专利名称：一种耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌bl21-xa及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于酶基因工程和酶工程领域，更具体涉及一种耐热耐碱木聚糖酶重组工 程菌BL21-XA及其应用。
背景技术：
木聚糖酶是一类可以催化分解半纤维、木聚糖、支链木寡糖的水解酶类。它们不同 于一般的酶类，它是一种内切酶系，对底物具有很好的转糖基和降解作用。近年来随着人们 对于该酶应用范围认识的增强，此类酶得到了一定的研究。然而由于生产中使用木聚糖酶 常需要有一定的高温条件和较高的耐碱性，因此耐热嗜碱木聚糖酶的选育具有极大潜能的 应用价值；但是现有技术中理想的制备耐热耐碱木聚糖酶用的重组工程菌比较缺乏。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中对于制备耐热耐碱木聚糖酶用的重组工程菌比 较缺乏的问题，提供一种耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA及其应用，由该工程菌 BL21-XA制备的热稳定木聚糖酶具有很好的活性、耐受性好、pH值适应性宽，耐热耐碱性等 性能。本发明的含有土芽孢杆菌属(Gebacillus sp.)嗜热菌TC-W7的高温木聚糖酶基 因的重组质粒PXA 所述重组质粒的核苷酸序列的碱基序列为如SEQ NO. 1中所述。本发明的耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA 所述重组工程菌BL21-XA中含 有上述的高温木聚糖酶基因的重组质粒PXA。本发明的耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA，用大肠杆菌为宿主细胞得到大 肠埃希氏重组工程菌[Escherichia coli BL21-XA]，该菌株已于2009年7月22日由中国 典型培养物保藏中心收到登记入册，并于2009年7月25日由该保藏中心检测完毕为存活， 其保藏号为CCTCC :M209164。本发明的耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA构建为温泉样品经木聚糖平板 分离、纯化，得到酶活较大的菌株TC-W7。经16SrDNA鉴定为Gebacillus sp. TC-W7。从土芽 孢杆菌属(Gebacillus sp.)嗜热菌TC-W7中采用常规或采用基因组提取试剂盒提取其总 DNA ；以所提取的嗜热菌Gebacillus sp. TC-W7总DNA为模板，采用木聚糖酶酶基因简并引 物进行PCR扩增，获得1200bp的DNA片段，测序验证。采用基因工程工具酶，将扩增的DNA片 段连接到质粒载体pGEX中；然后用连接产物转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 感受态细胞，均勻涂布在LB平板上，所述LB平板含Amp 100 u g/ml ；挑取阳性重组工程菌 菌落，提取质粒；随后采用双酶切和测序的方法鉴定该木聚糖酶的DNA片段已正确融入了 表达载体本发明的热稳定木聚糖酶含有如SEQ NO. 1中所述的DNA的碱基序列。本发明的热稳定木聚糖酶为具有SEQ NO. 2氨基酸序列的蛋白质，或者热稳定木聚 糖酶也可以是将序列SEQ N0. 2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸取代、缺失或添加，并
3且具有序列SEQ NO. 2的相同活性的由序列SEQ NO. 2衍尘的蛋白质。本发明的热稳定木聚糖酶的制备步骤包括1、土芽孢杆菌属(Gebacillus sp.)嗜热菌TC-W7的分离鉴定将所采集的样品涂 布木聚糖平板后，挑取单菌落进行划线纯化，将纯化后的菌株点种透明圈观察平板上，选取 有透明圈产生的菌株进行复筛，从而得到酶活较大的菌株TC-W7。对该菌株进行菌落形态， 菌株形态的观察，革兰氏属性以及16SrDNA的鉴定，命名为Gebacillus sp. TC-W7。2、热稳定木聚糖酶酶基因的克隆从土芽孢杆菌属(Gebacillus sp.)嗜热菌 TC-W7中采用常规或采用基因组提取试剂盒提取其总DNA ；以所提取的嗜热菌Gebacillus sp. TC-W7总DNA为模板，采用木聚糖酶酶基因简并引物进行PCR扩增，获得1200bp的DNA 片段，测序验证。3、热稳定木聚糖酶重组工程菌的构建采用基因工程工具酶，将扩增的DNA片段 连接到质粒载体PGEX中；然后用连接产物转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感 受态细胞，均勻涂布在LB平板上，所述LB平板含Amp 100 u g/ml ；挑取阳性重组工程菌菌 落，提取质粒；随后采用双酶切和测序的方法鉴定该木聚糖酶的DNA片段已正确融入了表 达载体；4、重组工程菌按微生物发酵和酶工程技术制备热稳定木聚糖酶。