专利名称：*蛋白胨部分的制作方法
脉蛋白胨部分本发明一般涉及包含脉蛋白胨部分(PPf)的组合物。特别地，本发明涉及包含 β -乳球蛋白缺乏且富含PPf的去矿质蛋白部分的提取物的生产方法及这些提取物的用 途。尽管起泡(foaming)是乳蛋白(milk protein)的典型特征，但是已知奶在去除 酪蛋白、α-乳清蛋白和β-乳球蛋白后仍具有相当大的表面活性(R. Aschaffenburg， J. Dairy Res. 14 (1945)，316-328)。剩余部分包括脉蛋白胨部分(PPf)，其包含大量表面活 性组分。PPf表示特征不明显的蛋白质化合物的非均质混合物，其由Girardet等人， J. Dairy Res. 63 (1996)，333-350在该主题综述中所概述，该文献通过引用并入本文。描述了 PPf中的多种蛋白，如β-乳球蛋白、α-乳清蛋白和β-酪蛋白与Cisl-酪 蛋白以及血清白蛋白。两种糖蛋白PP 16k和pp20k，对大肠杆菌的肠毒素具有结合亲合力， 分别被鉴定为α-乳清蛋白和β-乳球蛋白的糖基化形式。骨桥蛋白-酸性60kDa磷糖蛋 白-和88kDa乳铁蛋白是由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测出的较 大蛋白质。奶样品中主要PPf组分(被命名为组分3、5和8(PP3、PP5、PP8))的量与其纤溶 酶活性相关。以下组分是纤溶酶活性对β-酪蛋白的结果PP5或i3-CN-5P f (1-105/7 ； β-酪蛋白的N端肽1-105和1-107)、PP8-fast或β-CN-4P f (1-28 ； β -酪蛋白的N端肽 1-28)。组分 PP8-slow 和 β-CN-IPf (29-105/7 ； β-酪蛋白的N 端肽29-105和 29-107)是 单独的实体，通过电泳迁移率难以区分。ΡΡ3组分的非均质分子结构通过以下观察来说明。ΡΡ3磷糖蛋白形成大小为 163kDa(通过超速离心法在ρΗ 8. 6测定)的复合物，使用5Μ-胍可以将该复合物解离成表 观MW为40kDa的亚单元。SDS-PAGE在二硫键还原剂2-巯基乙醇存在下进行时，显示存在 两种主要糖蛋白组分24. 6-33. 4kDa和17-20. QkDa0实际上总是观察到并发现表观分子 量为28kDa和ISkDa的重要糖蛋白与IlkDa的带有关。当通过二维聚丙烯酰胺凝胶电泳 (2D-PAGE)拆分时，它们分别表现为4个点和2个点，表观等电点范围为ρΗ 4. 9至6. 1。该 复合物由分子量为28kDa、18kDa和IlkDa的糖蛋白组成，与分子量为约7kDa的非糖基化多 肽相关联。通过凝集素亲和层析法用伴刀豆球蛋白A(ConA)进行分离，显示IlkDaUSkDa 和28kDa糖蛋白的复合物行为。IlkDa糖蛋白不与ConA结合，而较大的18kDa和28kDa形 式在非结合部分(称为糖蛋白PPl8_*pp28_)与结合部分(称为糖蛋白ppl8+和pp28+)之 间分布。在本领域中，PPf从脱脂乳获得。但是，从脱脂乳中分离PPf包括热处理(例如在90°C加热IOmin)以及将奶酸化 以通过沉淀/离心去除酪蛋白和变性乳清蛋白。这种常规方法非常昂贵且不适用于工业规 模。因此，本发明的目的是为本领域提供一种获得PPf的方法，该方法可以在工业上 应用。本发明的另一个目的是为本领域提供一种富含PPf的提取物，该提取物显示与从奶中分离的PPf不同的蛋白组成，且呈现优良的性质和额外的益处。本发明人惊讶地观察到这些目的可以通过各独立权利要求的主题来实现。本发明人发现，如果用去矿质蛋白部分、例如去矿质球状蛋白部分、特别是用与脱 脂乳相对的乳清蛋白浓缩物(WPC)或乳清蛋白分离物(WPI)生产富含PPf的提取物，那么 应用本发明的方法时将实现本发明的目的。非常具体的本发明方法使得可以生产具有特别有益性质的提取物。所得提取物例如是热稳定的，并且含有酸溶性和酸不溶性蛋白。此外，乳清是便宜的原料，通常是例如乳酪生产的废产物。