专利名称：一种利用淀粉类原料生产2,3-丁二醇的方法
技术领域：
本发明属于生物化工技术领域，尤其涉及一种利用淀粉类原料生产2，3-丁二醇的方法。
技术背景2,3-丁二醇(2,3-butanediol)是一种高附加值的平台化合物，具有广泛的应用领域。 2,3-丁二醇是一种无色无味的手性化合物，有3种构型。沸点为180-184°C，凝固点较低， D-2，3-丁二醇(-60'C)可以作为抗冻剂。2,3-丁二醇具有较高的辛垸值，可以用于生产高 级航空煤油，是极具价值的液体燃料。脱水可以转化为工业溶剂甲乙酮，甲乙酮可以作为 燃料添加剂，并可以作为溶剂用于树脂和制漆业。甲乙酮进一步脱水可以得到1,3-丁二烯， 可以作为底物用于合成橡胶工业(Syu MJ. Appl Microbiol Biotechnol， 2001, 55: 10-18) 。 2，3-丁二醇脱氢可以得到乙偶姻和丁二酮，可以作为香料作为食品添加剂。在我国，2，3-丁二 醇还被添加到白酒中以改善白酒风味。2,3-丁二醇在油墨、化妆品、香薰剂、软化剂、增 塑剂、炸药和药物载体等领域也具有潜在用途(Xiu ZL, Zeng AP. Appl Microbiol Biotechnol， 2008， 78: 917-926)。近年来由于石油价格的不稳定以及石化产品价格的不断上涨，2,3-丁 二醇的价格和生产在国际上也引起越来越广泛的关注。开发廉价可再生生物质资源发酵生 产2,3-丁二醇有利于降低发酵生产成本，实现生物质资源的高价值开发利用，并且利用可 再生生物质资源开发石化产品替代品有利于社会的可持续性发展。目前文献报道的用于2,3-丁二醇发酵生产的底物主要有葡萄糖、蔗糖、糖蜜、甘油等 (Syu MJ. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 55: 10-18; Qin et al. Chin J Chem Eng， 2006, 14:132-136; Afschar et al. Appl Microbiol Biotechnol, 1991, 34:582-585; Pe加v K and Petrova P, Appl Microbiol Biotechnol, DOI 10.1007/s00253-009-2004-x)，专利报道的2,3-丁二醇的 生产有中国专利申请号200610113390.9公开了一种利用植物秸杆发酵生产2,3-丁二醇 的方法，液体发酵得到0.14 0.24 g/L的2,3-丁二醇，固态发酵2,3-丁二醇的产量在0.026 0.067 g/g干料。中国专利申请号200810057041.9公开了一种由木质纤维原料生产乙醇和 2，3-丁二醇的方法，72小时可得到42.5 g/L 2,3-丁二醇。中国专利申请号200810011692.4 公开了一种以菊芋为原料发酵生产2,3-丁二醇的方法，得到了终浓度为49 105§/1^的2,3-丁二醇。中国专利申请号200510011959.6公开了一种由粗淀粉原料生产1,3-丙二醇和2，3-丁二醇的方法，该方法是先由粗淀粉原料经过酵母细胞发酵得到甘油发酵液，甘油发酵液 过滤处理后，再由处理的甘油发酵液经细菌先厌氧后有氧流加补料生产1,3-丙二醇和2,3-丁二醇，但由于工艺条件限制，1,3-丙二醇是主要产物，2,3-丁二醇浓度能达到30.4g/L。淀粉类生物质原料在我国有广泛的来源，近年我国每年生产各种淀粉超过1000万吨， 已发展成为世界淀粉最大生产国。淀粉包括玉米淀粉、薯类淀粉、变性淀粉等。目前淀粉 类原料已经成功用于乙醇、乳酸、柠檬酸等产品的发酵生产。利用淀粉类原料直接发酵生 产2,3-丁二醇鲜见报道。 发明内容本发明的目的是提供一种淀粉类原料发酵生产2,3-丁二醇的方法，以实现淀粉类原料 的充分开发利用，生产高值平台化合物2，3-丁二醇。本发明所述利用淀粉类原料生产2,3-丁二醇的方法，其特征在于包括如下步骤5(1) 淀粉类原料处理及分步糖化发酵培养基的制备 以水与淀粉类原料质量比为1 6:1的比例将淀粉类原料加入自来水中混匀成淀粉浆；调节淀粉浆pH值在5.5 8.0，向淀粉浆中加入a-淀粉酶，a-淀粉酶加酶量为1 10U/g 淀粉干重，在90 110'C条件下，液化0.5 4小时，得到淀粉液化液；将淀粉液化液pH 值调节在3.5 6.0后加入糖化酶，糖化酶的添加量为100 1000U/g淀粉干重，在50 70 t:条件下糖化0.5 6小时，得到淀粉糖化液，其葡萄糖浓度范围为60 510g/L;将糖化 液115t:灭菌20min，冷却后作为碳源，用于制备进行分步糖化发酵的发酵培养基；适于进行分歩糖化分批发酵的发酵培养基，配方是碳源为淀粉糖化液，其用量以其 含葡萄糖量计为100 120 g/L， (NH4)2S04 16 g/L, K2HP04'3H20 