在膜上提取和纯化核酸的方法

专利名称：在膜上提取和纯化核酸的方法
在膜上提取和纯化核酸的方法本发明涉及使用包含胍盐和N-十二烷基-肌氨酸(NLS)的组合的裂解组合物提 取核酸的方法，其可适用于过滤在膜上的极少量的微生物。这种方法使得可以收集适于以特定方式通过杂交或者扩增而检测形式的所述微 生物的核酸。在工业和医药领域，水和空气以及使用或者废弃的工具和材料的微生物质量控制 需要符合越来越严格的标准。因此，业内人士和卫生官员需要具有其可自行支配的工具以能尽可能快地检测微 生物污染，由此可以迅速地且低成本采取补救措施。按照惯例，微生物监测是在琼脂培养基上进行。这种类型的培养便于实施，可以用 肉眼计数微生物。其还可以保存活微生物，并且如果需要，可以赢得鉴定时间以定义所存在 的不同微生物的属或种。这些鉴定检测通常包括提取微生物中包含的核酸，并且以特定方式扩增所述核 酸，所述扩增方式如本领域技术人员已知的许多种链反应技术之一(PCR 聚合酶链反应， 或者LCR:连接链反应)。然而，尽管通过核酸扩增的鉴定检验具有高水平可靠性，但是需要很长时间进行 包括微生物培养、提取其核酸以及进行PCR的步骤。为了可以肉眼观测，微生物必须培养至少24小时及有时更长时间以延缓微生物 如甲基杆菌(methylobacterium sp.)的生长，或者微生物被环境条件刺激。此外，核酸的提取不能在琼脂糖上直接进行，这意味着在提取核酸之前必须取出 微生物。在这种情况中，检测成为定性检测且不再是定量检测。近年来，基于使用固定在固体支持物上的核酸探针的杂交技术的lab-on-a-chip 装置的进展，使得可以赢得时间进行微生物鉴定步骤。然而，这些技术仍是高成本的，且未 提供完全免除核酸提取和转移步骤。在这些条件下，仍必须培养24小时以上以计数和鉴定微生物，这在需要持续监测 产品质量的工业背景中是太长的时间。为了加速检测液体或者气体介质中或者其表面上存在的微生物，本申请人 (Millipore Corporation)几年来开发了一种检测微生物的通用方法，以Milliflex Rapid 之名销售。这种方法在专利申请WO 92-00145中描述。其包括通过使液体或者气体经过膜而 将该溶液或者气体中包含的微生物保留在所述膜的表面。将所述膜表面的微生物与琼脂培 养基接触培养一段使得用肉眼无法观测的小菌落形成必需的时间。然后将形成该小菌落的 细胞裂解以释放其包含的三磷酸腺苷(ATP)。释放的ATP用作标记以通过ATP-生物发光技 术鉴别和定量活细胞。ATP作为产生化学发光反应的酶底物，由此获得光信号，然后使用合 适的视频接口装置(video interface)(例如IXD相机)检测。获得信号形成图像，使得可 以原位观测所述膜上的发生微生物的位置，与在琼脂培养基中皮氏培养皿上进行的标准计 数方法相似。这种接口装置使得也可以量化分析的液体或者气体样品中最初存在的微生物的数目。在Milliflex 系统中微生物的检测被称作是“通用的”，因为其使用ATP (三磷酸腺 苷)，这是包含于所有活细胞中的底物。这种技术使得可以迅速检测例如在工业生产线上或 者在无尘室中污染物的存在，无论微生物如何甚至以极低浓度存在，由此可以在短时间内 采取必要的去污染措施。然而，使用Milliflex 系统目前不能同时获得关于检测的微生物特性的可靠信
