专利名称：结核分枝杆菌临床分离菌株基因型快速检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属医学检验领域，涉及结核分枝杆菌鉴定的方法，具体涉及一种结核分枝 杆菌临床分离菌株基因型快速检测试剂盒。
背景技术：
结核病是一种长期威胁人类健康的感染性疾病，其病原体是结核分枝杆菌。据世 界卫生组织统计，全球三分之一人口感染结核分枝分枝杆菌，其中每年900万新发结核病 人，160万人死于结核。中国属于全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数居全球第二 位，全国结核杆菌感染人数高达5亿，现有结核病人450万；每年新发病例145万；每年结 核病死亡人数13万，并且是全球耐药结核病患者人数最多的国家，结核病控制任务相当艰 巨。通常结核分枝杆菌通过呼吸道感染人体，并在人体内潜伏，有90%的感染者终身 不发病，仅有5%在感染后两年内发病(近期外源性感染引起的发病)，另有5%可在其一生 中的某个时期发病(内源性复燃引起的发病)。由于很难判断个体发病是由于近期外源性 感染还是内源性复燃引起，因此结核病的流行规律至今尚不明确。结核分枝杆菌菌株基因型分型方法是利用结核分枝杆菌的自身的分子标识快速 鉴定菌株基因型，可用于研究结核病爆发流行、传染源的寻找和追踪、鉴别内源性复发和近 期外源性感染、耐药菌株的传播和实验室污染等，对于了解结核病的传播模式具有重要的意义。长期以来，科研工作者一直致力于寻找一种快速简便又准确的结核分枝杆菌临床 分离菌株基因型分型方法。从1993年开始，通过标记结核分枝杆菌基因组中IS6110插入 序列来鉴定结核分枝杆菌菌株基因型的限制性片段长度多态性分析方法被用于结核分枝 杆菌基因型的鉴定，该方法具有良好的分辨率，但是操作复杂，并且在不同的实验室之间不 容易进行比较，另外该方法对于低拷贝数的临床分离菌株分辨率比较低[见参考文献1]。 Spoligotyping是另外一种成熟的结核分枝杆菌基因型分型技术，该方法是利用了在结核 分枝杆菌基因组直接重复区域(direct repeat region)间隔序列多态性对不同菌株进行 分型，该方法操作比较简便，但对于我国流行的大量北京基因型菌株分辨率却不尽如人意 [见参考文献2]。1998 年，Richard Frothingham 禾口 Winifred A. Meeker-O' Connel 两位美 国科学家首次系统地研究了结核分枝杆菌基因组中存在的可变数目串联重复序列 (variable-number tandem repeats, VNTR)，发现在不同的结核分枝杆菌菌株中，特定位点 的PCR扩增产物所包含的串联重复序列数目不同，因此能够作为一种可靠的分子标识，用 于区分不同的临床菌株，与IS6110-RFLP相比省时省力，并方便不同的实验室进行比较[见 参考文献3]。随着对结核分枝杆菌基因组的认识逐渐深入，人们逐渐发现了不同的VNTR 位点及组合=Philip Supply等鉴定出了结核分枝杆菌基因组中41个串联重复区域，并将 其命名为结核分枝杆菌散在重复单元(MIRU)，其中12个具有较高分辨率的位点组合称为MIRU-12分型方法，该方法得到了美国疾病预防控制中心(CDC)的推广[见参考文献4]。然 而，尽管MIRU-12在美国具有比较好的分辨率，但对我国流行的结核分枝杆菌菌株分辨率 却远远不及IS6110-RFLP。建立适合我国流行菌株的结核分枝杆菌基因型分型方法，将对探 索和研究我国结核病的流行和传播规律提供有力工具，具有重要的意义和价值。与本发明相关的参考文献如下1. Cowan, L. S.，et al.，Variable-number tandem repeat typing of Mycobacteriumtuberculosis isolates with low copy numbers of IS61IOby using mycobacterial interspersed repetitive units.J Clin Microbiol，2002.40 (5) p. 1592-602.2. Skuce, R. A.，et al.，Discrimination of Mycobacterium tuberculosis complexbacteria using novel VNTR-PCR targets. Microbiology,2002. 148 (Pt 2) p. 519-28.3. Frothingham, R. and W. A. Meeker-O^ Connel 1, Genetic diversity in theMycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandem DNA repeats. Microbiology,1998. 144(Pt 5) :p.1189—96.4. Supply, P.，et al.，Variable human minisatellite-like regions in theMycobacterium tuberculosis genome. Mol Microbiol,2000. 36(3) :p. 762-71.5.Zhang, L ， et al. ， Highly polymorphic variable-number tandem repeats locifor differentiating Beijing genotype strains of Mycobacterium tuberculosis inShanghai, China. FEMS Microbiol Lett, 2008. 282(1) :p. 22—3L6. Smittipat, N.and P.Palittapongarnpim, Identification of possible loci ofvariable number of tandem repeats in Mycobacterium tuberculosis. Tuber Lung Dis，2000. 80(2) :p. 69-74.7. Smittipat，N.，et al.，Polymorphism of variable-number tandem repeats atmultiple loci in Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol，2005. 43(10) p. 5034-43.8. Yokoyama, E.，et a 1.，Improved differentiation of Mycobacteriumtuberculosis strains， including many Beijing genotype strains， using a newcombination of variable number of tandem repeats loci.Infect Genet Evol, 2007. 7(4) :p. 499-508.9. Surikova, 0. V. , et al. , [ B # 考文 K Differentiation of the Mycobacteriumtuberculosis W-Beijing family strains from the Russian Federation by theVNTR-typing].Mol Gen Mikrobiol Virusol,2005(3) :p. 22-9.10. Kam, K. M.，et al.