4 g/L， KH2P04 4 g/L， NaC12g/L， CaCl20.4g/L， MgS04'7H20 0.4 g/L， ZnS04.7H20 0.4 g/L，乙酸钾4g/L，柠 檬酸三钠4 g/L; pH值调至6.0 7.0;适于进行分步糖化补料分批发酵的发酵培养基，配方是碳源为淀粉糖化液，其用量以其含葡萄糖量计为40 60 g/L， (NH4)2S04 16 g/L， K2HP04'3H20 4 g/L， KH2P044g/L， NaC12g/L， CaCl20.4g/L， MgS04'7H20 0.4 g/L， ZnS04'7H20 0.4 g/L，乙酸钾4g/L，梓 檬酸三钠4 g/L; pH值调至6.0 7.0;上述淀粉类原料为玉米粉、玉米淀粉、木薯粉、木薯淀粉、土豆粉、土豆淀粉、红薯 干粉中的一种或几种任意重量比例混合物；(2) 5升发酵罐分步糖化发酵生产2,3-丁二醇以体积比5 10%的接种量，将制备的肺炎克雷伯氏菌CS7efo/e〃a/wew附ww'ae) SDM CCTCCM 208097或者肺炎克雷伯氏菌(A7efc/e〃a;wewm^ae) CICC 10011或者肺炎克雷 伯氏菌(〖Mw'e〃a ，ewwow'ae) ATCC 8724种子液接种到装有2 4升分步糖化发酵培养 基的5升发酵罐中，以发酵温度为30 40°C，搅拌转速为200 500rpm，通气量0.5 1.5 vvm实施发酵；发酵过程中，通过发酵罐关联控制蠕动泵流加4 6 M的KOH或3 6 M 的H3P04来调节pH值，使之控制在pH 5.5 6.5;并每隔3 4小时取样测定发酵液中的 葡萄糖含量和2,3-丁二醇浓度；若进行分步糖化分批发酵，当2,3-丁二醇浓度不再上升时， 结束发酵，取发酵液分离、提取2,3-丁二醇；若进行分步糖化补料分批发酵，当检测葡萄 糖浓度降到15 20g/L时，补加上述灭菌的淀粉糖化液，保持发酵液中葡萄糖浓度在15 60g/L，当测得葡萄糖消耗速率低于2g/(L七)时，停止补加淀粉糖化液，待2,3-丁二醇浓 度不再上升时，结束发酵，取发酵液分离、提取2，3-丁二醇；或者(1)淀粉类原料处理及同步糖化发酵培养基的制备以水与淀粉类原料质量比为1 6:1的比例将淀粉类原料加入自来水中混匀成淀粉 浆；调节淀粉浆pH值在5.5 8.0，向淀粉浆中加入a-淀粉酶，a-淀粉酶加酶量为1 10U/g 淀粉干重，在卯 110'C条件下，液化0.5 4小时，得到淀粉液化液；将淀粉液化液115 'C灭菌20min，冷却后作为碳源，用于制备进行同步糖化发酵的发酵培养基；适于进行同步糖化分批发酵的发酵培养基，配方是碳源为淀粉液化液，其用量为 250 600 mL/L， (NH4)2S04 16 g/L， K2HP04-3H20 4 g/L， KH2P04 4 g/L， NaCl 2 g/L， CaCl2 0.4g/L， MgSO4'7H2O0.4g/L， ZnS04'7H20 0.4 g/L，乙酸钾4 g/L，柠檬酸三钠4 g/L; pH 值调至6.0 7.0;适于进行同步糖化补料分批发酵的发酵培养基，配方是碳源为淀粉液化液，其用量为100 300mL/L， (NH4)2S04 16 g/L， K2HP04,3H20 4 g/L， KH2P04 4 g/L， NaC12g/L，CaCl2 0.4 g/L， MgS04'7H20 0.4 g/L， ZnS04'7H20 0.4 g/L，乙酸钾4 g/L，柠檬酸三钠4 g/L;pH值调至6.0 7.0;
上述淀粉类原料为玉米粉、玉米淀粉、木薯粉、木薯淀粉、土豆粉、土豆淀粉、红薯干粉中的一种或几种任意重量比例混合物；
(2) 5升发酵罐同步糖化发酵生产2,3-丁二醇
以体积比5 10%的接种量，将制备的肺炎克雷伯氏菌(i:/efc/e〃fl p加wmow'ae) SDMCCTCCM 208097或者肺炎克雷伯氏菌(《/efc/e〃a/weww w'ae) CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌(《/efe/e〃a p股wwo"/"e) ATCC 8724种子液接种到装有2 4升同步糖化发酵培养基的5升发酵罐中，同时补加过滤除菌的糖化酶，糖化酶的添加量为100 1000U/g淀粉干重；以发酵温度为30 40°C，搅拌转速为200 500 rpm，通气量0.5 1.5 vvm实施发酵；发酵过程中，通过发酵罐关联控制蠕动泵流加4 6 M的KOH或3 6 M的H3P04来调节pH值，使之控制在pH5.5 6.5;并每隔3 4小时取样测定发酵液中的葡萄糖含量和2，3-丁二醇浓度；若进行同步糖化分批发酵，当检测葡萄糖浓度降到15 20g/L时，加入过滤除菌的糖化酶，糖化酶的添加量为100 500 U/g淀粉干重，使发酵液中葡萄糖浓度在15 40g/L，当加入糖化酶后葡萄糖浓度不再增加时，停止补加糖化酶；待葡萄糖耗完，2,3-丁二醇浓度不再上升时，结束发酵，取发酵液分离、提取2,3-丁二醇；若进行同步糖化补料分批发酵，当检测葡萄糖浓度降到15 20 g/L时，补加200 800 mL灭菌的淀粉液化液并加入过滤除菌的糖化酶，糖化酶的添加量为100 500 U/g淀粉干重，以保持发酵液中葡萄糖浓度在15 60 g/L，当测得葡萄糖消耗速率低于2 g/(L七)时，停止补加淀粉液化液和糖化酶，待2,3-丁二醇浓度不再上升时，结束发酵，取发酵液分离、提取2,3-丁二醇。
