专利名称：一种鸟嘌呤核苷的生产方法
技术领域：
本发明属于一种食品和医疗产品重要中间体的鸟嘌呤核苷的生产方法。
背景技术：
鸟P票呤核苷(商品名称GR)又名9-P-D-吹喃核糖基鸟P票呤，简称鸟苷, 英文名称Guanosine。鸟苷为白色结晶性粉末或类白色结晶性粉末，溶于水、嘧 啶，不溶于醇。分子式为"MA,相对分子量为283. 24。化学结构式如下
鸟苷的用途十分广泛，是食品和医药产品的重要中间体。在医药工业领域， 鸟苷主要是作为合成利巴韦林、阿昔洛韦等核苷类抗病毒药物的重要中间体，也 是用于制造无环鸟苷(Acyclovir)、三氮唑核苷(ATC )、三磷酸鸟苷钠(GTP )、 抗癌药物氟铁龙(5-氟脱氧尿苷)等药物的主要原料；在食品工业领域，鸟苷是 作为呈味核苷酸鸟苷酸二钠的主要原料，与肌苷酸二钠混合简称I+G,添加到味 精中即是第二代、第三代味精，具有十分广阔的市场。目前，鸟苷需求量以每年 10%-20%的速度增加。
鸟苷的生产方法有化学合成法、菌体自溶法、发酵法。由于化学合成法需 要大量有机溶剂，存在原料来源及环境污染等问题在生产中极少使用；菌体自 溶法由于其效率太低目前也基本不用；发酵法生产鸟苷由于其产率高、周期短、 控制容易等优点，目前已经成为工业化生产鸟苷的重要方法。以枯草芽孢杆菌(fe"/勿S卯6〃/")为发酵菌种制备核苦具有产量高、产物中副产物少、便于产物分离提取等优点，因而，枯草芽孢杆菌成为核苷发酵工业最重要的生产
菌。20世纪60年代日本就大规模开展了发酵法生产鸟苷研究，主要侧重于传统的诱变育种技术改变菌种特性，提高鸟苷产量，最高达20g/L,而且近几年对鸟苷发酵研究较少。而我国对鸟嘌呤系列的化合物的研究始于80年代，随着鸟苷巿场需求激增，越来越多的科研机构对鸟苷发酵进行了全面深入的研究。据调查显示，目前国内鸟苷发酵水平与世界先进水平有很大差距。主要原因是育种技术落后，菌种产苷水平不高；发酵周期长、转化率及提取综合收率低。因此，
发明内容
针对上述同类技术的不足，本发明的目的是提供一种新的鸟嘌呤核苷的生
产方法。
(1)、摇瓶液体菌种培养
① 选用枯草芽孢菌TA208-IMPD为保藏菌种；
② 将葡萄糖、无机盐、有机氣等配制的初级菌种培养基装入茄瓶；
③ 接入保藏菌种，接种量为0.1%,在温度36'C条件下静置培养24h后获初级菌种；
④ 将初级菌种放入摇瓶，接种量为0.1%,在往复式摇床上培养，转速160转/分，温度36t:，时间周期10-12h,当菌种镜检及OD等各项指标达标后即获
(2)、葡萄糖液生产
① 将碎米在浸泡罐内浸泡时间4h，维持温度4(TC;
② 用砂磨机将碎米磨成米浆，其细度为30目，浓度达18 Be° -20Be° ;
③ 将米浆用液化喷射器在105r-10rc条件下高温液化，然后进入维持罐保温维持80- 12Qmin;
④ 将液化料液经板框压滤机压滤，压滤温度8(TC左右，压力《0. 25Mpa;
⑤ 将液化液泵入糖化罐进行糖化，糖化温度保持为6(TC，糖化周期33h-36h;
⑥ 糖化后用板框压滤机压滤糖化液，得葡萄糖液；压滤温度6(TC左右，压 力《0. 25MPa。
(3) 、鸟苷发酵液制取
① 将葡萄糖液、无机盐、有机氣等配制的二级菌种培养基经urc左右、
