赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的方法和基因的制作方法

专利名称：赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的方法和基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及赋予或增强靶微生物非特异黏附性和/或凝集性的方法、用于该方法 的DNA、由该DNA编码的蛋白、通过该方法得到的微生物、以及该微生物的培养方法。
背景技术：
微生物具有基于优异的催化作用的物质转化能力。因此，在酿造或发酵食品的生 产、废水或废气处理等领域被广泛使用。最近，人们在实施或研究利用基因重组微生物进行 的药品生产、生物乙醇的发酵生产、以及利用微生物的化学品合成，微生物应用技术成为重 要的产业技术。但是，在生产反应中发挥重要作用的微生物细胞时，消耗培养基及能量等成 本。另外，微生物反应往往在水溶液中进行，生产物质后必需从反应液中分离微生物。作为 分离方法，以往离心或过滤是主要方法。
为了使分离容易进行、以及连续或反复利用贵重的微生物细胞，人们认为微生物 细胞的固定化或自身凝集是有效的。作为现有的固定化技术，有利用褐藻酸等凝胶的包埋 固定法和使微生物细胞吸附在多孔质载体表面的表面固定法。但是，包埋固定法存在以下 缺点向凝胶内部输送氧或基质往往是限速性的；凝胶的机械强度弱，通过搅拌等容易被 破坏；微生物细胞从凝胶内部漏出等。此外，现有的表面固定法并不是使目标微生物聚积在 表面的方法，只不过是将多孔质载体等投入存在大量多种微生物的废水处理或环境净化的 现场，使容易黏附的微生物以生物膜的形式担载在表面。即，并不存在使目标微生物自由黏 附在固体表面的技术。另一方面，至于凝集，利用高分子聚合物等凝集沉淀剂的方法在废水 处理中广泛应用，此外本来还采用将凝集性的微生物筛选后使用的方法，但并不存在使非 凝集性的微生物细胞、特别是细菌自发凝集的技术。发明内容
本发明的目的在于提供赋予或增强不具有或具有弱的非特异黏附性或凝集性的 微生物非特异黏附性和/或凝集性的方法。
本发明人等成功地从具有非特异黏附性的微生物中分离出黏附相关基因，发现该 基因是自转运黏附素基因，以及通过将该基因导入靶微生物中，可以赋予或增强该微生物 非特异黏附性和/或凝集性，从而完成了本发明。
S卩，本发明包含以下发明。
(1)赋予或增强靶微生物非特异黏附性和/或凝集性的方法，该方法包括
将编码自转运黏附素的DNA导入该靶微生物中，所述自转运黏附素来自具有非特 异黏附性的微生物。
(2) (1)所述的方法，其中，具有非特异黏附性的微生物为不动杆菌属 (Acinetobacter)细菌。
(3)⑴或⑵所述的方法，其中，编码自转运黏附素的DNA为以下
(a)、(b)或(C)的 DNA
(a)包含SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列的DNA ；
(b)包含与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有70%以上同源性的核苷酸序列、 且编码具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA ；
(c)包含SEQ ID NO :1所示的一部分核苷酸序列、且编码具有赋予或增强微生物 非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA。
(4) (1) (3)中任一项所述的方法，其中，靶微生物为埃希氏菌属Escherichia) 细菌。
(5) (4)所述的方法，其中，埃希氏菌属Escherichia)细菌为大肠杆菌。
(6) (1) (5)中任一项所述的方法，其中，将编码自转运黏附素的DNA和以下(a) 或(b)的DNA同时导入
(a)包含SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列的DNA ；
(b)包含与SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列的 DNA。
(7) (6)所述的方法，其中，将以下(a)或(b)的DNA导入靶微生物中
(a)包含SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列的DNA ；
(b)包含与SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列具有70%以上同源性的核苷酸序列、 且具有赋予或增强宿主微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的DNA。
(8)赋予或增强非特异黏附性和/或凝集性的微生物，该微生物是通过(1) (7) 中任一项所述的方法得到的。
(9)以下(a)、(b)或(c)的 DNA
(a)包含SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列的DNA ；
(b)包含与SEQ ID NO=I所示的核苷酸序列具有70%以上同源性的核苷酸序列、 且编码具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA ；
(c)包含SEQ ID NO :1所示的一部分核苷酸序列、且编码具有赋予或增强微生物 非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA。
(10)赋予或增强非特异黏附性和/或凝集性的微生物，该微生物中导入有(9)所 述的DNA。
(11) (10)所述的微生物，该微生物为埃希氏菌属Escherichia)细菌。
(12) (11)所述的微生物，该微生物为大肠杆菌。
(13)以下(a)、(b)或(c)的蛋白
(a)包含SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的蛋白；
(b)包含SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被缺失、取代、插 入或添加而得到的氨基酸序列、且具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活 性的蛋白；
(c)包含SEQ ID NO :2所示的一部分氨基酸序列、且具有赋予或增强微生物非特 异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白。
(14)微生物的培养方法，该方法包括
通过使⑶、(10)、(11)或(12)所述的微生物黏附在载体上和/或凝集来回收该微生物。
根据本发明，可以赋予或增强不具有或具有弱的非特异黏附性或凝集性的微生物 非特异黏附性和/或凝集性。由此，在微生物反应中，微生物的分离变得容易，可以高效回 收贵重的微生物细胞并连续或反复利用。


图1显示实施例1得到的序列片段的位置关系。
图2显示实施例1中的克隆和测序的结果得到的全核苷酸序列。
图3显示AadA的氨基酸序列。
图4显示使用ClustalW制作自转运黏附素的信号肽、头域、颈域、膜锚定区的各结 构域的序列多重对比，并比较序列的结果。
图5显示比较Tol5-0mpA的序列和与其显示出同源性的外膜蛋白的序列的结果。
图6显示在光学显微镜下观察通过插入aadA基因和aadA-ompA操纵子引起的形 态变化的结果。
图7显示黏附在聚氨酯表面的DH5 α aadA的电子显微镜照片。
图8显示黏附在聚氨酯表面的DH5 α aadA-ompA的电子显微镜照片。
图9显示存在于聚氨酯表面上的DH5 α (WT)的电子显微镜照片。
图 10 显示 DH5 α aadA-ompA、DH5 α aadA 和 DH5 α WT 的培养液的照片。
图11显示DH5 α aadA和DH5 α WT的自身凝集试验的结果。
图12显示汇总实施例1中使用的引物的表。
具体实施方式
本发明的方法，其特征在于将编码自转运黏附素的DNA(自转运黏附素基因)导 入该靶微生物中，所述自转运黏附素来自具有非特异黏附性的微生物。
在病原性微生物等中，存在黏附于特定的生物表面(例如特定的细胞、生物或其 组织的表面)而形成菌落的微生物，但本发明中的具有非特异黏附性的微生物，是指具有 黏附于并不限于特定的生物表面、还包括载体等非生物表面的、任意的生物表面和非生物 表面的能力的微生物。具有非特异黏附性的微生物能够黏附在例如玻璃、塑料和金属等载 体上。
具有非特异黏附性的微生物的例子有革兰氏阴性细菌、例如不动杆菌属 (Acinetobacter)细菌、假单胞菌属(Pseudomonas)细菌、埃希氏菌属(Escherichia) 细菌、柄杆菌属(Caulobacter)细菌、黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌、嗜血杆菌属 (Haemophilus)细菌、耶尔森氏菌属(Yersinia)细菌、巴尔通氏体属(Bartonella)细菌、奈 瑟氏菌属(Neisseria)细菌、放线杆菌属(Actinobacillus)细菌等。在本发明中，特别优 选不动杆菌属(Acinetobacter)细菌。
具有非特异黏附性的微生物的具体例子有不动杆菌属(AcinetcAacter sp.) Tol5株。该菌株具有分解从废气处理反应器中分离的甲苯的能力，其以保藏号FERM Ρ-17188保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本国茨城县筑波 市东1-1-1筑波中心中央第6)。