上述淀粉类原料优选玉米粉、玉米淀粉、木薯粉或木薯淀粉。上述加水量与淀粉类原料质量比优选1 4:1。上述a-淀粉酶的加酶量优选2 6 U/g淀粉干重。
上述分步糖化发酵过程中，糖化酶的添加量优选400 800U/g淀粉干重。上述同步糖化发酵过程中，糖化酶的添加量优选200 400 U/g淀粉干重。上述发酵温度优选35 37°C，搅拌转速优选300 400 rpm，通气量优选0.8 1.2 vvm。上述肺炎克雷伯氏菌(《/efc/e〃ap^wmow'ae) SDM CCTCC M 208097或者肺炎克雷伯氏菌(A7eZw7'e〃c /7"ew附o"/ae) CICC 10011或者月市炎克雷伯氏菌(A7e6i7.e〃a /wewmow'ae)ATCC 8724种子液的制备方法是将活化的肺炎克雷伯氏菌(/^fc/e〃a/w^mow'ae) SDMCCTCCM208097或者肺炎克雷伯氏菌(幻efczW/a;wewww/ae) CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌(K/efc/e〃ap"ewwo"/ae) ATCC 8724菌种接到灭菌的种子培养基中，在30 37°C ,100 150rpm培养10 14小时得到种子液。
其中所述种子培养基配方是葡萄糖40 g/L，NH4Cl 5 g/L，K2HP04'3H20 3 g/L，KH2P043g/L， Na2S042g/L， MgS04.7H20 0.3 g/L， ZnS04.7H20 0.2 g/L。
本发明的显著特点是
1.充分利用自然资源中的淀粉类生物质原料来直接发酵生产高价值平台化合物2,3-
丁二醇，可以提高生物质资源的利用效率，产生更高的社会效益。并且利用可再生资源代替石化资源生产高价值化学品，有利于经济社会的可持续性发展。所用的淀粉类生物质原料来源广泛，价格低廉，再生循环迅速，环境友好，可以显著降低发酵生产成本。
2. 本发明通过对加水比、(X-淀粉酶加量、糖化酶加量、酶处理温度和处理时间、发酵时间、发酵条件优化等方面的研究，得到了优化的发酵工艺。
3. 通过比较，采用同步糖化发酵更有优势同步糖化发酵省略了糖化阶段，节约能耗；糖化和发酵在同一个反应器中进行，节省设备投资；另外糖化和发酵同时进行，糖化产生的葡萄糖很快被菌体利用，保持较低的水平，可以避免底物抑制，同时消除了菌体对高浓度底物的延迟期，縮短了发酵周期，提高了生产效率。
4. 本发明实现了淀粉类生物质原料的有效利用，与中国专利申请号为200510011959.6公开的方法相比，本发明方法回避了使用2种菌进行发酵，无需经过复杂的发酵过程。中国专利申请号200510011959.6公布的方法是使用酵母菌先有氧后厌氧制备甘油发酵液，甘油发酵液过滤处理后，再利用细菌由甘油发酵液先厌氧后有氧流加补料生产1，3-丙二醇和2,3-丁二醇，1，3-丙二醇是主要产物，2,3-丁二醇浓度能达到30.4g/L。本发明简化了发酵操作流程，利用淀粉类原料经细菌发酵获得了高产的2,3-丁二醇。通过分步糖化发酵或者同步糖化发酵，2,3-丁二醇的最终浓度达到43 112g/L,乙偶姻和2，3-丁二醇的最终浓度达到45 121 g/L，具有极大的推广和应用前景。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但不仅限于此。
一般性说明
本发明所选用的菌株为肺炎克雷伯氏菌(《/efo/e〃" ；wrawo附'ae) SDM CCTCC M208097或者肺炎克雷伯氏菌(/:/efc/e〃a p"ewwom'ae) CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌(A7efo/e〃of/wewmom'ae) ATCC 8724。其中，月市炎克雷伯氏菌(A7efc/e〃a/ "eM附om.ae) SDMCCTCC M 208097由山东大学(本申请发明人所在实验室)筛选并保藏在中国典型培养物保藏中心；肺炎克雷伯氏菌CICC 10011可由中国工业微生物菌种管理保藏中心购得；肺炎克雷伯氏菌ATCC 8724可由美国标准生物品收藏中心购得。