制备乳酪的方法需要加 入粗制凝乳酶_蛋白水解酶，这种酶使奶凝固，使其分离成凝乳(未来的乳酪)和可溶的乳 清部分。相比之下，奶是昂贵的原料。而且，因为WPI几乎是不含脂肪的，所以根据我们的发明在生产PPf的过程中，不 需要去除脂肪步骤，简化了方法并且进一步使PPf免遭污染。因此，本发明的一个实施方案是提取物的生产方法，其包括以下步骤-将去矿质的含水天然蛋白分散液的pH调节至约5.6至8. 4或约3. 5至5. 0，-将含水天然蛋白分散液加热至约70至95°C达约10秒至60分钟，-在加热后将至少一部分直径至少IOOnm的所形成的固体大分子量凝聚物从含水 蛋白分散液中去除，以及-收集分散液的剩余液体部分。所得提取物包含β -乳球蛋白缺乏且富含PPf的蛋白部分。所得提取物也被去矿 质。对本发明来说，“去矿质的(Demineralised)”意指与甜或酸乳清中任一种相比， 矿质含量减少至少25%，优选至少50%，更优选至少75%。甜或酸乳清的干物质平均含有 8. 8%矿质，包括 0. 9%钙、0. 8%钠、2. 2%钾、0. 镁、0. 7%磷和 2. 0%氯。在本发明的上下文中，“ β -乳球蛋白缺乏”意指与β "乳球蛋白相对于天然球状 蛋白溶液中蛋白总重量的重量含量相比，乳球蛋白相对于提取物中蛋白质总重量的重 量含量为至多70%，优选至多50%，进一步更优选至多20%。因此，β-乳球蛋白缺乏的提取物包含至多70重量％、优选至多50重量％、进一 步更优选至多20重量％的存在于天然球状蛋白溶液中的β _乳球蛋白的量。“富含PPf”意指与PPf相对于天然球状蛋白分散液中蛋白总重量的重量含量相 比，PPf相对于提取物中蛋白总重量的重量含量增加至少2倍，优选至少5倍，进一步更优 选至少10倍。本发明的提取物还可以富含α-乳清蛋白。富含α-乳清蛋白意指与α -乳清蛋 白相对于初始天然球状蛋白分散液中蛋白总重量的重量含量相比，α-乳清蛋白相对于提 取物中蛋白总重量的重量含量增加至少1. 2倍，优选至少1. 5倍，进一步更优选至少2倍。本发明的提取物优选用去矿质球状蛋白分散液制备，特别用乳清制备。去矿质蛋 白部分优选为去矿质球状蛋白部分，特别是乳清蛋白部分。在本发明的一个实施方案中，去矿质的含水天然蛋白分散液为去矿质的乳清或去 矿质的乳清蛋白部分。
一般而言，所形成的直径至少IOOnm的固体大分子量凝聚物可以在加热后通过任 何本领域已知的方法从含水乳清蛋白分散液中去除。但是，大分子量凝聚物的去除可以优 选通过沉降、离心、过滤、微量过滤或这些方法的组合进行。这种去除步骤可以伴随另外的 pH调节。沉降具有下述优点所需实验装置最小且其可以在最低能量输入下进行。离心是快速方法，这种方法不管怎样都包括能量输入。连续离心是已经用于工厂 的方法，例如用于白乳酪制备。过滤和微量过滤可广泛应用于大规模生产，在去除大分子量凝集物中是非常值得 信赖的。通过将这些方法中的数种组合，则可以组合它们各自的优点。例如，通过应用最后步骤的微量过滤方法，可以实现基本上完全去除直径至少 IOOnm的大分子量凝聚物。在加热后，从含水乳清蛋白分散液中去除优选至少90%、更优选95%、最优选至 少99%且最理想100%的直径至少IOOnm的固体大分子量凝聚物。本发明的方法还可进一步包括超滤和/或蒸发步骤。超滤是利用液体静压力来迫使液体通过半渗透性膜的膜过滤技术。悬浮固体和高 分子量溶质被拦截，而水和低分子量溶质跨过膜。在工业和研究中使用该分离方法来纯化 和浓缩含有大分子量分子(IO3至IO6Da)、尤其是蛋白质的溶液。超滤具有以下优点在工 业环境中广为接受，允许有效且同时温和地分离大分子量蛋白质，避免应力诱导的蛋白质 变性。蒸发是温和的方法，其允许浓缩蛋白溶液。蒸发可以例如通过加热来触发，例如加 热至至少40°C或优选至少60°C。例如，可以将包含PPf的组合物干燥以使水含量降至基 于总组合物重量以重量计10%以下，优选以重量计5%以下，进一步更优选以重量计2%以 下。该干燥步骤具有以下优点所得的富含PPf的提取物可以以高浓度贮存，使组合物的 重量减少同时保持其全部活性。