本发明的热稳定木聚糖酶可以用于生物质能源、食品、造纸或医药卫生等领域，对 木聚糖具有降解、糖基转化的作用。本发明的显著优点是本发明提供的木聚糖酶重组工程菌BL21-XA生产的木聚 糖酶具有很好的性能1、该木聚糖酶的最适作用温度为75°C，但在95°C时仍有一定的酶 活，表现了很好的耐热性，同时也具有很强的热稳定性，70°C耐受150min后仍保持着70% 的活性，该酶对热也具有较广的耐受范围(35-95度)；2、该酶对pH值有较宽的适应性 (3. 2-10. 2)，其最适最适作用pH为pH8. 2，在偏碱性条件下比较稳定，pH7. 2与8. 2耐受 90min后酶活仍高于80%的酶活，在pH10. 2耐受90min后仍具有50%的酶活，表现了很好 的耐碱性能。3、该酶对去污剂和抑制剂有较强的抗逆性，2-Me、Tween20、Triton X_100、DDT 在不同程度上均对该酶有激活作用。4、金属离子Na+，K+，Li+对该酶有较好的促进作用。5、 由于在造纸工业中纸浆漂白所需的木聚糖酶应具有在高温强碱条件下热稳定性强、碱稳定 强以及抗化学物质与金属离子的特点，本发明得到的木聚糖酶显然具有这些方面的优势， 非常适合在纸浆工业尘产中应用。
图1是本发明的木聚糖酶基因的克隆，其中A 木聚糖酶基因的PCR扩增；B 重组 质粒的双酶切验证(BamH I和Xho I)。图2是本发明的木聚糖酶在大肠杆菌表达系统中的表达，其中泳道1，只含空载 的菌，未诱导；2，只含空载的菌，诱导；3，含重组质粒的菌，未诱导；4，含重组质粒的菌，诱 导；5，GST纯化蛋白GST-XA ；6，纯化蛋白经凝血酶酶切。图3重组酶的最适反应温度测定曲线图，酶与底物在不同温度下反应30分，然后 进行酶活测定。图4是重组酶的温度耐受测定曲线图，酶先在不同温度下温育不同时间，然后加 底物反应30分，再进行残余酶活的测定。图5重组酶的最适反应pH测定曲线图，酶与底物在不同pH下反应30分，进行酶活测定。图6是重组酶的pH耐受测定曲线图，酶分别在不同pH下温育不同时间，然后加底 物，反应30分后，再进行酶活测定。图7是酶抑制剂和去污剂对重组木聚糖酶活的影响图，重组酶在抑制剂(ImM)及 去污剂(0.1%)作用下酶活测定。图8是金属离子对重组木聚糖酶酶活的影响图，在10mM不同浓度的金属离子作用 下，进行酶活的测定。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件如 Sambrook等所著的《分子克隆实验室手册》(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1.嗜热菌TC-W7的分离与鉴定将从福建永泰温泉采集的样品，均勻涂布在以木聚糖为碳源的筛选平板上，挑取 单菌落进行划线纯化，然后将纯化后的菌株点种于透明圈观察平板上，60°C培养两天后，用 0. 刚果红染色30min，再用lmol/L NaCl溶液脱色。挑选周围有透明圈产生的菌落进行 摇瓶发酵复筛，选取酶活较大的菌株TC-W7。该菌株平板上菌落白色，扁平状，粘性，半透明，边缘不规则，带有小“V”形缺刻。革 兰氏染色结果为阳性，显微镜下的形态为长杆状。16S rDNA鉴定采用天根细菌基因组提 取试剂盒说明书提取DNA，用细菌通用引物27F、1500R进行PCR扩增，PCR产物经胶回收后 与PMD-18T载体相连，转化E. coli DH5 a，双酶切验证后由北京天根有限公司测序。测序结 果与GeneBank数据库序列进行相似性比较，初步确定该菌株属于Gebacillus sp.，命名为 Gebacillus sp. TC-W7。实施例2.嗜热菌Gebacillus sp. TC-W7木聚糖酶基因的克隆以所提取的嗜热菌Gebaci 1 lus sp. TC-W7总DNA为模板，采用下列简并引物 sense primerXA:[5' -CAT (C)ACA (G)C (T)TGGTTTGGCA-3' ], antisense primer XA [5’ -A(T)CCCCAG(A)AAC(T)GTG(A)AC-3']或者来源于简并引物的一对特异引物。PCR反 应体系如下95°C，4分钟，一个循环；95°C，1分钟，55°C，1分钟，72°C，1分钟，30个循环； 72°C，10分钟一个循环。产物经1 %琼脂糖电泳验证得到一个约1200bp的DNA片段，测序 验证。实施例3.木聚糖酶重组工程菌构建，木聚糖重组酶的表达及纯化采用基因工程工具酶，将扩增的DNA片段连接到质粒载体pGEX中。然后用连接 产物转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞，均勻涂布在LB平板(含 Ampl00ug/ml)上。挑取阳性重组工程菌菌落，提取质粒。随后采用双酶切和测序的方法鉴 定该木聚糖酶的DNA片段已正确融入了表达载体。挑取含有重组质粒的单菌落于3ml LB液体培养基(含Amp 100 u g/ml)，37°C摇培 过夜。吸取1ml菌液于新的100ml LB液体培养基(含Amp 100 u g/ml)，30°C摇培至0D6(1(1 为0.6左右，加入IPTG至终浓度0.4mM，继续震荡培养4h。收集菌液离心，去上清。将细胞
