专利名称：：一种黄色柠檬酸菌及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及微生物菌种及其应用领域，具体的说，本发明涉及一种黄色柠檬酸菌及其应用的
技术领域：
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背景技术：
：放线菌类群是十分重要的高G+C含量的革兰阳性细菌，它们的培养形态与细菌有本质区别，大多数产生菌丝结构，包括培养基中的基质菌丝和培养基表面的气生菌丝及孢子丝。迄今已发表145个属，约2000个种。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。一些种类的放线菌还能产生蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等各种酶制剂、维生素(B12)和有机酸。弗兰克菌属(Fra/7l/a)为非豆科木本植物根瘤中有固氮能力的内共生菌。此外，放线菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。少数放线菌也会对人类构成危害，引起人和动植物病害。因此，放线菌与人类关系密切，在医药工业上有重要意义。放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。土壤特有的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。柠檬酸菌属于2002年由PetraAltenburger等人建立，其分类地位为细菌域、放线菌门、放线菌纲、微球菌科，柠檬酸菌属(C/"/cocc^)。至今该属总共有2个有效种，C/"/c0ccw51/z/waZ/s和Ci7"'coccwi1a/i^/27o/e^ns/i1。柠檬酸菌属的主要特征是革兰氏阳性，非游动，氧化酶阴性，过氧化氬酶阳性，无孢子形成。主要脂肪酸是anteiso-C15:0,anteiso-Ci7:0,iso-Ci5:0,iso-C16:0，但未见有关应用的报道。
发明内容针对国内外有关黄色柠檬酸菌领域的研究现状，本发明提供一种黄色柠檬酸菌及其应用。所述的黄色柠檬酸菌，明胶液化阳性，能够水解淀粉，但不能水解七叶戒、Tweens20,40，80,硝酸盐还原阳性，这些特性明显区别于已/>开报道的其他檬酸菌有效种。本发明具体提供一种黄色柠檬酸菌(CVWcoccw/"vw)。本发明通过从新疆甘家湖梭梭自然保护区土样中取样，分离筛选得到多抹菌，经过多级筛选，确定一株黄色梓檬酸菌(a>/coccw/m^XJEEM90729T),命名为黄色柠檬酸菌。该菌林已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期是2009年3月30日，保藏号是CGMCC.No2998。经微生物学鉴定为黄色种檬酸菌(CVn'cocc^ym;w)。该菌呈革兰氏阳性，球菌，直径O.6jum，好氧，非游动。菌落黄色，不透明，圓形突起。NaCl生长耐受范围0-25%(w/v),最适生长NaCl浓度、pH和温度分别为0-5%、6.0-8.0和37°C。氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性。曱基红和VP测试都是阴性。明胶液化阳性，能够水解淀粉。但不能水解七叶戒、Tweens20,40,80。硝酸盐还原阳性。碱性磷酸酶、酯酶(C4)、类脂酶(C8)、白氨酸芳胺酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、oc-糖趁酸甙酶、p-葡萄糖甙酶表现阳性，缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶。但类脂酶(C14)、oc-半乳糖甙酶、P-半乳糖戒酶、(3-糖醛酸甙酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、ot-甘露糖甙酶、p-岩藻糖甙酶为阴性。