肩、O但是这种鉴别可用于更详细地确定污染来源以及界定解决方案。这种鉴定的主要障碍在于在Milliflex 系统中实施的ATP-生物发光检测破坏包 含的微生物。事实上，在通过生物发光检测期间，首先使用基于乙醇的溶液处理微生物，以提取 ATP分子，然后通过生物发光试剂处理。此外，在这两个步骤之间使所述膜干燥，以进行生物 发光反应。这些处理的结果是微生物被杀死，由此阻止其随后被培养以进行标准鉴定检测 (抗生素抗性、代谢标记、革兰氏反应等)。因此，根据本发明，本发明人着手鉴定通过拯救生物发光处理的微生物的核酸而 检测的微生物，以通过杂交或者通过扩增、特别是通过PCR继续进行其特异性检测。然而，核酸的扩增或者杂交技术需要纯化的DNA或者RNA样品，这些样品被充分浓 缩以可以可靠地进行希望的检测反应。在滤膜上检测的特定情况中，回收这些核酸存在许多困难，特别是由于如下事实 所致-微生物以一或多个小菌落的形式被分散在膜的表面，每个菌落包含少量微生物， 通常少于IO3个细胞；以及_干燥含有待提取的核酸的细胞，以及另外用能抑制或者降低杂交或者PCR反应 产量的制剂和盐预先处理。这些限制意味着核酸必须在膜上回收在溶液中、纯化以及浓缩。现有技术领域中有许多提取、纯化和浓缩细胞中包含的核酸的技术，这些技术因 核酸的性质即RNA或DNA而不同。大多数这些技术需要最初用裂解缓冲液处理，然后在溶液中沉淀核酸的步骤。裂 解缓冲液的目的是破坏细胞膜及溶解蛋白质，而沉淀使得可以在溶液中分离核酸与其它细 胞成分。最常用的提取RNA(比DNA更易损坏)的方法是例如已知的“苯酚_氯仿”方法。根据这种技术，将细胞首先置于与包含去污剂_蛋白酶K混合物的裂解缓冲液接 触，目的是解离细胞成分以及释放核酸。通常使用的裂解缓冲液包含作为去污剂的十二烷基硫酸钠(SDS)，其是细胞裂解 齐U，以及包含作为蛋白酶K激活剂的Sark0Syl、Tween 20或者Nonidet P40。获得的细胞裂解物中包含的核酸然后通过应用苯酚(其是强力脱蛋白质剂)和氯 仿(其是有机溶剂)的混合物而与蛋白质分离。在离心后，核酸在有机相中溶解，同时在水 相与有机相之间的界面收集蛋白质。在将水相移至另一试管中之后，用氯仿-异戊醇混合物处理核酸。这种处理的结果是消除微量的苯酚，苯酚是一种有机化合物，具有不仅是毒性产物而且还是某些酶包括 聚合酶的抑制剂的缺点。然后通过加入沉淀剂沉淀核酸，所述沉淀剂典型为-20°C的纯乙醇，体积是裂解缓 冲液的2. 5倍，或者所述沉淀剂是异丙醇，体积是0. 7倍。随后在70%乙醇中洗涤沉淀的核酸是除去盐的不可或缺的步骤。然后将沉淀物置于较低离子浓度的缓冲液中，通常是Tris-EDTA缓冲液 (10/lmM)。尽管在核酸提取中提及苯酚/氯仿方法，但是其具有包括许多步骤且使用苯酚和 氯仿的缺点，苯酚和氯仿是易挥发且毒性产物，必须小心处理。当试图提取比RNA分子更 易损坏的基因组DNA时，因此倾向于使用裂解缓冲液，所述裂解缓冲液典型包含4-6M硫氰 酸胍、IOmM EDTA,2-6% NLS 和 50mM Tris-HCI (中性 pH)(所谓的经修改的 Crude Susan 方 法)[Chirgwin，J. et al. (1979) Isolation of biologically active ribonucleic acid fromsources enriched in ribonuclease, Biochem. 18 :5294_5299]。这禾中类型的裂角军 缓冲液使得可以不用苯酚-氯仿而直接在细胞裂解物中进行核酸的沉淀[Jeanpierre， Μ. (1987)A rapid method for the purification of DNA from blood, Nucleic Acids Research 15(22) :9611]。