微生物的非特异黏附性可以使用结晶紫染色的黏附试验(CV黏附试验)来评价。 具体而言，将菌体培养液离心，除去培养上清，向菌体团块中加入无机盐培养基，通过超声 波处理得到菌体悬浮液，用培养基进行调整，使菌体悬浮液的浊度OD66tl恒定(0. 5以下)，之 后向48孔塑料制板的各孔中分别添加Iml悬浮液，在微生物的最适温度下培养2小时，使 用移液管完全除去孔中的悬浮液，用Iml无机盐培养基清洗孔，之后风干，向孔中加入 的结晶紫水溶液，在室温下培养15分钟，使用移液管除去结晶紫，再用Iml无机盐培养基清 洗孔2次，之后风干，加入Iml无机盐培养基，剥离黏附于孔内壁上的染色菌体，通过超声波 处理使之分散，测定吸光度A59tlt5于是，可以评价吸光度A59tl为0. 15以上、优选0. 18以上、 更优选0. 2以上的微生物是具有非特异黏附性的微生物。
自转运黏附素是指作为革兰氏阴性细菌所具有的粘着性纳米纤维报道的蛋白，已 知其与宿主的组织或细胞表层分子、细胞外基质发生特异性相互作用，但未见其非特异性 地粘着在各种固体表面的报道。据说自转运黏附素具有黏附、浸入、细胞毒性、血清抗性、细 胞间传播的功能。自转运黏附素具有N末端信号肽、内部过客结构域、C末端易位子结构域 这些共通的区编成。其中，C末端易位子结构域是定义该属的结构域。自转运黏附素的分 泌由信号肽介导开始，通过Sec系统穿过内膜而分泌。接着，将易位子结构域插入外膜中， 形成β桶状结构。最终，过客结构域通过外膜，出现在菌体表面。自转运黏附素分为单体 自转运黏附素和三聚体自转运黏附素(Shane Ε. Cotter,Neeraj K. Surana和Jos印h W. St GemeIII 2005. Trimericautotransporters :a distinct subfamily of Autotransporter proteins. TRENDS in Microbiology. 13 :199-205)。认为单体自转运黏附素的易位子结构 域由1个亚单元形成β桶状结构，该β桶状结构是包含14个跨膜逆平行折叠和跨膜 α-螺旋的亲水性路径。但是，已知三聚体自转运黏附素的易位子结构域在外膜中形成对热 稳定且耐SDS的三聚体，具有4个β -折叠的亚单元发生寡聚化，由三个亚单元形成12条 链的β桶状结构。另外，大多通用自转运黏附素具有分子内陪伴区，但三聚体自转运黏附 素亚家族中不存在分子内陪伴区。并且，事实上所有单体自转运黏附素的过客结构域均与 易位子结构域形成非共价键而连接在细菌表面、或者被释放到细胞外，相对于此，在所有三 聚体自转运黏附素蛋白中，认为过客结构域与易位子结构域通过共价键连接。
三聚体自转运黏附素简称为TAA(Trimeric autotransporteradhesin)，作为 形成共通寡聚物结构的卷曲螺旋型的新纲，还被称作Oca家族(寡聚卷曲螺旋型黏附 素家方矣)(Andreas Roggenkamp, Nikolaus Ackermann, Christoph A. Jacobi, Konrad Truelzsch，HaraldHoffmann 禾口 Jurgen Heesemann 2003. Molecular analysis of transport andoligomerization of the Yersinia enterocolitica adhesin YadA. J Bacteriol. 185 :3735-3744)。
在本发明中，优选三聚体自转运黏附素。作为三聚体自转运黏附素，例如有作 为小肠结肠炎耶尔森菌(Yersina enterocolitica)的黏附素的YadA(Yersina adhesin A) (El Tahir Y，Skurnik Μ. 2001. YadA, themultifaceted Yersinia adhesin. Int J Med Microbiol. 291 :209-218)、引起髓膜炎的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae) 的 Hia(St Geme JW3rd, Cutter D. 2000.The Haemophilus influenzae Hia adhesin is anautotransporter protein that remains uncleaved at the C terminus and fullycell associated. J Bacteriol. 182 :6005-13)、引起牙周病的伴放线放线杆菌(Aggregatibacter(Actinobacillus)actinomycetemcomitans)的 EmaA (Mintz, K.P.2004. Identification of an extracellular matrix proteinadhesin, EmaA, which mediates the adhesion of Actinobacillusactinomycetemcomitans to collagen. Microbiο 1 ogy. 150，26774688)、作为呼吸系统感染症的主要病原菌的粘膜炎莫拉氏菌 (Moraxellacatarrhalis)的 UpsA 1、A2 (Lafontaine ER, Cope LD, Aebi C, Latimer JL, McCracken GH Jr, Hansen EJ. 2000. The UspA lprotein and a secondtype of UspA2 protein mediate adherence of Moraxella catarrhal is tohuman epithelial cells in vitro. J Bacteriol. 182 :1364-73)、引起猫抓病的汉氏巴尔通氏体(Bartonellahenselae) 的 BadA(Riess Τ, Andersson SG, Lupas A, Schaller M,Schafer A, Kyme P, Martin J, Walzlein JH, Ehehalt
U, Lindroos H, Schirle M, Nordheim A, Autenrieth IB, Kempf VA. ， . 2004. Bartonella adhesin a mediates a proangiogenic host cell response. J ExpMed. 200 1267-78)、作为髓膜炎菌的脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitides)的NadA(Capecchi B, Adu-Bobie J, Di Marcello F, CiucchiL, Masignani V, Taddei A, Rappuoli R, Pizza M, AricoB.2005.Neisseriameningitidis NadA is a new invasin which promotes bacterial adhesion toand penetration into human epithelial cells. Mol Microbiol. 55 :687-98)、作为植物病原性细菌的水稻黄单胞菌(Xanthomonasoryzae) 的 XadA(Ray SK, Rajeshwari R, Sharma Y, Sonti RV. 2002. Ahigh-molecular-weight outer membrane protein of Xanthomonas oryzaepv. oryzae exhibits similarity to non-fimbrial adhesins of animalpathogenic bacteria and is required for optimum virulence. Mol Microbiol. 46 :637-47)等。
优选的自转运黏附素的例子有包含SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的蛋白、与 该蛋白功能同等的蛋白。功能同等的蛋白是指，该蛋白与包含SEQ ID NO :2所示的氨基酸 序列的蛋白具有同等的生物学功能、生化学功能。作为与包含SEQ ID NO :2所示的氨基酸 序列的蛋白功能同等的蛋白，例如有包含SEQ ID NO :2中1个或多个氨基酸被缺失、取代、 插入或添加而得到的氨基酸序列的蛋白，该蛋白具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/ 或凝集性的活性。并且，还可以列举以下蛋白(c)包含SEQ ID NO :2所示的一部分氨基酸 序列、且具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白，换言之，包含从 SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中删除1处或多处数十 数百、有时千以上的连续的氨基 酸序列而得到的氨基酸序列、且不丧失赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活 性的缺失蛋白。
1个或多个氨基酸的缺失、取代、插入或添加可以利用常用技术、例如位点特异性 诱变法Goller等人、Nucleic Acids Res. 106478-6500，1982)，通过修饰编码该蛋白的DNA 序列(例如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列)来实施。