能够利用以下底物产酸阿东糖醇，葡萄糖，松三糖，木糖苦，水杨酸，淀粉和木糖。能够利用以下碳源，氮源作为唯一能源果糖，葡萄糖，麦芽糖、甘油，甘露醇、甘露糖、棉籽糖、蔗糖、淀粉、乙酸钠，海藻糖和柠檬酸三钠。但是不能利用腺嘌呤，阿拉伯糖、精氨酸、天冬氨酸，纤维二糖、甜醇、半乳糖、甘氨酸、组氨酸、黄嘌呤，肌醇，乳糖、赖氨酸、脯氨酸，核糖、鼠李糖，丝氨酸、山梨醇、苏氨酸、酪氨酸和木糖醇。曱基萘醌为MK-8(H2)(65.8%),MK-9(H2)(17.2%)andMK-7(H2)(16.8%)。主要脂肪酸含anteiso-C15:0(44.2%),iso-C15:o(17.4%)，anteiso-C17:。(16.4%),iso-C16:Q(4.1%),C16:。(3.5%),iso-C17:0(4.8%),C18:0(2.1%).DNA基因的G+C含量是69.3mol%。对该菌种黄色杵檬酸菌(C7/n'cocc^yZavM)CGMCC.No2998的形态观察、培养特征、生理生化特性和细胞化学分析按《常见细菌系统鉴定手册》东秀珠，蔡妙英所述的方法进行。酶学特性按APIZYM(BioM6rieux)试剂条根据手工操作说明进行。产酸实验按API50CH(BioM6rieux)试剂条根据手工操作说明进行。菌抹曱基萘醌组分测定用高压液相(HPLC)来分析醌型。脂肪酸组分分析釆用美国MIDI司Sherolock全自动细菌鉴定系统MIDI(MicrobialIdentificationSystem)分析。G+Cmol%测定采用高压液相(HPLC)测定。DNA同源性采用液相复性速率法(DeLeyWa/.，1970;HuPWa/.,1983;Jahnke,1992),参考菌抹6V"/coc譜加固7/sDSM144427和""/coc譜a/h/y^^era/^YIM70010T分别由德国微生物和细胞培养物保藏中心(GermanCollectionofMicroorganismsandCellCulture,DSMZ)和云南孩i生物研究所放线菌研究室获得，用于DNA-DNA同源性杂交分析。本发明通过总DNA的提取、16SrRNA基因的PCR扩增和测序按李文均等使用的方法进行(Lie/a7.,2007)。根据测序结果，用Blast搜索软件从GenBank、EMBL等数据库中调出相似性较高的相关放线菌菌抹的16SrRNA基因序列，用CLUSTALX软件进行多序列比对，并采用Saitou和Nei的邻接法(NeighborJoining)用MEGA4软件进行系统进化树的构建和同源性比较。经测定，黄色柠檬酸菌(C餘occ—纖s)CGMCC.No2998的16srRNA基因序列为1636bp，具体为GTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGT从16srRNA基因构建的系统发育进化树上可明显的看到黄色柠檬酸菌(C/Wcoca^y7"my)CGMCC.No2998与柠檬酸菌属的2个有效种聚为一支，并形成独立的分支。与典型种。'/"'CO"ZAS"孤,s7/s和。'"/COCC〃i1Wh/"o/ers/w的相似性分别为97.5%，97.7%，MA-DNA杂交值分别为37.6%和45.5%,都远远低于70°/。这个定义新种的杂交值(WayneW.，1987)。基于菌XJEEM90729T的表型，生理生化，基因型比较分析表明菌黄色柠檬酸菌(CzYn'coccwsy/avws)CGMCC.No2998是细菌域、放线菌门、放线菌纲、微球菌科、杵檬酸菌属(""/COCCM)的一个新菌种。基于该菌种呈革兰氏阳性，非游动，氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性，无孢子形成。NaCl生长耐受范围0-25%(w/v),最适生长NaCl浓度、pH和温度分别为0-5%、6.0-8.G和37。C。氧化酶阴性，过氧化氬酶阳性。甲基红和VP测试都是阴性。明胶液化阳性，能够水解淀粉。但不能水解七叶戒、Tweens—20，40，80。硝酸盐还原阳性。本发明提供的黄色柠檬酸菌(C/的'coccws/7avws)CGMCC.No29986广泛应用于淀粉酶工业生产领域。