专利名称：血管紧张素Ⅰ转换酶抑制剂、制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种血管紧张素I转换酶(ACE)抑制肽，尤其是一种以牡蛎为原料，无 毒副作用、安全性高、成本廉价、可产业化生产的血管紧张素I转换酶抑制剂、制备方法及 其应用。
背景技术：
高血压是最常见的心血管疾病之一，它能造成大脑、心血管、肾脏的损害，是引起 脑卒中、心力衰竭和冠心病等的重要因素，严重威胁着人类的健康。血管紧张素I转换酶在 人体肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统中，对血压调节起着重要的作用，它可 以将血管紧张素I转换为血管紧张素II，使周围小动脉、血管平滑肌收缩，同时刺激醛固酮 分泌，促进人体肾脏对Na+、K+的重吸收，引起钠储量和血容量的增加，使血压升高；还可以 使舒缓激肽失活，引起血压升高，如果抑制了血管紧张素I转换酶的活性，就可以起到降压 的作用。现有的作为治疗高血压的合成物卡普托利就是血管紧张素I转换酶的抑制剂，但 由于它是由化学药品合成，因此有很多副作用。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种以牡蛎为原料，安 全性高、成本廉价、可产业化生产的血管紧张素I转换酶抑制剂、制备方法及其应用。本发明的技术解决方案是一种血管紧张素I转换酶抑制剂，其特征是氨基酸序 列为 Vel Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe0一种上述血管紧张素I转换酶抑制剂的制备方法，其特征在于按如下步骤进行a.将新鲜牡蛎去壳、除内脏，留存的白色蛎肉、鳃和体液用勻浆机在-10°C到10°C 的低温状态下制成牡蛎浆液，提取牡蛎粗蛋白粉；b.将牡蛎粗蛋白粉进行酶解并经过超滤膜过滤制得牡蛎粗蛋白酶解液；c.将牡蛎粗蛋白酶解液经凝胶柱进行层析分离及RP-HPLC纯化分离。所述a步骤的提取牡蛎粗蛋白粉是将牡蛎浆液加到等体积PBS溶液中充分搅拌， 于4°C条件下静置6小时，5000 Xg离心25分钟取上清液，向上清液中加入硫酸铵，使硫酸 铵最终浓度达到75%并在4°C条件下静置6小时，5000Xg离心25分钟，取沉淀；将沉淀与 水混溶，装入MW 10000道尔顿的透析袋中流水透析M小时，再用去离子水透析M小时，然 后将内容物真空冷冻干燥，得到牡蛎粗蛋白粉末；所述PBS溶液是用0. 2mol/L NaH2PO4和 0. 2mol/L Na2HPO4按体积比39 61混合的pH 7. 0溶液。所述b步骤是将牡蛎粗蛋白粉末溶于0. 05mol、pH 2. 0的磷酸缓冲液中使蛋白浓 度为2.5%，加入胃蛋白酶，胃蛋白酶与蛋白的质量比为1 50，在37°C下酶解24小时；所 得酶解液加热至100°C并保持10分钟，用碱或者碱性盐(如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁， 碳酸钠、碳酸钾等)调节酶解液PH为中性，5000 X g、室温离心25分钟，经MW 10000道尔顿超滤膜过滤，透过超滤膜的组分为牡蛎可溶蛋白酶解液。所述c步骤是取牡蛎可溶蛋白酶解液15ml经kphadex LH-20柱进行层析分离， 进行层析分离，用30%的甲醇溶液洗脱，按管数收集，20分钟/管，检测波长为280nm，收集 具有血管紧张素I转换酶抑制剂活性的组分，将所得组分在RP-HPLC上纯化，具体条件是在 RP-HPLC上用Hypersil Cw柱，流动相A液为0. 1 % TFA+0%乙腈的水溶液，用前超声脱气； 流动相B液为0. 1 % TFA+100%乙腈的水溶液，检测波长215nm，室温，进样体积20 μ 1，采 用梯度洗脱，按时间收集；洗脱梯度0 60min A液 100% 50%线性降低；B液0% 50%线性升高；60 80minA 液 0%;B 液 100%。上述血管紧张素I转换酶抑制剂在制备降低高血压产品中的应用。本发明是以牡蛎浆液为原料，通过对牡蛎浆液酶解所产生的牡蛎蛋白酶解液的进 一步分离、纯化得到其氨基酸序列为VYPWTQRF的新肽，实验证明是有效的血管紧张素I转 换酶抑制剂，具有无毒副作用、安全性高、成本廉价、可产业化生产的等优点，可广泛应用于 制备降低高血压的药品及保健品中。