其中，作为蛋白的构成要素的氨基酸的侧链在疏水性、电荷、大小等方面各不相 同，但实质上在不影响蛋白整体的三维结构(也称作立体结构)的意义上，保守性高的几种 关系根据经验或通过理化实测而获悉。例如，作为不同氨基酸残基间的保守取代的例子，已 知有甘氨酸(Gly)与脯氨酸(ftx))、甘氨酸与丙氨酸(Ala)或缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)与 异亮氨酸(He)、谷氨酸(Glu)与谷氨酰胺(Gin)、天冬氨酸(Asp)与天冬酰胺(Asn)、半胱氨酸(Cys)与苏氨酸(Thr)、苏氨酸与丝氨酸(kr)或丙氨酸、赖氨酸(Lys)与精氨酸(Arg) 等氨基酸间的取代。因此，氨基酸的取代优选为保守取代。
由于包含SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的蛋白是具有信号肽、头域、颈域、茎部 区域(stalk domain)和膜锚定区的三聚体自转运黏附素，所以氨基酸突变优选为维持该结 构域结构的突变。在SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中，信号肽相当于1 57位的氨基酸， 头域相当于108 269位和四97 3148位的氨基酸，颈域相当于296 319位和3149 3172位的氨基酸，茎部区域相当于406 四66位和3173 3537位的氨基酸，膜锚定区相 当于3538 3630位的氨基酸。
“多个”通常是指2 10个、优选2 5个、更优选2 3个。功能同等的蛋白通 常在氨基酸序列水平具有高同源性。高同源性是指，在氨基酸水平通常具有70%以上、优 选80%以上、更优选90%以上、进一步优选95%以上、最优选99%以上的同源性(或同一 性)。
在包含SEQ ID NO :2所示的一部分氨基酸序列的蛋白中，可以删除的数十 数百 个连续的氨基酸序列优选为相当于单方或两方的茎部区域、单方的头域、单方的颈域的序 列部位，可以删除其中的一个连续序列或多个连续序列。更优选删除上述各结构域的部位 中接近氨基末端的头域 茎部区域的全区(108 四66位)或接近羧基末端的头域 茎部 区域的全区(四97 3537位)。进一步优选删除茎部区域中多个可见的重复区，使其不再 重复，各出现1次。最优选删除茎部区域中多个可见的重复区中的任一处。
作为优选的自转运黏附素基因、即编码自转运黏附素的DNA的例子，例如有包含 SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列的DNA、以及与该DNA功能同等的DNA。作为与包含SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的DNA功能同等的DNA，可以列举包含与SEQ ID NO :1所示的核苷 酸序列具有70%以上、优选80%以上、更优选90%以上、进一步优选95%以上、最优选98% 以上同源性(或同一性)的核苷酸序列、且编码具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/ 或凝集性的活性的蛋白的DNA。或者，在严格条件下和包含与SEQ ID NO :1所示的核苷酸 序列互补的核苷酸序列的DNA杂交、且编码具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝 集性的活性的蛋白的DNA。可以进一步列举包含SEQ ID NO :1所示的一部分核苷酸序列、 且编码具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA，换言之，包 含从SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列中删除1处或多处数十 数千个连续的核苷酸序列而 得到的核苷酸序列、且由其翻译的蛋白不丧失赋予或增强非特异黏附性和/或凝集性的活 性的缺损基因的DNA。
严格条件是指形成特异性杂交而不形成非特异性杂交的条件，有低严格条件和 高严格条件，优选高严格条件。低严格条件是指，在杂交后的清洗中，例如在42°C下、在 5XSSC.0. 1% SDS中清洗的条件，优选为在50°C下、在5XSSC、0. SDS中清洗的条件。 高严格条件是指，在杂交后的清洗中，例如在65°C下、在0. 1 XSSC^nO. SDS中清洗的条 件。
核苷酸序列中的突变也优选为维持包含信号肽、头域、颈域、茎部区域和膜锚定区 的该结构域结构的突变。在SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列中，信号肽相当于1 171位 的核苷酸，头域相当于322 807位和8989 9444位的核苷酸，颈域相当于886 957位 和9445 9516位的核苷酸，茎部区域相当于1216 8898位和9517 10611位的核苷酸，膜锚定区相当于10612 10890位的核苷酸。
在包含SEQ ID NO=I所示的一部分核苷酸序列的DNA中，可以删除的数十 数百 个连续的核苷酸序列优选为编码单方或两方的茎部区域、单方的头域、单方的颈域的序列 部位，可以删除其中的一个连续序列或多个连续序列。更优选删除上述各结构域的部位中 编码接近氨基末端的头域 茎部区域的全区的区(322 8898位)或编码接近羧基末端的 头域 茎部区域的全区的区(8989 10611位)。进一步优选删除茎部区域的编码区中多 个可见的重复区，使其不再重复，各出现一次。最优选删除茎部区域的编码区中多个可见的 重复区中的任一处。
通过将编码自转运黏附素的DNA和包含SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列的DNA — 同导入靶微生物中，可以进一步提高靶微生物的非特异黏附性和/或凝集性。由于包含SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的DNA与不动杆菌属(AcinetcAacter)细菌等所具有的外膜蛋 白OmpA基因具有同源性，所以该DNA是编码外膜蛋白的DNA。可以导入与包含SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列的DNA功能同等的基因。作为与包含SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列 的DNA功能同等的DNA，可以列举包含与SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列具有90%以上、 优选95%以上、更优选98%以上同源性的核苷酸序列的DNA。或者，可以列举在严格条件 下和包含与SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交的DNA。
可以将含有编码自转运黏附素的DNA的操纵子导入靶微生物中，所述自转运黏附 素来自具有非特异黏附性的微生物。例如，通过将包含SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列的 DNA导入靶微生物中，可以将编码自转运黏附素的DNA和上述编码外膜蛋白的DNA同时导入 靶微生物中。可以导入与该操纵子功能同等的操纵子。作为功能同等的操纵子，可以列举 包含下述DNA的操纵子包含与SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列具有70%以上、优选80% 以上、更优选90%以上、进一步优选95%以上、最优选98%以上同源性的核苷酸序列、且具 有赋予或增强宿主微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的DNA。
对导入编码自转运黏附素的DNA的靶微生物没有特别限定，例如有不具有或具 有弱的非特异黏附性和/或凝集性的微生物。例如有埃希氏菌属Escherichia)细菌、 例如大肠杆菌(Escherichia coli)；不动杆菌属(Acinetobacter)细菌、例如乙酸钙不 动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)；青枯菌属(Ralstonia)细菌、例如真氧产碱杆菌 (Ralstoniaeutropha)；假单胞菌属(Pseudomonas)细菌、例如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、焚光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)；气单胞菌属(Aeromonas)细菌、 例如豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)；产碱杆菌属(Alcaligenes)细菌、例如广泛产 碱杆菌(Alcaligenes latus)；黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌、例如野油菜黄单胞菌 (Xanthomonascampestris)等。
