鸡脂肪候选基因lpin1基因及功能突变检测方法

专利名称：鸡脂肪候选基因lpin1基因及功能突变检测方法
技术领域：
本发明属于分子生物学检测动物脂肪性状技术领域，具体涉及一种鸡脂肪候选基 因Ipinl基因及功能突变检测方法。
背景技术：
动物每天从食物中摄取能量，并主要在肝脏和脂肪组织中把多余的能量转变成脂 肪储存起来。动物脂肪沉积所需要的脂肪酸大多来自于脂肪酸的全程合成。动物脂肪的过 度沉积是影响胴体品质和人类健康的重要问题之一。近年来，减少动物脂肪的过度沉积，阐 明其调控的分子机制及建立相应的调控技术，已成为动物营养学研究的热点，并已取得许 多重要的研究成果。人Lipinl基因与酵母的PAHl基因为同源基因，PAHl基因编码酵母细胞的Mg2+依 赖性的磷脂酸(PA)磷酸化酶，该酶活力与细胞膜和细胞液有关，酶的膜结合形式是盐溶性 的，脂分析显示缺乏PAHl的突变导致磷脂酸的聚集，减少了甘油二酯和甘油三酯的量，缺 少这种酶的酵母细胞，其酵母的脂肪细胞减少90 %。人Lipinl基因在大肠杆菌的杂合表达 表明该基因也是一种编码Mg2+依赖性的磷脂酸磷酸化酶(PAP酶)的基因。在对患有脂肪 肝营养不良症小鼠的研究结果显示，Lipinl基因在脂肪组织和骨骼肌组织中可以发挥磷脂 酸磷酸化酶(PAP酶)的所有功能。目前研究发现，由Lipinl基因编码的哺乳动物Lipin-I蛋白家族不仅具有胞质定 位信号区，而且还拥有核定位信号区。已经得到证实，由Lipinl基因编码的Lipin-I蛋白 由于能够定位在脂肪细胞和肝脏细胞的细胞核中，Finck和他的同事们在鼠中研究发现，在 空腹状态下，Lipin-I蛋白是激活肝脏内脂肪酸氧化相关基因并发挥作用所必须的因素。在以前的研究中，Lipin-I蛋白具有重要的生理学功能，即自身代谢平衡的独特生 理学功能，然而Lipin-I蛋白所具有的两种不同的细胞功能最近才被发现。首先，Lipin-I 蛋白作为一种酶，参与甘油三酯和磷脂合成；其次，Lipin-I蛋白作为一个转录辅激活因 子，直接与细胞核受体过氧化物酶体增生物激活受体α (PPARa)和PPARa共活化物 PGC-I α直接相互作用并形成复合物，以调节脂肪酸利用及脂类合成相关基因的表达。另 外，Lipin-I蛋白还具有在脂肪、骨骼肌、肝脏等组织和外周神经中调节脂类自身代谢平衡 的独特生理学功能。Lindegaard在对两组均感染艾滋病病毒的男性(其中一组同时患有脂肪营养不 良症)研究结果显示，在患有脂肪营养不良症的男性血清中总胆固醇含量显著高于没有患 脂肪营养不良症的男性(p<0.(^)；血清中甘油三酯含量极其显著高于没有患脂肪营养不 良症的男性(P<0. 001)。在患有脂肪营养不良症的男性脂肪组织中Lipinl基因表达水平 显著高于没有患脂肪营养不良症的男性(ρ <0.05)。在健康青年男性中，脂肪细胞当达到 正常成熟脂肪细胞大小的时候，脂肪细胞中Lipinl基因表达水平会被削弱，但是此时，脂 肪组织中甘油三酯的贮存能力达到最大，即甘油三酯含量最高。研究结果显示，Lipinl基 因表达水平与血清中甘油三酯含量呈显著的负相关关系(R2 = -0. 10 ；ρ < 0. 05)。
Lipinl/LIPINl是通过对fid小鼠突变体进行候选位置克隆获得的。fid突变小 鼠患有脂肪营养不良症(lipodystrophy，fid)，表现为脂肪组织数量的严重缺乏(80%)、 胰岛素抗性及进程性的外周神经病。比较fid小鼠和野生型小鼠的基因组，发现fid小鼠 的Lipinl的基因组序列出现了缺失、反转和复制现象，为一种无效突变。在fid小鼠体内 既不表达Lipinl- α，也不表达Lipinl- β。不表达Lipinl的fld/fld小鼠与野生型小鼠 相比，其脂肪组织、骨骼组织仅有很少的PAP酶活力。Cao从脂肪营养不良患者和正常人群中未检测到Lipinl基因的特异变异，仅从外 显子、外显子-内含子边界检测到5个变异位点。