图1是本发明实施例中用kphadex LH-20柱进行层析分离，检测波长为为^Onm 的谱图。图2是应用本发明实施例降血压得效果示意图。
具体实施例方式a.将新鲜牡蛎去壳，除内脏，留存的白色蛎肉、鳃和体液用勻浆机在低温状态下切 碎制成牡蛎浆液。b.将牡蛎浆液加到等体积的PBS溶液(0. 2mol/L NaH2PO4和0. 2mo VLNa2HPO4按 体积比39 61混合，pH 7.0)中，充分搅拌，于4°C条件下，静置6小时后，离心(5000Xg， 4°C ) 25分钟取上清液；向上清夜中加入硫酸铵，使硫酸铵最终浓度达到75%，并在4°C条件 下，静置6小时，离心(5000 X g，4°C ) 25分钟取沉淀；将沉淀与少量水混溶，装入透析袋(MW 10000道尔顿)流水透析M小时，再用去离子水透析M小时，然后将内容物真空冷冻干燥， 得到牡蛎粗蛋白粉末，-20°C保存；c.将牡蛎可溶蛋白溶于0. 05mol、pH 2. 0的磷酸缓冲液中(用lmol/L的HCl调 PH 2.0)，蛋白浓度2.5%，加入胃蛋白酶，胃蛋白酶与蛋白的质量比为1 50，在37°C下 酶解M小时；将所得酶解液加热至10(TC并保持10分钟，使蛋白酶失活；之后用碱或者碱 性盐(如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁，碳酸钠、碳酸钾等)调节酶解液PH为中性，离心 (5000 X g，室温)25分钟，经超滤膜(MW10000道尔顿)过滤，取透过超滤膜的组分即为牡蛎 可溶蛋白酶解液；d.由牡蛎可溶蛋白酶解液15mlLH-20柱进行层析分离，用30 %的 甲醇溶液洗脱，按管数收集，20分钟/管，检测波长^Onm，收集具有较强ACE抑制活性的 组分，即收集如图1所示的10管 30管；将所收集具有较强ACE抑制活性的部分继续在 RP-HPLC上分离纯化，在RP-HPLC上用HypersilC18柱，流动相A液为0. 1 % TFA+0%乙腈的水溶液，用前超声脱气；流动相B液为0. 1% TFA+100%乙腈的水溶液，检测波长215nm，室 温，进样体积20 μ 1，采用梯度洗脱，按时间收集洗脱梯度0 60min A液100% -50%线性降低；B液0% -50%线性升高60 80min A 液 0 % ;B 液 100 %。对所收集的组分用Edman降解(Edmandegradation)法检测，是氨基酸序列为 VYPWTQRF的肽，此肽及肽的类似物的盐类均可以用于制备降低高血压的药物、保健品等。实验例1.静脉注射动物实验选择20只平均收缩压为195mmHg的自发性高血压大白鼠为实验模型，大白鼠饲养 一周后，将其分成2组，每一组10只，将本发明实施例的提取物每日按大白鼠体重5-20mg/ kg剂量进行静脉注射，结果表明，1周后对照组大白鼠的血压持续升高，而治疗组自发性高 血压大白鼠的血压明显下降，从平均收缩压从195mmHg下降到162mmHg，说明此肽具有明显 的降血压效果。2.灌胃动物实验选择20只平均收缩压为185mmHg的自发性高血压大白鼠为实验模型，大白鼠饲养 一周后，将其分组，将本发明实施例的提取物每日按大白鼠体重20-200mg/kg剂量进行灌 胃投入，如图2所示，4周后对照组大白鼠的血压持续升高，而治疗组自发性高血压大白鼠 的血压明显下降，从平均收缩压从185mmHg下降到160mmHg，说明此肽具有明显的降血压效^ ο上述氨基酸序列为VYPWTQRF的肽类似物的盐类可以用通常的方法生产。公认的 与酸反应产生的盐类，比如说盐酸，硫酸，硝酸，磷酸等无机酸；蚁酸，乙酸，丙酸，甘氨胆酸， 苹果酸，柠檬酸，酒石酸，琥珀酸等有机酸等形成的盐类；公认的与金属离子形成的盐类，包 括钠盐，钾盐，钙盐，铵盐；以及氨基乙醇，三乙氨，二环乙氨等形成的胺类盐等没有特别的 限制。本发明实施例所提取的组分(肽)可用现有技术制成各种剂型，即由各种充填剂 形成的散剂，颗粒剂，片剂，胶囊，悬浮液，乳化液，喷剂，粉剂等，通过口腔摄取或者是注射 液的形式使用。本发明相关的ACE抑制剂，可经口腔和非经口腔投入使用。非经口腔的投入方法 比如皮下和静脉注射，肛肠投入等。注射液的制作可以任意选用生理盐水，葡萄糖，安定剂， 防腐剂，悬浮剂，乳化剂等。本发明实施例所提取的组分(肽)可以添加到各种食品当中，作为抑制血压保健 食品，食品的形态可以是清凉饮料，乳酸饮料，调味品，汤类，奶酪，火腿，点心等。本发明实施例所提取的组分(肽)无毒副作用，使用量是没有特别的限制，具体的 要根据高血压的程度，患者的年龄，体重，身体状况和给与的方法等因素适当地确定。序列表<110>大连水产学院<120>血管紧张素I转换酶抑制剂、制备方法及其应用<160>1