然而，在这些条件下获得的核酸的质量以及反应的产量不恒定，特别是当较大体 积水相和细胞成分荷载时，根据微生物的性质是可变的。然后可能需要进行核酸的二次沉 淀，以获得良好质量的 DNA[De Nedjma, A. (2005) Principe de Biologie Moleculaire in Biologie Clinique, Elsevier &Masson]。某些技术使用含有硅珠的微型柱，以便于核酸的洗涤和回收步骤。然而，原理是相 同的，因为也需要在吸附相的核酸沉淀步骤。上述技术不适于制备和检测少量的核酸。事实上，如上所述，当核酸太稀释时，其 沉淀变得更随机，且存在核酸在纯化期间丧失的危险增加。因此，本发明的目的是提供一种简便的、快速且有效的方法从少量微生物中制备 核酸(DNA和RNA)，用以随后对其进行鉴定。因此，本申请揭示了一种提取和纯化基因组DNA的方法，其可用于例如过滤在膜 上的细胞，由此在溶液中使用盐酸胍和限量的NLS处理所述细胞。根据这种方法，在膜上纯 化核酸而不用继续纯化步骤，将由所述膜保留的DNA以适于通过杂交或者PCR检测的形式 回收在纯水或者缓冲的水中。令人惊奇地，本发明人在组合物中使用比在裂解组合物中通常所见更低浓度的 NLS获得最佳检测结果。特别注意到，在这个更低浓度，NLS使得可以避免在纯化步骤期间 与膜堵塞相关的问题，而且还便于在该方法的后期拯救核酸。本发明目的更特别在于通过PCR鉴定过滤在膜上的极少量微生物，直至 Milliflex 快速检测系统的ICFU检测阈值。然而，本发明可用于超出膜微生物学的特定范 围制备核酸，无论细胞类型如何，特别是用于进行杂交或者扩增反应。获得的核酸制备物可 用于例如进行PCR反应或者LAMP型等温扩增反应，或者包含RNA分子的反应如NASBA或者 TMA型扩增，应理解通过逆转录步骤可以将RNA序列转录为DNA。下图举例说明了在本申请书中描述的实施例的结果。


图1 用于通过PCR检测微生物的裂解组合物1-7的效力对比。在所有情况中，在 通过相应的裂解组合物处理细胞之后，DNA在包含于(Microcon )离心管中的纤维素膜上 纯化。在培养取样的新鲜细胞(悬浮培养的细胞)、在PVDF滤膜上取样的新鲜细胞或者在 用ATP-生物发光处理(根据Milliflex 快速检测方法)之后的PVDF膜上取样的细胞上进 行实验。对于PCR抑制对照组，将纯DNA导入裂解组合物中，然后在膜上纯化，如在其它制 备物的情况中一样。每个实验至少检测所述组合物两次。检测的细胞是大肠杆菌。PCR结 果以照片形式提供，示出扩增的再现性和强度。+ 阳性扩增；-阴性扩增；1/2 无再现性； ND 未进行；NA 在膜上阴性结果。图2 本发明的核酸提取和检测方法的结果，涉及白色念珠菌和酿酒酵母。琼脂糖 凝胶示出通过PCR扩增的良好再现性。孔是从左向右编号。1 阳性PCR对照(纯白色念 珠菌DNA) ；2-6 (凝胶上部)或者2-5 (凝胶下部)检测的不同样品；7 (第一个凝胶)或者 6(第二个凝胶)1000bp plus梯。使用通用的引物进行PCR反应，使得可以检测单细胞真 菌。在所述膜的合成图像的中心，示出对每个PCR检测样品进行的通过ATP-生物发光通用 检测的结果。图3 本发明的核酸提取和检测方法的检测结果，其涉及革兰氏阳性菌(A)金黄色 葡萄球菌(S. aureus)、表皮葡萄球菌(S.印idermidis)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和革 兰氏阴性菌(B)铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)、大肠杆菌、肠道沙门氏菌(S. enterica)的 基因组DNA。