15min蒸汽灭菌后泵入二级种子罐，降温至36。C后，接入摇瓶菌种接种量为0. 1%, 同时将经过0.25-0. 3Mpa压缩、过滤后的无菌空气输入二级种子罐，此时通风 比1: 0. 2 - 0. 4v/V. min, pH6-8，压力0. 03 - 0. lMPa,培养10h-12h,经菌种
② 将葡萄糖液、无机盐、有机氮配制的发酵培养基经12rC左右、15min蒸 汽灭菌后泵入发酵罐，降温至36。C左右后接入二级菌种，接种量为10%;同时 在上述①中保压无菌空气输入的条件下将经118t:左右、10min蒸汽灭菌后的40 -60g/dL葡萄糖液进行流加；此时通风比为1: 0. 2 - 0. 8v/V. min, pH6-8, 压力0.03 MPa-0. IMPa,发酵50h - 60h;当产苷达到38g/L、转化率20%时， 即获得鸟苷发酵液。
(4) 、鸟苷提取精制
① 将鸟苷发酵液送入提取储料罐，加热至6(TC左右，用硫酸调PH值为2-4, 经微滤膜除菌后送入粗品鸟苷结晶罐搅拌降温至4°C-l(TC、调PH为7、时间 10h-12h后获初级鸟苷晶体；微滤控制温度6(TC左右，压力《0. 35Mpa,流速80 L/m2. h——100L/m2. h;
② 将初级鸟苷晶体用板框压滤机分离后，控制过滤压力《0. 25Mpa;粗级鸟 苷晶体重新溶解，并配置含量达到30g/L-45g/L的鸟苷溶液使其充分溶解；将 充分溶解后的粗级鸟苷晶体经超滤膜进行脱色、除杂后送入精品鸟苷结晶罐搅拌降温后获得精级鸟苷晶体；超滤膜温度6(TC左右，压力《0. 35Mpa,流速100L/m2.h——120L/m2.h;搅伴降温至4°C-10°C ,时间10h-12h;
③将精级鸟苷晶体用板框压滤机分离，压滤压力《0.25Mpa;然后在温度70。C-8(TC、真空度0. 06 Mpa-0. 08 Mpa的条件下进行真空干燥机烘干，最后包装获合格鸟苷产品。
本发明的优点是①保藏菌种TA208-IMPD遗传稳定，菌种同步生产率高，产苷水平高；②利用碎米生产葡萄糖液工艺合理，产品质量稳定，生产成本低；③采用流加葡萄糖液等新工艺，发酵产苷水平高，糖苷转化率高；④提取精制工艺流程合理，鸟苷产品纯度可达99%以上，收率达80U乂上。
具体实施例方式
1、摇瓶液体菌种培养
① 选用枯草芽孢菌TA208-IMPD为保藏菌种；
② 将葡萄糖、无机盐、有机氮等配制的初级菌种培养基装入茄瓶，初级菌种培养基的成分比为葡萄糖磷酸氢二钾硫酸镁酵母粉琼脂水=1%: 0.2%:0.1%: 2°/ :: 2%: 94.7%;
③ 接入保藏菌种，接种量为Q.l%，在温度36'C条件下静置培养24h后获初
④ 将初级菌种放入摇瓶，接种量为0.1%,在往复式摇床上培养，转速160转/分，温度36X:,时间周期10-12h,当菌种镜检及OD等各项指标达标后即获
摇瓶液体菌种。
① 将碎米在浸泡罐内浸泡时间4h，维持温度4(TC;
② 用砂磨机将碎米磨成米浆，其细度为30目，浓度达18 Be。 -20Be。；
③ 将米浆用液化喷射器在105°C-1081:条件下高温液化，然后进入维持罐保温维持80 - 120min;
④ 将液化料液经板框压滤机压滤，压滤温度8(TC左右，压力<0. 25Mpa;⑤ 将液化液泵入糖化罐进行糖化，糖化温度保持为6(TC，糖化周期33h-36h;
⑥ 糖化后用板框压滤机压滤糖化液，得葡萄糖液；压滤温度6(TC左右，压 力《0. 25MPa。
3、 鸟苷发酵液制取