<170>PatentIn Version 3. 1<210>1<211 >8<212>蛋白质或肽<213> 未知 <220><223>misc_feature<400>1VYPffTQRF 8
权利要求
1.一种血管紧张素I转换酶抑制剂，其特征是氨基酸序列为Vel Tyr Pro TrpThr Gln Arg Phe0
2.一种如权利要求1所述血管紧张素I转换酶抑制剂的制备方法，其特征在于按如下 步骤进行a.将新鲜牡蛎去壳、除内脏，留存的白色蛎肉、鳃和体液用勻浆机在-10°C 10°C状态 下制成牡蛎浆液，提取牡蛎粗蛋白粉；b.将牡蛎粗蛋白粉进行酶解并经过超滤膜过滤制得牡蛎粗蛋白酶解液；c.将牡蛎粗蛋白酶解液经凝胶柱进行层析分离及RP-HPLC纯化分离。
3.根据权利要求2所述的血管紧张素I转换酶抑制剂的制备方法，其特征在于所述a 步骤的提取牡蛎粗蛋白粉是将牡蛎浆液加到等体积PBS溶液中充分搅拌，于4°C条件下静 置6小时，5000 Xg离心25分钟取上清液，向上清液中加入硫酸铵，使硫酸铵最终浓度达到 75%并在4°C条件下静置6小时，5000 Xg离心25分钟，取沉淀；将沉淀与水混溶，装入丽 10000道尔顿的透析袋中流水透析M小时，再用去离子水透析M小时，然后将内容物真空 冷冻干燥，得到牡蛎粗蛋白粉末；所述PBS溶液是用0. 2mol/L NaH2PO4和0. 2mol/L Na2HPO4 按体积比39 61混合的pH 7. 0溶液。
4.根据权利要求3所述的血管紧张素I转换酶抑制剂的制备方法，其特征在于所述b 步骤是将牡蛎粗蛋白粉末溶于0. 05mol、pH 2. 0的磷酸缓冲液中使蛋白浓度为2. 5%，加入 胃蛋白酶，胃蛋白酶与底物蛋白的质量比为1 50，在37°C下酶解M小时；所得酶解液加 热至100°C并保持10分钟，用碱或者碱性盐调节酶解液pH为中性，5000Xg、室温离心25分 钟，经MW 10000道尔顿超滤膜过滤，透过超滤膜的组分为牡蛎可溶蛋白酶解液。
5.根据权利要求4所述的血管紧张素I转换酶抑制剂的制备方法，其特征在于所述c 步骤是取牡蛎可溶蛋白酶解液15mlLH-20柱进行层析分离，用30%的甲醇溶 液洗脱，按管数收集，20分钟/管，检测波长为观0·，收集具有血管紧张素I转换酶抑制剂 活性的组分，将所得组分在RP-HPLC上纯化，具体条件是在RP-HPLC上用Hypersil Cw柱，流 动相A液为0. 1% TFA+0%乙腈的水溶液，用前超声脱气；流动相B液为0. 1% TFA+100% 乙腈的水溶液，检测波长215nm，室温，进样体积20 μ 1，采用梯度洗脱，按时间收集；洗脱梯 度0 60min A液 100% 50%线性降低；B液0% 50%线性升高；60 80minA 液 0%;B 液 100%。
6.一种如权利要求1所述的血管紧张素I转换酶抑制剂在制备降低高血压产品中的应用。
全文摘要
本发明是以牡蛎浆液为原料，通过对牡蛎浆液酶解所产生的牡蛎蛋白酶解液的进一步分离、纯化得到其氨基酸序列为Vel Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe的新肽，实验证明是有效的血管紧张素I转换酶抑制剂，具有无毒副作用、安全性高、成本廉价、可产业化生产的等优点，可广泛应用于制备降低高血压的药品及保健品中。
文档编号C12P21/06GK102093471SQ20091022075
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月15日 优先权日2009年12月15日
发明者曲敏, 李伟, 汪秋宽, 王刚, 胡建恩, 赵前程, 陈玮, 马驰宇, 黄晓娟 申请人:大连水产学院