，Optimization of variable number tandem repeat typingset for differentiating Mycobacterium tuberculosis strains in the Beijing family. FEMS Microbiol Lett, 2006. 256(2) :p. 258-65.11. Iwamoto, T.，et al.，Hypervariable loci that enhance the discriminatoryability of newly proposed 15—loci and 24—loci variable—number tandem repeat typingmethod on Mycobacterium tuberculosis strains predominatedby the Beijing family. FEMS Microbiol Lett,2007. 270(1) :p. 67-74.12. Mokrousov, I. , et al. , Analysis of the allelic diversity of themycobacterial interspersed repetitive units in Mycobacterium tuberculosis strainsof the Beijing famiIy !practical implications and evolutionary considerations. JClin Microbiol,2004. 42(6) :p. 2438-44.13. Kremer, K. , et al. , Use of variable-number tandem-repeat typing todifferentiate Mycobacterium tuberculosis Beijing family isolates from Hong Kong andcomparison with IS6110 restriction fragment length polymorphism typing andspoligotyping. J Clin Microbiol,2005. 43(1) :p.314-20.14. Le Fleche, P. , et al. , High resolution, on-line identification ofstrains from the Mycobacterium tuberculosis complex based on tandem repeat typing. BMC Microbiol, 2002. 2 :p. 37.15. Nikolayevskyy, V. , et al. , Differentiation of tuberculosis strains ina population with mainly Beijing-family strains. Emerg Infect Dis,2006. 12(9) p. 1406-13.16. Steenken, W. J. , and L. U. Gardner. History of H37 strain of tuberclebacillus. Am. Rev. Tuberc. 1946. 54 :62-66.17. Parra, C. A. , et al. , Isolation, characterization, and molecular cloningof a specific Mycobacterium tuberculosis antigen gene identification of aspecies-specific sequence. Infect Immun,1991. 59(10) :p. 3411-7.
发明内容
本发明的目的是建立适合我国流行菌株的结核分枝杆菌临床分离菌株基因型快 速检测试剂盒以及结核分枝杆菌基因型分型方法。本发明的另一个目的是提供上述试剂盒的应用。本发明提供了一种结核分枝杆菌检测试剂盒，该试剂盒含有针对IS6110插入序 列设计的检测探针。上述试剂盒可以含有序列如SEQ ID NO 33_36所示的探针。该试剂盒还包括序列如SEQ ID NO 37_39所示的探针。Mtb 1atagggaatgctcggcaacSEQIDNO33
Mtb 2caacatcgacgcagtacccSEQIDNO34
IS6110-P1tcaggtcgagtacgccttctSEQIDNO35
IS6110-P2ggtcgcagagatccgcggtcSEQIDNO36
RD105_P1ggagtcgttgagggtgttcatcagctcagtcSEQIDNO37
RD105_P2cgccaaggccgcatagtcacggtcgSEQIDNO38
RD105_P3ggttgcccactggtcgatatggtggacttSEQIDNO39该试剂盒还包括序列如SEQ ID NO 1_14所示的探针。该试剂盒还包括序列如SEQ ID NO 15_32所示的探针。探针序列SEQ ID NO 1-32如下
权利要求
1.一种结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有针对IS6110插入序列设 计的检测探针。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测探针由序列如SEQIDNO 33、 SEQ ID NO 34、SEQ ID NO ；35和SEQ ID NO 36所示的四种探针组成。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括序列如SEQIDNO 37,SEQ ID NO 38和SEQ ID NO 39所示的三种探针。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括序列如SEQIDNO 1_14所 示的探针。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括序列如SEQIDNO 15-32 所示的探针。
6.权利要求1所述的试剂盒的应用，其特征在于，将其用于检测结核分枝杆菌。
7.权利要求3所述的试剂盒的应用，其特征在于，将其用于检测北京型结核分枝杆菌。
8.权利要求5或者4所述的试剂盒的应用，其特征在于，将其用于结核分枝杆菌的分型。
9.权利要求1所述的试剂盒的应用方法，其特征在于，提取样本菌株的DNA，以所述的 针对IS6110插入序列设计的检测探针为引物，进行PCR扩增，所得产物与结核分枝杆菌DNA 扩增产物一致的，样品中即含有结核分枝杆菌。
全文摘要
本发明属医学检验领域，提供了一种结核分枝杆菌临床分离菌株基因型快速检测试剂盒。该试剂盒含有针对IS6110插入序列设计的检测探针。本发明所涉及的结核杆菌分型的方法，提取样本菌株的DNA，以所述检测探针为引物进行PCR扩增，所的产物与结核分枝杆菌DNA扩增产物一致的，样品中即含有结核分枝杆菌。该方法对目前我国流行的结核分枝杆菌临床分离菌株具有较高的分辨率，同时每个菌株的基因型结果以数字化形式输出，便于不同实验室之间进行比较。另外该方法无需大量设备，操作比较简单，价格也相对低廉。本发明将为探索和研究我国结核病的流行和传播规律提供有力的工具。
文档编号C12Q1/68GK102094077SQ20091020110
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月15日 优先权日2009年12月15日
发明者张璐, 李霞, 王春香, 陈婧, 高建恩, 高谦 申请人:北京康为世纪生物科技有限公司, 复旦大学