治疗性融合蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明涉及构建一种新种类的靶向分泌抑制剂(TSIs)，其包含无细胞毒性蛋白酶、易位肽和靶向部分肽，其中所述靶向部分肽具有游离的N端结构域和游离的C端结构域；本发明还涉及其单链融合蛋白前体，以及激活所述单链融合蛋白前体的方法。
【专利说明】治疗性融合蛋白
[0001]本发明涉及构建一种新种类的祀向分泌抑制剂(Targeted SecretionInhibitors, TSIs),涉及其激活方法以及激活产物。
[0002]无细胞毒性蛋白酶是一组公认的蛋白酶，其通过破坏细胞功能而作用在靶细胞上。重要的是，无细胞毒性蛋白酶在其作用时不会杀死靶细胞。无细胞毒性蛋白的一些已知最好的实例包括梭菌神经毒素(例如，肉毒菌神经毒素，其以诸如DySp0rtTM，NeUf0bl0CTM和BotoX?的名称市售)和IgA蛋白酶。
[0003]无细胞毒性蛋白酶通过蛋白水解-切割已知为SNARE蛋白的细胞内转运蛋白(例如 SNAP-25，VAMP，或突触融合蛋白)作用-参见 Gerald K (2002) " Cell and MolecularBiology (细胞和分子生物学)”(第4版)John ffiley&Sons, Inc.。简称SNARE是来源于术语可溶NSF附着受体(Soluble NSF Attachment Receptor),其中NSF意指N-乙基马来酰亚胺_敏感因子(M_ethylmaleimide_Sensitive Factor) ? SNARE蛋白是细胞内囊泡形成所必需的，并且因此通过囊泡转运从细胞分泌分子。因此，一旦被递送到需要的靶细胞，`该无细胞毒性蛋白酶就能够抑制由所述靶细胞的细胞分泌。
[0004]无细胞毒性蛋白酶可以以其天然的或基本上天然的形式(即，作为全毒素，如在使用Dysport?,Neurobloc?和Botox?的情形中)使用，在该情形中，该蛋白酶祀向特定的细胞型取决于:(i)局部施用蛋白酶和/或(ii)天然蛋白酶的固有的结合能力。备选地，无细胞毒性蛋白酶可以以重新革巴向的形式(re-targeted form)使用,其中天然蛋白酶被修饰以包含已知为祀向部分(Targeting Moiety, TM)的外源配体。选择TM以提供对需要的靶细胞的结合特异性，并且作为重新靶向过程的一部分，可以去除无细胞毒性蛋白酶的天然结合部分。
[0005]本 申请人:率先提出了这样的观念并且开发了基于梭菌神经毒素的重新靶向技术，并且所产生的融合蛋白称为靶向分泌抑制剂(TSIs)。
[0006]TM置换可以通过技术人员公知的常规化学缀合技术实现。在这一点上，提及Hermanson, G.T.(1996), Bioconjugate techniques (生物缀合技术)，Academic Press,和Wong, S.S.(1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking(蛋白缀合和交联化学)，CRC Press。
[0007]然而，化学缀合通常是不精确的。例如，缀合后，TM可能在不止一个连接位点与缀合物的其余部分连接。化学缀合也难以控制。例如，TM可以在蛋白酶成分上的连接位点和/或在易位成分上的连接位点与修饰的毒素的其余部分连接。当为治疗功效需要仅与所述成分中的一个连接(优选在单个位点连接)时，这将成为问题。因此，化学缀合导致不理想的修饰毒素分子的混合群体。
[0008]作为化学缀合的备选方案，TM置换可以通过重组制备单链多肽融合蛋白而实现。此类分子的制备记述在W098/07864中。然而，本发明人已经鉴定了 W098/07864的方法并不适用于所有类型的TM。
[0009]W098/07864 的系统的备选系统记述在 W02006/059093 中。依据 W02006/059093，
TM存在于单链融合蛋白的中间(centrally-presented, CP),位于无细胞毒性蛋白酶成分和易位结构域成分之间。这形成具有下述结构的单链融合蛋白:
[0010]NH2-[蛋白酶成分]-[TM]-[易位成分]-COOH
[0011]上述融合蛋白通过用在位于所述蛋白酶成分C端的位点切割的蛋白酶处理而激活。这一激活过程产生二链蛋白，其包含与融合蛋白的易位成分共价连接(通过二硫键连接)的蛋白酶成分。在W02006/059093的情形中，产生的二链分子的TM通过其C端与易位结构域成分的N端的肽键结合。因此，该TM的N端则是游离的，从而与需要的受体相互作用和结合。这种排列对于需要游离的N端或游离的N端部分来结合其受体的TM种类是重要的。
[0012]例如，在蛋白水解激活后，W02006/059093提供具有下述二链构象的多肽:
[0013]
【权利要求】
1.单链多肽融合蛋白，其包含: (a)无细胞毒性蛋白酶，其能够切割靶细胞的胞吐融合器的蛋白； (b)靶向部分，其能够结合靶细胞上的结合位点，所述结合位点能够进行胞吞作用从而被引入到所述靶细胞内的内体中； (C)易位结构域，其能够将所述蛋白酶从内体中易位穿过内体膜并且进入所述靶细胞的细胞质中； (d)第一蛋白酶切割位点，在所述位点所述融合蛋白能够被第一蛋白酶切割，其中所述第一蛋白酶切割位点位于所述无细胞毒性蛋白酶与所述易位结构域之间； (e)第二蛋白酶切割位点，在所述位点所述融合蛋白能够被第二蛋白酶切割，其中所述第二蛋白酶切割位点位于所述易位结构域与所述靶向部分之间；和 (f)在所述靶向部分与所述易位结构域之间的共价键，其中在第二蛋白酶切割位点的蛋白水解切割之后，所述靶向部分通过所述共价键保持连接至所述易位结构域。
2.权利要求1的融合蛋白，其中所述易位结构域位于所述无细胞毒性蛋白酶与所述靶向部分之间。
3.权利要求1的融合蛋白，其中所述靶向部分位于所述无细胞毒性蛋白酶与所述易位结构域之间；并且其中所述 第一蛋白酶切割位点进一步位于所述无细胞毒性蛋白酶与所述靶向部分之间。
4.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述无细胞毒性蛋白酶位于所述蛋白的N端。
5.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述共价键是二硫键。