5用适量PBS(pH 7.2)重悬，超声裂解菌体，离心去沉淀，上清中的重组蛋白木聚糖酶用GST 柱进行亲和纯化。性能测定实施例4.木聚糖酶活性测定按照Bailey et al [8]等建立的酶活测定方法(DNS)。适量酶液与底物混合后， 75°C温育30分钟，通过测定540nm波长下的吸光值判定酶活。酶的定义为，单位时间内水 解释放出1 y mol还原糖木糖所需的酶量Miller [9]。实施例5.木聚糖酶的性质鉴定(1)酶最适反应温度与耐受性的测定以的oat spelt xylan为底物，在pH为7. 2缓冲液的中，于不同温度下反应 30min，分别测定重组木聚糖酶的活性(重复三次)，以不加酶液的反应体系为对照。结果显 示，重组木聚糖反应的最适温度是75°C，其反应温度范围在50°C 90°C，当温度高于或低 于最适反应酶活时，酶活逐渐降低(图3)。将重组的木聚糖酶加入缓冲液中，于不同温度条件下温浴不同时间，迅速加入含 有底物的反应体积，测定木聚糖酶的残余酶活。结果显示，重组酶在65°C和70°C条件下的 热稳定性较强，耐受2. 3h后仍有70%的酶活(图4)。75°C时，重组酶的半衰期为70min，温 度高于80°C，酶的热稳定性下降比较快。(2)重组酶的最适pH与pH耐受性测定以的oat spelt xylan为底物，于最适温度条件下，在不同pH(pH3. 2-10. 2)的 缓冲液中反应30min，以不加酶液的反应体系为对照，测定木聚糖酶的酶活(重复三次)。结 果显示，重组木聚糖酶的反应最适pH为8. 2 (图5)，当pH超过10. 2或低于5. 2时，木聚糖 酶的活性逐渐降低。将重组的木聚糖酶加入不同pH缓冲液中，于不同pH温浴不同时间后取出，迅速加 入含有底物的反应体积，测定木聚糖酶的残余酶活。结果显示重组酶在PH7. 2-9. 2这个范 围内比较稳定，耐受60min后酶活仍高于75 %的酶活，在pH10. 2耐受60min后仍具有70 % 的酶活，然后这个条件下酶活下降的比较迅速(图6)。(3)去污剂和抑制剂对酶活的影响在底物溶液中加入10mM或1 %的酶抑制剂(EDTA，2_Me，SDS，PMSF和DDT)和去污 剂(Tween20，Triton X-100)，在75°C，pH8. 2的条件下，以不加酶抑制剂和去污剂的底物溶 液为对照，测定重组木聚糖酶的活性(重复三次)。结果显示(图7)，EDTA和PMSF能够抑 制其大约80%的活性，SDS对该酶几乎没有什么影响，2-Me、Tween20、Triton X-100,DDT在 一定程度上对该重组酶有促进作用。(4)金属离子对酶活的影响在底物缓冲液液中加入终浓度为10mM的金属离子，以不加金属离子的反应体系 为对照，在72°C，pH8.2条件下测定重组木聚糖酶的活性(重复三次)。结果如图8所示，一 价的金属离子(如Li+、Na+、K+)对重组木聚糖酶有促进作用；二价的金属离子Mg2+，Ca2+, Ba2+和Mn2+对该重组酶也有促进作用。关于本发明的遗传资源的直接来源和原始来源的说明如下遗传资源名称高温木聚糖酶基因XA ；
遗传资源取自微生物；获取方式自行采集；直接来源获取时间2008年8月；采集方式采集地(国家、省(市))中国福建福州采集者名称(姓名)刘斌；张宁宁采集者联系方式0591-83794548 ； 13055783073原始来源采集者名称(姓名)刘斌；张宁宁采集者联系方式0591-83794548 ； 13055783073获取时间2006年10月获取地点(国家、省(市))中国福州市永泰县序列表SEQ NO. 1<110>福建农林大学<120> 一种嗜热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA及其应用<160>2<210>1<211>1224<212>DNA<213> 土芽孢杆菌属(Gebacillus sp)嗜热菌<220><223><400>1atgttgaaaattagggatgaagcgcattgcgctgttgaacaacagcattgttcaattttgcgtttccacaggccaaccaattaaaacggatattgggacgtatcaaatcgggcaacaagagctctttatacatcagtcccatgtttgccg
7