琼脂糖凝胶的孔从左至右编号。1:阳性PCR对照；2-4:使用革兰氏阳性菌或 者革兰氏阴性菌通用的引物对3个独立样品进行PCR ;5:100pb plus梯。在所述膜的合成 图像的中心，示出对每个PCR检测样品进行的通过ATP-生物发光技术的通用检测结果。图4 本发明的核酸提取和检测方法的检测结果，其涉及包含大肠杆菌与表皮葡 萄球菌的混合物的细胞群的基因组DNA。A 在Milliflex 方法之后通过ATP-生物发光技 术在三个细胞群中计数细胞混合物。B 在琼脂糖凝胶上观测的根据本发明通过PCR扩增 检测。1 阳性对照；2-4 对于三个细胞群的每一群进行的PCR ；5 阴性对照；6 IOOpb plus 梯。第一列使用通用引物对大肠杆菌和表皮葡萄球菌进行的PCR;第二列使用特异性引 物对大肠杆菌进行的PCR ；第三列使用特异性引物对表皮葡萄球菌进行的PCR ；第四列 使用特异性引物对枯草芽孢杆菌进行的PCR。图5 通过ATP-生物发光技术(Mi 11 if lex Rapid )及随后通过PCR和本发明的 微测序进行检测。A:13CFU的表皮葡萄球菌和9CFU的枯草芽孢杆菌的计数。B 在对纯化 自与在A中的膜上检测的那些细胞相同的表皮葡萄球菌和枯草芽孢杆菌细胞的基因组DNA 的提取物进行PCR扩增的产物的凝胶上进行观测。C 在B中观测的扩增产物上进行的微测
序结果。图6 关于本发明的PCR检测单细胞真菌和细菌的灵敏性检测结果。提取相应于 ICFU的基因组DNA，首先通过生物发光检测，然后根据本发明的方法通过PCR检测。A 使用 特异于细菌的通用引物对细菌样品(大肠杆菌)进行PCR的获得的阳性结果。B:对3个不 同的单细胞真菌样品(酿酒酵母)进行PCR获得的阳性结果。图7 通过ATP生物发光技术和PCR检测革兰氏阳性菌痤疮丙酸杆菌(P. acnes)。 Α:在三个样品中通过ATP生物发光技术的检测结果，使得可以评定在5和6CFU检测的细菌 数目。B 使用通过本发明的提取方法分别提取自这三个样品的核酸制备物获得的PCR阳性
7结果。 图8 得自通过TMA扩增提取自铜绿假单胞菌的两个核制备物中包含的RNA的RNA 扩增片段的实时累积图。所述制备物分别相应于大约30和300CFU的细菌。本发明的目的因此是提供一种在膜上提取和检测核酸的方法，使得可以鉴别在液 体或者气体介质中或者甚至在表面上低浓度存在的微生物。本发明的方法更特别涉及检测移至膜上的微生物，通过将液体或者气体样品通过 所述膜过滤或者通过将所述膜与能含有或者包含微生物的介质或者表面接触。所述方法更 特别针对解决鉴别分散在膜表面上的微生物的问题。本发明的方法特别适于鉴别预先在膜 上检测的微生物，例如使用非特异性方法如在Milliflex快速检测方法中使用的ATP生物 发光技术。本发明的方法包括提取和纯化较少量的细胞(活的或者死的细胞)的核酸。除 了在膜上检测微生物的特定情况之外，其可用于从中以快速和有效方式提取核酸的任何细 胞。这种方法可特别用于获得适于进行为鉴定其必需的杂交或者扩增反应形式的RNA和/ 或DNA核酸。这种方法包括如下步骤，其中a)将细胞用盐酸胍和N-十二烷基-肌氨酸(NLS)在溶液中处理，以使细胞裂解以 及释放其中包含的核酸；b)从通过将所述裂解物经过膜过滤获得的细胞裂解物中分离核酸；c)将由所述膜保留的核酸回收在水溶液或者弱离子化水溶液中。如本文所述，“细胞”是指小的生物实体，其包含由膜划界的细胞质以及含有核酸 形式的遗传物质。