微生物体系催化合成手性氮杂环丁烷酰胺和羧酸类化合物的方法

专利名称：微生物体系催化合成手性氮杂环丁烷酰胺和羧酸类化合物的方法
技术领域：
本发明涉及微生物体系催化合成手性氮杂环丁烷酰胺和羧酸衍生物的方法，特别 是利用红球菌来催化水解外消旋氮杂四元环腈和外消旋氮杂四元环酰胺类化合物以得到 手性氮杂环丁烷环酰胺和羧酸类化合物的方法。腈的生物转化反应在实际应用中的意义，主要体现在腈水合酶的工业化应用上。 最著名的是1985年，日本Nitto公司(现更名为Mitsubishi Rayon公司)在世界上率先 实现微生物法丙烯酰胺的工业化生产。1998年丙烯酰胺的年产量超过4万吨，成为目前世 界上最大规模的工业化生物转化途径之一。红球菌Rhodococcusrhodochrous Jl还被瑞 士 Lonza AG公司用以工业化生产B族维生素烟酰胺和烟酸，其中烟酰胺的年产量已经超过 3000吨。但是，腈的生物催化反应与酶催化酯水解和酯键形成反应的研究相比还相对较少， 腈的生物转化反应不仅能得到羧酸，而且通过动力学拆分的方法还能得到酯水解反应得不 到的含氮有机化合物——酰胺或腈。在手性合成和手性技术备受重视的今天，以及在工业 化生产中的潜在应用价值，通过腈的立体选择性生物转化反应来得到手性的化合物的方法 就显得不可小觑。

发明内容
本发明的目的是提供一种微生物体系催化合成手性氮杂环丁烷酰胺和羧酸类化 合物的方法。本发明提供的手性氮杂环丁烷酰胺，其结构通式如式I所示，其绝对构型为S构(式 I)式I结构通式中，R、R1和R2均选自下述基团氢、溴、甲基、甲氧基氓在苯环上的 位置为邻位、间位或对位。本发明提供的羧酸类化合物，其结构通式如式II所示，其绝对构型为R构型， 式II结构通式中，R、R1和R2均选自下述基团氢、溴、甲基、甲氧基氓在苯环上 的位置为邻位、间位或对位；R'为氢或甲基。

当R'为CH3时，所述手性化合物如式III所示，
R POOCH3
(式 III)。
当R'为氢时，所述手性化合物如式IV所示，
R .COOH本发明提供了两种制备方法，方法一为用红球菌(Rhodococcus erythropolis AJ270)催化体系催化水解外消旋式V所 示N-苄基氮杂环丁腈类化合物，得到手性N-苄基氮杂环丁酰胺(如式I所示)和羧酸(如 式IV所示)，再对该手性羧酸进行酯化，得到羧酸酯类化合物。该反应方程式如下所示
红球菌R、c_R-、COOH
R^ "·^V
(式 I)(式 IV)
R POOCH3
R2 —V
(式 IV)
方法二为
用红球菌(Rhodococcus erythropolis AJ270)微生物体系催化水解式VI所示外 消旋N-苄基氮杂环丁酰胺，得到手性N-苄基氮杂环丁酰胺(如式I所示)和羧酸(如式 IV所示)，再对该手性羧酸进行酯化，得到相应的羧酸酯化合物。该反应方程式如下所示
R- .CONH2
R. XONH5
R、C00H
(式 IV)(式 III) 上述式V所示外消旋氮杂环丁烷腈类化合物是按照下述文献提供的方法进行 制备的Couty, F. ；Prim，D. Synthesis of enantiopure 2-acyl azetidines and the applicationof amino alcohols derived therefrom in enantioseletive catalysis.
5Tetrahedron =Asymmetry, 2002,13, 26190其中，当所用式V所示外消旋氮杂环丁烷腈 类化合物结构中的R基团为甲基，R2为氢时，可以从已有的底物即R基团为氢的底物 出发，运用原位生成的LDA强碱在0°C以下的低温条件下(优选-78°C )与碘甲烷作用 来大量合成，具体参照下述文献:Kieczykowski, G. R. ；Schlessinger, R. H. ；Sulsky, R. B. Regiospecificmonoalkylation of 3-butenenitrile. Tetrahedron Lett. 1975，52， 4647。式VI所示外消旋N-苄基氮杂环丁酰胺的制备可以相应的外消旋腈化合物为起始反 应物，通过常规化学水解的方法而获得(具体方法如下若选用2毫摩尔的底物腈为起始底 物，可添加2-20毫升甲醇、乙醇、正丁醇、叔丁醇、异丙醇、正丙醇和水中任意一种或几种的 混合作为溶剂(优选10毫升的叔丁醇)，再添加1毫摩尔及以上的氢氧化钾、氢氧化钠、碳 酸钾、碳酸钠、碳酸铯中任意一种作为碱或任意浓度硫酸、盐酸、硝酸、磷酸等强酸中任意一 种酸在室温至回流的温度下进行水解反应，0. 5-2小时反应结束后，利用乙酸乙酯萃取，并 用粗硅胶(100-200目)柱层析分离提纯得到所用的外消旋的酰胺)。本发明中使用的红球菌Rhodococcus erythropolis AJ270样品最初是使用 Anderson生物粒子采样器中从含有25mM的乙腈琼脂培养基上分离得到的，样品源最初则 采集于英国泰恩河畔废弃的工业厂区附近的干燥的土壤中。对AJ270菌其细胞壁的枝菌酸 和二氨基庚二酸化学分类学研究确认了其属于Rhodococcus菌种。直到2005年，通过对其 16SrRNA 基因序歹Ij 的研究，确认了 Rhodococcus AJ 270 属于 Rhodococcus erythropolis 菌系。具体参考下述文献:Blakey, A. J. Colby, J. ；Williams, Ε. ；0，Reilly, C. Regio-and stereo-specific nitrile hydrolysis by the nitrile hydratase fromRhodococcus AJ270. FEMS Microbiol. Lett. 1995,129,57. & 0’ Mahony， R. ；Doran, J. ；Coffey, L.； Cahill, 0. J. ；Black, G. W. ；0' Reilly, C. Characterisation of the nitrilehydratase gene clusters of Rhodococcus erythropolis strains AJ270 and AJ300 andMicrobacterium sp.AJ115 indicates horizontal gene transfer and reveals an insertion ofISl 166. Antonie van Leeuwenhoek 2005，87，221.)，是一种源自土壤的微生 物，并被证明是一种高活性的含腈水合酶/酰胺水解酶体系的整细胞催化剂。