专利名称：一种包括肝羧酸酯酶1的用于诊断肝癌的血浆生物标记物工具及肝癌筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种用于肝癌(hepatocellular carcinoma ； HCC)的诊断的血浆生物标记物(羧酸酯酶1)以及相关的确定健康志愿者与患有HCC的病人之间的差异生物标记物 表达的筛选方法，该筛选方法采用双向荧光凝胶电泳O-D DIGE)、免疫沉淀以及纳升液 相色谱质谱(Nano-LC-MS/MS)系统。分泌到血浆中的生物标记物蛋白的量被测定并被 用作HCC的存在的指示。
背景技术：
肝癌(HCC)在全世界是第五大最常见的癌症并且具有第四高的致死率。它是亚 洲和非洲人群中特别主要的问题。与患有其他癌症(例如，肺癌和乳腺癌)的病人不同， 95%以上的HCC病人在诊断患有HCC的五年内死亡。
尽管HCC是不断研究的对象，并且它的症状已经众所周知，但是该疾病的早期 诊断仍然困难并且确诊后的存活率非常低(3%至5%)。
除了通过计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)用来诊断HCC的活组织切 片检查以外，诸如血浆之类的体液提供了临床样品以允许蛋白的同时测量来确定可能存 在 HCC。
如今，生物标记物甲胎蛋白(AFP)、des- Y -羧基凝血酶原(DCP)、 glypican-3 (GPC3)、α -1-岩藻糖苷酶以及转化生长因子_bl已被单独或组合地用于HCC 病人的临床筛选。尽管这些生物标记物对于HCC的检测是有用的，但是它们存在敏感性 和/或特异性差的问题。例如，已被用作HCC的血清标记物多年的甲胎蛋白具有低敏感 性(39%至65% )和中等特异性(76%至94% )。因此，急需一类新的具有提高的敏感性 和特异性并能早期诊断HCC的生物标记物。
本发明的发明人已经发现了是HCC的特异生物标记物的N-连接糖基化蛋白。 通过双向凝胶电泳O-D DIGE)和纳升液相色谱质谱(Nano-LC-MS)鉴定出了该蛋白， 即，人肝羧酸酯酶1 (hCEl)，并发现该蛋白在从健康志愿者和HCC病人获得的临床血浆 样品中差异表达。
已知主要在肝脏中表达的候选的HCC生物标记物蛋白(hCEl)在HCC组织中相 对于正常肝组织以较低水平表达。然而，没有关于在人体液(即，血浆)中直接检测到分 泌的hCEl蛋白的报道。与此一致的是，本发明的发明人对公共血浆蛋白数据库Chttp:// www.plasmaproteomedatabase.org)的检索未能发现血浆中存在hCEl的证据。
有关人血浆中的hCEl的在先研究已经使用采用了非特异性基质、三油酸甘油酯 或乙酸对硝基苯酯的酶测定法，来测量通过琼脂糖亲和色谱纯化的样品中的hCEl或其异 形物的活性。然而，最近已经报道该水解活性可能归因于同样存在于人血浆中的丁酰胆 碱脂酶、对氧磷酶(paraoxonase)和白蛋白的酯酶活性。观察到特异的hCEl抑制剂-双 (对硝基苯基)磷酸酯(BNPP)，未证实人血浆中存在hCEl，该观察支持了上述解释。
在该上下文中，本发明的发明人使用蛋白质组学技术在肝组织和血浆中检测 hCEl。使用免疫沉淀以及2-D DIGE和Nano-LC-MS/MS系统的蛋白质组学技术，本发 明的发明人已经证明hCEl存在于健康志愿者和患有HCC的病人的血浆中，并且提供了 hCEl代表一种新的HCC生物标记物的证据。发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供hCEl是能够使用病人血浆来有效地检测HCC的存在的 HCC诊断生物标记物的新的证据，以及常规的检测方法。
本发明提供的HCC筛选方法包括以下的必要步骤确认人血液样品中hCEl的 存在；通过使用免疫沉淀、蛋白质印记分析(Westemblotanalysis)和Nano-LC-MS/MS 系统对血浆中的hCEl进行定量检测而在患有HCC的病人和健康志愿者之间做出区分。
