专利名称：一种共价增强型纤维素酶固定化方法
技术领域：
本发明涉及酶的固定化技术，特别是涉及一种用EudragitL-100载体共价固 定化纤维素酶的方法。
背景技术：
开发纤维素燃料乙醇第二代生物质液体燃料技术，对于解决能源危机、食 品短缺和环境污染等问题具有积极的意义。在纤维素乙醇糖化过程中，纤维素 酶起着关键性的作用。但目前使用中的纤维素酶都或多或少地存在着酶稳定性 差、使用寿命短、活力低等缺陷，致使纤维素酶的使用成本过高，影响着纤维 素燃料乙醇的产业化迸程。所以如何降低纤维素酶的使用成本，增加其稳定性 和使用寿命，是打通由纤维质原料到燃料乙醇技术路线的关键，也是世界范围 内所面临的一项共性关键技术。纤维素酶固定化能有效克服游离纤维素酶反应 过程中存在的分离困难、稳定性差和易流失等缺陷，为提高纤维素酶的使用效 率，降低使用成本提供了可能。而对于纤维素酶的固定化而言，共价结合方法 可使纤维素酶与载体牢固结合、渗漏量小，能有效降低纤维素酶的使用成本， 明显优于吸附结合方式。
EDC (l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)作为一种水溶性的碳二亚胺，在多肽、蛋白质和核苷酸合成中，广泛地被用作羧基活化剂，促使酰胺
和酯的生成。单独采用EDC作为羧基活化剂，羧酸与EDC反应生成的O-酰基 脲中间体很不稳定，如果该中间体不与氨基反应，则会很快水解并重新释放出 羧基基团。而在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)同时存在的情况下，EDC可以将羧 基转变为稳定的具有氨基反应活性的中间体，从而可以提高产率，减少副反应 的发生。
本发明在中国专利申请CN101225380A(—种肠溶衣材料固定化纤维素酶的 制备方法)的基础上，采用EDC和NHS作为羧基活化剂，实现纤维素酶在可 溶-不可溶肠溶衣材料Eudragit L-100上的高效共价固定。目前，国内还未见有 相关的专利文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种共价增强型纤维素酶固定化方法。 为达到上述目的，本发明采取了如下的技术方案
本发明通过活化剂EDC和NHS的偶联作用，把纤维素酶高效共价固定于 pH值敏感性载体Eudragit L-100上，通过溶液pH值的变化，可方便地实现固定 化酶的使用和回收，大大提高了纤维素酶的稳定性和使用寿命，从而为降低纤 维素酶的使用成本提供了可能。
所述活化剂EDC指l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，所述NHS 指N-羟基琥珀酰亚胺。所述Eudragit L-100指丙烯酸树脂聚合物，为医药辅料，有粘合和成膜作用，可用于包衣、缓释和成膜。上述物质都是现有技术中公开 使用的物质。为方便描述，在权利要求书和下文中均用代号表示。 本发明的具体步骤如下
1) 将Eudragit L-100均匀地分散于蒸馏水中，用2M的NaOH调节pH值为
11.0，待Eudragit L-100完全溶解后，用2M的HC1调节pH值至6.5后
定容备用；
2) 在pH 6.5的Eudragit L-100溶液中，先后加入活化剂EDC和NHS，室 温下活化Eudragit L-100载体30min;
3) 在活化的载体溶液中，加入纤维素酶酶粉，室温下缓慢搅拌固定3 6 小时；
4) 用3M醋酸调节pH值为3.6，离心去上清得到沉淀；
5) 将沉淀溶解于pH 5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，即得到所需的固定化纤 维素酶。
所述的载体材料Eudragit L-100溶液浓度为质量体积比(W/V)浓度2 5%。 所述步骤1)中，可使用滴加2 M的NaOH调节pH值为11.0，待Eudragit L-100 完全溶解后，滴加2M盐酸调节pH值至6.5后定容备用。 所述的活化剂EDC用量为0.3g/g载体。 所述的活化剂NHS用量为0.3g/g载体。
所述的固定化纤维素酶中蛋白质载量为10 100mg蛋白/g载体。本发明的优点在于可通过溶液pH的变化方便地实现固定化酶的均相酶解 和异相回收，也能够确保固定化酶在均相状态下对不溶性纤维素材料的高效酶 解，以及酶解后副产物木质素的快速分离，具有反复使用多次，酶活保留率变 化不大的优点，制备过程简单方便，可大大降低纤维素酶的使用成本，具有较 好的推广应用价值。