已有研究表 明，与其他菌株相比，红球菌Rhodococcus erythropolis AJ270具有很好的底物广谱性，可 以高效地催化脂肪腈、芳香腈和芳杂环腈类化合物的水解(Wang，Μ. -X. Enantioselective biotransformations of nitrilesin organic synthesis. Top. Catal. 2005，35，117)0本发明实施中所使用的溶剂可以为pH = 6. 0-8.0，浓度可以调节的缓冲溶液， 具体可为Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液、K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液(或常用磷酸盐缓冲溶液)、 Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲溶液、Hanks'缓冲溶液和PBS缓冲溶液等常用缓冲溶液； 所选用的温度20-37°C为使用的红球菌Rhodococcus erythropolis AJ270微生物催化体 系中酶的最适活性温度。红球菌催化体系与式V所示外消旋化合物的质量比为0. 1-10 0.01-10。红球菌催化体系中，红球菌在缓冲溶液中的质量百分比浓度为0.2-5%。上述两 方法中，所用的酯化反应可以利用多种酯化方法，常用的方法如下(1)若选用1毫摩尔的底物羧酸出发，可以添加1毫摩尔及以上的碳酸钾、碳酸钠、 氢氧化钾、氢氧化钠或碳酸铯中的任意一种作为碱，在丙酮、DMF、DMS0或THF等为溶剂的情 况下，再添加1毫摩尔及以上的碘甲烷进行甲酯化(若选用苄溴类化合物则为苄酯化)，在 常温即可进行反应。
(2)若选用1毫摩尔的底物羧酸出发，于低温反应条件(如0°C以下)，使用新制备 的重氮甲烷的乙醚溶液(由于重氮甲烷不稳定，常保存在乙醚溶液中)滴入反应体系，也可 使羧酸甲酯化得到相应产物。该重氮甲烷的乙醚溶液的摩尔浓度为0. l-lmol/L0本发明中所使用的红球菌Rhodococcus erythropolis AJ270微生物催化体系具 有发酵培养和保存方便的特点，该方法是一种非酯类化合物水解合成手性氮杂环丁烷酰胺 和羧酸衍生物的新方法。运用此生物转化得到的手性氮杂环丁酰胺和羧酸衍生物的方法， 具有操作简便，反应高效，反应条件温和，对映选择性高，产物易分离和产物纯度高的特点， 具有很好的应用前景。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。本 发明中所用红球菌催化体系均来源于英国桑德兰大学(University of Sunderland)，医学 院(School of Health Science)的 John Colby 教授实验室。实施例1 制备式Ia和IIIa结构通式所示的化合物其反应式如下 (式 Va) (式 la) (式 Ilia)取两克湿重的Rhodococcus erythropolis AJ270菌体(中国科学院化学研究 所)，30°C条件下解冻30分钟，用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的缓冲溶液(0. 1M，pH 7.0， 50ml)将菌体洗入150毫升带螺纹口的Erlenmeyer平底烧瓶中，分散摇勻后放入摇床中 30°C条件下活化30分钟，然后一次性加入Immol (172毫克)的底物腈(式Va所示)，放入 摇床中30°C，200rpm条件下进行生物转化反应。整个反应用TLC监测，反应3. 25小时后停 止反应，所得反应液通过一层硅藻土抽滤除去菌体，依次用水15毫升和乙酸乙酯15毫升各 洗涤滤渣三次。得到的滤液用乙酸乙酯50毫升萃取三次，合并萃取液，然后用无水硫酸钠 干燥过夜，浓缩后运用粗硅胶(100-200目)柱层析得到酰胺Ia，产率43%，即163毫克， Dicel-ODH手性柱测定ee值为> 99. 5%0solid ；mp 93. 0-94. O "C ； IR (KBr) ν 3379,3265,3158, 1682, 1652cm-1 ； [α ]25d-104 ° (c 0· 5，CHCl3)；力 WR(300MHz，CDCl3) δ 7· 25-7. 35(m，5H)，7· 00(s，1H)， 5. 43 (s, 1H) ,3. 72 (d, J = 12. 7Hz，1H)，3· 68 (t，J = 8. 6Hz, 1H) ,3. 57 (d, J = 12. 8Hz, 1H) ,3. 37 (m, 1H)，3. 01 (q, J = 16. 3Hz, 1H)，2. 37-2. 47 (m, 1H) ,2. 11-2. 23 (m, 1H) ；13C NMR(75MHz, CDCl3) δ 176. 2，137. 3，128. 6，128. 6，127. 4,66. 1,62. 3,50. 8,23. O ；MS (ESI)m/ z( % ) 191[M+H]+ ； Anal. Calcd. for C11H14N2O :C，69. 45 ；H, 7. 42 ；N, 14. 73. Found :C，69. 10 ； H, 7. 45 ；N, 14. 55.其中，萃取后剩余的水相液体，利用冷冻干燥(-50 to -60°C)把水分抽干，得到残 余物，再滴入重氮甲烷的乙醚溶液在-15°C的条件下进行甲酯化反应，结束后加入少量水， 然后利用乙醚或乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后，浓缩后利用100-200目的硅胶柱层析 得到纯的羧酸甲酯化合物Illa，产率:41%,BP 156毫克，Dicel-OJH手性柱测定ee值为>99. 5%。oil. IR(KBr)v 1743CHT1 ； [ α ]25D+96° (c 0. 5，CHCl3)，+118° (c 1.0 CH2Cl2), 1HNMR(300MHz, CDCl3) δ 7. 23-7. 33 (m, 5Η) , 3. 80 (d, J = 12. 6Hz, 1H) ,3. 74(t, J = 8. 4Hz, 1H) ,3. 64(s，3H)，3. 58 (d, J = 12. 6Hz, 1H) ,3. 29-3. 35 (m, 1H)，2. 91-2. 98 (m, 1H) ,2. 31-2. 43 (m, 1H) ,2. 17-2. 25 (m, 1H) ； 13C NMR(75MHz, CDCl3) δ 173. 1，137. 0，129. 0， 128. 3，127. 2,64. 3,62. 3,51. 7,50. 8,21. 6 ；MS (ESI)m/z( % )206[M+H]+ ；Anal. Calcd. for C11H15NO2 :C, 70. 22 ；H, 7. 37 ；N, 6. 82. Found :C，70. 46 ；H, 7. 58 ；N, 6. 85.若本制备过程把式Va所示底物外消旋腈的量提高到13mmol (2. 236克)，同时增 加红球菌Rhodococcus erythropolis AJ270菌体的量到湿重6克，采取分批加料的方式， 在如上同样的水解条件和后处理条件下，可以分离得到纯的手性的酰胺Ia 1. 03克(产率 42% )和羧酸酯IIa 1. 07克(产率40% )，即此实施方式可以实现手性的氮杂环丁烷酰 胺和羧酸酯类化合物的克量级制备。实施例2 制备式Ib和IIIb结构通式所示的化合物其反应式如下