gatcgcgaaaagcgataatagttggattctcatttatgctgttgctccct60cgaatgcattggcaaaaactgaacaatcatactctaaaaagcctcaaatc120atgccccacaattggaccagcgctacaaagattcattcactattggtgcg180cttatcagctactaaacgagaaagacgcacaaatgctaaaacgccatttt240tcgctgagaacgttatgaagccgattaatattcaaccggaagaaggaaaa300ctgaggcggatcaaatcgttcggtttgcta3.3.3.3.3.C3.CC3.tatggatatc360cgctcgtttggcatagccaagtacctcaatggttctttcttgacaaggaa420tggtcaatgaaacggaccctgtgaaacgcg3.3. C 3.3.3.3.13.3.acagctgtta480tcgaaacccatattaaaacgattgtcgagcggtataaagatgacatcaaa540ttgtaaatgaggtagtcggggatgatggagaattgcgcgattccccatgg600ctggcatcgattatattaaggtagcgttccaaacagcaagaaaatatggc660ttaaactttacattaatgattacaatacggaagttgaaccaaagcgaagc720acttggtgaaacaattaaaagaagagggcattcccattgatggtattggc780acatccaaattgactggccttctgaagaggaaatcgaaaaaacgattatc840atctagggttagacaaccaaattactgagctggatgtgagcatgtacggc9000089]tggccgccgc gggcctaccc gtcgtatgacgccattccgg agcaaaagtttttggaccaa0090]gcgaatcgct atgatcgattgtttaagctgtatgaaaaac acagcgataa aatcagtaac0091]gtcaccttct ggggcatcgccgacaaccatacgtggctcg acagtcgagcggatgtttac0092]tatgatgctg atgggaatgtgattgtagacccgaaagccc catacacgag agtggaaaaa0093]gggaatggaa aagatgcgccatttgtgttcgaccccgaat acaacgtaaa acctgcgtat0094]tgggctatta tcgatcataa gtga0095]SEQ NO. 20096]<210>20097]<211>12240098]<212>DNA0099]<213> 土芽孢杆菌属(Gebacillus sp)嗜热菌0100]<220>0101]<223>0102]<400>20103]atgttgagategcgaaaa gcgataatagtt gga ttctea ttt 450104]METLeuLysArgSerArgLys AlalielieVal Gly PheSer Phe0105]1510150106]atgctgttgctccct600107]METLeuLeuLeuPro0108]200109]ttagggatgacgaatgcattg gcaactgaa caa teatac tct 1050110]LeuGlyMETThrAsnAlaLeu AlaLysThrGlu Gin SerTyr Ser0111]2530350112]clclclaagcctcaaate1200113]LysLysProGinlie0114]400115]agegcattgcatgccccacaa ttggaccagcgc tac aaagat tea 1650116]SerAlaLeuHisAlaProGin LeuAspGinArg Tyr LysAsp Ser0117]4550550118]ttcactattggtgcg1800119]PheThrlieGlyAla0120]600121]getgttgaaccttatcageta etaaacgagaaa gac gcacaa atg 2250122]AlaValGluProTyrGinLeu LeuAsnGluLys Asp AlaGin MET0123]6570750124]etacgccatttt2400125]LeuLysArgHisPhe0126]800127]aacageattgtcgetgagaac gttatgaagccg att aatatt caa 285
960 1020 1080 1140 1200 1224
ASh Set Ile Val Ala Glu ASh Val ME／Lys Pro Ile ASh Ile Gln
859095
Pro Glu Glu Gly Lys
100
ttC aat ttt gct gag gcg gat Caa atC gtt cgg ttt gct aaa aaa345