本发明方法中涉及的葡萄糖的测定方法为发酵液稀释后离心，采用生物传感分析仪SBA-40C (山东省科学院生物研究所)测定。测定原理为利用固定化葡萄糖氧化酶膜专一性测定葡萄糖含量。
本发明方法中涉及的2,3-丁二醇的测定方法为VARIAN CP-3380气相色谱仪检测。乙酸丁酯为萃取剂，体积比l:l萃取，取上层有机相检测。具体测定的条件是火焰离子监测器(FID)温度为280°C，进样器温度为220'C，而毛细管柱温是从50。C升温到180'C，升温速度20 °C/min，载气为氮气。利用2,3-丁二醇标准品(德国Sigma-Aldrich公司，货号361461)做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液中2,3-丁二醇的含量。
实施例l:利用肺炎克雷伯氏菌(幻efc/e〃a; "ewmom^) ATCC 8724以玉米淀粉为原料在5升发酵罐中分步糖化补料分批发酵生产2,3-丁二醇
(1)玉米淀粉处理及分步糖化补料分批发酵培养基的制备
将1200 g玉米淀粉加水调制成淀粉浆定容至2.5 L，调节pH至5.5，按加酶量为10U/g淀粉干重加入a-淀粉酶，在95'C条件下蒸煮2小时，得到玉米淀粉液化液；将玉米淀粉液化液冷却至55°C ，调节液化液的pH至4.0，按加酶量为1000 U/g淀粉干重加入糖化酶，在55'C条件下处理2小时，得到玉米淀粉糖化液，测得葡萄糖浓度为452g/L，将糖化液
8115'C灭菌20分钟，冷却后作为碳源用于制备进行分步糖化补料分批发酵的发酵培养基；适于进行分步糖化补料分批发酵的发酵培养基，配方是碳源为玉米淀粉糖化液，其
用量以其含葡萄糖量计为45g/L;其余成分是(NH4)2S04 16g/L， K2HP(V3H20 4 g/L，KH2P044g/L， NaCI2g/L， CaCl2 0.4 g/L， MgS04.7H20 0.4 g/L， ZnS04.7H20 0.4 g/L,乙酸钾4g/L，柠檬酸三钠4g/L; pH值调至6.5， 115。C灭菌20分钟；(2) 5升发酵罐分步糖化补料分批发酵生产2,3-丁二醇无菌条件下将培养好的肺炎克雷伯氏菌(《/efc/e〃fl，《/wo"/fle) ATCC 8724种子液按体积比为5%的接种量接入灭菌的发酵培养基，发酵罐初始装液量为2L，以发酵温度为35'C，搅拌转速为350rpm，通气量为1.2 vvm进行发酵；发酵初始pH值为6.5，发酵过程中，当pH值降低到6.0，通过发酵罐关联控制蠕动泵流加4 6 M的KOH或3 6 M的H3P04来调节pH值，使之控制在pH6.0;每隔3 4小时取样测定发酵液中的葡萄糖含量和2,3-丁二醇浓度；发酵过程中，当检测葡萄糖浓度降到15 20 g/L时，补加200 400 mL灭菌的玉米淀粉糖化液，保持发酵液中葡萄糖浓度在15 60g/L，当测得葡萄糖消耗速率低于2g/(L-h)时，停止补加玉米淀粉糖化液，待2,3-丁二醇浓度不再上升时，结束发酵，最终发酵时间为66小时；发酵完毕后，2,3-丁二醇的浓度为107.87 g/L，乙偶姻和2,3-丁二醇的总含量为114.69 g/L，生产效率为1.74g/(L-h)。
实施例2:利用肺炎克雷伯氏菌(《fefe,W/a/wwwow'ae) ATCC 8724以玉米淀粉为原料在5升发酵罐中同步糖化补料分批发酵生产2,3-丁二醇
(1) 玉米淀粉处理及同步糖化补料分批发酵培养基的制备
将1200 g玉米淀粉加水调制成淀粉浆定容至2.5 L，调节pH至6.5，按加酶量为2 U/g淀粉干重加入(x-淀粉酶，在9(TC条件下蒸煮4小时，得到玉米淀粉液化液，115。C灭菌20分钟，冷却后作为碳源，用于制备进行同步糖化补料分批发酵的发酵培养基；
适于进行同步糖化补料分批发酵的发酵培养基，配方是碳源为玉米淀粉液化液，其用量为150mL/L;其余成分是(NH4)2S04 16 g/L， K2HP04'3H20 4 g/L， KH2P04 4 g/L，NaC12g/L, CaCl20.4g/L， MgS04'7H20 0.4 g/L， ZnS04'7H20 0.4 g/L，乙酸钾4 g/L，柠檬酸三钠4g/L; pH值调至6.0， 115。C灭菌20分钟；
(2) 5升发酵罐同步糖化补料分批发酵生产2,3-丁二醇无菌条件下将培养好的肺炎克雷伯氏菌(K/efo/e//a p加w附ow'ae) ATCC 8724种子液