6.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中存在位于所述易位结构域与所述靶向部分之间的提供二级多肽结构的短多肽，并且其中所述二级多肽结构起作用使得所述靶向部分的一部分与所述易位结构域紧密接近，由此使能量上更有利的共价键形成。
7.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述靶向部分包含第一和第二结构域，并且其中所述第一和第二结构域由至多10个氨基酸残基隔开，优选由至多5个氨基酸残基隔开、更优选由O个氨基酸残基隔开。
8.权利要求7的融合蛋白，其中所述靶向部分的第一和第二结构域来源于针对不同受体的配体。
9.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述靶向部分能够通过所述靶向部分的N端结构域与所述结合位点的结构域之间的相互作用同时通过所述靶向部分的C端结构域与所述结合位点的结构域之间的相互作用与靶细胞上的结合位点相互作用。
10.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述靶向部分包含肽或由肽组成，所述肽选自由下列组成的组:促性腺素释放素(GnRH)肽，阿片样肽，β-内啡肽，缓激肽，BAM肽，伤害感受肽，强啡肽，甘丙肽，脑啡肽，P物质肽，促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)肽，胃泌素释放肽(GRP)，神经调节肽B肽，铃蟾肽，胃泌素肽，CCK肽，促生长素抑制素(SST)肽，皮质抑素(CST)肽，生长激素释放激素(GHRH)肽，PAR肽，甲状旁腺素(PTH)肽，血管活性肠肽(VIP), @2肾上腺素受体激动性肽，胃泌素释放肽，降钙素基因相关肽，促甲状腺素(TSH)肽，胰岛素肽，胰岛素样生长因子肽，戈那瑞林肽，促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)肽，促肾上腺皮质素(ACTH)肽，垂体腺苷环化酶激活肽(PACAP)。
11.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述无细胞毒性蛋白酶与所述第一蛋白酶切割位点由至多10个氨基酸残基隔开，优选由至多5个氨基酸残基隔开、更优选由O个氨基酸残基隔开。
12.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述易位结构域与所述第一蛋白酶切割位点由至多10个氨基酸残基隔开，优选由至多5个氨基酸残基隔开、更优选由O个氨基酸残基隔开。
13.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述易位结构域与所述第二蛋白酶切割位点由至多10个氨基酸残基隔开，优选由至多5个氨基酸残基隔开、更优选由O个氨基酸残基隔开。
14.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述靶向部分与所述第二蛋白酶切割位点由至多10个氨基酸残基隔开，优选由至多5个氨基酸残基隔开、更优选由O个氨基酸残基隔开。
15.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述第一蛋白酶与所述第二蛋白酶相同。
16.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述无细胞毒性蛋白酶是梭菌神经毒素L-链或其片段。
17.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述易位结构域是梭菌神经毒素Hn结构域或其片段。
18.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含纯化标签。
19.编码前述权利要求任一项所述的多肽融合蛋白的核酸序列。
20.DNA载体，其包含启动子，权利要求19的核酸序列，和终止子；其中所述核酸序列位于所述启动子的下游；并且其中所述终止子位于所述核酸序列的下游。
21.权利要求19所述的DNA序列的互补DNA链。
22.制备权利要求1-18中任一项所述的单链多肽融合蛋白的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达权利要求19所述的核酸序列或权利要求17所述的DNA载体。
23.制备无细胞毒性剂的方法，所述方法包括: a.提供包含本发明的单链多肽融合蛋白的溶液； b.向所述溶液中添加能够切割第一蛋白酶切割位点的第一蛋白酶和能够切割第二蛋白酶切割位点的第二蛋白酶；和 c.切割所述第一蛋白酶切割位点和所述第二蛋白酶切割位点； 由此形成三链融合蛋白。
24.能够通过权利要求23的方法获得的无细胞毒性多肽，其中所述多肽是三链多肽，并且其中: a.第一链包含无细胞毒性蛋白酶，所述无细胞毒性蛋白酶能够切割靶细胞的胞吐融合器的蛋白； b.第二链包含易位结构域，其能够将所述无细胞毒性蛋白酶从内体内易位穿过内体膜并且进入靶细胞的细胞质中； c.第三链包含靶向部分，其能够结合在靶细胞上的结合位点，所述结合位点能够进行胞吞作用从而被引入到所述靶细胞内的内体中； d.第一链和第二链被二硫键连接在一起；并且第二链和第三链通过共价键连接在一起。
25.权利要求1-18中任一项所述的单链多肽融合蛋白或权利要求24所述的无细胞毒性多肽，其用于治疗、预防或改善医学病症。
26.用于按照权利要求25所述的应用的单链多肽融合蛋白或用于按照权利要求25所述的应用的无细胞毒性多肽，其中所述医学病症选自疼痛，(慢性)神经原性炎症，泌尿生殖-神经学病症，诸 如膀胱活 动过度，前列腺癌，肺癌，乳腺癌或结肠直肠癌。
【文档编号】C12N15/62GK103649317SQ201280023958
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年5月16日 优先权日:2011年5月16日
【发明者】约翰·查多克, 伊莱恩·哈珀 申请人:辛它可辛有限公司