Phe ASh Phe Ala Glu Ala Asp Gln Ile Val Arg Phe Ala Lys Lys
105110115
CaC Cat atg gat atC 360
HiS HiS ME／Asp Ile
120
cgt ttC CaC acg CtC gtt tgg Cat agc Caa gta CCt Caa tgg ttC405
Arg Phe HiS／hr Leu Val／rio HiS Set Gln Val Pro Gln／rio Phe
125130135
ttt Ctt gac aag gaa 420
Phe Leu Asp Lys Glu
140
ggc Caa CCa atg gtc aat gaa acg gac CCt gtg aaa cgc gaa Caa465
Gly Gln Pro ME／Val ASh Glu／hr Asp Pro Val Lys Arg Glu Gln
145150155
aat aaa cag ctg tta 480
ASh Lys Gln Leu Leu
160
tta aaa cgg atC gaa aCC Cat att aaa acg att gtc gag cgg tat525
Leu Lys Arg Ile Glu／hr HiS Ile Lys／hr Ile Val Glu Arg／yr
165170175
aaa gat gac atC aaa 540
Lys Asp Asp Ile Lys
180
tat tgg gac gtt gta aat gag gta gtc ggg gat gat gga gaa ttg 585
／yr／rio Asp Val Val ASh Glu Val Val Gly Asp Asp Gly Glu Leu
185190195
Arg Asp Set Pro／rio
200
tat Caa atC gct ggc atC gat tat att aag gta gcg ttC Caa aCa645
／yr Gln Ile Ala Gly Ile Asp／yr Ile Lys Val Ala Phe Gln／hr
205210215
gca aga aaa tat ggc 660
Ala Arg Lys／yr Gly
220
ggc aaC aag att aaa Ctt taC att aat gat taC aat acg gaa gtt605
225230235
gaa CCa aag cga agc 720
Glu Pro Lys Arg Set
240
gct Ctt tat aaC ttg gtg aaa Caa tta aaa gaa gag ggc att CCC765
Ala Leu／yr ASh Leu Val Lys Gln Leu Lys Glu Glu Gly Ile Pro
245250255
att gat ggt att ggc 780
Ile Asp Gly Ile Gly
260
Cat cag tCC CaC atC Caa att gac tgg CCt tCt gaa gag gaa atC825
HiS Gln Set HiS Ile Gln Ile Asp／rio Pro Set Glu Glu Glu Ile
265270275
gaa aaa acg att atC 840
Glu Lys／hr Ile Ile
280
atg ttt gcc gat Cta ggg tta gac aaC Caa att aCt gag ctg gat885
ME／Phe Ala Asp Leu Gly Leu Asp ASh Gln Ile／hr Glu Leu Asp
285290295
Val Set ME／／yr Gly
300
tgg ccg ccg cgg gcc taC ccg tcg tat gac gcc att ccg gag Caa 945
／rio Pro Pro Arg Ala／yr Pro Set／yr Asp Ala Ile Pro Glu Gln
305310315
aag ttt ttg gac Caa 960
Lys Phe Leu Asp Gln
320
gcg aat cgc tat gat cga ttg ttt aag ctg tat gaa aaa CaC agc1005
325330335
gat aaa atC agt aaC 1020
Asp Lys Ile Set ASh
340
gtc aCC ttC tgg ggc atC gcc gac aaC Cat acg tgg CtC gac agt1065