① 将葡萄糖液、无机盐、有机氮等配制的二级菌种培养基经12rc左右、 15min蒸汽灭菌后泵入二级种子罐，二级菌种培养基的成分比为葡萄糖磷酸氢 二钾硫酸镁酵母粉水=5%: 0.2%: 0.1%: 1.5%: 93.2%;降温至36。C左右 后接入摇瓶菌种接种量为0.1%，同时将经过O. 25-0. 3Mpa压缩、过滤后的无菌 空气输入二级种子罐；此时通风比1: 0. 2-0. 4v/V.min， pH6-8,压力0.03-0. lMPa,培养10h-12h,经菌种镜检及OD等各项指标达标后即获得二级菌种；
② 将葡萄糖液、无机盐、有机氮配制的发酵培养基经12rC左右、15min蒸 汽灭菌后泵入发酵罐，发酵培养基的成分比为葡萄糖磷酸氢二钾硫酸镁 酵母粉水=15%: 0.2%: 0.1%: 1.0%: 83.7%;降温至36。C左右后接入二级菌种， 接种量为10%;同时在上述①中保压无菌空气输入的条件下将经118€左右、 10min蒸汽灭菌后的40 - 60g/dL葡萄糖液进行流加；此时通风比为1: 0.2-0. 8v/V. min,pH 6 — 8,压力0. 03MPa — 0. lMPa，发酵50h - 60h;当产苷达到38g/L、 转化率20%时，即获得鸟苦发酵液。
4、 鸟苷提取精制
① 将鸟苷发酵液送入提取储料罐，加热至6(TC左右，用硫酸调PH值为2-4, 经微滤膜除菌后送入粗品鸟苷结晶罐搅拌降温至4°C-l(TC、调PH为7、时间 10h-12h后获初级鸟苷晶体；微滤控制温度6(TC左右，压力《0. 35Mpa,流速80 L/m2. h——100L/m2. h;
② 将初级鸟苷晶体用板框压滤机分离后，控制过滤压力<0. 25Mpa;粗级鸟 苷晶体重新溶解，并配置含量达到30g/L-45g/L的鸟苷溶液使其充分溶解；将 充分溶解后的粗级鸟苷晶体经超滤膜进行脱色、除杂后送入精品鸟苷结晶罐搅 拌降温后获得精级鸟苷晶体；超滤膜温度6(TC左右，压力《0. 35Mpa，流速100L/ni2.h——120L/W.h;搅伴降温至4 °C-10°C ，时间10h-12h;
③将精级鸟苷晶体用板框压滤机分离，压滤压力《0.25Mpa;然后在温度70°C-80°C、真空度0. 06 Mpa-O. 08 Mpa的条件下进行真空干燥机烘干，最后包装获合格鸟苷产品。
权利要求
1、一种鸟嘌呤核苷的生产方法，其特征是(1)、摇瓶液体菌种培养①选用枯草芽孢菌TA208-IMPD为保藏菌种；②将葡萄糖、无机盐、有机氮等配制的初级菌种培养基装入茄瓶；③接入保藏菌种，接种量为0.1％，在温度36℃条件下静置培养24h后获初级菌种；④将初级菌种放入摇瓶，接种量为0.1％，在往复式摇床上培养，转速160转/分，温度36℃，时间周期10-12h，当菌种镜检及OD等各项指标达标后即获摇瓶液体菌种。(2)、葡萄糖液生产①将碎米在浸泡罐内浸泡时间4h，维持温度40℃；②用砂磨机将碎米磨成米浆，其细度为30目，浓度达18Be°-20Be°；③将米浆用液化喷射器在105℃-108℃条件下高温液化，然后进入维持罐保温维持80-120min；④将液化料液经板框压滤机压滤，压滤温度80℃左右，压力≤0.25Mpa；⑤将液化液泵入糖化罐进行糖化，糖化温度保持为60℃，糖化周期33h-36h；⑥糖化后用板框压滤机压滤糖化液，得葡萄糖液；压滤温度60℃左右，压力≤0.25MPa。