具体实施例方式
为更好地理解本发明，下面结合实施实例对本发明作进一步描述。实施例 仅限于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
下列实施例方法适用于固定化的对象并不仅限于纤维素酶，其他类似于淀 粉酶、木聚糖酶、溶菌酶等也都可适用。
本实施例采用的EDC和NHS购自Sigma-Aldrich公司。 实施例1
准确称取1.00 g Eudragit L-100置于40 mL蒸馏水中(体积以最后定容后的 体积为准，质量体积比浓度2%)，滴加2 M的NaOH至pH值为11.0，待Eudragit L-100完全溶解后，滴加2 M盐酸至pH值至6.5，然后定容至50mL备用；先 后往载体溶液里加入0.30 gEDC和0.30 gNHS，室温下活化载体30 min;然后 加入0.10 g纤维素酶，室温固定6 h;用3 M的醋酸调节pH值为3.6， 10， OOOrpm 下离心5min;将沉淀溶解于pH 5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，即得到所需的固 定化纤维素酶。实施例2
准确称取2.50 g的Eudragit L-100置于40 mL蒸馏水中(体积以最后定容 后的体积为准，质量体积比浓度5%)，滴加2 M的NaOH至pH值为11.0，待 EudragitL-100完全溶解后，滴加2 M盐酸至pH值至6.5，然后定容至50mL备 用；先后往载体溶液里加入0.75 gEDC和0.75 gNHS，室温下活化载体30 min; 然后加入0.25§纤维素酶，室温固定6h;用3M的醋酸调节pH值为3.6， 10， 000rpm下离心5 min;将沉淀溶解于pH 5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，即得到所 需的固定化纤维素酶。
权利要求
1、一种共价增强型纤维素酶固定化方法，其特征在于包括如下步骤1)将载体Eudragit L-100均匀地分散于蒸馏水中，用2M的NaOH调节pH值为11.0，待Eudragit L-100完全溶解后，用2M的HCl调节pH值至6.5后定容备用；2)在pH 6.5的Eudragit L-100溶液中，先后加入EDC和NHS，室温下活化Eudragit L-100载体30min；3)在活化的载体溶液中，加入纤维素酶酶粉，室温下缓慢搅拌固定3～6小时；4)用3M醋酸调节pH值为3.6，离心去上清得到沉淀；5)将沉淀溶解于pH 5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，即得到所需的固定化纤维素酶。
2、 如权利要求1所述的共价增强型纤维素酶固定化方法，其特征在于步骤l) 中所述的Eudragit L-100溶液质量体积比浓度为2 5%。
3、 如权利要求1所述的共价增强型纤维素酶固定化方法，其特征在于步骤2) 中所述的活化剂EDC用量为0.3g/g载体。
4、 如权利要求1所述的共价增强型纤维素酶固定化方法，其特征在于步骤2) 中所述的活化剂NHS用量为0.3g/g载体。
5、 如权利要求1所述的共价增强型纤维素酶固定化方法，其特征在于所述的固 定化纤维素酶中蛋白质载量为10 100mg蛋白/g载体。
全文摘要
本发明提供了一种共价增强型纤维素酶固定化方法。步骤为1)将载体Eudragit L-100均匀地分散于蒸馏水中，调节pH值为11.0，待其完全溶解后调节pH值至6.5后定容备用；2)先后加入EDC和NHS，室温下活化载体30min；3)加入纤维素酶酶粉，室温下缓慢搅拌固定3～6小时；4)用3M醋酸调节pH值为3.6，离心去上清得到沉淀；5)将沉淀溶解于pH 5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中。本发明可通过溶液pH的变化方便地实现固定化酶的均相酶解和异相回收，也能够确保固定化酶在均相状态下对不溶性纤维素材料的高效酶解，以及酶解后副产物木质素的快速分离，具有反复使用多次，酶活保留率变化不大的优点，制备过程简单方便，可大大降低纤维素酶的使用成本，具有较好的推广应用价值。
文档编号C12N11/06GK101555473SQ200910039540
公开日2009年10月14日 申请日期2009年5月18日 优先权日2009年5月18日
发明者吕鹏梅, 吴创之, 庄新姝, 宇 张, 王忠铭, 袁振宏, 许敬亮, 马隆龙 申请人:中国科学院广州能源研究所