技术问题
为了实现上述目的，使用2-D DIGE和蛋白质印记分析，本发明证实了与患有 HCC的病人的非肿瘤性肝组织相比，患有HCC的病人的肿瘤性肝组织中的hCEl表达显 著降低。
本发明还使用蛋白质组学技术(Nano-LC-MS/MS系统)确定了 hCEl实际上是 一种血浆蛋白，这在此前未使用传统方法予以证明。此外，本发明表明与健康志愿者的 血浆中的hCEl蛋白的水平相比，患有HCC的病人的血浆中的hCEl蛋白的水平平均是其 2至5倍。
由于hCEl是结合血凝素的N-连接糖蛋白，所以在非肿瘤性肝组织和肿瘤性肝 组织的分析中，本发明采用血凝素亲和色谱来分离糖蛋白。接下来进行2-DDIGE，以将 hCEl蛋白定位在2-D图谱上的与大约62kDa分子量和4.5至5.3PI对应的位置上。
通过本发明描述的方法，在磁珠(Dynabeads，Invitrogen)上富集之后使用免疫 沉淀以及基于高灵敏度的Nano-LC-MS/MS的方法来验证hCEl的存在。在确定最佳的 Dynabeads分装和血浆浓度条件的过程中，还确定了健康志愿者与患有HCC的病人的血 浆中hCEl的水平的比较分析可以使用蛋白质印记分析来完成。
根据本发明，通过采用下面步骤的蛋白质组学技术的使用，可以证实人血浆中 hCEl的存在
a)将血液样品收集到含有乙二胺四乙酸二钾(Ii2EDTA)的试管中并在室温下保 持30分钟；以2,400Xg离心15分钟，以获得血浆(上清物)；
b)将400 μ g抗hCEl的抗体与IOmg磁珠结合，然后将500 μ g抗体包被的磁珠 转移到含有8mg来自HCC病人或健康志愿者的血浆的Iml试管中并培育2小时，以对 hCEl进行免疫沉淀并将其与剩余的血浆蛋白分开；
c)在裂解缓冲液中使经免疫沉淀的来自健康志愿者的hCEl和经免疫沉淀的来自 HCC病人的每种样品变性，然后使用一维凝胶电泳将样品分离；
d)在大约60kDa处切割凝胶条带，并使用胰蛋白酶将蛋白消化为肽；
e)使用高灵敏度的Nano-LC-MS/MS系统来分析消化的肽，以鉴定hCEl蛋白 (参见图6和图7)。
此外，在本发明中也对人血浆中的分泌的hCEl的水平进行了测定，并且可将分 泌的hCEl用作使用下面一系列步骤而在患有HCC的病人与健康志愿者之间做出区分的 生物标记物
1)使用2-D DIGE和蛋白质印记分析证实与非肿瘤性肝组织中的hCEl表达水平 相比，来自患有HCC的病人的肿瘤性肝组织中的hCEl的表达水平显著降低；
2)按上述a)至b)步骤对血浆样品进行免疫沉淀，以获得hCEl的溶液；
3)通过使用抗hCEl的抗体的蛋白质印记分析确认hCEl信号的存在；以及
4)证实患有HCC的病人的血浆中的hCEl信号比健康志愿者的血浆中的hCEl信 号强(参见图8和图9)。
图1是示出来自患有HCC的病人的非肿瘤性肝组织的分级的糖蛋白的2-D DIGE 图像的照片；hCEl的位置被示出。
图2是示出来自患有HCC的病人的肿瘤性肝组织的分级的糖蛋白的2-DDIGE图 像的照片；hCEl的位置被示出。
图3是示出来自另外十名患有HCC的病人的非肿瘤性肝组织和肿瘤性肝组织的 成对样品的hCEl表达水平差异的照片。
N非肿瘤性肝组织
T 肿瘤性肝组织
图4是示出hCEl表达水平的免疫组化染色、石蜡包埋的组织阵列的照片，该组 织阵列通过来自47名患有HCC的病人的成对的非肿瘤性肝脏部分和肿瘤性肝脏部分而构建。
图5是描绘出染色得分的频率分布的图表，该频率分布图表通过患有HCC的病 人的成对的非肿瘤性肝脏部分和肿瘤性肝脏部分的免疫组化染色来确定。这些结果表明 与非肿瘤性肝脏部分相比，hCEl的表达水平在肿瘤性肝脏部分中明确地降低。
图6是示出通过Nano-LC-MS/MS系统鉴定的健康志愿者和患有HCC的病人血 浆中的hCEl的胰蛋白酶肽的表格，使用该表格证实人血浆中的hCEl的存在。
图7是图6中示出的共同肽的代表性Nano-LC-MS/MS色谱图。
图8是示出在免疫沉淀之后使用蛋白质印记分析确定的有代表性的三名健康志 愿者与三名患有HCC的病人之间的hCEl水平的差异的照片。