产CONH2.COOH
L||jRhodococcus erythropolis AJ270|_1
、phosphate buffer pH 7.0, 30 0C、 + N、 CH2N2
.COOCH3
U、
4.7 hours
CH3
(式 Vb) (式 lb) (式 IIIb) 具体实施方法
取两克湿重的Rhodococcus erythropolis AJ270菌体，30°C条件下解冻30分钟， 用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的缓冲溶液(0. 1M，pH 7.0,50ml)将菌体洗入150毫升带螺纹 口的Erlenmeyer平底烧瓶中，分散摇勻后放入摇床中30°C条件下活化30分钟，然后一次性 加入Immol (186毫克)的底物腈(式Vb所示)，放入摇床中30°C，200rpm条件下进行生物 转化反应。整个反应用TLC监测，反应4. 7小时后停止反应，所得反应液通过一层硅藻土抽 滤除去菌体，依次用水15毫升和乙酸乙酯15毫升各洗涤滤渣三次。得到的滤液用乙酸乙酯 50毫升萃取三次，合并萃取液，然后用无水硫酸钠干燥过夜，浓缩后运用粗硅胶(100-200 目)柱层析得到酰胺Ib.得到的酰胺Ib的产率45%，Dicel-ODH手性柱测定ee值为> 99. 5%。solid ；mp 174. 0-175. O "C ；IR(KBr) ν 3407,3179,3140, 1691, 1649cm-1 ； [α ]25d-88 ° (c 0.5，CHCl3) ；1H NMR(300MHz, CDCl3) δ 7. 14 (d, J = 8·9Ηζ，2Η)，7· 12 (d, J = 8. 9Ηζ，2Η)，6. 99(s，1Η)，5. 35(s，1Η)，3. 66(d，J = 12. 7Hz，1Η)，3. 66 (t，J = 8. 4Ηζ, 1Η)，3. 53 (d, J = 12. 7Hz, 1Η)，3. 31-3. 37 (m, 1Η)，2. 99 (q, J = 16. 6Hz, 1Η)，2. 36-2. 46 (m, 1Η) , 2. 33(s,3H) ,2. 10-2. 22 (m, 1Η) ；13C NMR(75MHz, CDCl3) δ 176. 1, 137. 1，134. 2， 129. 2，128. 6,66. 0,62. 0,50. 7,23. 0,21. 1 ；MS (ESI)m/z( % )205[M+H]+ ；Anal. Calcd. forCnH13BrN20 :C，49. 09 ；H, 4. 87 ；N, 10. 41. Found :C，49. 12 ；H, 4. 90 ；N, 10. 19.其中，萃取后剩余的水相液体，利用冷冻干燥(-50 to -60°C)把水分抽干，得到残余物，再滴入重氮甲烷的乙醚溶液在_15°C的条件下进行甲酯化反应，结束后加入少量水， 然后利用乙醚或乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后，浓缩后利用100-200目的硅胶柱层析 得到纯的羧酸甲酯化合物Illb，产率39%，Dicel-OJH手性柱测定ee值为> 99. 5%。oil. IR(KBr)v 1736cm-1 ；[α ]25D+88 ° (c 0· 5，CHCl3)；力 WR(300MHz，CDCl3) δ 7. 16 (d, J = 8. 0Ηζ，2Η)，7· 11 (d, J = 7. 9Hz，2H)，3· 77 (d, J = 12. 7Hz, 1H)，3. 72 (t, J = 8. 5Hz, 1H)，3· 64(s，3H)，3· 55 (d, J = 12. 5Hz, 1H)，3· 27-3. 32 (m, 1Η)，2· 89-2. 97 (m, 1Η)， 2· 30-2. 42(m，1Η)，2· 32(s，3H)，2· 15-2. 24(m，1Η) ； 13C NMR(75MHz, CDCl3) δ 173. 1,136. 8, 133. 8，129. 1，128. 9,64. 2,61. 9,51. 7,50. 5,21. 6,21. 1 ；MS (ESI)m/z (% ) 220 [M+H]+ ；Anal. Calcd. for C13H17NO2 :C，71. 21 ；H, 7. 81 ；N, 6. 39. Found :C，71. 24 ；H, 7. 86 ；N, 6. 61.实施例3 制备式Ic和IIIc结构通式所示的化合物其反应式如下 (式Vc) (式 Ic) (式 IIIc)具体实施方法取两克湿重的Rhodococcus erythropolis AJ270菌体，30°C条件下解冻30分钟， 用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的缓冲溶液(0. 1M，pH 7.0,50ml)将菌体洗入150毫升带螺纹 口的Erlenmeyer平底烧瓶中，分散摇勻后放入摇床中30°C条件下活化30分钟，然后一次性 加入Immol (202毫克)的底物腈(式Vc所示)，放入摇床中30°C，200rpm条件下进行生物 转化反应。整个反应用TLC监测，反应3小时后停止反应，所得反应液通过一层硅藻土抽滤 除去菌体，依次用水15毫升和乙酸乙酯15毫升各洗涤滤渣三次。得到的滤液用乙酸乙酯 50毫升萃取三次，合并萃取液，然后用无水硫酸钠干燥过夜，浓缩后运用粗硅胶(100-200 目)柱层析得到酰胺Ic.得到的酰胺Ic的产率45%，Dicel-ODH手性柱测定ee值为> 99. 5%。solid ；mp 54. 0-56. 0 "C ；IR(KBr) ν 3380, 3260 (sh) , 3217, 1630, 1586cm-1 ； [α ]25d-68 ° (c 0.5，CHCl3) ；1H NMR(300MHz, CDCl3) δ 7. 17 (d, J = 8. 6Hz,2H) ,6. 96 (s, 1H)，6· 85 (d, J = 8. 6Hz，2H)，5· 60 (s, 1H)，3. 79(s，3H)，3· 64 (t, J = 8. 5Hz, 1H)，3· 63 (d, J = 12. 6Hz，1Η)，3. 51 (d，J = 12. 3Hz，1Η)，3· 29-3. 