按体积比为10%的接种量接入灭菌的发酵培养基，同时补加过滤除菌的糖化酶，糖化酶添加量为300U/g淀粉干重；发酵罐初始装液量为2L，以发酵温度为37'C，搅拌转速为450 rpm，通气量为1.2 vvm进行发酵；发酵初始pH值为6.0，发酵过程中通过发酵罐关联控制蠕动泵流加4 6 M的KOH或3 6 M的H3P04来调节pH值使之维持在pH 6.0;每隔3 4小时取样测定发酵液中的葡萄糖含量和2,3-丁二醇浓度；发酵过程中，当检测葡萄糖浓度降到15 20 g/L时，补加200 400 mL灭菌的玉米淀粉液化液并加入过滤除菌的糖化酶，糖化酶的添加量为100 500 U/g淀粉干重，以保持发酵液中葡萄糖浓度在15 60 g/L，当测得葡萄糖消耗速率低于2 g/(L七)时，停止补加玉米淀粉液化液和糖化酶，待2,3-丁二醇浓度不再上升时，结束发酵，发酵时间为58小时；发酵完毕后，2,3-丁二醇的浓度为110.63 g/L，乙偶姻和2,3-丁二醇的总含量为120.87 g/L，生产效率为2.08 g/(L'h)。与实施例l相比，玉米淀粉同步糖化发酵縮短了发酵周期，乙偶姻和2,3-丁二醇的生产效率有很大提高。
实施例3:利用肺炎克雷伯氏菌(iCM^W/a/wewwo"/ae) SDM CCTCC M 208097以木薯粉为原料在5升发酵罐中同步糖化补料分批发酵生产2,3-丁二醇
(1) 木薯粉处理及同步糖化补料分批发酵培养基的制备
将540 g木薯粉加水调制成淀粉浆定容至1.2 L，调节pH至6.5，按加酶量为5 U/g淀粉干重加入a-淀粉酶，在90。C条件下蒸煮1小时，得到木薯粉液化液，115。C灭菌20分钟，冷却后作为碳源，用于制备进行同步糖化补料分批发酵的发酵培养基；
适于进行同步糖化补料分批发酵的发酵培养基，配方是碳源为木薯粉液化液，其用量为170mL/L;其余成分是(NH4)2S04 16g/L， K2HP04'3H20 4 g/L， KH2P04 4 g/L， NaCl2g/L， CaCl20.4g/L， MgS04'7H20 0,4 g/L， ZnS04.7H20 0.4 g/L，乙酸钾4 g/L，拧檬酸三钠4g/L; pH值调至6.0， 115t:灭菌20分钟；
(2) 5升发酵罐同步糖化补料分批发酵生产2,3-丁二醇无菌条件下将培养好的肺炎克雷伯氏菌(A7efc/e//a SDM CCTCC M
208097种子液按体积比为10%的接种量接入灭菌的发酵培养基，同时补加过滤除菌的糖化酶，糖化酶添加量为500 U/g淀粉干重；发酵罐初始装液量为1.2L，以发酵温度为35'C，搅拌转速为400 rpm，通气量为0.6 vvm进行发酵；发酵初始pH值为6.0，发酵过程中通过发酵罐关联控制蠕动泵流加4 6 M的KOH或3 6 M的H3P04来调节pH值使之维持在pH6.0;每隔3 4小时取样测定发酵液中的葡萄糖含量和2,3-丁二醇浓度；发酵过程中，当检测葡萄糖浓度降到15 20 g/L时，补加100 200 mL灭菌的木薯粉液化液并加入过滤除菌的糖化酶，糖化酶的添加量为100 500U/g淀粉干重，以保持发酵液中葡萄糖浓度在15 60g/L，当测得葡萄糖消耗速率低于2 g/(L七)时，停止补加木薯粉液化液和糖化酶，待2,3-丁二醇浓度不再上升时，结束发酵，发酵时间为60小时；发酵完毕后，2，3-丁二醇的浓度为62.73 g/L，乙偶姻和2,3-丁二醇的总含量为65.10g/L，生产效率为1.09 g/(L.h)。
实施例4:利用肺炎克雷伯氏菌(A7efc/e〃flp"eMmow^) CICC 10011以木薯淀粉为原料在5升发酵罐中同步糖化分批发酵生产2,3-丁二醇
(1) 木薯淀粉处理及同步糖化分批发酵培养基的制备
将350 g木薯淀粉加水调制成淀粉浆定容至1 L，调节pH至6.0，按加酶量为6 U/g淀粉干重加入a-淀粉酶，在95'C条件下蒸煮1小时，得到木薯淀粉液化液，115'C灭菌20分钟，冷却后作为碳源，用于制备进行同步糖化分批发酵的发酵培养基；
适于进行同步糖化分批发酵的发酵培养基，配方是碳源为淀粉液化液，其用量为500mL/L， (NH4)2S04 16 g/L， K2HP04-3H20 4 g/L， KH2P04 4 g/L， NaCl 2 g/L， CaCl2 0,4g/L， MgS04'7H20 0.4 g/L， ZnS04'7H20 0.4 g/L，乙酸钾4 g/L，柠檬酸三钠4g/L; pH值调至6.5， 115"灭菌20分钟；
(2) 5升发酵罐同步糖化分批发酵生产2,3-丁二醇无菌条件下将培养好的肺炎克雷伯氏菌(^efc/e〃apm wwom'ae) CICC 10011种子液按
体积比为5%的接种量接入灭菌的发酵培养基，同时补加过滤除菌的糖化酶，糖化酶添加量为200U/g淀粉干重；发酵罐总装液量为2L，以发酵温度为37'C，搅拌转速为350rpm，通气量为l.O wm进行发酵；发酵初始pH值为6.5，发酵过程中，当pH值降低到6.0，发酵过程中通过发酵罐关联控制蠕动泵流加4 6 M的KOH或3 6 M的H3P04来调节pH值，使之控制在pH 6.0;每隔3 4小时取样测定发酵液中的葡萄糖含量和2，3-丁二醇浓度；当检测葡萄糖浓度降到15 20 g/L时，加入过滤除菌的糖化酶，糖化酶的添加量为100 500 U/g淀粉干重，以保持发酵液中葡萄糖浓度在15 40g/L,当加入糖化酶后葡萄糖浓度不再增加时，停止补加糖化酶，待葡萄糖耗完，2,3-丁二醇浓度不再上升时，结束发酵，发酵时间为40小时；发酵完毕后，2,3-丁二醇的浓度为69.48 g/L，乙偶姻和2，3-丁二醇的总含量为72.32g/L，生产效率为1.81 g/(L-h)。