通过将编码自转运黏附素的DNA导入靶微生物中进行转化，可以得到被赋予或增 强非特异黏附性和/或凝集性的微生物。典型的是，将编码自转运黏附素的DNA连接在适 当的载体上，利用该载体转化靶微生物(宿主微生物)，从而可以得到被赋予或增强非特异 黏附性和/或凝集性的微生物。具体而言，通过多拷贝将该DNA导入宿主微生物中，或者在 以组成型表达的启动子支配下连接该DNA、或者在诱导酶型启动子支配下连接该DNA，可以 得到被赋予或增强非特异黏附性和/或凝集性的微生物。将编码自转运黏附素的DNA和编 码外膜蛋白的DNA —同导入的情形、以及导入含有编码自转运黏附素的DNA的操纵子的情形亦同。
首先，将目标DNA连接到载体中，制备重组载体。上述载体中，除了使用能够在 宿主细胞中自主增殖的噬菌体、粘粒、人工染色体或质粒以外，例如在将质粒以表达盒 (expression cassette)的形式导入染色体中时，必需具有在该表达盒的构建所必需的宿 主(例如大肠杆菌)中自主复制的能力，但未必具有在导入该表达盒的宿主(例如酵母) 中自主复制的能力。这些重组载体例如还可以使用设计成在大肠杆菌和酵母两者中能够使 用的穿梭载体等。
作为质粒，例如有来自大肠杆菌的质粒(例如pET21a⑴、pET3h⑴、 pET39b (+)、pET40b (+)、ρΕΤ43· la(+)、pET44a(+)、pKK223_3、pGEX4T、pUC118、pUC119、 pUC18、pUC19 等)、来自枯草杆菌(Bacillus subtilis)的质粒(例如 pUB110、pTP5 等)、来 自酵母的质粒(例如YEpl3、YEp24、YCp50等)、以及酵母中毕赤酵母(Pichiapastoris)用 的质粒(例如 pPICZ、pPICZa、pHIL_D2、pPIC3. 5、pHIL-Sl、pPIC9、pPIC6、pGAPZ、pPIC9K、 pPIC3. 5K、pA0815、pFLD)等，作为噬菌体DNA，有λ噬菌体(Xgtll、λ ZAP等)。并且，还 可以使用牛痘病毒等动物病毒、杆状病毒等昆虫病毒载体。此外，可以将PCR4-T0P0(注册 商标)等市售的克隆用载体用于克隆及序列确认。
将DNA插入载体中可以采用以下方法首先，用适当的限制酶切断已纯化的DNA， 之后将其插入适当的载体DNA的限制酶切位点或多克隆位点，并与载体连接的方法等。例 如，目标DNA可以利用通常已知的方法进行合成，再将其插入载体中，使用引物通过PCR法 进行扩增，使两末端含有适当的限制酶的切断位点。PCR反应的条件可以由本领域技术人员 适当确定。
此外，在重组载体中，除了启动子和本发明的DNA外，根据需要还可以连接有增强 子等顺式元件、剪接信号、poly A添加信号、选择标志物、核糖体结合序列(SD序列)等。选 择标志物的例子有卡那霉素、氨苄青霉素、四环素、氯霉素等耐药性标志物；亮氨酸、组氨 酸、赖氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、色氨酸、尿嘧啶等营养要求性标志物，但并不限于此。
对启动子没有特别限定，本领域技术人员可以根据宿主微生物来适当选择。例如， 当宿主为大肠杆菌时，可以使用T7启动子、Iac启动子、trp启动子、λ -PL启动子等。还可 以适当使用包含SEQ ID NO 所示的核苷酸序列的启动子、以及与其功能同等的启动子、 例如包含与SEQ ID NO 28所示的核苷酸序列具有90%以上、优选95%以上、更优选98% 以上同源性的核苷酸序列的启动子。
连接DNA片段和载体片段时，使用公知的DNA连接酶。之后，将DNA片段和载体片 段退火后连接，制作重组载体。优选通过使用市售的连接试剂盒、例如Ligation High(高 效率连接试剂盒)(东洋纺株式会社制)，按照规定的条件进行连接反应，可以得到重组载 体。
包含克隆、连接反应、PCR等的重组DNA技术例如可以利用Sambrook，J等人， Molecular Cloning 2nd ed. ,9. 47-9. 58, Cold SpringHarbor Lab. press(1989)禾口 Short Protocols In Molecular Biology, ThirdEdition, A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons, Inc.中记载的技术。
所得载体根据需要可以通过煮沸法、碱性SDS法、磁珠法以及利用上述原理的市 售试剂盒等进行纯化，再利用例如乙醇沉淀法、聚乙二醇沉淀法等浓缩方法进行浓缩。
对向靶微生物中导入重组载体的方法没有特别限定，例如有使用钙离子的方法、 电穿孔法、脂质转染法等。
含有目标DNA的转化微生物可以利用该重组载体所具有的标志物基因，通过在例 如含有氨苄青霉素、卡那霉素等抗生素的LB培养基琼脂板上形成菌落来进行筛选，但为了 确认所克隆的宿主微生物是否是利用重组载体转化的微生物，可以使用其中一部分，进行 通过PCR法插入的扩增确认、或使用序列分析仪进行的双脱氧法的序列分析。除导入能够 自主复制的质粒的形式外，还可以采用下述染色体插入型的导入方法将与染色体基因同 源的区配置在载体内，使之发生同源重组以导入目标基因。
用培养基培养所得的转化微生物的方法可以按照用于培养靶微生物的常规方法 来进行。作为培养以大肠杆菌或酵母菌等微生物作为宿主得到的转化微生物的培养基，只 要是含有微生物能够利用的碳源、氮源、无机盐类等、且可以有效进行转化微生物的培养的 培养基即可，可以使用天然培养基，也可以使用合成培养基。具体例子有M9培养基、M9G培 养基、BS培养基、LB培养基、营养肉汤(NutrientBroth)培养基、肉膏培养基、SOB培养基、 SOC培养基、PDA培养基等。
作为碳源，只要是可以利用的碳化合物即可，例如可以使用葡萄糖等糖类；甘油 等多元醇类；甲醇等醇类；或丙酮酸、琥珀酸或枸橼酸等有机酸类。作为氮源，只要是可以 利用的氮化合物即可，例如可以使用蛋白胨、肉膏、酵母提取物、酪蛋白水解物、大豆粕碱性 提取物、甲基胺等烷基胺类、或氨或其盐等。此外，根据需要，还可以使用磷酸盐、碳酸盐、硫 酸盐、镁、钙、钾、铁、锰、锌等盐类、特定的氨基酸、特定的维生素、消泡剂等。另外，根据需 要，可以向培养基中添加异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷等蛋白表达诱导剂。
培养通常在振荡培养或通气搅拌培养等需氧条件下、优选0 40°C、更优选10 37°C、特别优选15 37°C下进行。培养期间，培养基的pH可以在宿主能够发育、且不损及 自转运黏附素的活性的范围内适当变更，但优选为PH4 8左右的范围。pH的调整使用无 机或有机酸、碱溶液等来进行。培养中，根据需要，可以向培养基中添加氨苄青霉素或四环 素等抗生素。
如上操作，可以得到被赋予或增强非特异黏附性和/或凝集性(自身凝集性)的 微生物。有关所得微生物的非特异黏附性，可以通过上述利用结晶紫染色进行的黏附试验 (CV黏附试验)来评价，有关凝集性，可以如下评价。将菌体培养液离心，除去培养上清，向 菌体团块中加入无机盐培养基，通过超声波处理得到菌体悬浮液，用培养基进行调整，使菌 体悬浮液的浊度OD66tl恒定，以此时的OD66tl作为初期0D·，通过将玻璃离心管中的菌体悬浮 液在室温下静置，使形成的细胞自身凝集体沉淀，测定上清的OD66tl的时间变化。于是，可以 评价OD66tl的减少为初期OD66tl的10%以上、优选15%以上、更优选20%以上的微生物是具 有凝集性的微生物。
培养所得的微生物后，通过通常已知的方法、例如机械方法、使用溶菌酶等的酶方 法或使用表面活性剂等的化学处理破坏菌体或细胞，也可以分离自转运黏附素蛋白。
本发明不仅可以直接用于传统的发酵产业或废物处理，对生物质能的生产或使用 微生物细胞的绿色生物技术也极为有效。特别是能量或化学品的生产要求低成本，通过赋 予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性使其固定化及自身凝集，这直接关系到生产过 程的效率化，能够成为这些产业发展的基础。12实施例
实施例1黏附相关基因的分析
1-1黏附件降低的突变株Tl和反向PCR用引物的制作
为了分析不动杆菌属(AcinetcAacter sp. ) Tol5株的黏附相关基因，使用转座子 随机插入法制作黏附性降低的突变株。以Tol5 WT(Tol5野生株)作为受体细胞、以具有转 座子载体的E. coli S17-1作为供体细胞，在下接合22 M小时。用含有甲苯和四环 素的培养基进行选择培养，进行所得株的黏附试验。其结果，成功地得到了若干黏附性降低 的株。采集它们的基因组DNA，以用限制酶HindIII处理的DNA作为模板，使用DIG-Iabeled tetA作为探针，进行DNA杂交。其结果，存在在约51Λ的位置明显检测到谱带的株，以其作 为黏附性降低株Tl。在电子显微镜下观察Tl株的表面结构时，观察到缺失附器(细胞表层 的突起物)的形态。
接着，为了分析Tl株的转座子插入位点，从琼脂糖凝胶中切出通过DNA杂交检测 到的约51Λ的DNA片段。以该片段作为Τ1-51Λ。将Τ1-51Λ插入pUC118载体中，之后克隆 到E. coli DH5 α中。测定所得质粒DNA的插入部分的两端的序列，结果确认在Τ1-51Λ的 内部，除了存在Τη5的序列外，还存在来自Tol5WT株的68bp的核苷酸序列(SEQ ID NO :6)。
1-2黏附相关基因的克降