在本发明中，“微生物”是指具有显微粒径的细胞，即大小在0. 5-5微米之间，具有 代谢和繁殖潜力，如藻类、单细胞真菌、原生动物、霉菌、细菌以及配子。所述微生物更特别是如下菌属的革兰氏阳性或者革兰氏阴性致病菌假单胞菌 属，埃希氏菌属，军团菌属，沙门氏菌属，利斯特氏杆菌属，杆菌属，链球菌属，弧菌属，耶尔 森氏菌属，葡萄球菌属，分支杆菌属，志贺氏菌属，梭菌属，弯曲杆菌属，或者气单胞菌属；贾 第虫属、内阿米巴属、隐孢子虫属、圆孢子虫病属原生动物；支原体(Mycoplasma)和解脲支 原体属支原体，酵母属、曲霉属、念珠菌属或者青霉属真菌。在步骤a)中通过盐酸胍和N-十二烷基_肌氨酸处理细胞可以用一种化合物及然 后再用另一化合物进行，或者甚至同时处理。根据本发明一优选方面，所述处理是使用裂解 组合物进行，所述裂解组合物包含的NLS浓度是所述组合物总重量的0. 1-1 %。所述盐酸胍是用作裂解剂的一种离液剂。其具有使蛋白质特别是膜蛋白质变性以 及产生渗透压休克(osmotic shock)的双重功效。其通常使用的浓度是每升裂解组合物 3_8mo 1 e,优选 4_6mo 1 e。N-十二烷基-肌氨酸(Sarkosyl NL-97或者NLS)是N-甲基_N_ (1_氧代十二烷 基(oxododecyl))甘氨酸的钠盐(C15H28NO3Na)15这个分子是与蛋白酶K组合在裂解缓冲液 中常用的去污剂以溶解蛋白质、特别是膜蛋白质，其浓度为每升几摩尔。根据本发明，NLS不用作或者至少不主要用作裂解剂。事实上，根据本发明，优选 NLS以裂解组合物最终重量的0. 1-1%的浓度使用，更优选0. 1-0.5%，即在其中细胞裂解 被限制的浓度。
如在本发明申请书的实施例中所示(特别见图1的结果)，加入在这个浓度的NLS 似的可以改善提取和纯化产量，特别是在上述方法的步骤b)和c)中，因此随后可以使用获 得核酸制备物进行微生物的鉴定。NLS是一种阴离子去污剂，其使得蛋白质中几乎所有非共 价相互作用变性，且趋于使该蛋白质溶解。不受理论所限，本发明人认为NLS在细胞裂解物 通过膜过滤期间以及在随后的DNA漂洗时促进DNA和蛋白质的分离。如本文所用，“细胞裂解物”是指使用裂解组合物完成步骤a)的处理后在溶液中裂 解的细胞。优选地，本发明的裂解组合物还包含0. 1-lmmol/l的乙二胺四乙酸(EDTA)。尽 管认为EDTA是能抑制许多酶、特别是PCR反应中的聚合酶活性的物质，但是在本发明人进 行的实验中发现存在EDTA使得不仅可以改善革兰氏阴性微生物的裂解，也可以改善革兰 氏阳性微生物的裂解。原则上，EDTA通过螯合二价离子而可以使细菌细胞膜不稳定。在本申请书中，“膜”是指具有两个表面的一种合成的支持物，其，其孔径具有已知 的平均直径。这种膜具有高表面/体积比率。所述膜的厚度通常是恒定的，在90-200微米 之间。这种膜可以是单层或者多层的。其通常由选自如下的一或多种材料组成聚四氟 乙烯，聚偏二氟乙烯(PVDF)，聚碳酸酯，聚酰胺，聚酯，聚醚砜，醋酸纤维素和硝化纤维。在本发明的DNA提取方法的步骤b)中指定的膜通常是称作的超滤膜的由纤维 素制成的膜，即膜的分子量标称限制(nominal limit)是3，000-100，000道尔顿，优选 50，000-100，000道尔顿。举例的这种类型的膜是与microcon 离心管(Millipore公司) 一起提供的膜。根据本发明，在负压或者正压的作用下通过所述膜从细胞裂解物中分离核酸。例 如，可以通过使用真空泵使所述膜的一面处于低压而使所述裂解物通过该膜。这可以在离 心的作用下进行，即对在膜表面的细胞裂解物应用离心力。