35 (m，1Η)，2· 98 (q，J = 16. 5Ηζ, 1Η)，2· 35-2. 45 (m, 1Η)，2· 09-2. 21 (m, 1Η) ； 13C NMR(75MHz, CDCl3) δ 176. 3，159. 0，129. 8， 129. 4，113. 9,66. 0,61. 6,55. 2,50. 5,23. 0 ；MS (ESI)m/z( % )221[Μ+Η]+ ；Anal. Calcd. for C12H16N2O2 :C, 65. 43 ；H, 7. 32 ；N, 12. 72. Found :C，65. 42 ；H, 7. 42 ；N, 12. 34.其中，萃取后剩余的水相液体，利用冷冻干燥(-50 to -60°C)把水分抽干，得到残 余物，再滴入重氮甲烷的乙醚溶液在-15°C的条件下进行甲酯化反应，结束后加入少量水， 然后利用乙醚或乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后，浓缩后利用100-200目的硅胶柱层析 得到纯的羧酸甲酯化合物IIc，得到的酯IIIc的产率37%，01(^1-0邛手性柱测定扰值为
Rhodococcus erythropolis AJ27 phosphate buffer pH 7.0, 30 0C91%。oil. IR(KBr)v 1742cm-1 ；[α ]25D+88 ° (c 0· 5，CHCl3)；力 WR(300MHz，CDCl3) δ 7. 20 (d, J = 8· 5Ηζ，2Η)，6· 84(d，J = 8. 6Hz，2Η)，3. 79 (s，3Η)，3. 72 (d，J = 12. 7Hz, 1H)，3· 71 (t, J = 8. 8Hz, 1H)，3· 64(s，3H)，3· 53 (d, J = 12. 5Hz, 1H)，3. 26-3. 31 (m, 1H) ,2. 88-2. 96 (m, 1H) , 2. 30-2. 42 (m, 1H) , 2. 15-2. 24 (m, 1H) ； 13C NMR(75MHz, CDCl3) δ 173. 1，158. 9，130. 3，129. 0，113. 6，64. 1，61. 6，55. 2，51. 8，50. 5，21. 6 ；MS (ESI) m/ z(% ) 236 [M+H]+ ； Anal. Calcd. for C13H17NO3 :C，66. 36 ；H, 7. 28 ；N, 5. 95. Found :C，66. 28 ；H, 7. 34 ；N, 6. 04.实施例4 制备式Id和IIId结构通式所示的化合物其反应式如下 (式Vd) (式 Id) (式 IIId)具体实施方法取两克湿重的Rhodococcus erythropolis AJ270菌体，30°C条件下解冻30分钟， 用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的缓冲溶液(0. 1M，pH 7.0,50ml)将菌体洗入150毫升带螺纹 口的Erlenmeyer平底烧瓶中，分散摇勻后放入摇床中30°C条件下活化30分钟，然后一次性 加入Immol (250毫克)的底物腈(式Vd所示)，放入摇床中30°C，200rpm条件下进行生物 转化反应。整个反应用TLC监测，反应4. 25小时后停止反应，所得反应液通过一层硅藻土抽 滤除去菌体，依次用水15毫升和乙酸乙酯15毫升各洗涤滤渣三次。得到的滤液用乙酸乙酯 50毫升萃取三次，合并萃取液，然后用无水硫酸钠干燥过夜，浓缩后运用粗硅胶(100-200 目)柱层析得到酰胺Id.得到的酰胺Id的产率43%，Dicel-ODH手性柱测定ee值为> 99. 5%。solid ；mp 147. 0-148. 0 "C ；IR(KBr) ν 3406, 3204, 3145 (sh), 1697,1650cm-1 ； [α ]25d-56 ° (c 0.5，CHCl3) ；1H NMR(300MHz, CDCl3) δ 7. 45 (d, J = 6. 7Hz,2H) ,7. 14 (d, J = 8. 3Hz，2H)，6. 98(s，1H)，5. 48(s，1H)，3. 68(d，J = 12. 7Hz，1H)，3. 67 (t，J = 8. 2Hz， 1H)，3. 52 (d, J = 12. 8Hz, 1H)，3. 31-3. 37 (m, 1H)，2. 98 (q, J = 16. 4Hz, 1H)，2. 37-2. 47 (m, 1H)，2· 14-2. 24 (m, 1H) ； 13C NMR(75MHz, CDCl3) δ 175. 9，136. 3，131. 7，130. 2，121. 3,66. 1， 61. 5,50. 8,23. 0 ；MS (ESI)m/z(% ) 269 [M+H]+，271 [M+H+2]+ ；Anal. Calcd. fOrC11H13BrN2O :C， 49. 09 ；H，4. 87 ；N, 10. 41. Found :C，49. 12 ；H，4. 90 ；N, 10. 19.其中，萃取后剩余的水相液体，利用冷冻干燥(-50 to -60°C)把水分抽干，得到残 余物，再滴入重氮甲烷的乙醚溶液在-15°C的条件下进行甲酯化反应，结束后加入少量水， 然后利用乙醚或乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后，浓缩后利用100-200目的硅胶柱层析 得到纯的羧酸甲酯化合物IIId得到的酯IId的产率43%，Dicel-OJH手性柱测定ee值为89%。
Rhodococcus erythropolis AJ270 phosphate buffer pH 7.0, 30 0C
oil. IR(KBr)v 1743cm-1 ；[α ]25D+64 ° (c 0. 5, CHC13) ；1H 匪R(300MHz，CDCl3) δ 7. 42 (d, J = 8. 3Hz,2H)，7. 17 (d, J = 8. 2Hz,2H)，3. 77 (d, J = 12. 8Hz, 1H)，3. 73 (t, J = 8. 4Hz, 1H)，3· 65(s，3H)，3· 53 (d, J = 12. 8Hz, 1Η)，3· 28-3. 34 (m, 1Η)，2· 88-2. 95 (m, 1Η)， 2. 31-2. 44 (m, 1Η)，2· 17-2. 27 (m, 1Η) ；13C NMR(75MHz, CDCl3) δ 172. 8，136. 1，131. 4，130. 7， 121. 1,64. 4,61. 6,51. 8,50. 8,21. 6 ；MS (ESI)m/z( % ) 284 [Μ+Η]+，286 [Μ+Η+2] + ；Anal. Calcd. for C12H14BrNO2 :C，50. 