(3)、鸟苷发酵液制取①将葡萄糖液、无机盐、有机氮等配制的二级菌种培养基经121℃左右、15min蒸汽灭菌后泵入二级种子罐，降温至36℃后，接入摇瓶菌种接种量为0.1％，同时将经过0.25-0.3Mpa压缩、过滤后的无菌空气输入二级种子罐，此时通风比1∶0.2-0.4v/V.min，pH6-8，压力0.03-0.1MPa，培养10h-12h，经菌种镜检及OD等各项指标达标后即获得二级菌种；②将葡萄糖液、无机盐、有机氮配制的发酵培养基经121℃左右、15min蒸汽灭菌后泵入发酵罐，降温至36℃左右后接入二级菌种，接种量为10％；同时在上述①中保压无菌空气输入的条件下将经118℃左右、10min蒸汽灭菌后的40-60g/dL葡萄糖液进行流加；此时通风比为1∶0.2-0.8v/V.min，pH6-8，压力0.03MPa-0.1MPa，发酵50h-60h；当产苷达到38g/L、转化率20％时，即获得鸟苷发酵液。(4)、鸟苷提取精制①将鸟苷发酵液送入提取储料罐，加热至60℃左右，用硫酸调PH值为2-4，经微滤膜除菌后送入粗品鸟苷结晶罐搅拌降温至4℃-10℃、调PH为7、时间10h-12h后获初级鸟苷晶体；微滤控制温度60℃左右，压力≤0.35Mpa，流速80L/m2.h——100L/m2.h；②将初级鸟苷晶体用板框压滤机分离后，控制过滤压力≤0.25Mpa；粗级鸟苷晶体重新溶解，并配置含量达到30g/L-45g/L的鸟苷溶液使其充分溶解；将充分溶解后的粗级鸟苷晶体经超滤膜进行脱色、除杂后送入精品鸟苷结晶罐搅拌降温后获得精级鸟苷晶体；超滤膜温度60℃左右，压力≤0.35Mpa，流速100L/m2.h——120L/m2.h；搅伴降温至4℃-10℃，时间10h-12h；③将精级鸟苷晶体用板框压滤机分离，压滤压力≤0.25Mpa；然后在温度70℃-80℃、真空度0.06Mpa-0.08Mpa的条件下进行真空干燥机烘干，最后包装获合格鸟苷产品。
2、 根据权利要求1所述的一种鸟嘌呤核苷生产及其制备方法，其特征是 初级菌种培养基的成分比为葡萄糖磷酸氢二钾硫酸镁酵母粉琼脂水 =1%: 0.2%: 0.1%: 2%:: 2%: 94.7%。
3、 根据权利要求1所述的一种鸟P票呤核苷生产及其制备方法，其特征是 二级菌种培养基的成分比为葡萄糖磷酸氢二钾硫酸镁酵母粉水=5%: 0. 2%: 0.1%: 1.5%: 9 3.2%。
4、 根据权利要求1所述的一种鸟嘌呤核苷生产及其制备方法，其特征是 发酵培养基的成分比为葡萄糖磷酸氢二钾硫酸镁酵母粉水=15%: 0.2%:,0.1%: 1.0%: 8 3.7%。
全文摘要
一种鸟嘌呤核苷的生产方法，它由摇瓶液体菌种培养、葡萄糖液生产、鸟苷发酵液制取和鸟苷提取精制四大工艺过程组成，选用了遗传稳定的保藏菌种TA208-IMPD，碎米经浸泡、磨浆、液化、压滤和糖化制取葡萄糖液，在发酵过程中采用流加葡萄糖液等新工艺，鸟苷发酵液经微滤膜除菌、粗品鸟苷结晶、超滤膜脱色除杂和分离烘干生产合格鸟苷，克服了传统工艺育种技术落后、菌种产苷不高、发酵周期长、转化率及提取综合收率低等不足，菌种同步生产率和产苷水平高，葡萄糖液产品稳定，发酵产苷水平高，鸟苷产品纯度可达99％以上，收率达80％以上。
文档编号C12P19/00GK101487036SQ20091004278
公开日2009年7月22日 申请日期2009年3月4日 优先权日2009年3月4日
发明者蔡传康, 钟广新 申请人:湖南赛康德生物科技有限公司