所述离心作用通常通过将所述 膜置于离心机中放置的支持物如离心管上而获得。本发明另外提供了在所述方法的步骤b)与C)之间，可以进行洗涤由所述膜保留 的核酸的步骤，使用洗涤溶液如水或者弱离子化水溶液洗涤。所述洗涤溶液在经过所述膜 后被除去。在步骤C)中，可以与在步骤b)中所用或者甚至上述另外的洗涤步骤相反方向，使 所述水或者弱离子化水溶液通过该膜。当通过应用负压或者正压或者甚至通过离心而便于 步骤C)进行时，需要将其上固定了所述膜的支持物以与其最初表面相反方向放置，并且在 所述膜的表面上滴一滴弱离子化溶液。通过压力或者离心发挥的压力使得水通过所述膜孔，并且从膜中释放核酸。然后 将所述核酸以水滴滴入收集在离心管底部。在这种情况中，弱离子化溶液是指这样的溶液，其每升盐浓度低于10_2mOle/L，更 优选低于 5. l(T3mole/L。更具体地，本发明涉及一种在液体或者气体介质中检测一或多种细胞的方法，特 征在于其包括如下步骤a)将所述液体或者气体介质样品通过膜过滤，以使所述样品中含有的细胞保留在 所述膜上；b)将在步骤a)中的细胞用盐酸胍和N-十二烷基-肌氨酸(NLS)在溶液中处理，
9获得含有从所述细胞中释放的核酸的细胞裂解物；c)将在步骤b)中获得的细胞裂解物的核酸通过使所述裂解物通过所述膜或者另 一膜过滤而分离；d)将在步骤C)中由所述膜保留的核酸回收在水或者弱离子化溶液中；e)检测在步骤d)中回收的核酸。所述检测方法的步骤b)至d)优选相应于本发明的核酸提取和纯化方法，即在上 述方法的步骤a)至c)进行的那些步骤。所述检测方法的目的是计数液体介质如水或者气体介质如空气中存在的细胞、更 特别是微生物，同时尽可能地确定其特性(家族、种属、物种等)。液体或者气体介质是指能 通过施加压力差而被过滤通过膜的任何液体，所述膜孔的平均直径通常为0. 1-1. 5微米， 优选0. 15-0. 8微米，更优选0.2-0. 6微米。这种液体可由组成生产无菌产物一部分的纯溶 液组成，也可以是复合溶液(饮用水、血清、尿液、羊水等)，或者也可以是气体混合物如空 气。本发明的方法可用于诊断领域，以分析源自动物或者患者的样品。在所述检测方 法的步骤a)中，细胞转移通常在所谓的滤膜上进行，即可以使液体或者气体介质透过的 膜，然而其平均孔径使得保留至少80%、优选90%的寻求的细胞或者微生物。优选地，这种 膜主要由PVDF(聚偏氟乙烯)、纤维素或者聚苯砜组成。更优选地，其是由PVDF制成的、由 Millipore公司以Milliflex商标销售的滤膜，以及提及的MXHVWP124或者RMHVMFX24。根据本发明的一个优选方面，用于在步骤C)中分离裂解组合物的核酸的膜与在 步骤a)中使用的膜不同。在步骤a)中使用的膜可另外置于与营养介质接触，由此在步骤 a)与b)之间由所述膜保留的细胞或者微生物可以在其表面上生长。所述营养介质通常是 琼脂糖介质，其营养成分通过毛细管作用到达细胞。在所述膜的表面上繁殖时，细胞形成小 菌落。本发明还提供了 Milliflex技术，这是可以计数膜上微生物的检测步骤，其可以 在步骤b)中细胞裂解之前提前实施，例如通过在步骤a)与b)之间从细胞中提取ATP以及 使该ATP与包含萤光素和萤光素酶的生物发光试剂反应进行。根据本发明，提取的核酸由RNA和DNA组成，特别是由信使RNA和核糖体RNA以及 基因组DNA组成。本发明的方法具有能使用根据本发明的方法从细胞中提取的RNA以及 DNA的优势。在步骤e)中检测核酸优选通过使用能被特异性标记的引物或者探针特异性杂交 在步骤d)中回收的所有或者部分核酸进行。