72 ；H, 4. 97 ；N, 4. 93. Found :C，50. 69 ；H, 4. 90 ；N, 4. 97.实施例5 制备式Ie和IIIe结构通式所示的化合物其反应式如下 (式Ve) (式 Ie) (式 IIIe)具体实施方法取两克湿重的Rhodococcus erythropolis AJ270菌体，30°C条件下解冻30分钟， 用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的缓冲溶液(0. 1M，pH 7.0,50ml)将菌体洗入150毫升带螺纹 口的Erlenmeyer平底烧瓶中，分散摇勻后放入摇床中30°C条件下活化30分钟，然后一次性 加入Immol (250毫克)的底物腈(式Ve所示)，放入摇床中30°C，200rpm条件下进行生物 转化反应。整个反应用TLC监测，反应4. 75小时后停止反应，所得反应液通过一层硅藻土抽 滤除去菌体，依次用水15毫升和乙酸乙酯15毫升各洗涤滤渣三次。得到的滤液用乙酸乙酯 50毫升萃取三次，合并萃取液，然后用无水硫酸钠干燥过夜，浓缩后运用粗硅胶(100-200 目)柱层析得到酰胺Ie.得到的酰胺Ie的产率42%，Dicel-ODH手性柱测定ee值为> 99. 5%。solid ；mp 72. 0-74. O "C ； IR (KBr) ν 3364,3292,3265, 1686, 1650cm-1 ； [α ]25d-64 ° (cO. 5，CHCl3)；力 NMR (300MHz，CDCl3) δ 7. 43 (s，1H)，7. 37-7. 42 (m，1H)， 7. 18-7. 20 (m, 2H)，7. 03 (s, 1H)，5. 58 (s, 1H)，3. 73 (d, J = 12. 9Hz, 1H)，3. 69 (t, J = 8. 6Hz, 1H)，3. 51 (d, J = 13. 1Hz, 1H)，3. 34-3. 39 (m, 1H)，2. 98 (q, J = 16. 3Hz, 1H)，2. 38-2. 48 (m, 1H)，2· 13-2. 25 (m, 1H) ； 13C NMR(75MHz, CDCl3) δ 179. 5，139. 7，131. 4，130. 5，130. 1，127. 1， 122. 6,66. 1,61. 6,50. 9,23. 0 ；MS (ESI)m/z( % ) 269 [Μ+Η]+，271 [Μ+Η+2] + ；Anal. Calcd. forCnH13BrN20 :C，49. 09 ；H, 4. 87 ；N, 10. 41. Found :C，49. 10 ；H, 4. 68 ；N, 10. 23.其中，萃取后剩余的水相液体，利用冷冻干燥(-50 to -60°C)把水分抽干，得到残 余物，再滴入重氮甲烷的乙醚溶液在-15°C的条件下进行甲酯化反应，结束后加入少量水， 然后利用乙醚或乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后，浓缩后利用100-200目的硅胶柱层析 得到纯的羧酸甲酯化合物IIIe得到的酯IIe的产率42%，Dicel-OJH手性柱测定ee值为> 99. 5%。oil. IR(KBr)v 1743cm-1 ；[α ]25D+68 ° (c 0· 5，CHCl3)；力 WR(300MHz，CDCl3) δ 7. 47 (s，1Η)，7· 36-7. 40 (m, 1Η)，7· 14-7. 23 (m，2Η)，3· 79 (d, J = 12. 8Hz, 1H)，3· 74 (t，
11 实施例6 制备式If和IIIf结构通式所示的化合物其反应式如下
^CN^CONH2.COOHPOOCH3(式Vf) (式 If) (式 IIIf)具体实施方法取两克湿重的Rhodococcus erythropolis AJ270菌体，30°C条件下解冻30分钟， 用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的缓冲溶液(0. 1M，pH 7.0,50ml)将菌体洗入150毫升带螺纹 口的Erlenmeyer平底烧瓶中，分散摇勻后放入摇床中30°C条件下活化30分钟，然后一次性 加入Immol (250毫克)的底物腈(式Vf所示)，放入摇床中30°C，200rpm条件下进行生物 转化反应。整个反应用TLC监测，反应5天后停止反应，所得反应液通过一层硅藻土抽滤除 去菌体，依次用水15毫升和乙酸乙酯15毫升各洗涤滤渣三次。得到的滤液用乙酸乙酯50 毫升萃取三次，合并萃取液，然后用无水硫酸钠干燥过夜，浓缩后运用粗硅胶(100-200目) 柱层析得到酰胺If.得到的酰胺If的产率42%，Dicel-ODH手性柱测定ee值为97%。solid ；mp 154. 0-156. O "C ；IR(KBr) ν 3416, 3256 (sh) ,3217,1696,1646cm-1 ； [α ]25d-72 ° (c 0. 5, CHCl3) ；1H NMR(300MHz，CDCl3) δ 7. 56 (d，J = 8. OHz, 1H), 7. 24-7. 32 (m, 2H)，7. 21 (s, 1H)，7. 12-7. 19 (m, 1H)，5. 30 (s, 1H)，3. 81 (d, J = 13. OHz, 1H)，
3.74 (t, J = 8. 6Hz, 1H)，3· 66 (d, J = 13. OHz, 1Η)，3· 31-3. 37 (m, 1H)，3· 05 (q, J = 15. 3Hz, 1H)，2· 39-2. 49 (m, 1H)，2· 13-2. 25 (m, 1H) ； 13C NMR(75MHz, CDCl3) δ 175. 9，136. 4，131. 4， 133. 0，130. 8，129. 2，127. 5，124. 5,65. 9,61. 9,50. 9,23. 0 ；MS(ESI)m/z( % )269[M+H].， 271 [M+H+2]+ ；Anal. Calcd. for C11H13BrN20 :C，49. 09 ；H, 4. 87 ；N, 10. 41. Found :C，48. 96 ；H,