实施例5:利用肺炎克雷伯氏菌(《/efc/e〃ap7eww)m^) SDM CCTCC M 208097以红薯干粉为原料在5升发酵罐中分步糖化补料分批发酵生产2，3-丁二醇
(1) 红薯干粉处理及分歩糖化补料分批发酵培养基的制备
将1000 g红薯干粉加水调制成淀粉浆定容至2 L，调节pH至5.5，按加酶量为5 U/g淀粉干重加入(x-淀粉酶，在94'C条件下蒸煮1小时，得到红薯干粉液化液；将红薯干粉液化液冷却至60'C，调节液化液的pH至4.3，按加酶量为300 U/g淀粉干重加入糖化酶，在60'C条件下处理6小时，得到红薯干粉糖化液，测得葡萄糖浓度为312g/L，将糖化液115"C灭菌20分钟，冷却后作为碳源用于制备进行分步糖化补料分批发酵的发酵培养基；
适于进行分步糖化补料分批发酵的发酵培养基，配方是碳源为红薯干粉糖化液，其用量以其含葡萄糖量计为38g/L;其余成分是(NH4)2S04 16g/L， K2HPCV3H20 4 g/L，KH2P044g/L， NaC12g/L， CaCl20.4g/L， MgS04-7H20 0.4 g/L， ZnS04-7H20 0.4 g/L，乙酸钾4g/L，柠檬酸三钠4g/L; pH值调至6.0， 115。C灭菌20分钟；
(2) 5升发酵罐分步糖化补料分批发酵生产2,3-丁二醇无菌条件下将培养好的肺炎克雷伯氏菌(Wefe!W/a ，eioww/ae) SDM CCTCC M
208097种子液按体积比为10%的接种量接入灭菌的发酵培养基，发酵罐初始装液量为2.2L,以发酵温度为35'C，搅拌转速为300卬m，通气量为1.2 vvm进行发酵；发酵初始pH值为6.0，发酵过程中通过发酵罐关联控制蠕动泵流加4 6 M的KOH或3 6 M的H3P04来调节pH值使之维持在pH 6.0;每隔3 4小时取样测定发酵液中的葡萄糖含量和2,3-丁二醇浓度；发酵过程中，当检测葡萄糖浓度降到15 20 g/L时，补加200 500 mL灭菌的红薯干粉糖化液，保持发酵液中葡萄糖浓度在15 60 g/L，当测得葡萄糖消耗速率低于2 g/(L-h)时，停止补加红薯干粉糖化液，待2,3-丁二醇浓度不再上升时，结束发酵，最终发酵时间为44小时；发酵完毕后，2,3-丁二醇的浓度为50.28 g/L，乙偶姻和2,3-丁二醇的总含量为56.94 g/L,生产效率为1.29g/(L七)。
实施例6:利用肺炎克雷伯氏菌(/:/eZwW/apwwwo"/ae) CICC 10011以土豆淀粉为原料在5升发酵罐中同步糖化分批发酵生产2，3-丁二醇
(1) 土豆淀粉处理及同步糖化分批发酵培养基的制备
将400 g 土豆淀粉加水调制成淀粉浆定容至1 L,调节pH 6.5，按加酶量为8 U/g淀粉干重加入a-淀粉酶，在95。C条件下蒸煮1.5小时，得到土豆淀粉液化液，115'C灭菌20分钟，冷却后作为碳源用于制备进行同步糖化分批发酵的发酵培养基；
适于进行同步糖化分批发酵的发酵培养基，配方是碳源为淀粉液化液，其用量为500mL/L， (NH4)2S04 16 g/L， K2HP04'3H20 4 g/L， KH2P04 4 g/L， NaC12g/L， CaCl2 0.4g/L， MgS04'7H20 0.4 g/L， ZnS04'7H20 0.4 g/L，乙酸钾4 g/L，拧檬酸三钠4 g/L; pH值调至7.0， 115'C灭菌20分钟；
(2) 5升发酵罐同歩糖化分批发酵生产2,3-丁二醇无菌条件下将培养好的肺炎克雷伯氏菌(《/efc/e〃"/weMmo"/w) CICC 10011种子液按体积比为10%的接种量接入灭菌的发酵培养基，同时补加过滤除菌的糖化酶，糖化酶添加量为300U/g淀粉干重；发酵罐总装液量为2L，以发酵温度为37。C，搅拌转速为300rpm，通气量为l.O vvm进行发酵；发酵初始pH值为7.0,发酵过程中，当pH值降低到5.5，发酵过程中通过发酵罐关联控制蠕动泵流加4 6 M的KOH或3 6 M的H3P04来调节pH值，使之控制在pH 5.5;每隔3 4小时取样测定发酵液中的葡萄糖含量和2,3-丁二醇浓度；当检测葡萄糖浓度降到15 20 g/L时，加入过滤除菌的糖化酶，糖化酶的添加量为100 500 U/g淀粉干重，以保持发酵液中葡萄糖浓度在15 40g/L，当加入糖化酶后葡萄糖浓度不再增加时，停止补加糖化酶，待葡萄糖耗完，2，3-丁二醇浓度不再上升时，结束发酵，发酵时间为52小时；发酵完毕后，2,3-丁二醇的浓度为81.91 g/L，乙偶姻和2，3-丁二醇的总含量为86.18g/L，生产效率为1.66g/(L七)。