根据本发明，探针是指能识别并组合上述核酸类别之一的大分子，使得其可以标记。根据本发明，引物是指能识别并组合上述核酸类别之一的大分子，以起始所述核 酸的扩增反应。使用的探针或者引物通常是能与提取的核酸中存在的DNA或者RNA序列以一定 程度的特异性杂交的大分子。本发明展望了本领域技术人员已知的可以与核酸特异性 杂交任何类型的探针或者引物，所述核酸例如是简单的寡核苷酸，2' 0-甲基-RNA型寡 核苷酸，PNA型探针或者引物(由嘌呤和嘧啶碱基取代的多肽链组成的探针)[NielsenP. E. et al. Science(1991)254 :1497-1500]或者 LNA(包含一或多个 2' -0-4' -C-亚甲 基- β -D-核糖呋喃糖基(ribofuranosyl)单体的寡核苷酸)，如专利EP 1013661所述。扩增反应是指可以从所述核酸中合成大分子的酶反应，其存在可以通过标准方法 检测，例如通过在琼脂糖凝胶或者丙烯酰胺上层析、显微测序或者荧光性。本发明的方法因此可以在步骤e)中包括扩增在步骤d)中回收的所有或者部分核 酸的步骤，通过本领域技术人员已知的技术之一进行，如PCR(聚合酶链反应)，或者根据本 领域技术人员熟知的技术进行等温扩增反应，例如NASB[Compton，J.，Nature (1991) 350 91-92]、TMA 或者 LAMP 类型[Notomi T. ,Nucleic Acids Research (2000), 28 (12) :e63]扩
+飽
+曰ο这种扩增通过增加可用于检测目的的核酸的数量而可用于优化微生物的检测。如 果这个扩增步骤是高度特异性的，其还可以高选择性鉴别微生物。根据本发明的方法获得核酸制备物特别适于通过扩增检测核酸。本发明还提供了提取核酸的试剂盒，特征在于其包含膜，优选由纤维素或者 PVDF制成的膜；以及如前文所述裂解组合物。此外，这种试剂盒可有利地包含一或多种特 异性探针或者引物，以对提取的核酸进行检测，特别是通过杂交或者通过PCR检测。任选 地，这种试剂盒还可包含另一种膜以过滤液体或者气体介质。这种试剂盒使得可以实施本 发明的方法。这种试剂盒可特别用于实施DNA的提取和纯化方法，以及随后在先前限定的条件 下鉴别所述细胞或者微生物。如下实施例用于补充本发明的描述，无任何限制本发明之意义。 实施例材料和方法检测的微生物在后文描述的检测检验中使用的微生物得自美国典型微生物保藏中心ATCC。菌株 的参考编号在表1中提供。表1:使用的微生物
权利要求
裂解组合物，特征在于其包含盐酸胍和N 十二烷基 肌氨酸(NLS)，其中包含的所述NLS浓度相对于所述组合物的总重量在0.1 1％之间。
2.权利要求1的裂解组合物，特征在于包含的所述盐酸胍浓度在3-8mol/l之间。
3.权利要求1或2的裂解组合物，特征在于其还包含EDTA。
4.权利要求3的裂解组合物，特征在于所述组合物包含的EDTA的浓度在0.1-lmmol/l 之间。
5.权利要求1-4任一项的裂解组合物，特征在于其以溶液形式存在。
6.提取一或多种细胞的核酸的方法，特征在于其包括如下步骤a)用盐酸胍和N-十二烷基-肌氨酸(NLS)溶液处理所述细胞，使细胞裂解及释放其包 含的核酸；b)经过膜过滤步骤a)中获得的细胞裂解物而从所述裂解物中分离核酸；c)将通过所述膜保留的核酸回收在水溶液或者弱离子化水溶液中。
7.权利要求6的方法，特征在于所述溶液中使用的NLS的浓度在0.1-1%之间。
8.权利要求6或7的方法，特征在于盐酸胍和NLS同时用于权利要求5的裂解组合物中。