SUViOlahtU20(^)从瘦型对照人群及 dyslipidemic Finnish家系和肥胖群体中，发现Lipinl基因内SNP及相应的等位基因单倍 型与血清胰岛素水平和体重指数的关联，显示这个基因的等位基因变异体在人类代谢性状 中有重要的作用。Eun Seok Kang在人上研究表明，Lipinl基因的遗传变异能够影响降血糖药物匹 格列酮(pioglitazone)对II型糖尿病的治疗作用，匹格列酮能够增强Lipinl基因在人脂 肪细胞中中的表达量。Lipinl基因的变异能够引起儿童横纹肌溶解症复发，并成为引起与 肌肉相关疾病诱因的携带者。Phan等发现具有Lipinl缺陷的fid小鼠采食量正常，但饲料转化率降低，同样， 在脂肪组织和骨骼肌组织过量表达Lipinl基因小鼠的采食量也正常，但小鼠的体重显著 高于Lipinl正常表达的小鼠，其中骨骼肌过量表达小鼠的体重与正常小鼠体重差异最大， 饲料转化率显著提高，尤其在高脂日粮的效应最显著，此外，骨骼肌和脂肪组织过量表达 Lipinl的小鼠脂肪含量分别极显著和显著大于正常表达小鼠，表明LIPim水平应具有调 控能量消耗的作用，LIPim缺陷阻止了日粮诱发肥胖和遗传性肥胖，并且需要上游的正常 脂肪细胞分化基因PPARy的协同作用。是否鸡的不同品种或不同个体中存在鸡Lipinl基 因表达量的差异，表达量的差异与鸡只的采食量，饲料转化率，脂肪沉积是否有关？能否依 据该基因的DNA变异或表达差异选择低脂系或高饲料转化率的鸡品系。这些都值得研究。目前的研究表明，Lipinl基因表达具有强烈的影响脂肪沉积的效应，Lipinl的不 表达、正常表达、过量表达均能引起脂肪沉积的剧烈变化，引起脂肪组织量增加，即从正常 情况的10%到3倍的增加。在极端状态下，人和鼠Lipinl的无效突变会导致脂肪营养不良 症。Lipinl对脂肪沉积的效应在转基因过量表达小鼠研究和自然人群的研究却有相反的结 论。在人和鼠的研究表明Lipinl基因能引起脂肪沉积的剧烈变化，Lipinl对脂沉积 的效应在转基因过量表达研究和自然群体的研究却得到相反的结论，有必要以其它模式动 物为对象进行该基因在自然群体中对脂肪沉积效应的进一步研究。比较基因组学的分析表 明Lipinl也是影响鸡脂肪沉积的潜在候选基因，这已经为后继的研究工作打下坚实的基 石出。Lipinl转基因过量表达增加了小鼠的肥胖程度。骨骼肌与脂肪组织过量表达 Lipinl的转基因小鼠的脂肪垫分别极显著和显著大于Lipinl正常表达小鼠。在Lipinl过 量表达的转基因小鼠研究表明，Lipinl表达水平的变异自身就已经足够引起肥胖的极端状 态。但发现Lipinl基因在脂肪组织和骨骼肌组织中是通过不同的机制完成的，脂肪细胞的 Lipinl基因影响脂肪细胞的脂肪储存能力，而骨骼肌中的Lipinl水平则是全身能量消耗和脂肪利用的决定因子。表明人类Lipinl基因不仅是脂肪沉积减少而且是脂肪沉积增加 失调的候选基因。与其它脂肪相关组织不一样的是，Lipinl基因在外周组织优势表达并发 挥作用，应是一个新的治疗肥胖和脂肪营养不良症的一个新的靶点。自然体形人群中Lipinl基因表达与肥胖有呈负相关的报道。Lipinl基因的表 达水平和肥胖的关系似乎比较复杂，尽管转基因小鼠的脂肪组织的过度表达促进了脂肪合 成基因的表达并引起肥胖，但在遗传异质的人群中，Lipinl基因表达量与脂肪沉积的关系 似乎并不是这样，这是否是因为大量的环境和遗传因子互作影响的效应还值得研究。在人 和鼠脂肪组织中，Lipinl基因的表达水平与肥胖呈现负相关关系，而以前在aP2-Lipinl 转基因小鼠研究中，研究结果是Lipinl基因的表达水平与肥胖呈现正相关关系。产生这 种差异的基础，我们不太清楚，但是在aP2-Lipinl转基因小鼠中，由于增加了 Lipinl基因 的表达，通过异源调控元件的介入引起基因表达上调，没有对正常调节Lipinl基因表达水 平所产生的分子的和生理学的信号作出反应，可能与这种情况有关。