1权利要求
1.一种利用淀粉类原料生产2，3-丁二醇的方法，其特征在于包括如下步骤(1)淀粉类原料处理及分步糖化发酵培养基的制备以水与淀粉类原料质量比为1～6∶1的比例将淀粉类原料加入自来水中混匀成淀粉浆；调节淀粉浆pH值在5.5～8.0，向淀粉浆中加入α-淀粉酶，α-淀粉酶加酶量为1～10U/g淀粉干重，在90～110℃条件下，液化0.5～4小时，得到淀粉液化液；将淀粉液化液pH值调节在3.5～6.0后加入糖化酶，糖化酶的添加量为100～1000U/g淀粉干重，在50～70℃条件下糖化0.5～6小时，得到淀粉糖化液，其葡萄糖浓度范围为60～510g/L；将糖化液115℃灭菌20min，冷却后作为碳源，用于制备进行分步糖化发酵的发酵培养基；适于进行分步糖化分批发酵的发酵培养基，配方是碳源为淀粉糖化液，其用量以其含葡萄糖量计为100～120g/L，(NH4)2SO4 16g/L，K2HPO4·3H2O 4g/L，KH2PO4 4g/L，NaCl 2g/L，CaCl2 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，乙酸钾4g/L，柠檬酸三钠4g/L；pH值调至6.0～7.0；适于进行分步糖化补料分批发酵的发酵培养基，配方是碳源为淀粉糖化液，其用量以其含葡萄糖量计为40～60g/L，(NH4)2SO4 16g/L，K2HPO4·3H2O 4g/L，KH2PO4 4g/L，NaCl 2g/L，CaCl2 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，乙酸钾4g/L，柠檬酸三钠4g/L；pH值调至6.0～7.0；上述淀粉类原料为玉米粉、玉米淀粉、木薯粉、木薯淀粉、土豆粉、土豆淀粉、红薯干粉中的一种或几种任意重量比例混合物；(2)5升发酵罐分步糖化发酵生产2，3-丁二醇以体积比5～10％的接种量，将制备的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDMCCTCC M 208097或者肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 8724种子液接种到装有2～4升分步糖化发酵培养基的5升发酵罐中，以发酵温度为30～40℃，搅拌转速为200～500rpm，通气量0.5～1.5vvm实施发酵；发酵过程中，通过发酵罐关联控制蠕动泵流加4～6M的KOH或3～6M的H3PO4来调节pH值，使之控制在pH 5.5～6.5；并每隔3～4小时取样测定发酵液中的葡萄糖含量和2，3-丁二醇浓度；若进行分步糖化分批发酵，当2，3-丁二醇浓度不再上升时，结束发酵，取发酵液分离、提取2，3-丁二醇；若进行分步糖化补料分批发酵，当检测葡萄糖浓度降到15～20g/L时，补加上述灭菌的淀粉糖化液，保持发酵液中葡萄糖浓度在15～60g/L，当测得葡萄糖消耗速率低于2g/(L·h)时，停止补加淀粉糖化液，待2，3-丁二醇浓度不再上升时，结束发酵，取发酵液分离、提取2，3-丁二醇；或者(1)淀粉类原料处理及同步糖化发酵培养基的制备以水与淀粉类原料质量比为1～6∶1的比例将淀粉类原料加入自来水中混匀成淀粉浆；调节淀粉浆pH值在5.5～8.0，向淀粉浆中加入α-淀粉酶，α-淀粉酶加酶量为1～10U/g淀粉干重，在90～110℃条件下，液化0.5～4小时，得到淀粉液化液；将淀粉液化液115℃灭菌20min，冷却后作为碳源，用于制备进行同步糖化发酵的发酵培养基；适于进行同步糖化分批发酵的发酵培养基，配方是碳源为淀粉液化液，其用量为250～600mL/L，(NH4)2SO4 16g/L，K2HPO4·3H2O 4g/L，KH2PO4 4g/L，NaCl 2g/L，CaCl20.4g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，乙酸钾4g/L，柠檬酸三钠4g/L；pH值调至6.0～7.0；适于进行同步糖化补料分批发酵的发酵培养基，配方是碳源为淀粉液化液，其用量为100～300mL/L，(NH4)2SO4 16g/L，K2HPO4·3H2O 4g/L，KH2PO4 4g/L，NaCl 2g/L，CaCl2 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，乙酸钾4g/L，柠檬酸三钠4g/L；pH值调至6.0～7.0；上述淀粉类原料为玉米粉、玉米淀粉、木薯粉、木薯淀粉、土豆粉、土豆淀粉、红薯干粉中的一种或几种任意重量比例混合物；(2)5升发酵罐同步糖化发酵生产2，3-丁二醇以体积比5～10％的接种量，将制备的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDMCCTCC M 208097或者肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 8724种子液接种到装有2～4升同步糖化发酵培养基的5升发酵罐中，同时补加过滤除菌的糖化酶，糖化酶的添加量为100～1000U/g淀粉干重；以发酵温度为30～40℃，搅拌转速为200～500rpm，通气量0.5～1.5vvm实施发酵；发酵过程中，通过发酵罐关联控制蠕动泵流加4～6M的KOH或3～6M的H3PO4来调节pH值，使之控制在pH 5.5～6.5；并每隔3～4小时取样测定发酵液中的葡萄糖含量和2，3-丁二醇浓度；若进行同步糖化分批发酵，当检测葡萄糖浓度降到15～20g/L时，加入过滤除菌的糖化酶，糖化酶的添加量为100～500U/g淀粉干重，使发酵液中葡萄糖浓度在15～40g/L，当加入糖化酶后葡萄糖浓度不再增加时，停止补加糖化酶；待葡萄糖耗完，2，3-丁二醇浓度不再上升时，结束发酵，取发酵液分离、提取2，3-丁二醇；若进行同步糖化补料分批发酵，当检测葡萄糖浓度降到15～20g/L时，补加200～800mL灭菌的淀粉液化液并加入过滤除菌的糖化酶，糖化酶的添加量为100～500U/g淀粉干重，以保持发酵液中葡萄糖浓度在15～60g/L，当测得葡萄糖消耗速率低于2g/(L·h)时，停止补加淀粉液化液和糖化酶，待2，3-丁二醇浓度不再上升时，结束发酵，取发酵液分离、提取2，3-丁二醇。
2. 如权利要求l所述利用淀粉类原料生产2，3-丁二醇的方法，其特征在于所述的淀 粉类原料为玉米粉、玉米淀粉、木薯粉或木薯淀粉。
3. 如权利要求l所述利用淀粉类原料生产2,3-丁二醇的方法，其特征在于所述加水 量与淀粉类原料质量比为1 4:1。
4. 如权利要求1所述利用淀粉类原料生产2,3-丁二醇的方法，其特征在于所述a-淀粉酶的加酶量为2 6 U/g淀粉干重。
5. 如权利要求l所述利用淀粉类原料生产2,3-丁二醇的方法，其特征在于所述分步 糖化发酵过程中，糖化酶的添加量为400 800U/g淀粉干重；所述同步糖化发酵过程中， 糖化酶的添加量为200 400 U/g淀粉干重。
6. 如权利要求l所述利用淀粉类原料生产2,3-丁二醇的方法，其特征在于所述发酵 温度为35 37'C，搅拌转速为300 400rpm，通气量为0.8 1.2 vvm。
7. 如权利要求l所述利用淀粉类原料生产2,3-丁二醇的方法，其特征在于所述肺炎 克雷伯氏菌CS7efozW/a /wewwow'flie) SDM CCTCC M 208097或者肺炎克雷伯氏菌 (A7efc/e〃a jW7eMmwH'ae ) CICC 10011或者月市炎克雷伯氏菌(/C/efc/e〃a /wew附ow'ae) ATCC 8724种子液的制备方法是将活化的肺炎克雷伯氏菌(《/efc/e〃ap"ra附om'ae)SDM CCTCC M 208097或者肺炎克雷伯氏菌(/:/￡^&//"/ 恥"附0"/"￡) CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌(幻dwW/a;7"eMm0"/"e) ATCC 8724菌种接到灭菌的种子培养基中，在30 37。C， 100〃 150 rpm培养10 14小时得到种子液；其中，所述种子培养基配方是葡萄糖40g/L， NH4C15g/L， K2HP04'3H20 3 g/L， KH2P04 3 g/L， Na2S042 g/L， MgS04.7H20 0,3 g/L， ZnS04,7H20 0.2 g/L。
全文摘要
本发明公开了一种利用淀粉类原料生产2，3-丁二醇的方法，是将淀粉类原料经过α-淀粉酶和糖化酶处理，以糖化液或者液化液作为发酵底物，用肺炎克雷伯氏菌作为发酵菌株，在无菌条件下通过分步糖化发酵或者同步糖化发酵来生产2，3-丁二醇。最终2，3-丁二醇的浓度达到43～112g/L，乙偶姻和2，3-丁二醇的最终浓度达到45～121g/L。本发明的优点是利用淀粉类原料发酵生产高值平台化合物2，3-丁二醇，可降低发酵生产2，3-丁二醇的原料成本；建立了淀粉类原料糖化发酵生产2，3-丁二醇的最佳发酵条件；本发明的同步糖化发酵生产2，3-丁二醇可以节约能耗，节省设备投资，缩短发酵周期，提高生产效率。
文档编号C12R1/22GK101565721SQ200910015400
公开日2009年10月28日 申请日期2009年6月4日 优先权日2009年6月4日
发明者唐鸿志, 李理想, 钰 王, 王爱龙, 平 许, 马翠卿 申请人:山东大学