9.权利要求6-8任一项的方法，特征在于步骤b)中使用的从细胞裂解物中分离核酸的膜是纤维素膜。
10.权利要求6-9任一项的方法，特征在于步骤b)中使用的膜的分子量标称限制在 3，000-100, 000道尔顿之间，优选在50，000-100, 000道尔顿之间。
11.权利要求6-10任一项的方法，特征在于在负压或者正压的作用下通过膜从细胞裂 解物中进行核酸分离。
12.权利要求6-10任一项的方法，特征在于在离心作用下通过膜从细胞裂解物中进行 核酸分离。
13.权利要求6-12任一项的方法，特征在于在步骤b)和c)之间进一步包括使用洗涤 溶液如水或者弱离子化水溶液洗涤由所述膜保留的核酸的步骤，这个洗涤溶液在经过所述 膜之后被清除。
14.权利要求6-13任一项的方法，特征在于在步骤c)中，通过使所述水或者弱离子化 水溶液以与步骤b)中所用的方向相反的方向经过所述膜而回收所述核酸，优选在负压或 正压或者离心作用下进行。
15.检测液体或者气体介质中一或多种细胞的方法，特征在于其包括如下步骤a)将所述液体或者气体介质样品通过膜过滤以使所述样品中含有的细胞保留在膜上；b)将在步骤a)中保留的细胞用盐酸胍和N-十二烷基-肌氨酸(NLS)溶液处理，以获 得含有从所述细胞中释放的核酸的细胞裂解物；c)通过所述膜或者通过另一膜过滤所述裂解物，从而从在步骤b)中获得的细胞裂解 物中分离核酸；d)将在步骤c)中由所述膜保留的核酸回收在水或者弱离子化水溶液中；e)检测在步骤d)中回收的核酸。
16.权利要求15的方法，特征在于使用探针或者特异性标记的引物通过与在步骤d)中2回收的所有或者部分核酸进行特异性杂交而进行步骤e)中的核酸检测。
17.权利要求15或16的方法，特征在于步骤e)中核酸的检测包括扩增在步骤d)中回 收的所有或者部分核酸的步骤。
18.权利要求17的方法，特征在于所述扩增步骤包括聚合酶链反应(PCR)。
19.权利要求18的方法，特征在于所述扩增步骤包括等温扩增，如LAMP、NASBA或者 TMA型扩增。
20.权利要求15-19任一项的方法，特征在于步骤e)中的核酸检测包括RNA逆转录为 DNA的步骤。
21.权利要求15-20任一项的方法，特征在于在步骤c)中用于分离裂解组合物的核酸 的膜与步骤a)中使用的膜不同。
22.权利要求15-21任一项的方法，特征在于根据权利要求6-14任一项的方法的步骤 a)至c)进行步骤b)至d)。
23.权利要求15-22任一项的方法，特征在于步骤a)中使用的膜置于与营养介质接触， 由此在步骤a)和b)之间微生物可以在所述膜的表面上生长。
24.权利要求15-23任一项的方法，特征在于通过使提取自微生物的ATP与生物发光试 剂反应在步骤a)和b)之间进行检测步骤，所述检测步骤使得可以计数微生物，所述生物发 光试剂如包含萤光素和萤光素酶的试剂。
25.提取核酸的试剂盒，特征在于其包含-过滤膜，-权利要求1-5任一项的裂解组合物。
26.检测微生物的试剂盒，特征在于其包含-过滤膜，-权利要求1-5任一项的裂解组合物，-用于通过杂交或者通过PCR检测提取的核酸的一或多种特异性引物。
全文摘要
本发明涉及在膜上提取和检测核酸的方法，使得可以鉴别液体或者气体介质中低浓度存在的微生物，本发明还涉及一种新的裂解组合物，其包含盐酸胍以及0.1-1％的N-十二烷基-肌氨酸(NLS)，使得可以实施这种方法。
文档编号C12N15/10GK101978058SQ200980110269
公开日2011年2月16日 申请日期2009年1月19日 优先权日2008年1月21日
发明者F·马克, R·伊萨克 申请人:米利波尔公司