所以，在脂肪组织中 Lipinl基因是PAPl酶合成甘油三酯所必须的，在转基因小鼠脂肪组织中由于外界强制作 用使Lipinl基因表达量增强，结果就会增强甘油三酯的蓄积，然而在正常受试人群中，脂 肪细胞当达到正常成熟脂肪细胞大小的时候，脂肪细胞中Lipinl基因表达水平会被削弱。 有以下研究可以证实上述可能性如果在人脂肪组织中没有达到正常甘油三酯的贮存能力 的话，如患有脂肪营养不良的人群，那么，Lipinl基因表达水平与脂肪重呈正相关关系。Yao-Borengasser和van Harmelen观察到人脂肪组织Lipinl基因的表达水平与 脂肪沉积量呈负相关关系，肥胖者Lipinl基因的表达水平低于瘦者，而且在肥胖人群中随 着肥胖程度的增加，脂肪组织Lipinl基因表达量呈下降趋势；vanHarmelenQOOe)认为脂 肪沉积应是脂肪组织Lipinl基因表达量的一个主要调控因素。Yao-Borengasser (2006)发 现Lipinl总表达量、Lipinl-α ,Lipinl-β表达量都呈随着肥胖程度的增加显著下降的特 点，并随着胰岛素敏感性的增加而增加，脂肪组织Lipinl表达量与体型指数(BMI)、体脂比 例、肌细胞内脂质(IMCLs)呈显著负相关。但私0-80仪叫狀紹1·没有发现肌肉中Lipinl基 因表达的变化与肥胖或胰岛素抗性的相关，包括从瘦子到胖子、从正常到葡萄糖耐性受损 人群。肉鸡脂肪相关性状已被定位在多个染色体区域，Jermen和Ueobi都检测到3号染 色体上有影响脂肪重和脂肪率的一个QTL位点，Jennen进一步确证了 3号染色体的0_2cM 处MCW0116-MCW0148区间有一个影响脂肪重，脂肪率和体重的QTL位点。而该区域与人的 2P区域和鼠的12A区域为同源区间，人和鼠Lipinl基因正好位于这个区间。基因定位和比 较基因组研究表明，Lipinl基因应是鸡脂肪性状的重要候选基因。

发明内容
本发明的目的在于是克隆出鸡脂肪性状的功能候选基因Ipinl基因，并提供一种 鸡脂肪候选基因功能突变检测方法，即单核苷酸多态性(SNPs)来检测鸡脂肪性状的方法。 并根据基因型进行相关性状的标记辅助选择。本发明目的是通过以下技术方案实现的本发明采用电子克隆和RT-PCR方法克隆出鸡脂肪侯选基因LPinl的编码序列，并 用该序列进一步搜索鸡基因组得到该基因5’-UTR，设计引物检测5’-UTR的变异，分析检测5到的变异位点及其周围信息后，采用创造酶切位点PCR-RFLP法检测鸡脂肪性状侯选基因 功能突变。本发明的鸡脂肪候选基因Ipinl基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。鸡脂肪候选基因Ipinl基因，该基因的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。鸡脂肪候选基因Ipinl功能突变检测方法，采用上述鸡脂肪候选基因Ipinl基 因序列，与鸡基因组序列比对，获得鸡的5’ -非翻译区，针对存在的变异，设计引物检测 5’-UTR的变异，分析检测到的变异位点及其周围信息后，采用创造酶切位点PCR-RFLP法检 测鸡脂肪性状侯选基因功能突变。通过引入酶切位点，采用创造酶切位点PCR-RFLP法，用下述引物对鸡的总DNA进 行PCR扩增，正向引物5，-AGCTCTGATGTGCCAAACCATAATA-3，；反向引物5，-TCAGACTTTCAGATTGCAGCTCCTA-3，。采用创造酶切位点PCR-RFLP检测5，_UTR的多态，检测到5，_UTR存在一个C/T变 异，包含创造酶切位点PCR-RFLP引物的一段5，-UTR序列如SEQ ID No. 3所示，其中第290 个核苷酸是变异位点处，引物序列区域为第23-47个核苷酸，()内为引入的错配碱基。检 测到 5' -UTR 区域的一个 C/T 变异，采用 Patch 1. 0 (http //www, gene-regulation, com/ cgi-bin/pub/programs/patch/bin/patch. cgi)预测该 T — C 变异可引起一个 GR转录因子 结合位点的丢失，显示该变异有潜在重要的效应。