Np 健康志愿者的血浆
Tp:患有HCC的病人的血浆
图9是比较八名健康志愿者与八名患有HCC的病人的血浆中的hCEl水平的图表。
具体实施方式
在下面的实施例中详细描述本发明。所包括的实施例仅为描述本发明，然而， 本发明的范围不局限于实施例。
实施例1 临床组织和血浆的收集
患有HCC的病人的非肿瘤性肝组织和肿瘤性肝组织以及个体病理信息从延世大 学医学院(韩国首尔)的病理学系获得。使用下面的化验物来评估来自健康志愿者的血 浆作为阴性对照的适当性源自HIV的HIV-I抗体和HIV-2抗体，是表征肝癌的标准测 试成分；HIV-I抗原；乙型肝炎表面抗原；乙型肝炎核心抗原；丙型肝炎病毒；T细胞 白血病病毒(HTLV-I/II)抗原；以及苍白螺旋体。根据人类蛋白质组组织(HUPO)正式 采用的标准化的样品分离方法来获得血浆。
将来自男性或女性的每种血液样品^ml)在含有乙二胺四乙酸二钾CK2EDTA)的 试管中在室温下保持30分钟，接下来以2,400Xg离心15分钟。保留上清物(血浆)。 将非肿瘤性肝组织、肿瘤性肝组织和血浆样品以-70°C保存直到准备使用。肝组织和血 浆在取得病人知情同意的情况下根据延世大学医学院的伦理委员会(IRB)的批准程序获得。
实施例2 非肿瘤性肝组织和肿瘤性肝组织中的糖蛋白的分离
在RIPA 缓冲液(50mM Tris，150mM NaCl，乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P-40)，0.25%脱氧胆酸钠，pH 7.4)中以4°C将每种组织的IOOmg样品进行均质化。使 用五种不同的琼脂糖结合血凝素的混合物通过血凝素亲和色谱将糖蛋白分离，五种不同 的琼脂糖结合血凝素是伴刀豆球蛋白A、麦胚凝集素、榴莲凝素(Jacalin)、接骨木提 取物Mambucus nigra)和橙黄网孢盘菌提取物(Aleuria aurantia)。将对于具有不同的糖组 成的糖蛋白有着结合特异性的血凝素混合物装入2mlPD-10柱(Pierce)中。将含有糖蛋 白的样品施加到结合缓冲液(20mMTris，ImMMnCl2, ImMCaCl2, 0.15M NaCl, pH7.4) 中的柱，并使所述样品与柱相互作用30分钟。
将结合的糖蛋白用缓冲液(0.2M甲基-D-吡喃甘露糖苷，0.2M甲基_D_吡喃 葡萄糖苷，0.2MN-乙酰葡糖胺，0.2M半乳糖，0.1M乳糖，0.IM海藻糖，2OmM Tris， 0.5MNaCl, pH 7.0)洗脱，该缓冲液基于糖组成转移糖蛋白。使用5_kDa的膜滤器将洗 脱的糖蛋白浓缩，并用50%三氯乙酸和100%冰冷的丙酮沉淀。将沉淀物溶解在2D裂解 缓冲液(7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS，30mMTris, pH8.5)中，并且将得到的蛋白溶 液调整至pH8.5。使用2D Quant (GE Healthcare)试剂盒测定蛋白的浓度。
实施例3 双向荧光差异凝胶电泳O-D DIGE)
使用来自五名病人的十个成对的样品(五个来自非肿瘤性肝组织，五个来自肿 瘤性肝组织)来准备用于2-D DIGE的分析样品(每份50 μ g)。对分析样品和相应的合 并标准样品的每个用荧光染料Cy3、Cy5和Cy2 (400pmol ； GE Healthcare)在黑暗条件下 标记30分钟。
通过加入IyllOmM赖氨酸使反应终止，并将三种标记的样品混合，通过加入样 品缓冲液(6M 尿素，2M 硫脲，4%CHAPS，60mM 二硫苏糖醇(DTT)，3OmM Tris，pH 8.5)将样品的终体积调节到450 μ 1并通过用2% IPG3-10NL缓冲溶液在室温下培育16小 时而再水化。