4.86 ；N, 10. 19.其中，萃取后剩余的水相液体，利用冷冻干燥(-50 to -60°C)把水分抽干，得到残 余物，再滴入重氮甲烷的乙醚溶液在-15°C的条件下进行甲酯化反应，结束后加入少量水， 然后利用乙醚或乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后，浓缩后利用100-200目的硅胶柱层析 得到纯的羧酸甲酯化合物IIIf.得到的酯IIf的产率45%，Dicel-OJH手性柱测定ee值为> 99. 5%。oil. IR(KBr)v 1742cm-1 ；[α ]25D+98 ° (c 0· 5，CHCl3)；力 WR(300MHz，CDCl3) δ 7. 53 (d, J = 7. 9Hz, 1H)，7. 43 (d, J = 7. 6Hz, 1H)，7. 27 (t, J = 7. 4Hz, 1H)，7. 10 (t, J = 7. 6Hz, 1H)，3· 96 (d, J = 14. IHz, 1Η)，3· 88 (t, J = 8. 4Hz, 1Η)，3· 74 (d, J = 14. IHz, 1Η)，
123. 68 (s，3H)，3. 39-3. 44 (m, 1H)，2. 96-3. 04 (m, 1H)，2. 36-2. 48 (m, 1H)，2. 17-2. 29 (m, 1H) ； 13C NMR(75MHz, CDCl3) δ 173. 0，136. 8，132. 6，130. 5，128. 6，127. 3，124. 2,64. 4,61. 3,51. 8， 51. 3,21. 7 ；MS(ESI)m/z( % ) 284[M+H]+, 286 [M+H+2]+ ；Anal. Calcd. for C12H14BrNO2 :C， 50. 72 ；H, 4. 97 ；N, 4. 93. Found :C，50. 76 ；H, 5. 13 ；N, 4. 87.实施例7 制备式Ig和IIIg结构通式所示的化合物其反应式如下 (式Vg) (式 Ig) (式 IIIg)具体实施方法取两克湿重的Rhodococcus erythropolis AJ270菌体，30°C条件下解冻30分钟， 用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的缓冲溶液(0. 1M，pH 7.0,50ml)将菌体洗入150毫升带螺纹 口的Erlenmeyer平底烧瓶中，分散摇勻后放入摇床中30°C条件下活化30分钟，然后一次性 加入2mmol (372毫克)的底物腈(式Vg所示)，放入摇床中30°C，200rpm条件下进行生物 转化反应。整个反应用TLC监测，反应72小时后停止反应，所得反应液通过一层硅藻土抽滤 除去菌体，依次用水15毫升和乙酸乙酯15毫升各洗涤滤渣三次。得到的滤液用乙酸乙酯 50毫升萃取三次，合并萃取液，然后用无水硫酸钠干燥过夜，浓缩后运用粗硅胶(100-200 目)柱层析得到酰胺Ig。得到的酰胺Ig的产率47%，Dicel-ODH手性柱测定ee值为99%。oil. IR(KBr)v 3430, 3282 (sh), 3192,1682,1583cm-1 ； [ α J2511-SO ° (c 0.5， CHCl3) ；1H NMR(300MHz, CDCl3) δ 7. 21-7. 34 (m, 5H) , 6. 99 (s, 1H) , 5. 63 (s, 1H), 3. 77-3. 90 (m, 2Η)，3. 84 (d, J = 13. 8Hz, 1Η)，3. 59 (d, J = 13. 8Hz, 1Η)，2. 34-2. 42 (m, 1Η)， 2. 00-2. 08 (m, 1Η)，1. 24 (d, J = 6. 7Hz，3H) ；13C NMR(75MHz, CDCl3) δ 176. 6，138. 4，128. 6， 128. 0，127. 1,63. 8,54. 5,53. 8,30. 7，15. 6 ；MS(ESI)m/z( % )205[M+H]+ ；Anal. Calcd. forC12H16N20 :205. 13354[M+H]+ ；Found -.205. 13323[M+H]+。其中，萃取后剩余的水相液体，利用冷冻干燥(-50 to -60°C)把水分抽干，得到残 余物，再滴入重氮甲烷的乙醚溶液在-15°C的条件下进行甲酯化反应，结束后加入少量水， 然后利用乙醚或乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后，浓缩后利用100-200目的硅胶柱层析 得到纯的羧酸甲酯化合物Illg。得到的酯IIg的产率39%，Dicel-OJH手性柱测定ee值为99%。oil. IR(KBr)v 1734cm-1 ；[α ]25D+88 ° (c 0· 5，CHCl3)；力 WR(300MHz，CDCl3) δ 7. 20-7. 32(m,5H) ,4. 04 (q, J = 13. 4Hz, 1H) ,3. 88 (q, J = 6. 7Hz，1H)，3. 77 (d，J = 12. 9Hz, 1H) ,3. 70 (d, J = 12. 9Hz，1H)，3. 63 (s，3H)，2. 36-2. 44 (m，1H)，1. 93-2. 02 (m，1H)， 1. 12 (d, J = 6. 3Hz，3H) ； 13C NMR(75MHz, CDCl3) δ 173. 6，138. 4，128. 7，128. 2，126. 9,61. 5， 58. 1,54. 9,51. 4,29. 3,18. 9 ；MS(ESI)m/z( % )220[M+H]+ ；Anal. Calcd. for C13H17NO2 :C， 71. 21 ；H, 7. 81 ；N, 6. 39. Found :C，71. 29 ；H, 7. 71 ；N, 6. 55.实施例8 制备式Ih和IIIh结构通式所示的化合物
13
其反应式如下 (式Vh) (式 Ih) (式 IIIh)具体实施方法取两克湿重的Rhodococcus erythropolis AJ270菌体，30°C条件下解冻30分钟， 用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的缓冲溶液(0. 1M，pH 7.0,50ml)将菌体洗入150毫升带螺纹 口的Erlenmeyer平底烧瓶中，分散摇勻后放入摇床中30°C条件下活化30分钟，然后一次性 加入2mmol (372毫克)的底物腈(式Vh所示)，放入摇床中30°C，200rpm条件下进行生物 转化反应。整个反应用TLC监测，反应31小时后停止反应，所得反应液通过一层硅藻土抽滤 除去菌体，依次用水15毫升和乙酸乙酯15毫升各洗涤滤渣三次。得到的滤液用乙酸乙酯 50毫升萃取三次，合并萃取液，然后用无水硫酸钠干燥过夜，浓缩后运用粗硅胶(100-200 目)柱层析得到酰胺Ih。在此反应进行31小时之后，依然有少量底物腈剩余，进行柱层析分离得到产率 16%，其结构数据表征如下oil. IR(KBr)v 2222cm-1 ；1H NMR(300MHz，CDCl3) δ 7· 26—7. 37 (m，5H)，3· 77 (d，J = 12. 9Hz, 1H)，3. 65 (d, J = 12. 9Hz, 1H)，3. 27-3. 