Val Thr Phe Trp Gly lie Ala Asp Asn His Thr Trp Leu Asp Ser345350355cga gcg gat gtt tac 1080Arg Ala Asp Val Tyr360tat gat get gat ggg aat gtg att gta gac ccg aaa gcc cca tac 1125Tyr Asp Ala Asp Gly Asn Val lie Val Asp Pro Lys Ala Pro Tyr365370375acg aga gtg gaa aaa 1140Thr Arg Val Glu Lys380ggg aat gga aaa gat gcg cca ttt gtg ttc gac ccc gaa tac aac 1185Gly Asn Gly Lys Asp Ala Pro Phe Val Phe Asp Pro Glu Tyr Asn385390395gta aaa cct gcg tat 1200Val Lys Pro Ala Tyr400tgg get att ate gat catTrp Ala lie lie Asp His405
aag tga 1224
T ~k ~k ~k Lys
1权利要求
一种含有土芽孢杆菌属(Gebacillus sp.)嗜热菌TC-W7的高温木聚糖酶基因的重组质粒pXA，其特征在于所述重组质粒的核苷酸的碱基序列如SEQ NO.1中所述。
2.一种耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA，其特征在于所述重组工程菌BL21-XA 中含有权利要求1所述的重组质粒。
3.根据权利要求2所述的嗜热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA，其特征在于所述 耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA属于大肠杆菌Escherichia coli，其保藏号为 CCTCC :M209164o
4.一种热稳定木聚糖酶，其特征在于所述热稳定木聚糖酶含有如权利要求1所述的 DNA的碱基序列。
5.根据权利要求4所述的热稳定木聚糖酶，其特征在于所述热稳定木聚糖酶为具有 SEQ NO. 2氨基酸序列的蛋白质。
6.根据权利要求4所述的热稳定木聚糖酶，其特征在于所述热稳定木聚糖酶为采用 权利要求2所述的耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA制备。
7.根据权利要求6所述的热稳定木聚糖酶，其特征在于所述热稳定木聚糖酶的制备 步骤包括(1)土芽孢杆菌属(Gebacillus sp.)嗜热菌TC-W7的分离鉴定温泉样品经木聚糖平 板分离、纯化，得到酶活较大的菌株TC-W7 ；对该菌株进行菌落形态，菌株形态的观察，革兰 氏属性以及16SrDNA的鉴定，命名为Gebacillus sp. TC-W7 ；(2)高温嗜热木聚糖酶酶基因的克隆从土芽孢杆菌属(Gebacillussp.)嗜热菌 TC-W7中采用常规或采用基因组提取试剂盒提取其总DNA ；以所提取的嗜热菌Gebacillus sp. TC-W7总DNA为模板，采用木聚糖酶酶基因简并引物进行PCR扩增，获得1200bp的DNA 片段，测序验证；(3)高温嗜热木聚糖酶重组工程菌的构建采用基因工程工具酶，将扩增的DNA片段连 接到质粒载体PGEX中；然后用连接产物转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受 态细胞，均勻涂布在LB平板上，所述LB平板含Amp 100 u g/ml ；挑取阳性重组工程菌菌落， 提取质粒；随后采用双酶切和测序的方法鉴定该木聚糖酶的DNA片段已正确融入了表达载 体；(4)重组工程菌按微生物发酵和酶工程技术制备高温木聚糖酶。
8.—种如权利要求4、5、6或7所述的热稳定木聚糖酶的用途，其特征在于所述热稳 定木聚糖酶用于生物质能源、食品、造纸或医药卫生领域，对木聚糖具有降解、糖基转化的 作用。
全文摘要
本发明提供一种嗜热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA及其应用，本发明属于酶基因工程和酶工程领域，解决现有技术中对于制备木聚糖酶用的嗜热耐碱木聚糖酶重组工程菌比较缺乏或者活性、嗜热耐碱性不理想等问题。本发明包括含有土芽孢杆菌属(Gebacillus sp.)嗜热菌TC-W7的高温木聚糖酶基因的重组质粒pXA的核苷酸序列如SEQ NO.1中所述，含有重组质粒pXA的重组工程菌BL21-XA，以及利用该工程菌制备的热稳定木聚糖酶、制备方法及木聚糖酶的应用。本发明工程菌BL21-XA耐热性好、pH值适应性宽，耐受性好，其制备的热稳定木聚糖酶具有很好的活性、耐热耐碱等性能。
文档编号C12P19/14GK101845450SQ20091022118
公开日2010年9月29日 申请日期2009年10月31日 优先权日2009年10月31日
发明者刘斌, 吴祖建, 张宁宁, 谢联辉 申请人:福建农林大学