使用Immobiline DryStrip pH 3-10 NL 在 MultiPhor II 型电泳系统(GEHealthcare) 上以最佳条件(达95,000V)执行等电聚焦(IEF)，然后进行一步法还原和烷基化，其中， DryStrip在三丁基膦(TBP)缓冲溶液(6M尿素，2%十二烷基硫酸钠6DS)，30mM Tris， 20%甘油，2.5%丙烯酰胺溶液，5mMTBP)中培育25分钟。
在还原和烷基化之后，使用Ettan Dalt-twelve电泳系统(GE Healthcare)通过在9%至16%梯度的聚丙烯酰胺凝胶上的电泳对等电聚焦的蛋白进行第二向分离。然后，使 用Typhoon 9400扫描仪(GE Healthcare)以与Cy2、Cy3和Cy5对应的波长对每块凝胶进 行扫描，并且使用Decyder 2-D分析软件(GEHealthcare)分析每块凝胶的图像。
实施例4 2-D DIGE分离的蛋白的鉴定
在进行图像分析之后，将与显著差异表达的蛋白对应的点从考马斯亮蓝染色的 凝胶上切下、脱色并用胰蛋白酶消化。使用Poros R2和Oligo R3树脂混合物对消化的肽 进行脱盐。使用4800 MALDI-TOF-MS (AppliedBiosystem)来分析蛋白并使用MASCOT数据库对图谱进行鉴定。
实施例5 通过蛋白质印记分析对组织中的HCC生物标记物表达水平进行验证
通过蛋白质印记分析验证了来自十名病人的非肿瘤性肝组织和肿瘤性肝组织之 间的HCC生物标记物蛋白浓度的差异。将来自每种样品的等量(5yg)的蛋白在10%的 凝胶上通过SDS-PAGE分离。
然后，将蛋白转移到硝酸纤维素(NC)膜，通过在含有5%脱脂乳的TBS-T缓冲 液(20mMTris，137mMNaCl，0.1%吐温-20，pH 7.6)中以室温培育1小时而对蛋白进行 封闭。然后，将所述膜与抗hCEl的一抗(CE1，Abcam ；以1 10000存在于TBS-T/5% 脱脂乳中)在室温下一起培育1小时。使用小鼠抗β -actin(Santa Cruz)作为阳性对照。
在使用TBS-T/5%脱脂乳洗涤之后，将所述膜与辣根过氧化物酶(HRP)耦联的 抗兔IgG的二抗Manta Cruz ；以1 20000稀释)以室温一起培育1小时。使用ECL Plus蛋白质印记试剂(GE Healthcare)检测免疫反应的蛋白，使用Typhoon 9400扫描仪对 点进行扫描及分析。
实施例6 使用免疫组化染色方法验证组织中HCC生物标记物表达水平
将通过来自患有HCC的47名病人的非肿瘤性肝部分和肿瘤性肝部分的成对的 组织构建的石蜡包埋的组织阵列用于免疫组化。使用二甲苯和乙醇对载片进行脱蜡，水 化，然后用0.6%过氧化氢进行处理。将抗hCEl的抗体(1 100)施加到载片并培育30 分钟。使用ChemMate Envision试剂盒(DAKO)使hCEl结合抗体颜色显示出来并使用苏 木精(用作对照染色剂)染色30秒。染色的强度得分为1) “_”，未染色；2) “ + ”， 弱染色；以及3) “++”，强染色。
实施例7:通过免疫沉淀和蛋白质印记分析验证人血浆中HCC生物标记物蛋白 分泌水平
按照制造商的描述，用抗hCEl的抗体包被Dynabead MyOne Tosylactivated(Invitrogen)磁珠。简单来说，将磁珠(IOmg)禾Π抗 hCEl 的抗体 000 μ g)混合并在结合缓冲液(0.1M硼酸钠，IM硫酸胺，pH9.5)中以37°C培育16小时，然后 用TBS-T/5%脱脂乳封闭额外的16小时。通过将抗体包被的珠子(500 μ g)转移到含有 Smg血浆的Iml试管中并培育2小时而将hCEl从健康志愿者和患有HCC的病人的血浆 中免疫沉淀出来。
通过将TBS-T缓冲液的pH调整至pH2来洗脱抗体结合的蛋白。通过使用如在 实施例5中描述的抗hCEl的一抗(Abeam; 1 1000)和辣根过氧化物酶(HRP)耦联的 抗兔IgG的二抗MantaCruz ； 1 5000)的蛋白质印记分析来确定健康志愿者和患有HCC的病人的血浆之间的hCEl水平差异。
实施例8 通过Nano-LC-MS/MS系统验证人血浆中的hCEl蛋白