通过蒸发而提供的低水活性也确保了产物具有较高的稳定 性。在本发明的方法中，优选将含水天然乳清蛋白分散液加热约15分钟至约85°C。优 选将PH调节至约3. 5至5. 0，或约5. 6至6. 4，优选约5. 8至6. 0，或约7. 5至8. 4，优选约 7. 6至8. 0，或约6. 4至7. 4，优选约6. 6至7. 2。在获得本发明的广泛实验的过程中，本发明人令人惊讶地注意到，当在热处理之 前将PH调节至非常精确的pH值(士 0. IpH单位)时，获得球形颗粒的乳清蛋白凝聚物，其 显示直径小于1 μ m。发现最佳pH值取决于原料例如WPI的浓度和组成。这种方法具有在 缺乏任何机械应力例如剪切下产生乳清蛋白颗粒的优点。所得微粒提供以下优点容易从 本发明的含PPf提取物中去除形成这些颗粒的化合物。本发现表明，pH和离子强度是所示方法的两个重要因素。因此，经广泛透析的样品 极其缺乏游离阳离子如Ca++、K+、Na+、Mg++，该样品在应用所述的热处理之后易于在低于5. 4 的PH产生凝乳，在高于6. 8的pH产生可溶的乳清蛋白凝聚物。因此，仅有相当窄的pH值 范围提供PPf提取物制备所需的固体乳清蛋白颗粒类型。类似的乳清蛋白颗粒通过使用对 称位于乳清的等电PH之下的pH值来制备，即3. 5至5. 0。
如果就低浓度(对于IOOg初始乳清蛋白粉末，低于0.2g) 二价阳离子而言将pH 调节至5. 6至6. 4、更优选5. 8至6. 0的pH范围，则获得带负电荷的颗粒。根据乳清蛋白源 (例如WPC或WPI)的矿质含量，可以增加pH到8. 4。特别地，可以将pH调节至7. 5至8. 4， 优选7. 6至8. 0，以在大量游离矿质存在下获得带负电荷的颗粒。可以将pH调节至6. 4至 7. 4，优选6. 6至7. 2，以在适当浓度的游离矿质存在下获得带负电荷的颗粒。当然，颗粒电荷可用作从本发明含有PPf的乳清提取物中分离这些颗粒的工具。一般通过加入酸来调节pH，所述酸优选为食品级的，例如盐酸、磷酸、乙酸、柠檬 酸、葡糖酸或乳酸。当矿质含量较高时，一般通过加入碱性溶液来调节PH，所述碱性溶液优 选为食品级的，例如氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵。就本发明的方法而言，优选基本上不含盐的含水天然乳清蛋白分散液。“基本上无 盐的”意指对于约4重量％的蛋白浓度而言，盐含量为lg/L或更低。例如，含水乳清蛋白溶 液可以含有少于2. 5重量％、更优选少于2重量％的其总干物质为二价阳离子。天然蛋白、优选天然球状蛋白、进一步更优选乳清蛋白存在于含水天然蛋白分散 液中，其量基于溶液总重量以重量计约0. 至12%、优选约0. 1 %至8%、更优选约0.2% 至7%、进一步更优选约1%至5%。含水乳清蛋白分散液可以包含来自牛或水牛、或绵羊或山羊、或马、或骆驼来源或 其混合物的乳清。本发明的一个实施方案是包含由本发明方法可得的PPf、特别是乳清PPf的组合 物。由本发明方法可得的乳清PPf不同于现有技术中可用的PPf，特别是那些从奶中 可得的PPf，因为在本发明中乳清用作原料且使用特定的方法。由本发明方法可得的乳清PPf具有如下总氨基酸组成百分比的氨基酸组成约 6-9 % ASP、约 4-7 % THR、约 4-7 % SER、约 22-25 % GLU、约 9-12 % PRO、约 0-3 % GLY、约 1. 5-4. 5% ALA、约 4-7% VAL、约 0-2% CYS、约 1-4% MET、约 4-7% ILE、约 7. 5-10. 5% LEU、 约 0-3% TYR、约 6. 7-9. 7% LYS、约 1. 5-4. 5% HIS、约 1-4% ARG。该组成不同于通过常规方法可得的典型的PPf组成。在表1中，提供了根据常规 方法(样品1)和乳清PPf (本发明，样品2)的典型PPf-氨基酸谱，并可以进行比较。