为了分析黏附性降低的突变株Tl的转座子插入位点的核苷酸序列，根据通过分 析Tl而明确的插入位点68bp的序列，尝试着进行WT株的染色体DNA的反向PCR。首先， 用BS培养基培养Tol5野生株，之后进行DNA提取、RNase处理。用存在于pUC118的多克 隆位点的 HindIII 以外的限制酶(Acc I、Hae III、Hinc II、Kpn I.Pst I、Pvu II,Sal I、 Sau3A I,Sma I,Xba I)处理所得的基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳(以下记作Ε. P.)来确 认。分析Tl时使用限制酶HindiII，但由于在68bp内确认到Hindi11位点，所以判断限制酶 HindIII不适合用于得到目标区，在此将其除去。E.P.的结果，在与基因组同等的高分子量 的位置残留有谱带的酶，其限制酶反应位点少、片段的长度太长，所以不适合。另外，出现低 分子量谱带的酶，其片段太短，即使进行测序，所得的序列信息也少，所以不适合。因此，选 择在1，50(^ 5，00(^ 出现信号的圯1^ II，对基因组DNA进行Hinc II处理(Tol5/Hinc II)。连接已进行DNA纯化的Tol5/HinC II，使其进行自身连接(自身环化)(Tol5/HinC II/circular)0然后，以其为模板，进行反向PCR。为了连接在进行了 Hinc II处理的载体 上，使用带有Hinc II接头的引物。条件如下。以所得的51Λ的PCR产物作为Το15_51Λ。
反向PCR条件
聚合酶K0D-plus-
模板DNA :Tol5/Hinc 11/环
引物 F:Tl_5kbR3
引物 R:Tl_5kbRC
退火66°C
伸长5分钟
纯化所得的PCR产物，之后用限制酶Hinc II进行处理。该操作的目的在于缩短 片段以提高克隆的成功率、以及使接头形成Hinc II切断面。为了分离收集各样品，从琼脂糖凝胶中提取 DNA^jIAquickGel Extraction Kit，QIAquick 凝胶提取试剂盒)。将 2. 8kb 片段和 1. 8kb 片段分别作为 Tol5-2. 8kb 和 Το15_1· 8kb。将 Το15_2· 8kb 和 Το15_1· 8kb 与 载体连接。之后进行转化(化学法；蓝白菌落筛选法)。采集白菌落，用LB液体培养基进 行培养，之后提取少量的质粒DNA。用限制酶Hinc II处理质粒DNA，通过E. P.进行确认。 限制酶处理的结果，得到了载体+2. 81Λ和1.81Λ这样的理想谱带。另外，通过PCR确认片 段的大小和插入方向。条件如下所示。
PCR 条件
聚合酶Blend Taq
模板DNA :Tol5-l. 8kb、Το15_2· 8kb
引物 F :Tl_5kb R3、pUC118F
引物 R :Tl_5kb RC、pUC118R
退火62°C
伸长2分钟
PCR 的结果，在！"015-2. 8kb 中，利用 pUC118RXTl-5kb R3 的引物对扩增了 2. 8kb 的片段；在Tol5-l. 8kb中，利用pUC118FXTl-5kb RC的引物对扩增了 1. 8kb的片段。根据 此结果，成功地确认了插入片段的大小，同时确定了片段插入的方向。对这两株进行测序。 测序采用引物步移法。但是，出现了以下问题序列分析仪的信号混乱；而且在利用计算机 进行装配(assembly)时，即使在认为是重叠区的位点也出现了不一致的核苷酸等。由分析 结果可知序列中存在多个长的重复序列。因此，还出现了以下等的困难装配后的长度也 不满足目标插入片段的长度、即2. 81Λ或1. Skb0于是，重复进行引物的设计和测序，终于确 定了插入片段的长度分的核苷酸序列。但是，由于是这种重复序列，所以结果的可靠性低。 于是，为了提高测序的确实性，决定直接克隆Το15-51Λ，并再次进行测序。为了进行TA克 隆，使用在Taq系统中正确性高的DNA聚合酶来进行PCR，扩增I\)15-51ib。PCR条件 如下所示。
PCR 条件
聚合酶Easy-AHigh-Fidelity PCR 克隆酶
模板DNA :Tol5/Hinc 11/环
引物 F :Tl_5kb R3-2
引物 R :Tl_5kb RC-2
退火67.9°C
伸长5分钟
使用所得的PCR产物进行TA克隆。转化按照化学法来进行，涂布在LB/Km琼脂培 养基上。将菌落在LB/Km液体培养基中培养，培养后提取质粒DNA。为了确认插入，用限制 酶EcoR I处理DNA。其结果，可以确认载体和5kb的片段的存在。并且，通过PCR确认了插 入片段的大小。条件如下所示。
PCR 条件
聚合酶BlendTaq
模板DNA :Tol5-5kb 质粒 No. 5
引物 F:pUC118F
引物 R:pUC118R
退火65 71 °C
伸长5分钟
PCR的结果，可以确认到插入的51Λ谱带。对其进行序列分析。测序再次通过引物 步移法来进行，但由于是重复结构，所以再次测序极为困难。根据之前的1. Skb和2. Skb的 序列信息，慎重地重复进行引物设计和测序，花费了精力和时间，最终成功地得到了具有巨 大的重复结构的4907bp的序列。由于该Tol5-5kb的序列与Tol5_2. 8kb和Το15_1· 8kb的 序列完全一致，所以测序的确实性提高。所得的Το15-51Λ的序列见SEQ ID NO :7。根据该 序列，利用BLAST对翻译蛋白进行同源性检索时，发现了与在其他细菌中报道的自转运黏 附素显示出20 30%的同源性的4(^6bp的0RF，转座子也被插入该ORF内。由此可以明 确与iTol 5株的高黏附性和附器的生产有关的ORF的存在。但是，该ORF在Το15_51Λ的 3’末端被中途切断，为了明确全0RF，必需重新克隆与Το15-51Λ接续的下游域。另外，可以 说与细菌的粘着有关的自转运粘附素通过同源性检索而显示出来，由于同源性低、作为特 定该组的决定者的羧基末端的膜锚定区也未出现，所以充分考虑到可能是部分序列类似的 其他蛋白。
为了根据所得序列的结果进一步得到下游的序列信息，尝试着获取由DNA杂交产 生的特定片段。为了制作DIG标记的探针，避开重复部分来制作引物。使用该引物，以Tol 5株的染色体DNA为模板，扩增160bp的目标谱带。PCR条件如下所示。
PCR 条件
聚合酶BlendTaq
模板DNA :1^)15基因组
引物F :Tol5-ad-探针 2F
引物R To 15-ad-探针跗
退火66 72°C
伸长1秒
由于有多个谱带被扩增，所以在已分析的部分中，推定不存在反复的探针的序列 部分也在未分析的下游区进一步出现重复，为了推进测序的进行，使用QIAquick凝胶提取 试剂盒只切出160bp的目标谱带。以其为模板，利用PCR来制作探针。PCR条件如下所示。
PCR 条件
PCR DIG探针合成试剂盒
模板DNA :Tol5160bp探针凝胶提取
引物F To 15-ad-探针 2F
引物R To 15-ad-探针跗
退火67.9°C
伸长2分钟
使用所得的探针，对用各种限制酶处理Tol 5株的染色体DNA而得到的消化物进 行DNA杂交。其结果，在限制酶I^st I的消化物中，在31Λ和2. 31Λ的位置检测到探针杂交 的信号。于是，将这两个DNA片段从琼脂糖凝胶中切出并进行提取OHAquick凝胶提取试剂 盒)。将它们作为Tol5-3kb和Tol5-2. 3kb。连接所切出的DNA和经PstI消化的pUC118。通过所得的重组载体转化大肠杆菌DH5 α (化学法；蓝白菌落筛选法)。进一步通过菌落杂 交，选择导入有这些片段的转化体。其结果，产生信号的菌落只有导入有Το15-31Λ的菌落。 采集产生信号的部分菌落(Tol5-CC、-Cl、-C2、-O)，用LB/Amp液体培养基培养后，提取少 量的质粒DNA。分别用限制酶I3St I进行处理。对其进行DNA杂交时，在I\)15-CC、-C2、-C3 中产生信号。对它们进行测序。插入的两端的测序结果，不存在与已知序列一致的片段。 另外，这些序列各自不同。即，与之前确定了核苷酸序列的51Λ区(Το15-51Λ)接续的下游 域的克隆失败。此时还无法确定其原因。但本发明人认为问题在于从以Tol 5株的染色 体DNA为模板进行的DNA杂交中出现的多个信号中勉强选择一个并切出片段，由此制作了 探针。于是，暂时保留这些克隆株，以获取与Το15-51Λ连续的片段。
将模板由 \)15染色体变更为pUC118: :Tol5-5kb质粒DNA，利用PCR法制作新的 DIG标记探针。由于该质粒只含有一处探针区，所以认为只产生1种(1本)DIG标记的扩增 片段。PCR条件如下所示。
PCR 条件
PCR DIG探针合成试剂盒
模板DNA :pUC 118: :Tol5-5kb 质粒 DNA
引物F To 15-ad-探针 2F
引物R To 15-ad-探针 2R
退火68°C
伸长2分钟