将基于蛋白质印记分析(实施例7)与hCEl对应的条带从凝胶切下来，并通过 二硫苏糖醇(DTT)/碘乙酸(IAA)处理来还原并烷基化。在用胰蛋白酶消化来获得肽之 后，使用Nano-LC-MS/MS系统和四极杆线性离子阱(LTQ)检测器来对将凝胶-分离的 蛋白鉴定为hCEl的结论进行验证。
产业上的可利用性
如上所述，发现hCEl是一种用于HCC诊断的新的生物标记物。根据本发明， 血浆中的hCEl蛋白分泌水平可以用作进行HCC早期诊断的指标，从而有助于通过实施 及时的治疗干涉来增大患有HCC的病人的存活率。
权利要求
1.一种用于肝癌诊断的血浆生物标记物的组合物，所述组合物包括作为活性组分的 人肝羧酸酯酶1蛋白。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，患有肝癌的病人的血浆中的人肝羧酸酯酶1蛋 白的水平增加为高于健康志愿者的血浆中的人肝羧酸酯酶1蛋白的水平。
3.如权利要求2所述的组合物，其中，患有肝癌的病人的血浆中的人肝羧酸酯酶1 蛋白的水平与健康志愿者的血浆中的人肝羧酸酯酶1蛋白的水平相比平均增加了 2倍至5 倍。
4.一种筛选肝癌的方法，所述方法包括以下步骤通过蛋白质组学技术来确认人血液样品中人肝羧酸酯酶1的存在，以将人肝羧酸酯 酶1用作肝癌诊断的血浆生物标记物；使用免疫沉淀、蛋白质印记分析和纳升液相色谱质谱系统基于人肝羧酸酯酶1的存 在及其相对水平而在患有肝癌的病人和健康志愿者之间做出区分。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述确认步骤由以下步骤组成a)将血液样品收集到含有乙二胺四乙酸二钾的试管中并在室温下保持30分钟，然后 以2,400 Xg离心15分钟，并获得作为上清物的血浆；b)将400μ g抗人肝羧酸酯酶1的抗体与IOmg磁珠结合，然后通过将500 μ g抗体结 合的磁珠转移到含有8mg来自患有肝癌的病人或健康志愿者的血浆蛋白的Iml试管中并 培育2小时，而将人肝羧酸酯酶1从血浆中免疫沉淀出来；C)在裂解缓冲液中使在步骤b中分离的来自健康志愿者和来自患有肝癌的病人的每 种样品降解，并且使用一维凝胶电泳将样品分离；d)在大约60kDa处切割凝胶条带，并通过胰蛋白酶处理将蛋白消化为肽；e)使用高灵敏度的纳升液相色谱质谱系统来确认人肝羧酸酯酶1蛋白的鉴定。
6.如权利要求4所述的方法，其中，所述区分的步骤由以下步骤组成1)基于双向荧光凝胶电泳、蛋白质印记分析和免疫组化染色的结果，证实与非肿瘤 性肝组织中的人肝羧酸酯酶1的表达水平相比，患有肝癌的病人的肿瘤性肝组织中的人 肝羧酸酯酶1的表达水平显著降低；2)对血浆样品进行免疫沉淀，并获得人肝羧酸酯酶1的溶液；3)通过使用抗人肝羧酸酯酶1的抗体的蛋白质印记分析确认抗人肝羧酸酯酶1信号；4)证实患有肝癌的病人的血浆中的人肝羧酸酯酶1信号比健康志愿者的血浆中的人 肝羧酸酯酶1的信号强。
7.如权利要求4所述的方法，其中，患有肝癌的病人的血浆中的人肝羧酸酯酶1蛋白 的水平增大为比健康志愿者的血浆中的人肝羧酸酯酶1蛋白的水平的更大的范围。
8.如权利要求7所述的方法，其中，患有肝癌的病人的血浆中的人肝羧酸酯酶1蛋白 的水平平均增加为健康志愿者的血浆中的人肝羧酸酯酶1蛋白的水平的2倍至5倍。
全文摘要
本发明涉及一种用于诊断肝癌(HCC)的血浆生物标记物，具体来讲，本发明使用双向荧光差异凝胶电泳(2-D DIGE)、免疫沉淀以及纳升液相色谱质谱(Nano-LC-MS/MS)系统发现了血浆中的一种基于传统技术处于未知的蛋白。通过证明人血浆中肝羧酸酯酶1(hCE1)的存在并证实人肝羧酸酯酶1在患有HCC的病人中的分泌水平高于健康志愿者的分泌水平，可将本发明用作HCC早期诊断的筛选方法。
文档编号C12Q1/44GK102027127SQ200880129216
公开日2011年4月20日 申请日期2008年10月1日 优先权日2008年3月14日
发明者白融基, 罗根 申请人:生物融合技术株式会社