33 (m, 1H)，2. 35-2. 41 (m, 1H)，2. 19-2. 28 (m, 1H)，1. 38(s，3H) ；13C NMR(75MHz, CDCl3) δ 136. 9，129. 0，128. 3，127. 4，120. 1,61. 8,57. 7， 50. 2,30. 8,25. 5 ；MS (ESI)m/z(% ) 187 [M+H]+.得到的酰胺Ih的产率44%，Dicel-OD手性柱测定ee值为80%。Solid ；mp 71.0-72.0 "C ；IR(KBr) ν 3389，3235 (sh)，3141，1686，1567 (cm—1) cm—1 ； [α ]25d-80 ° (c 0· 5，CHCl3)；屯 WR(300MHz，CDCl3) δ 7. 62(s，1H)，7· 26-7. 35(m，5H)， 5. 79 (s，1H)，3. 73 (d, J = 13. IHz, 1H)，3. 48 (d, J = 13. 1Hz, 1H)，3. 29-3. 35 (m, 1H)，3. 06 (q, J = 8. 6Hz, 1H)，2· 36 (q, J = 8. 7Hz, 1H)，. 1. 91-1. 99 (m, 1H)，1. 57(s，3H) ；13C NMR(75MHz, CDCl3) δ 179. 0，137. 9，128. 5，128. 4，127. 2,67. 6,55. 3,49. 0,30. 5，14. 6 ；MS (ESI)m/ z( % ) 205 [M+H]+ ； Anal. Calcd. for C12H16N2O :C，70. 56 ；H, 7. 90 ；N, 13. 71. Found :C，70. 30 ； H, 7. 82 ；N, 13. 51.其中，萃取后剩余的水相液体，利用冷冻干燥(-50 to -60°C)把水分抽干，得到残 余物，再滴入重氮甲烷的乙醚溶液在-15°C的条件下进行甲酯化反应，结束后加入少量水， 然后利用乙醚或乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后，浓缩后利用100-200目的硅胶柱层析 得到纯的羧酸甲酯化合物Illh。得到的酯IIh的产率:30%，Dicel-OJH手性柱测定ee值为91%.oil. IR(KBr)v 1732cm-1 ；[α ]25D+36 ° (c 0· 5，CHCl3)；力 WR(300MHz，CDCl3) δ 7. 20-7. 30(m，5H)，3. 74(d，J = 14. 0Hz，1H)，3. 73 (s，3H)，3. 57 (d，J = 14. OHz, 1H), 3. 21-3. 28 (m, 1H)，3. 10 (q, J = 6. 8Hz, 1H)，2. 54-2. 62 (m, 1H)，1. 89-1. 96 (m, 1H)，1. 48 (s, 3H) ；13C NMR(75MHz, CDCl3) δ 175. 2，138. 3，128. 7，128. 2，126. 9,67. 8,55. 7,51. 7,49. 2， 28. 6，18. 8 ;MS(ESI)m/z( % ) 220 [M+H]+ ；Anal. Calcd. for C13H17NO2 :C,71. 21 ；H, 7. 81 ；N,6. 39. Found :C，71. 07 ；H, 7. 69 ；N, 6. 39.实施例9 制备式Ia和IIIa结构通式所示的化合物其反应式如下 (式 Via) (式 Ia) (式 Ilia)具体实施方法是取两克湿重的Rhodococcus erythropolis AJ270菌体，30°C条件下解冻30分钟， 用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的缓冲溶液(0. 1M，pH 7.0,50ml)将菌体洗入150毫升带螺纹 口的Erlenmeyer平底烧瓶中，分散摇勻后放入摇床中30°C条件下活化30分钟，然后一次性 加入提前用3毫升丙酮溶解的Immol (190毫克)的外消旋底物酰胺的丙酮溶液，放入摇床 中30°C，200rpm条件下进行生物转化反应。整个反应用TLC监测，反应3. 7小时后停止反 应，所得反应液通过一层硅藻土抽滤出去菌体，依次用水15毫升和乙酸乙酯15毫升各洗涤 滤渣三次。得到的滤液用乙酸乙酯50毫升萃取三次，合并萃取液，然后用无水硫酸钠干燥 过夜，浓缩后运用粗硅胶(100-200目)柱层析得到酰胺Ia，产率49% Dicel-ODH手性柱 测定ee值为>99.5%。
化合物结构分析鉴定数据同上。
羧酸甲酯化合物IIIa的制备方法以及后处理方法同上。 实施例10 制备式Ie和IIIe结构通式所示的化合物 其反应式如下 具体实施方法取两克湿重的Rhodococcus erythropolis AJ270菌体，30°C条件下解冻30分钟， 用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的缓冲溶液(0. 1M，pH 7.0,50ml)将菌体洗入150毫升带螺纹 口的Erlenmeyer平底烧瓶中，分散摇勻后放入摇床中30°C条件下活化30分钟，然后一次性 加入提前用3毫升丙酮溶解的Immol (268毫克)的外消旋底物酰胺的丙酮溶液，放入摇床 中30°C，200rpm条件下进行生物转化反应。整个反应用TLC监测，反应6. 3小时后停止反 应，所得反应液通过一层硅藻土抽滤出去菌体，依次用水15毫升和乙酸乙酯15毫升各洗涤 滤渣三次。得到的滤液用乙酸乙酯50毫升萃取三次，合并萃取液，然后用无水硫酸钠干燥 过夜，浓缩后运用粗硅胶(100-200目)柱层析得到酰胺Ie.化合物结构分析鉴定数据同上。实施例11 制备式If和IIIf结构通式所示的化合物
15
其反应式如下 (式Vic) (式 If) (式 IIIf)具体实施方法取两克湿重的Rhodococcus erythropolis AJ270菌体，30°C条件下解冻30分钟， 用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的缓冲溶液(0. 1M，pH 7.0,50ml)将菌体洗入150毫升带螺纹 口的Erlenmeyer平底烧瓶中，分散摇勻后放入摇床中30°C条件下活化30分钟，然后一次性 加入提前用3毫升丙酮溶解的Immol (268毫克)的外消旋底物酰胺的丙酮溶液，放入摇床 中30°C，200rpm条件下进行生物转化反应。整个反应用TLC监测，反应5天后停止反应，所 得反应液通过一层硅藻土抽滤出去菌体，依次用水15毫升和乙酸乙酯15毫升各洗涤滤渣 三次。得到的滤液用乙酸乙酯50毫升萃取三次，合并萃取液，然后用无水硫酸钠干燥过夜， 浓缩后运用粗硅胶(100-200目)柱层析得到酰胺If.