不出所料，被扩增的片段只有目标大小(160bp)，成功地制作了高纯度的新探针。 使用该探针，与使用上述含有Το15-31Λ和Tol5-2. 3kb的载体进行转化操作后得到的板进 行菌落杂交。采集认为发出信号的菌落，在板中培养，再次进行菌落杂交以进行确认。采 集产生信号的部分菌落(3kb的No. 3和2. 3kb的No. 6、12、13、21、22)，用LB/Amp液体培养 基培养后，提取少量的质粒DNA。所得质粒DNA用限制酶I^st I进行处理。其结果，各质粒 含有目标的3kb(No. 3)或2. 3kb(No.6、12、13、21、22)，这些插入片段均与160bp的探针杂 交。如果这些片段如期待的那样含有与Το15-51Λ接续的下游域，则应该含有夹在I^stI位点 与HincII位点之间的约1. 5kb的核苷酸序列作为与Το15-51Λ重复的区。因此，用限制酶 Hinc II处理在多克隆位点的I3StI位点插入有这些片段的上述质粒时，应该得到在1. 5kb 的重复片段中添加有多克隆位点的一小部分的约1. 5kb的DNA片段。于是，用HincII消 化No. 3、6、22的质粒时，从它们中均可得到约1. 5kb的DNA片段。但是，其大小各自略有不 同。其中，首先对No. 6的质粒进行测序，所述No. 6的质粒除了被切成1.51Λ片段外、还被 切成认为含有3. Ikb的载体片段的3. 3kb片段和600bp的片段。但是，根据以前进行的测 序或DNA杂交的结果，由于该质粒的重复序列部分多，在多个部分发生退火，所以认为通过 目前确定作为高通量的方法的引物步移法无法正确测序。另外，想定在计算机装配中也会 出现故障。即，在Το15-51Λ时经历的困难有可能重复出现。于是，这次不采用引物步移法， 而是决定制作缺失突变体的系列，尽管这要花费精力和时间。为了制作从之前的1. 5kb的 重复片段侧依次删除插入到No. 6中的2. 3kb的Tol 5的DNA片段的突变体，用3’突出的 SacI和5’突出的^CbaI处理该质粒后，用核酸外切酶III进行消化。通过制作错开核酸外 切酶III作用的时间的一系列试样，得到被删除的长度不同的缺失产物。之后，再利用绿豆、核酸酶(Mimg Bean Nuclease)进行末端平滑化以及利用Klenow片段进行末端修复，最后 通过实施平端连接，得到缺失质粒系列。通过乙醇沉淀进行纯化后，通过用经核酸外切酶 III消化应该消除的)CbaI进行处理，排除了未反应的质粒的影响，通过用该DNA转化大肠杆 菌DH5ci，得到了缺失突变体的系列。采集多个转化体菌落进行培养，用限制酶HincII处 理已提取的质粒。考虑到1通径(path)的序列的大小(800bp )，以适当的间隔选择缺 失突变体，分别进行测序。综合各测序结果，确定了 2280bp的核苷酸序列。该序列见SEQ IDNO :8(Tol5-No. 6)。Το15_Νο· 6含有与Tol5-5kb重复的约1. 5kb的序列，由此可以确定 与Το15-51Λ接续的约750bp的核苷酸序列。由此，编码与上述自转运黏附素显示出低同源 性的蛋白的ORF与4707bp接续，由此编码的蛋白的氨基酸序列也具有1569个残基。但是， ORF尚未终结，其在3’末端中断。因此，必须进一步克隆与Tol5-No.6连接的下游域。另 夕卜，虽然该序列与伴放线放线杆菌(Actinobacillusactinomycetem comitans)的EmaA显 示出最高的同源性，但其在氨基酸水平的同源性也低至26%，达不到膜锚定区的编码区，所 以不能定论其是属于TAA家族的蛋白。总之，推定通过转座子的插入而被破坏的黏附相关 基因所编码的蛋白是非常巨大的、而且以复杂方式混入了长的重复序列的新型粘附蛋白。
为了得到与Tol5-No. 6接续的下游域的序列信息，根据重新明确的序列，再次避 开重复，以含有Tol5_No. 6的质粒为模板，利用PCR法制作158bp的探针。PCR条件如下所不。
PCR 条件
PCR DIG探针合成试剂盒
模板DNA :pUC118: Ιο δ-Νο. 6
引物F To 15-ad-探针 5F
引物R To 15-ad-探针 6R
退火65°C
伸长2分钟
由于在离合成的探针区近的上游存在限制酶HindIII位点，所以用HindIII消化 Tol 5的染色体DNA后进行E. P.，再利用158bp探针进行DNA杂交。其结果，又确认到3 个信号，所以从琼脂糖凝胶中切出所有信号部分，提取DNA(使用DEAE纸)。按照分子量从 大到小，依次为 Tol5-B(2500bp), Tol5_M(1200bp)、Tol5_S (600bp)。连接切出的 DNA 和用 HindIII处理的pUC118。纯化连接后的DNA，接着进行转化(电穿孔；蓝白菌落筛选法)。使 用之前的158bp的探针，对形成有菌落的板进行菌落杂交。采集产生信号的部分的菌落，用 LB/Amp液体培养基培养。提取少量的质粒DNA，用限制酶HindIII处理，确认插入片段的长 度时，确认插入了 2500bp、1200bp、600bp的长度的Tol 5株DNA片段，所以对这些质粒进行 测序。由于M片段和S片段短，所以利用1通径序列可以分别确定1185bp和6(X3bp的核苷 酸序列。另外，为了 B片段的测序，制作缺失突变体。用3’突出的Mel和5’突出的^CbaI 处理含有B片段的质粒后，用核酸外切酶III进行消化。通过制作错开核酸外切酶III的作 用时间的一系列试样，得到被删除的长度不同的缺失产物。之后，进一步利用绿豆核酸酶进 行末端平滑化以及利用Klenow片段进行末端修复，最后进行平端连接，从而得到缺失质粒 的系列。通过乙醇沉淀进行纯化后，用通过核酸外切酶III消化应该消除的)(bal进行处理， 从而排除未反应的质粒的影响，通过用所得的DNA试样转化大肠杆菌DH5 α，得到缺失突变、体的系列。采集多个转化体菌落进行培养，用限制酶HindIII和EcoR I双重消化已提取的 质粒。考虑到1通径的序列的大小(800bp )，以适当的间隔选择缺失突变体，分别进行测 序。连接各序列结果，确定了 2540bp的B片段的核苷酸序列。已确定的Tol5-B、Tol5_M、 iTolS-S 的序列分别见 SEQ ID NO :9 SEQ ID NO :11。其中，Tol5_M 片段作为与 ^ο δ-Νο. 6 的序列100%—致的重复区，含有53!3bp的核苷酸序列。但是，作为相同的HindIII片段的 Tol5-B.-M.-S的各片段彼此不含有重复区，仅凭推定-M片段与Tol5-No. 6接续，还不能明 确其他两个片段的位置关系。这些片段彼此含有几乎相同的核苷酸序列区，158bp的探针区 也位于此。即，推定这些片段也是形成重复序列的巨大片段的一部分。通过Tol5-M片段的 重复，ORF与5358bp延续，由此编码的蛋白的氨基酸序列也含有1785个残基。但是，ORF尚 未终结，其在3’末端中断。因此，与Tol5-M片段连接的下游域的核苷酸序列也必须进一步 得到明确。显示出最高同源性的仍然是伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetem comitans)的EmaA，但在氨基酸水平只显示出25%的同源性，尚未达到膜锚定区的编码区， 所以依然不能判定其是否是属于同家族的蛋白。
在此，对1Tol 5的DNA片段、如Tol5_CC和Tol5_C2进行了重新测序，该Tol 5的 DNA片段最初是通过DNA杂交尝试克隆与Το15-51Λ接续的下游域而得到的片段，但所得片 段无法与Το15-51Λ连接。由于想定都含有重复序列，所以分别制作缺失突变体。用3’突 出的McI和5’突出的^CbaI处理质粒后，按照与上述相同的程序制作缺失突变体的系列， 进行测序并连接起来，确定了 Tol5-CC和Tol5-C2的核苷酸序列。所得的Tol5-C2、Tol5-CC 的序列见 SEQ ID N0:12 禾口 SEQ IDNO :13。
通过重复分析Tol5_B、M、S片段和Tol5_CC、C2片段的序列，确定了位置关系。只 将序列100%—致的情形作为重复序列。利用158bp探针进行DNA杂交而检测到的信号 有3个，但根据重复分析和Tol5-C2的分析结果，判明实际上有4个片段。由于第4个片 段与Tol5-S在大小和序列方面几乎相同，所以其与约600bp的信号重复存在。将该区作 为 iTolS-S'。整理上述片段时，发现以！"olS-MJolS-S^TolS-SJolS-CZJolS-BJolS-CC 片段的顺序重复排列。其结果，ORF与10798bp接续，由此编码的蛋白的氨基酸序列也含有 3598个残基。但ORF尚未终结，其在3’末端中断。因此，还必须进一步克隆与Tol5_CC连 接的下游域。显示出最高的同源性的是Burldiolderia phymatum的TAA，但其在氨基酸水平 只显示出25 %的同源性。虽然含有一部分膜锚定区的序列，但并不含有全部序列，也不可能 预测该部分的高级结构，所以即使在此时也无法定论其属于TAA家族。另外，还明确其大小 也远远大于已经报道的TAA中最大的汉氏巴尔通氏体(Bartonellahenselae)的BadA(3036 个氨基酸)。
根据以前的测序结果，Tol5_CC的C末端区没有确认到重复序列。因此，在C末端 区制作507bp的探针，以通过限制酶HindIII处理的Tol 5株的DNA为模板进行DNA杂交。 其结果，在51Λ的位置检测到信号，将该片段作为Tol5-C51A。从琼脂糖凝胶中切出该DNA并 进行提取(DEAE纸)，将其与用HindIII消化的pUC118载体连接，进行转化(电穿孔；蓝白 菌落筛选法)。采集白菌落，用LB/Amp液体培养基进行培养。从液培养基中的菌体中提取 质粒DNA，用限制酶HindIII进行处理，确认插入。推测Tol5-C51A内没有重复结构，通过引 物步移法确定序列。所得的！"015-05 的序列见SEQ ID N0:14。Tol5_C51ib与Tol5_CC的 序列重复，判明其是与Tol5_CC连接的下游域。之后通过连接所述片段，大到10，893bp(SEQID NO 1)的巨大ORF完成，明确了其是包含由其编码的3，630个氨基酸(SEQ ID NO 2)的 巨大蛋白。其是通过转座子的插入而被破坏的、与黏附有关的基因的本体。之前显示的序 列片段的位置关系见图1。如此操作，确定了包含编码与粘着有关的蛋白的巨大ORF的Tol 5株的15011 bp基因片段的核苷酸序列。
1-3黏附相关基因的序列
连接对各种克隆株进行测序的结果得到的序列片段的操作使用GENEITX来进行。 为了判明是具有多个复杂的重复结构的基因，连接序列和序列时只将序列100% —致的情 形视为重复部分。本实施例中的克隆和测序的结果得到的全核苷酸序列见图2和SEQ ID NO :15ο
1-4牛物信息学解析