本发明进一步将菌抹黄色柠檬酸菌(C加/cocci^/7av"s)CGMCC.No2998接种于淀粉琼脂平板上，于37。C中培养8-9小时。取出发酵液冷却至室温，用真空循环泵抽滤以除去石充颗粒，然后11000rpm/min,20min离心取上清液得到粗酶液。粗酶液中緩慢添加硫酸铵粉末至70%饱和度，边加边搅拌，添加完毕后继续搅拌15min，然后将其置于4。C培养箱中静置12小时；再11000r/min20min离心收集沉淀，加入少量pH为6.0-8.0的50mMTris-HCi緩冲液溶解。将盐析液置于透析袋中，置于4匸中，用pH7.5的50raMTris-HCl緩沖液透析24h(约换緩冲液4次)，再经过DEAE-sepharoseFlatFlow、羟基磷灰石、丁基疏水及S印hacrylS-200方法得到淀粉酶。通过实施本发明具体的技术指标，实现本
发明内容，可以达到以下有益效果。通过试验表明，本发明的黄色柠檬酸菌(a^coccw^m;附)CGMCC.No2998有效地用于淀粉酶生产领域。图1所示为黄色柠檬酸菌(C7fn'coccu^avi^)CGMCC.No2998基于16SrRNA基因序列构建的系统发育树。下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。具体实施例方式实施例一黄色柠檬酸菌(C7加'cocc附/7"vws)CGMCC.No2998的筛选、分离、纯化1.分离本发明所述的黄色柠檬酸菌分离自新疆甘家湖梭梭自然保护区，用P5培养基lg天门冬氨酸，10g甘油，5g酵母浸膏，5gKN03，50gNaCland15g琼脂粉，采用平板稀释涂布法，分离到一林放线细菌XJEEM90729T。分离步骤为取盐湖土样2g、放入20ml已灭菌的含10%NaCl溶液，37。C振荡(100r.p.m)30分钟，取0.2ml10_2溶液、修改的P5培养基，37。C培养3周，挑单菌落于P5培养基培养、纯化2次，确认为纯菌株后，用于科研和保藏。菌种釆用冻干物安瓿管保藏、甘油管保藏和液氮保藏等保藏方式。2.培养条件培养基P5培养基(lg天门冬氨酸，10g甘油，5g酵母浸膏，5gKN03,50gNaCland15g琼脂粉)。NaCl生长耐受范围0-25%,最适生长NaCl为0-5°/。。最适生长pH:6.G-8.0。最适生长温度37°C。好氧。3.繁殖用接种针取少量菌体于P5琼脂培养基，37。C培养3天后，产生黄色菌落，菌落光滑，突起，边缘整齐。4.菌种描述本发明所述的黄色柠檬酸菌(C妙/cocc^/7avws)呈革兰氏阳性，球菌，直径0.6jam,好氧，非游动。菌落黄色，不透明，圆形突起。NaCl生长耐受范围0-25%(w/v),最适生长NaCl浓度、pH和温度分别为0-5%、6.0-8.0和37。C。氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性。甲基红和VP测试都是阴性。明胶液化阳性，能够水解淀;盼。但不能水解七叶戒、Tweens20，40,80。硝'酸盐还原阳性。^t性磷酸酶、酯酶(C4)、类脂酯酶(C8)、白氨酸芳胺酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、a-糖醛酸戒酶、p-葡萄糖戒酶表现阳性，缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶。但类脂酶(C14)、a-半乳糖戒酶、p-半乳糖甙酶、p-糖醛酸戒酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、a-甘露糖戒酶、|3-岩藻糖甙酶为阴性。能以下底物产酸阿东糖醇，葡萄糖，松三糖，木糖香，水杨酸，淀粉和木糖。能够利用以下碳源，氮源作为唯一能源果糖，葡萄糖，麦芽糖、甘油，甘露醇、甘露糖、棉籽糖、蔗糖、淀粉、乙酸钠，海藻糖和柠檬酸三钠。但是不能利用腺嘌呤，阿拉伯糖、精氨酸、天冬氨酸，纤维二糖、甜醇、半乳糖、甘氨酸、组氨酸、黄噤呤，肌醇，乳糖、赖氨酸、脯氨酸，核糖、鼠李糖，丝氨酸、山梨醇、苏氨酸、酪氨酸和木糖醇。