化合物结构分析鉴定数据同上。
实施例12 制备式Ig和IIIg结构通式所示的化合物
其反应式如下
(式 Ig) (式 IIIg) 具体实施方法
取两克湿重的Rhodococcus erythropolis AJ270菌体，30°C条件下解冻30分钟， 用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的缓冲溶液(0. 1M，pH 7.0,50ml)将菌体洗入150毫升带螺纹 口的Erlenmeyer平底烧瓶中，分散摇勻后放入摇床中30°C条件下活化30分钟，然后一次 性加入提前用3毫升丙酮溶解的2mmol (408毫克)的外消旋底物酰胺的丙酮溶液，放入摇 床中30°C，200rpm条件下进行生物转化反应。整个反应用TLC监测，反应70小时后停止反 应，所得反应液通过一层硅藻土抽滤出去菌体，依次用水15毫升和乙酸乙酯15毫升各洗涤 滤渣三次。得到的滤液用乙酸乙酯50毫升萃取三次，合并萃取液，然后用无水硫酸钠干燥 过夜，浓缩后运用粗硅胶(100-200目)柱层析得到酰胺Ig.化合物结构分析鉴定数据同上。实施例13 制备式Ih和IIIh结构通式所示的化合物其反应式如下 (式Vie) (式 Ih) (式 IIIh)具体实施方法取两克湿重的Rhodococcus erythropolis AJ270菌体，30°C条件下解冻30分钟， 用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的缓冲溶液(0. 1M，pH 7.0,50ml)将菌体洗入150毫升带螺纹 口的Erlenmeyer平底烧瓶中，分散摇勻后放入摇床中30°C条件下活化30分钟，然后一次 性加入提前用3毫升丙酮溶解的2mmol (408毫克)的外消旋底物酰胺的丙酮溶液，放入摇 床中30°C，200rpm条件下进行生物转化反应。整个反应用TLC监测，反应24小时后停止反 应，所得反应液通过一层硅藻土抽滤出去菌体，依次用水15毫升和乙酸乙酯15毫升各洗涤 滤渣三次。得到的滤液用乙酸乙酯50毫升萃取三次，合并萃取液，然后用无水硫酸钠干燥 过夜，浓缩后运用粗硅胶(100-200目)柱层析得到酰胺Ih.化合物结构分析鉴定数据同上。
1权利要求
式I所示手性化合物，(式I)式I结构通式中，R、R1和R2均选自下述基团氢、溴、甲基、甲氧基；R1在苯环上的位置为邻位、间位或对位。F2009100850908C0000011.tif
2.式II所示手性化合物， (式 II)式II结构通式中，R、R1和R2均选自下述基团氢、溴、甲基、甲氧基；Rl在苯环上的位 置为邻位、间位或对位；R'为氢或甲基。
3.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于所述式II结构通式中，R'为CH3时， 所述手性化合物如式III所示，(式 III)。
4.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于所述式II结构通式中，R'为氢时，所 述手性化合物如式IV所示，(式 IV)。
5. 一种制备权利要求1和权利要求4所述化合物的方法，是用红球菌 (Rhodococcuserythropolis AJ270)催化体系催化水解式V所示外消旋化合物，得到权利 要求1所述手性化合物和权利要求4所述手性化合物；(式V) 式V结构通式中，KR1和R2均选自下述基团氢、溴、甲基、甲氧基氓在苯环上的位置 为邻位、间位或对位。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述红球菌催化体系由红球菌和pH值为 6. 0-8. O的缓冲溶液组成。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述缓冲溶液为Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶 液、K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液、Tris缓冲溶液、Hanks'缓冲溶液或PBS缓冲溶液
8.根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于所述红球菌催化体系与式V所示外消旋化合物的质量比为0.1-10 0.01-10;所述红球菌催化体系中，红球菌在所述缓冲 溶液中的质量百分比浓度为0. 2-5%。
9.根据权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于所述催化水解的温度为20-37°C， 催化水解时间为3-120小时。
10.一种制备权利要求3所述化合物的方法，是将权利要求4所述式IV手性化合物与 碘甲烷或重氮甲烷进行酯化反应，得到权利要求3所述化合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述式IV手性化合物与碘甲烷或重氮 甲烷的摩尔比为小于等于1 1。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于所述反应温度为-15-30°C，反应 时间为1-12小时。
13.根据权利要求10-12任一所述的方法，其特征在于所述式IV手性化合物与碘甲 烷进行酯化反应时，还加入碱；所述碱为碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、氢氧化钠或氢氧化钾，反 应介质选自N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮和四氢呋喃中的至少一种；其中，所述式IV手性化合物与所述碱的摩尔比小于等于1 1;所述式IV手性化合物 在所述反应介质中的摩尔浓度为0. l-2mol/L ；所述式IV手性化合物与重氮甲烷进行酯化反应的步骤，是将重氮甲烷的乙醚溶液加 入到反应体系中；所述重氮甲烷的乙醚溶液的摩尔浓度为0. 1-lmol/L。
14.一种制备权利要求1和权利要求4所述手性化合物的方法，是用红球菌 (Rhodococcus erythropolis AJ270)催化体系催化水解式VI所示外消旋化合物，得到权利 要求1和权利要求4所述手性化合物；式VI结构通式中，R、R1和R2均选自下述基团氢、溴、甲基、甲氧基氓在苯环上的位 置为邻位、间位或对位。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于所述红球菌催化体系由红球菌和pH值 为6. 0-8. 0的缓冲溶液组成。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述缓冲溶液为Na2HPO4-柠檬酸缓冲 溶液、K2HP04-KH2P04缓冲溶液、Tris缓冲溶液、Hanks'缓冲溶液或PBS缓冲溶液。
17.根据权利要求14-16任一所述的方法，其特征在于所述红球菌催化体系与式VI 所示外消旋化合物的质量比为0.1-10 0.01-10;所述红球菌催化体系中，红球菌在所述 缓冲溶液中的质量百分比浓度为0. 2-5%。
18.根据权利要求14-17任一所述的方法，其特征在于所述催化水解的温度为 20-37°C，催化水解时间为3-120小时。(式 VI) 全文摘要
本发明公开了一种微生物体系催化合成手性氮杂环丁烷酰胺和羧酸类化合物的方法。所述手性化合物的绝对构型分别为S和R构型。其结构通式如式I和II所示。本发明提供的制备该类化合物的方法，是在红球菌Rhodococcus erythropolis AJ270微生物体系催化水解外消旋N-苄基氮杂环丁腈或酰胺类化合物得到目标产物。所用红球菌菌体用量可根据底物的用量来进行调节。反应溶剂为pH＝6.0-8.0的常用缓冲溶液，温度为20-37℃，反应时间为3-120小时。该红球菌微生物催化体系具有发酵培养和保存方便的特点，而运用此生物转化得到的手性氮杂环丁酰胺和羧酸衍生物的方法，具有操作简便，反应高效，反应条件温和，对映选择性高，产物易分离，产物纯度高的特点，具有很好的应用前景。
文档编号C12R1/01GK101898990SQ200910085090
公开日2010年12月1日 申请日期2009年6月1日 优先权日2009年6月1日
发明者冷冬辉, 王德先, 王梅祥 申请人:中国科学院化学研究所