样品1应用如下常规方法从相同WPI制备大体上，常规PPf 根据由 Paquet, D. Nejjar, Y. &Linden，G. (1988)；“从奶穌蛋白 胨中分离的疏水蛋白部分的研究”，Journal of Dairy Science，71，1464-1471提出的方法 制备。使用Prolacta 90 作为原料。将 Prolacta 90 (428g)在 5L Milli-Q 级 H2O 中重 建。测量该溶液的PH为6. 43，然后通过加入约15mL IN NaOH将pH调节至7. 00。将溶液 体积调至6L(终蛋白浓度为6% (w/w))并平等地分配至6个IL瓶中，将瓶在设为93°C的 水浴中放置30min，以使蛋白质变性。孵育20min之后使瓶内温度达到90°C。在孵育结束 时，将瓶放置在冰浴中，冷却至20°C。通过将pH调节至4. 6，完成蛋白质化合物的等电沉 淀。在实践中，将3个IL瓶的内容物混合(pH 7. 17)，用约88mL IN HCl将pH调节至4. 6。 同样地处理其它3个IL瓶。将所得两组酸化溶液混合，在4°C贮存18小时，平等地分配至 6个IL塑料瓶中。将瓶离心(在6°C进行60min，5000rpm/7200g，配备有H 6000A转子的Sorval RC3C Plus)之后，回收含有PPf的上清液。然后在半饱和(313g/L)下于2小时内 完成PPf的硫酸铵沉淀。离心(在6°C进行60min，5000rpm,使用Sorval RC3CPlus)之后 回收沉淀，混合，重新分散于350mL 1^11^级吐0中。使用截留MW为1000的Spectrapor 膜管(Spectrum Laboratories公司)、用22LMilli_Q级H2O对混浊的悬液/溶液进行透 析4次。透析之后，对含PPf的提取物进行离心(在6°C进行60min，5000rpm)，过滤上清液 (0. 22 μ m 过滤器，来自 Millipore 的 GP Stericup Express plus )，冷冻干燥。由 360g 总乳清蛋白载荷，PPf的产量为6g(l. 6% )。例如，提供两种下述标准来区分这两种PPf 氨基酸谱(表1)和由2D-PAGE测定 的蛋白质谱(
图1和2)。表1 常规PPf (样品1)和乳清蛋白PPf (样品2)的氨基酸组成，表示为g每种氨 基酸/IOOg粉末，或总氨基酸组成的百分比。
权利要求
富含蛋白胨部分(PPf)的提取物的生产方法，其包括以下步骤 将去矿质的含水天然蛋白分散液的pH调节至约5.6至8.4或约3.5至5.0， 将所述含水天然蛋白分散液加热至约70 95℃达约10秒至60分钟， 在加热后将至少一部分直径为至少100nm的所形成的固体大分子量凝聚物从所述含水蛋白分散液中去除，以及 收集所述分散液的剩余液体部分。FPA00001229444600011.tif
2.根据权利要求1的方法，其中所述去矿质的含水天然蛋白分散液是去矿质的乳清蛋 白部分。
3.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在加热后将至少90%、优选95%、最优选 至少99%的直径为至少IOOnm的固体大分子量凝聚物从所述含水蛋白分散液中去除。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述pH被调节至约3.5至5. 0， 或约5. 6至6. 4，优选约5. 8至6. 0，或约7. 5至8. 4，优选约7. 6至8. 0，或 约6. 4至7. 4，优选约6. 6至7. 2。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述含水天然蛋白分散液基本上不含盐。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中蛋白质存在于含水蛋白分散液中的量为基 于分散液总重以重量计约0. 至12%、优选约0. 至8%、更优选约0.2%至7%、进一 步更优选约1%至5%。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述含水蛋白分散液包含少于以重量计 2. 5%、更优选少于以重量计2%的其总干物质为二价阳离子。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中将所述分散液的剩余液体部分干燥以使水 含量降至基于总组合物重量以重量计10%以下，优选5%以下，进一步更优选2%以下。