曱基萘醌为MK-8(H2)(65.8%),MK-9(H2)(17.2%)andMK-7(H2)(16.8%)。主要脂肪酸含anteiso-C15:o(44.2%)，iso-C15:o(17.4%),anteiso_C17:o(16.4%),iso-C16:0(4,1%),C16:。(3.5%),iso-C17:0(4.8%),C1S:0(2.1%).DNA基因的G+C含量是69.3mol%。实施例二黄色柠檬酸菌(C/加'cocc"s/^v"s)CGMCC.No2998的鉴定1.表型特征和化学分类特征形态观察、生理生化特性按《常见细菌系统鉴定手册》东秀珠，蔡妙英所述的方法进行。酶学特性按APIZYM(BioM6rieux)试剂条根据手工操作说明进行。产酸实验按API50CH(BioM&ieux)试剂条根据手工操作说明进行。菌抹醌组分测定用高压液相(HPLC)来分析醌型。脂肪酸组分分析采用美国MIDI公司Sherolock全自动细菌鉴定系统MIDI/cfe/〃/7ca〃朋i"/Weyw)分析。G+Cmol。/。测定采用高压液相(HPLC)测定。DM同源性采用液相复性速率法(DeLeyWs/.,1970;Hup"a/.,1983;Jahnke，1992,参考菌抹C/"/c(9CCiAS"M/rs/isDSM14442T和6V,Wcoccwa7h/77o/e"/75"YIM70010T分别由德国微生物和细胞培养物保藏中心(GermanCollectionofMicroorganismsandCeliCulture,DSMZ)和云南孩i生物研究所;故线菌研究室获得，用于DNA-DNA同源性杂交分析。参见表l表1:黄色柠檬酸菌(CV的'coccws_/7m^)CGMCC.No2998与标准菌株C/"/coccws卿ra//51和C/"/cocc〃sa/ira/27o/era/751生理特征差异。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2.16SrRNA基因序列测定和系统发育分析总DNA的提取、16SrRNA基因的PCR扩增和测序按李文均等使用的方法进行(Li，2007)。根据测序结果，用Blast搜索软件从GenBank、EMBL等数据库中调出相似性较高的相关放线菌菌抹的16SrRNA基因序列，用CLUSTALX软件进行多序列比对，并采用Saitou和Nei的邻接法(NeighborJoining)用MEGA4软件进行系统进化树的构建和同源性比较。3.鉴定为新种的理由柠檬酸菌属于2002年由PetraAltenburger等人建立，到目前为止，该属总共有2个有《文种,。7r/cocci/51肌/ra/i"5"和C/fr/coccwsa/i^/Z/o/era^^柠檬酸菌属的主要特征是革兰氏染色阳性，非游动，球菌，无孢子形成，氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性，尿酶，H2S,巧l哚生成和VP测试阴性，主要脂肪酸是anteiso-C15:o，anteiso-Cn:0,iso-Ci5:0，iso-Ci6:。。本发明菌XJEEM90729T符合这些主要特征。黄色柠檬酸菌(0/coccwy7mw)CGMCC.No2998的菌落黄色，硝酸盐还原阳性，能够水解淀粉，这些特性明显区别于其他2个有效种。同时碳源利用也有很大不同，具体结果总结在表l中。菌XJEEM90729T的的优势醌是MK-8(H2),而典型种和。-"2'c0ccz^<2/^///^^^/^是^1](-9(H2)。从附图l所示的16srRNA基因构建的系统发育进化树可明显的看到菌XJEEM90729T与柠檬酸菌属的2个有效种聚为一支，并形成独立的分支。与典型种C/"/coccw5"蕭ra//51和C/Wc0cc〃sa/h/^/e/^的相似性分别为97.5%,97.7%,DNA-DNA杂交值分别为37.6%和45.5%,都远远低于70°/。这个定义新种的杂交值(Waynea/.,1987)。