设计一对特异引物并PCR扩增含LPinl多态位点的DNA片段，根据单碱基突变位 点的碱基替代情况设计引物，其中反向引物根据突变位点邻近序列设计，人为引入一个错 配碱基，使引物3'端和单碱基突变的一种突变型在PCR扩增后形成一个STYI酶切位点， 并应用相应内切酶进行酶切鉴定，通过PCR-RFLP技术判断LPim基因SNP位点多态性。结 果表明使用限制性内切酶STYI酶切判断LPim位点多态性，PCR和酶切效果均较好。然后 用STYI酶进行单核苷酸多态性检测出鸡脂肪候选基因Ipinl的5’-UTR是C还是T等位基 因，C等位基因可被STYI酶切产生一个268和25碱基的片段，T等位基因不能被STYI酶 切。这样，TT纯合基因型只产生一个四3的片段，CC纯合基因型将产生268和25碱基的片 段；CT杂合基因型将产生四3、268和25碱基三种片段。分析显示鸡LPim基因不同基因型对一些屠体性状有显著效应。对腹脂重、腹脂 率的效应达到显著水平中，TT基因型的腹脂重和腹脂率最大，TC基因型的腹脂重和腹脂率 显著和极显著地低于TT基因型，而TT基因型与CC基因型的差异未达到显著水平。血清中 的甘油三酯水平在三种基因型间的差异达到P < 0. 1的显著水平，也以TT基因型最高。显 示LPim基因对脂肪相关性状有重要的效应，有望用于鸡的标记辅助选择。本发明巧妙地利用创造酶切位点PCR-RFLP法检测SNPs，发现了影响鸡脂肪性状 的功能基因和特异性突变位点。目前肉鸡的高腹脂含量影响了鸡肉的品质，采用标记辅助 选择选择低腹脂含量的肉鸡是一大发展趋势。
具体实施例方式一.实验材料与方法1.实验材料
1. 1菌株和克隆载体本发明所用菌株见表
权利要求
1.一种鸡脂肪候选基因Ipinl基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如SEQID No. 1 所示。
2.根据权利要求1所述的鸡脂肪候选基因Ipinl基因，其特征在于该基因的氨基酸 序列如SEQ ID No. 2所示。
3.一种鸡脂肪候选基因功能突变检测方法，其特征在于采用权利要求1所述的鸡脂 肪候选基因Ipinl基因序列，与鸡基因组序列比对，获得鸡的5’ -非翻译区，针对存在的变 异，设计引物检测5’ -UTR的变异，分析检测到的变异位点及其周围信息后，采用创造酶切 位点PCR-RFLP法检测鸡脂肪性状侯选基因功能突变。
4.根据权利要求3所述的鸡脂肪候选基因功能突变检测方法，其特征在于通过引入 酶切位点，采用创造酶切位点PCR-RFLP法，用下述引物对鸡的总DNA进行PCR扩增，然后用 STYI酶进行单核苷酸多态性检测出鸡脂肪候选基因Ipinl的5’-UTR是C还是T是T等位 基因，正向引物5’ -AGCTCTGATGTGCCAAACCATAATA-3’ ；反向引物5’ -TCAGACTTTCAGATTGCAGCTCCTA-3，。
全文摘要
鸡脂肪候选基因lpin1基因及功能突变检测方法，属于分子生物学技术领域。本发明提供的鸡脂肪候选基因lpin1基因，的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的鸡脂肪候选基因功能突变检测方法，采用鸡脂肪候选基因lpin1基因序列，与鸡基因组序列比对，获得鸡的5’-非翻译区，针对存在的变异，设计引物检测5’-UTR的变异，检测功能性突变位点所用引物，正向5′-GATTTGATCTGCTTGGAGAC-3′；反向5′-GTCATGATAGCAAAGAGCAAG-3′。利用该引物扩增后，用限制性酶切方法进行单核苷酸多态性检测，可以检测出lpin1编码序列5’UTR的碱基是T还是C等位基因。
文档编号C12N15/54GK102051366SQ20091006637
公开日2011年5月11日 申请日期2009年11月5日 优先权日2009年11月5日
发明者孙桂荣, 康相涛, 王彦彬, 田亚东, 陈文 , 韩瑞丽, 黄艳群 申请人:河南农业大学