蛋白的一部分。
29. 权利要求26的方法，其中PIV蛋白的所述部分与NDVM蛋白结合。
30. 权利要求24的方法，其中所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含与NDV蛋白融合的所述病毒蛋白。
31. 权利要求30的方法，其中所述NDV蛋白选自由NP、 F、和HN蛋白组成的组。
32. 权利要求30的方法，其中所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所述NDV蛋白的一部分。
33. 权利要求30的方法，其中NDV蛋白的所述部分与NDVM蛋白结合。
34. 权利要求24的方法，其中所述病毒蛋白来自选自下组的病毒流感病毒、登革病毒、黄病毒、单纯疱渗病毒I和II、狂犬病病毒、副流感病毒、水痘带状疱療病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、人免疫缺陷病毒、冠状病毒和肝炎病毒。
35. 权利要求34的方法，其中所述流感病毒蛋白是HA和/或NA。
36. 权利要求34的方法，其中所述呼吸道合胞病毒病毒蛋白是F和/或G。
37. 权利要求34的方法，其中所述登革病毒病毒蛋白是E和/或preM/M。
38. —种抗原性配制剂，其包含嵌合的VLP，所述嵌合的VLP包含新城疫病毒(ND V)核心蛋白(M)和至少一种来自不同传染原的蛋白质。
39. 权利要求38的抗原性配制剂，其中所述来自传染原的蛋白质是病毒蛋白。
40. 权利要求39的抗原性配制剂，其中所述病毒蛋白在所述VLP的表面上表达。
41. 权利要求40的抗原性配制剂，其中病毒蛋白包含会在脊推动物中产生保护性免疫应答的表位。
42. 权利要求39的抗原性配制剂，其中所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含与副流感病毒(PIV)蛋白或其片段融合的所述病毒蛋白。
43. 权利要求42的抗原性配制剂，其中所述PIV蛋白选自由HN和F蛋白组成的组。
44. 权利要求42的抗原性配制剂，其中所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所述PIV蛋白的 一部分。
45. 权利要求44的抗原性配制剂，其中病毒蛋白的所述部分在所述VLP的表面上表达。
46. 权利要求42的抗原性配制剂，其中病毒蛋白的所述部分包含会在脊推动物中产生保护性免疫应答的表位。
47. 权利要求42的抗原性配制剂，其中PIV蛋白的所述部分与所述NDVM蛋白结合。
48. 权利要求39的抗原性配制剂，其中所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含与NDV蛋白融合的所述病毒蛋白。
49. 权利要求48的抗原性配制剂，其中所述NDV蛋白选自由NP、 F、和HN蛋白组成的组。
50. 权利要求48的抗原性配制剂，其中所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所述NDV蛋白的一部分。
51. 权利要求50的抗原性配制剂，其中病毒蛋白的所述部分在所述VLP的表面上表达。
52. 权利要求50的抗原性配制剂，其中病毒蛋白的所述部分包含会在脊推动物中产生保护性免疫应答的表位。
53. 权利要求50的抗原性配制剂，其中NDV蛋白的所述部分与所述NDV M蛋白结合。
54. 权利要求39的抗原性配制剂，其中所述病毒蛋白选自下组流感病毒、 登革病毒、黄病毒、单纯疱渗病毒I和II、狂犬病病毒、副流感病毒、水 痘带状疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、人免疫缺陷病毒、冠 ^j犬病毒和肝炎病毒。
55. 权利要求54的抗原性配制剂，其中所述流感病毒蛋白是HA和/或NA。
56. 权利要求54的抗原性配制剂，其中所述呼吸道合胞病毒病毒蛋白是F和/ 或G。
57. 权利要求54的抗原性配制剂，其中所述登革病毒病毒蛋白是E和/或 preM/M。
58. 权利要求38的抗原性配制剂，其进一步包含佐剂。
59. 权利要求58的抗原性配制剂，其中所述佐剂是Novasomes。
60. 权利要求38的抗原性配制剂，其中所述配制剂适合于人施用。
61. 权利要求38的抗原性配制剂，其中不同嵌合的VLP被混合在一起以产生多价配制剂。