基于菌XJEEM90729T的表型，生理生化，基因型比较分析表明菌XJEEM90729T是柠檬酸菌的一个新菌种。实施例三黄色柠檬酸菌(C,7/7'a>cc"s_/3^v"s)CGMCC.No2998的应用黄色柠檬酸菌(C/化/cocc^_/7m^)CGMCC.No2998的NaCl生长耐受范围0-25°/。(w/v),最适生长NaCl浓度、pH和温度分别为0-5%、6.0-8.0和37°C。氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性。曱基红和VP测试都是阴性。明胶液化阳性，能够水解淀粉。但不能水解七叶戒、Tweens20,40,80。硝酸盐还原阳性等特性，本发明提供的黄色柠檬酸菌(C/^o^cw/7flv^)CGMCC.No2998广泛应用于淀粉酶工业生产领域。将菌抹分别接种于淀粉琼脂平板上，待菌生长良好时，在菌落周围滴加碘液，菌落周围形成白色透明圈为阳性。菌XJEEM90729T产生白色透明圈表明有水解淀粉的能力。淀粉水解培养基可溶性淀粉10g,K2HP040.3g，MgC031.0g,琼脂20g,蒸馏水1000ml，pH自然。碘液的制备碘片lg,碘化钾2g，蒸馏水300ml。实施例四黄色柠檬酸菌(。'/r/cocc〃;y/7ara<s)CGMCC.No2998的应用1、利用上述实施例所述的黄色柠檬酸菌(C"r/coccM/7aP7A)CGMCC.No2998生产制备淀粉酶的步骤如下(1)将菌抹接种于pH为6.0-8.0的淀粉琼脂平板上，于37。C中培养8-9小时；取出发酵液冷却至室温，用真空循环泵抽滤除去^L颗粒，然后11000rpm/min,20min离心取上清液才寻到斗且酶液；(2)粗酶液中添加硫酸铵粉末至70%饱和度，边加边搅拌，添加完毕后继续搅拌15min，然后将其置于4'C培养箱中静置12小时；再11000r/min，20min离心收集沉淀，加入适量pH为7.5的50mMTris-HCl緩冲液溶解，将盐析液置于透析袋中，置于4。C中，用pH为7.5的50mMTris-HCl緩冲液透析24小时再经过DEAE-sepharoseFlatFlow、羟基石岸灰石、丁基發u水及SephacrylS-200方法得到淀粉酶。2、淀粉酶酶活测定方法用50mM/L,pH5的乙酸钠溶液配制的1%的可溶性淀粉190ul加入10ul酶液，88。C反应30min，加入200ulDNS100。C煮沸5min,终止反应，显色，520mn进行比色，空白由190ul淀粉加入10ul乙酸钠溶液。3、酶活力单位定义在一定条件下，每分钟催化产lug葡萄糖的酶量为一个活力单位。权利要求1、一种黄色柠檬酸菌(Citricoccusflavus)CGMCC.No2998。2、如权利要求1所述的黄色柠檬酸菌(C^n'coccw刀av^)CGMCC.No2998,其特征在于，所述菌适合生长NaCl浓度、pH和温度分别为0-5%、6.0-8.O和37°C;氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性；曱基红和VP测试都是阴性；明胶液化阳性，能够水解淀粉，但不能水解七叶戒、Tweens20，40,80;硝酸盐还原阳性；其DNA基因的G+C含量是69.3mol%。全文摘要本发明公开了一种黄色柠檬酸菌(Citricoccusflavus)CGMCC.No2998。通过从新疆甘家湖梭梭自然保护区土样中取样，分离、筛选、生理生化鉴定，确定该菌种NaCl生长耐受范围0-25％(w/v)，最适生长NaCl浓度、pH和温度分别为0-5％、6.0-8.0和37℃。氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性，甲基红和VP测试都是阴性，明胶液化阳性，能够水解淀粉，但不能水解七叶甙、Tweens20，40，80，硝酸盐还原阳性，广泛应用于淀粉酶工业生产领域。文档编号C12N1/20GK101643717SQ20091011335公开日2010年2月10日申请日期2009年6月4日优先权日2009年6月4日发明者恺娄,健孙,涛张,敏楚,芸王申请人:新疆农业科学院微生物应用研究所