必须检索在核苷酸序列中是哪个区编码蛋白。使用ORF finder和GeneMark预测 编码蛋白的区。其结果，推测在取得的基因中存在4个0RF。插入有转座子的ORF是上述巨 大的0RF，可以说该ORF所编码的蛋白是黏附因子。另外，由于5’末端和3’末端的ORF未 确认到终止密码子，所以认为其在中途中断。编码蛋白时，在起始密码子的上游存在核糖体 结合位点和启动子位点。由于这些序列往往被保留，所以检索黏附相关基因的巨大ORF中 启动子位点的存在。其结果，确认到启动子位点的存在。以下显示该区。由此预测起始密 码子并不在第925位，第949位的密码子才是正确的密码子。
-35 区-10 区
—TATCTCATTTTTTTGATTGCTTTAATTGTATGTAAATTGTTAAATAAAAAAAATTGTACATTTTATA TGCATTGCTA
AAGCAGAACCTACTGCCCAAAATGCATCTCCTAAGGAAAAGCGATATGAATAAAATCTACAAAGTGA—
925SD序列949起始密码子
使用NCBI-BLAST检索各ORF的同源性。其结果，黏附关联的巨大ORF所编码的巨 大蛋白整体不存在显示出同源性的蛋白。但是，部分含有与属于TAA家族的蛋白显示出同 源性的区。
属于TAA家族的蛋白具有信号肽、头域、颈域、茎部区域、膜锚定区这样的结构域。 于是，使用ClustalW分别制作各结构域的序列多重对比并比较序列。其结果见图4。使用 I^edictProtein预测膜锚定的二次结构的结果也一并显示。比较对象为TAA家族的成员。 其结果，在信号肽、头域、颈域中，与伴放线放线杆菌(Aggregatibacter(Actinobacillus) actinomycetemcomitans)的EmaA的各结构域的同源性最高，分别显示出；34%、44%、52% 的同源性。另外，在TAA家族中，与研究最多的、也可称作是该蛋白家族的原型的小肠结肠 炎耶尔森菌(Yersina enterocolitica)的YadA分别显示出11 %、23 %、40 %的同源性。 至于膜锚定，其与睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)的自转运黏附素显示出48%的同 源性、与^dA显示出25%的同源性。另一方面，有关包含2591个氨基酸的茎部区域，通过 BLAST分析显示其中一部分与TAA家族成员显示出同源性，但其同源性低。例如显示出最 高的同源性的是琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)的^dA样蛋白，但2591 个氨基酸中的800个氨基酸的部分与该蛋白只不过显示出33%的同源性。以上，在各结构 域中，作为具有同源性的蛋白，TAA家族的蛋白通过BLAST分析而显示出来，但它们的同源 性水平并不高。但是，TAA家族最具特征的是膜锚定区的立体结构。TAA为同源三聚体，各多肽链具有1个α螺旋和4个β链，三根多肽链集合起来具有12根β链，在革兰氏阴 性细菌的外膜中形成β桶状结构，成为蛋白分泌用的隧道。于是，由Tol 5的黏附关联蛋 白的膜锚定对应区的氨基酸序列预测二次结构时，推定具有1个α螺旋和4个β链。综 合考虑上述情况和各结构域的排列等，推定Tol 5株的黏附蛋白是属于TAA家族的新型蛋 白，将其命名为意味着不动杆菌属(AcinetcAacter)细菌的粘附素的AadA。AadA基因的核 苷酸序列见SEQID NO =UAadA的氨基酸序列见图3和SEQ ID NO :2。AadA由10，893bp的 基因编码的3，630个氨基酸构成。AadA远远大于已经报道的TAA家族的蛋白，多个长的重 复结构复杂配置的茎部区域与其他蛋白的同源性低，而且头域和颈域不仅存在于氨基末端 侧、还存在于靠近膜锚定区所具有的羧基末端等，与已经报道的成员相比是特异性的TAA。 关于该特异性是否带来hi 5株的高黏附性或非特异黏附能，目前还不清楚。但是，迄今为 止报道的TAA全部都是在病原性细菌感染时用于特异性黏附在宿主的细胞或细胞外基质 上的TAA，显示出高粘着力的TAA等还未见报道。
orf的同源性检索结果，在aada基因的邻近下游，发现了与其他不动杆菌属 (acinetobacter)细菌等所具有的外膜蛋白ompa显示出同源性的蛋白的0rf。将其命名 为tol5-0mpa。tol5_0mpa的核苷酸序列见seq id no :3、氨基酸序列见seq id no :4。 tol5-0mpa包含由7%bp的基因编码的264个氨基酸。使用clustalw制作序列多重对比， 并和与tol5-0mpa的序列显示出同源性的外膜蛋白的序列进行比较。其结果见图5。与大 肠杆菌e. coli的ompa比较时，在c末端区同源性高、但在n末端区同源性低。另一方面， 与不动杆菌属(acinetcaacter)细菌所具有的外膜蛋白整体的同源性都高。但它们的功能 未见报道。但是，由于与aada的orf接近，所以aada和tol5-ompa很有可能位于同一操纵 子上。此外，由于是外膜蛋白，所以tol5-ompa有可能也参与黏附或粘着性的附器生产。
存在于已确定核苷酸序列的Tol 5株的15011bp基因片段的5’末端的ORF与不 动杆菌属(AcinetcAacter sp. )ADP1等所具有的甲硫氨酰tRNA转甲酰基酶显示出高同源 性。另外，存在于3’末端的ORF与不动杆菌属(AcinetcAacter Sp.)ADPl等所具有的二羟 基酸脱水酶显示出高同源性。由于每一种蛋白都未见具有与黏附有关的功能的报道，所以 推定不动杆菌属(Acinetobacter sp.) !"ο δ也与黏附无关。
1-5全长AadA基因的克隆
为了确认上述测序是正确的，通过PCR扩增含有推定启动子位点的aadA全长，确 认其长度。所用引物Tol5-TKD-F和Tol5-TKD-R的区如下所示。
引物 jtois-tkd-f
5' -AATATAGCTTAATTTCAAAAAAATTAAACCAATTGGTTTAAAAGTTAAAAAAAGTGAAATATATCT CATTTTTTTGATTGCTTT
AATTGTATGTAAATTGTTAAATAAAAAAAATTGTACATTTTATATGCATTGCTAAAGCAGAACCTACTG CCCAAAATGCATCTCCTA
AGGAAAAGCGATATGAATAAAATCTACAAAGTGATTTGGAATGCGACTTTGTTGGCATGGG-3’
引物 jtois-tkd-r (补体)
5’ —GGCGGTGTAGCTGCAGCGTCTCAAGGCGATGCAAGTGTTCGTATCGGTATCAGCGGTGTGATTGA CTAATTCACTCGACAGGG
AAGATCTTCGGGTCTTCCTTTTTCTTCGAAAATTTTTTAAGAGAGAAAAAATGAAAGCATTTAACAAAA20AAATTATGTTTGGTGTAT
TCAGCGGTCTTGTGATGTCATTGAGCCATGCTGCTGAAGTCGAAAGTGCAAATACGCAAGAA—3’
PCR的条件如下。
PCR 条件
聚合酶Easy-AHigh-Fidelity PCR 克隆酶
模板DNA :1^)15基因组
引物 F :Tol5-TKD_F
引物 R :Tol5-TKD_R
退火55 64.5 °C
伸长11分钟
PCR的结果，得到了与上述克隆和测序得到的ll，145bp(约111Λ)的序列相当的谱 带，将其作为Το15-111Λ。接着，使用所得产物进行TA克隆。转化通过电穿孔来进行，涂布 在LB/Km琼脂培养基上。所形成的菌落在LB/Km液体培养基中培养，培养后提取质粒DNA。 为了确认插入，用限制酶EcoR I处理DNA。进一步通过PCR来确认。条件如下所示。
PCR 条件
聚合酶BlendTaq
模板DNA :pCR-XL-T0P0: :Tol5-llkb 质粒
引物 F:pUC118F
引物 R:pUC118R
退火56 68 °C
伸长11分钟
限制酶处理的结果，可以清楚地确认到载体和AadA的理想谱带。另外，由PCR的 结果还可以确认具有AadA的大小的谱带。并且，对质粒DNA进行测序的结果，插入片段的 两端的序列与之前确定的核苷酸序列完全一致。因此，在确认上述测序精度的同时，成功地 克隆了约111Λ的含有推定启动子序列的aadA基因。
进一步尝试着克隆包括含有推定启动子的aadA和Tol5-ompA的约12，505bp (约 13kb)的基因。通过PCR扩增片段。条件如下。
PCR 条件
聚合酶Easy-AHigh-Fidelity PCR 克隆酶
模板DNA :1^)15基因组
引物 F :Tol5-TKD_F
引物 R To 15-ad-op-R3
退火50 60
伸长14分钟
所用引物Tol5-ad_op-R3的区如下所示。
5 ’ —TATGATGTGTACATATTTCGACTGATTTATTGCTATATCAGTTTTATTTAGCCAGAGTGAATCTG ATTCATTTCAA
GCTCAAACAATGTNGGAAATACAAATGCCNGACTATCGTTCAAAAACATCGACACATGGAAGAAATATG GCTGGTGCACG
TGGCTTATGGCGTGCAAC-3，
将所得的约131Λ的片段作为Το15-131Λ，使用其进行TA克隆。转化通过电穿孔来 进行，涂布在LB/Km琼脂培养基上。在LB/Km液体培养基中培养菌落，培养后提取质粒DNA。 为了确认插入，用限制酶EcoR I处理DNA。进一步通过PCR来确认。条件如下所示。
PCR 条件
聚合酶BlendTaq
模板DNA :pCR-XL-T0P0: :Tol5-13kb 质粒
引物 F:pUC118F
引物 R:pUC118R
退火50 60 °C
伸长14分钟