9.包含乳清PPf的组合物，所述乳清PPf可根据权利要求1-8中任一项的方法得到。
10.根据权利要求9的组合物，其具有如下总氨基酸组成百分比的氨基酸组成约 6-9 % ASP、约 4-7 % THR、约 4-7 % SER、约 22-25 % GLU、约 9-12 % PRO,约 0-3 % GLY、约 1. 5-4. 5% ALA、约 4-7% VAL、约 0-2% CYS、约 1-4% MET、约 4-7% ILE、约 7. 5-10. 5% LEU、 约 0-3% TYR、约 6. 7-9. 7% LYS、约 1. 5-4. 5% HIS、约 1-4% ARG。
11.根据权利要求9-10的组合物，其在经受以下方法后产生类似于图1中所示的凝胶-将来自蛋白质溶液、特别是PPf的250 μ g蛋白质当量溶于340 μ 1变性溶液中，所述 变性溶液由终浓度分别为7M、2M、65mM、20mM、65mM、0. 4% (w/v)的脲、硫脲、CHAPS、Tris, DTT、两性电解质和用于着色的溴酚蓝组成，-将所述样品装载到PH 3至pH 10的pH梯度固定化电解质条带上，所述条带位于用 1. 5M Tris缓冲液制备的9至16%丙烯酰胺凝胶上，-施加300伏特的电压达11. 6小时，然后施加5000伏特的电压达12. 4小时通过所述 固定化电解质条带凝胶，以借助电荷分离蛋白质，-将所述固定化电解质条带凝胶定位在丙烯酰胺范围为9至16%的丙烯酰胺梯度凝胶 上，所述凝胶位于25mM Tris/192mM甘氨酸/0. 1% SDS (w/v)，pH 8. 3的缓冲液中，-施加40mA电流通过所述凝胶过夜，以将此前在固定化电解质条带凝胶上分离的蛋白质拖到丙烯酰胺基质中，进而根据尺寸将其分离，“用考马斯亮蓝染色使凝胶蛋白点显影。
12.根据权利要求9至11中任一项的组合物在制备食品、食物补充剂、营养剂、药物和 /或美容组合物中的用途。
13.根据权利要求9至11中任一项的组合物作为乳化剂、作为起泡剂和/或用于低脂 肪产品的用途。
14.根据权利要求12至13中任一项的用途，用于制备以下产品奶精、特别是咖啡奶 精，发泡饮料如热牛奶咖啡、拿铁咖啡、巧克力、酸乳酪、巴氏杀菌UHT奶、甜炼乳、发酵乳、 基于奶的发酵产品、牛奶巧克力、慕斯、泡沫、乳状液、冰淇淋、酸性饮料、碳酸饮料、果汁、制 备饮料的团聚粉、奶制粉末、婴儿配方食品、饮食强化产品、宠物食品、片剂、干燥的口服补 充剂、湿的口服补充剂、卫生保健营养配方、化妆品。
15.根据权利要求9至11中任一项的组合物用于提取和/或稳定疏水或脂溶性组分的 用途，如来自生物材料如植物、水果、生物组织或流体、发酵产品、细胞培养物、细菌、酵母的 色素、生物活性剂或抗氧化剂。
全文摘要
本发明一般涉及包含蛋白胨部分(PPf)的组合物。特别地，本发明涉及包含β-乳球蛋白缺乏且富含PPf的去矿质蛋白部分的提取物的生产方法及这些提取物例如在食品、食物补充剂、营养剂、药物和/或美容组合物中的用途、例如作为乳化剂或起泡剂的用途。本发明的PPf部分可以如下获得将含水天然蛋白分散液的pH调节至约5.6至8.4或约3.5至5.0，将含水天然蛋白分散液加热至约70至95℃达约10秒至60分钟，在加热后将至少一部分直径至少100nm的所形成的固体大分子量凝聚物从含水蛋白分散液中去除，以及收集分散液的剩余液体部分。
文档编号A23J1/20GK101977515SQ200980110017
公开日2011年2月16日 申请日期2009年2月18日 优先权日2008年2月20日
发明者C·施米特, L·J·R·博韦托, M·福雷, P·蒙塔冯 申请人:雀巢产品技术援助有限公司