62. 权利要求38的抗原性配制剂，其中所述配制剂是给脊推动物口服、皮内、 鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用的。
63. —种疫苗，其包含嵌合的VLP,所述嵌合的VLP包含新城疫病毒(NDV) 核心蛋白(M)和至少一种来自不同传染原的蛋白质。
64. 权利要求63的疫苗，其中所述来自传染原的蛋白质是病毒蛋白。
65. 权利要求64的疫苗，其中所述病毒蛋白在所述VLP的表面上表达。
66. 权利要求65的疫苗，其中所述病毒蛋白包含会在脊推动物中产生保护性 免疫应答的表位。
67. 权利要求64的疫苗，其中所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包 含与副流感病毒(PIV)蛋白或其片段融合的所述病毒蛋白。
68. 权利要求67的疫苗，其中所述PIV蛋白选自由HN和F蛋白组成的组。
69. 权利要求67的疫苗，其中所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所 述PIV蛋白的一部分。
70. 权利要求69的疫苗，其中病毒蛋白的所述部分在所述VLP的表面上表 达。
71. 权利要求69的疫苗，其中病毒蛋白的所述部分包含会在脊推动物中产生 保护性免疫应答的表位。
72. 权利要求69的疫苗，其中PIV蛋白的所述部分与所述NDVM蛋白结合。
73. 权利要求64的疫苗，其中所述VLP含有嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包 含与NDV蛋白融合的所述病毒蛋白。
74. 权利要求73的疫苗，其中所述NDV蛋白选自由NP、 F、和HN蛋白组成的组。
75. 权利要求73的疫苗，其中所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所 述NDV蛋白的一部分。
76. 权利要求75的疫苗，其中病毒蛋白的所述部分在所述VLP的表面上表达。
77. 权利要求75的疫苗，其中病毒蛋白的所述部分包含会在脊推动物中产生 保护性免疫应答的表位。
78. 权利要求75的疫苗，其中NDV蛋白的所述部分与所述NDVM蛋白结合。
79. 权利要求64的疫苗，其中所述病毒蛋白选自下组流感病毒、登革病毒、 黄病毒、单纯疱渗病毒I和II、狂犬病病毒、副流感病毒、水痘带状疱渗 病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、人免疫缺陷病毒、冠状病毒和肝 炎病毒。
80. 权利要求79的疫苗，其中所述流感病毒蛋白是HA和/或NA。
81. 权利要求79的疫苗，其中所述呼吸道合胞病毒病毒蛋白是F和/或G。
82. 权利要求79的疫苗，其中所述登革病毒病毒蛋白是E和/或preM/M。
83. 权利要求63的疫苗，其进一步包含佐剂。
84. 权利要求63的疫苗，其中所述佐剂是Novasomes。
85. 权利要求63的疫苗，其中不同嵌合的VLP被混合在一起以产生多价配制剂。
86. 权利要求63的疫苗，其中所述配制剂是给脊推动物口服、皮内、鼻内、 肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下施用的。
87. —种在脊推动物中诱导免疫的方法，包括给所述脊推动物施用嵌合的 VLP,所述嵌合的VLP包含新城疫病毒(NDV)病毒核心蛋白(M)和至少一 种来自不同病毒的病毒蛋白。
88. 权利要求87的方法，其中所述来自传染原的蛋白质是病毒蛋白。
89. 权利要求87的方法，其中所述免疫应答是体液免疫应答。
90. 权利要求87的方法，其中所述免疫应答是细胞免疫应答。
91. 一种诱导针对抗原组合物的免疫应答的方法，所述抗原组合物包含嵌合的VLP，所述嵌合的VLP包含新城疫病毒(NDV)病毒核心蛋白(M)和至少一种来自不同病毒的病毒蛋白。
全文摘要
本发明公开并要求保护表达和/或含有新城疫基质蛋白的嵌合病毒样颗粒(VLP)。本发明包括包含所述蛋白质的载体构建体、包含所述构建体的细胞、包含本发明的嵌合的VLP的配制剂和疫苗。本发明还包括制备嵌合的VLP和给脊椎动物施用嵌合的VLP的方法，包括诱导针对感染的免疫的方法。
文档编号C12N15/63GK101668857SQ200880012924
公开日2010年3月10日 申请日期2008年2月21日 优先权日2007年2月21日
发明者库塔布·马穆德, 彼得·普什科, 盖尔·史密斯 申请人:诺瓦瓦克斯股份有限公司