由限制酶处理和PCR的结果，确认到具有理论长度的插入谱带。对该质粒DNA进行 测序的结果，插入片段的两端的序列与已知序列完全一致。因此，成功地克隆了包括含有推 定启动子的aadA和Tol5_ompA的基因、即含有11，858bp的aadA-ompA操纵子(SEQ IDNO 5)的约131Λ的基因。在SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列中，1 106位是启动子/核糖体 结合位点(SEQ ID NO :29)，107 10999 位是 aadA 基因，11064 11858 位是 ^οΙδ-οπιρΑ 基 因。
t施例2插入有不动杆菌属(Acinetobacter SD. ) Tol5株的黏附相关某因的大肠 杆菌的件状评价
比较通过插入有aadA基因和aadA-ompA操纵子的载体转化的大肠杆菌(E. coli) DH5 α (分别命名为 DH5 α :aadA 和 DH5 α aadA-ompA)、以及作为对照的 E. coli DH5 α 野生株(WT)的性状。通过插入有aadA-ompA操纵子的载体转化的Ε. coli DH5 α作为 "DH5 α -XLT0P0 :aadA_ompA”，以接收号 NITE ABP_490(接收日 2008 年(平成 20 年)2 月 19日)被独立行政法人制品评价技术基础机构生物技术本部特许微生物寄托中心(日本国 千叶县木更津市Af 鎌足2-5-8)接收。
2-1利用光学显微镜观察形态
为了观察通过插入aadA基因和aadA-ompA操纵子而引起的形态变化，对 DH5 α :aadA、DH5 α aadA-ompA,DH5 α WT这3种株进行革兰氏染色，并在光学显微镜下观 察。结果见图6。
在插入有aadA-ompA操纵子的株DH5 α aadA-ompA中，除了观察到菌体外，还可 以观察到连接菌体间的线状结构物。认为这种看起来象EPS(菌体外聚合物)的物质与黏 附力的添加有关。在插入有aadA的株DH5 α aadA中，观察到菌体细长、极端连结的形态。 这些株的形态均与野生株明显不同，由此可知通过导入黏附相关基因，形态发生了变化。
2-2利用电子显微镜观察形态
为了更仔细地观察通过导入基因而引起的形态变化，对DH5 α :aadA, DH5 α aadA-ompA、DH5 α WT这3种株，使用扫描型电子显微镜FE-SEM和透过型电子显微 镜TEM来观察形态。FE-SEM的观察结果见图7 9。
在DH5ci :aadA中，观察到有菌体黏附的聚氨酯载体表面和没有菌体黏附的聚氨 酯载体表面明显区分开来。即，观察到形成了凝集体这样的形态，在该凝集体单位内发生黏附。观察到在凝集体内产生大量的EPS样结构物，在多层中菌体彼此堆积、黏附。另外，在 DH5ci ::aadA的菌体中观察到较多的形状变得细长的物质。这与光学显微镜观察的结果所 得到的图像一致。若放大来看，则在细长的形状中可以确认到部分连接的形状(節目O J ^ ^ ^ )，观察到菌体极端连结的形态。另外，从变得细长的菌体中也观察到附器这样的 结构物(图7)。
在DH5 α aadA-ompA中，观察到非常多的菌体黏附在聚氨酯载体上的情况。这种 情况看起来象是菌体一个一个地黏附在载体上，在载体表面均勻地形成单层膜。另外，在 DH5a :aadA-ompA中也观察到产生EPS样结构物的情况。这与光学显微镜下观察到的结果 一致。并且，在DH5 α :aadA-ompA中观察到许多连接菌体和载体的附器样的物质图8)。
与两个重组株相比，E. coli DH5 α WT中几乎没有黏附在聚氨酯载体上的菌体，说 是“黏附”，但看起来更象是“偶然搭载”。另外，生产附器这样的结构物的菌体少(图9)。
这样，通过在Ε. coli DH5a 中插入不动杆菌属(Acinetobacter sp. )Tol5 的aadA 基因和aadA-ompA操纵子，成功地使其黏附形态发生了变化。
并且，在DH5 α aadA-ompA禾Π DH5 α :aadA之间也观察到了不同。在 DH5a aadA-ompA中，各个菌体细胞零散地黏附在载体上，形成均勻的层，但菌体彼此间并 没有凝集形成多层。相对于此，在DH5ci ::aadA中，菌体细胞形成巨大的凝集体，黏附在载 体上形成多层，但没有观察到各个细胞零散地黏附在载体上的情况。
2-3黏附试验和凝集试验
为了确认由于插入aadA和aadA-ompA操纵子而引起的黏附性变化，通过结晶紫染 色进行黏附试验(CV黏附试验)。黏附试验通过以下试验方法来评价。
<黏附试验>
1.将菌体培养液以3，400rpm的转速在室温下离心10分钟。
2.通过倾析除去培养基，加入适量的MATS实验用BS培养基。
3.按照OUTPUT = 5、TIME = 20秒进行超声波处理(UD-200 ；Τ0ΜΥ)，使菌体悬浮， 之后进行调整使OD66tl达到约0. 2。
4.在48孔微量培养板(IWAKI)的各孔中分别添加Iml悬浮液，在37°C下培养2 小时。
5.吸取孔中的所有悬浮液。此时，注意Chip的顶端不要擦到板。
6.用Iml的MATS实验用BS培养基清洗孔。之后将板风干。
7.向孔中加入结晶紫，在室温下培养15分钟。
8.吸取所有的结晶紫，用Iml的MATS实验用BS培养基清洗孔2次。之后将 板风干。
9.加入Iml的MATS实验用BS培养基，按照OUTPUT = 4、TIME = 20秒进行超声 波处理，使染色菌体分散在BS培养基中。
10.测定 A590。
用M9培养基培养的菌体的黏附试验结果如下所示。
权利要求
1.赋予或增强靶微生物非特异黏附性和/或凝集性的方法，该方法包括将编码自转运黏附素的DNA导入该靶微生物中，所述自转运黏附素来自具有非特异黏 附性的微生物。
2.权利要求1所述的方法，其中，具有非特异黏附性的微生物为不动杆菌属 (Acinetobacter)细菌。
3.权利要求1或2所述的方法，其中，编码自转运黏附素的DNA为以下(a)、(b)或(c) 的 DNA (a)包含SEQID NO 1所示的核苷酸序列的DNA ；(b)包含与SEQID NO :1所示的核苷酸序列具有70%以上同源性的核苷酸序列、且编 码具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA ；(c)包含SEQID NO :1所示的一部分核苷酸序列、且编码具有赋予或增强微生物非特 异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA。
4.权利要求1 3中任一项所述的方法，其中，靶微生物为埃希氏菌属Escherichia) 细菌。
5.权利要求4所述的方法，其中，埃希氏菌属Escherichia)细菌为大肠杆菌。
6.权利要求1 5中任一项所述的方法，其中，将编码自转运黏附素的DNA和以下(a) 或(b)的DNA同时导入(a)包含SEQID NO 3所示的核苷酸序列的DNA ；(b)包含与SEQID NO :3所示的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列的DNA。
7.权利要求6所述的方法，其中，将以下(a)或(b)的DNA导入靶微生物中(a)包含SEQID NO 5所示的核苷酸序列的DNA ；(b)包含与SEQID NO :5所示的核苷酸序列具有70%以上同源性的核苷酸序列、且具 有赋予或增强宿主微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的DNA。
8.赋予或增强非特异黏附性和/或凝集性的微生物，该微生物是通过权利要求1 7 中任一项所述的方法得到的。
9.以下(a)、(b)或(c)的DNA (a)包含SEQID NO 1所示的核苷酸序列的DNA ；(b)包含与SEQID NO :1所示的核苷酸序列具有70%以上同源性的核苷酸序列、且编 码具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA ；(c)包含SEQID NO :1所示的一部分核苷酸序列、且编码具有赋予或增强微生物非特 异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA。
10.赋予或增强非特异黏附性和/或凝集性的微生物，该微生物中导入有权利要求9所 述的DNA。
11.权利要求10所述的微生物，该微生物为埃希氏菌属Escherichia)细菌。
12.权利要求11所述的微生物，该微生物为大肠杆菌。
13.以下(a)、(b)或(c)的蛋白(a)包含SEQID NO 2所示的氨基酸序列的蛋白；(b)包含SEQID NO :2所示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被缺失、取代、插入或 添加而得到的氨基酸序列、且具有赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的活性的蛋白；(c)包含SEQ ID NO :2所示的一部分氨基酸序列、且具有赋予或增强微生物非特异黏 附性和/或凝集性的活性的蛋白。
14.微生物的培养方法，该方法包括通过使权利要求8、10、11或12所述的微生物黏附在载体上和/或凝集来回收该微生物。
全文摘要
本发明提供赋予或增强不具有或具有弱的非特异黏附性或凝集性的微生物非特异黏附性和/或凝集性的方法。本发明涉及赋予或增强靶微生物非特异黏附性和/或凝集性的方法，该方法包括将编码自转运黏附素的DNA导入该靶微生物中，所述自转运黏附素来自具有非特异黏附性的微生物。
文档编号C12N5/10GK102037126SQ20088012888
公开日2011年4月27日 申请日期2008年2月22日 优先权日2008年2月22日
发明者堀克敏 申请人:国立大学法人名古屋工业大学