表达血凝素之转基因植物中生产的重组流感病毒样颗粒(vlp)的制作方法

专利名称：表达血凝素之转基因植物中生产的重组流感病毒样颗粒(vlp)的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒样颗粒的生产。更具体而言，本发明涉及包含流感抗原之病毒样 颗粒的生产。
背景技术：
流感是人由于呼吸道病毒引起的死亡的首要原因。常见的症状包括发热、喉咙 疼痛、气短和肌肉酸痛等。在流感季节，流感病毒感染全世界10 20 %的人口，每年导致 250 500，000人死亡。流感病毒是从受感染之哺乳动物和禽类细胞的质膜出芽的包膜病毒。根据所存在 的核蛋白和基质蛋白抗原，流感病毒分为A型、B型或C型。根据所存在的血凝素(HA)和神 经氨酸酶(NA)表面糖蛋白的组合，A型流感病毒可进一步分成若干亚型。HA支配病毒与宿 主细胞结合以及穿入宿主细胞的能力。NA从宿主细胞和病毒表面蛋白上的聚糖链除去末端 唾液酸残基，这防止病毒凝集并有利于病毒运动。目前，已鉴定出16种HA(H1-H16)和9种 NA(N1-N9)亚型。每种A型流感病毒具有一种HA糖蛋白类型和一种NA糖蛋白类型。一般 而言，每种亚型均表现出物种特异性；例如，已知所有HA和NA亚型均感染鸟类，而只有HI、 H2、H3、H5、H7、H9、H10、m、N2、N3 和 N7 显示感染人类(Horimoto 2006 ；Suzuki 2005)。含 有H5、H7和H9的流感病毒被认为是致病性最强的A型流感病毒形式，并且最有可能引起将 来的大流行。流感大流行通常由高传播性且致病性强的流感病毒引起，并可导致全球性疾病和 死亡水平升高。在20世纪，新的A型流感亚型的出现导致四次主要的大流行。1918 1919 年由Hmi病毒引起的西班牙流感在1917年至1920年之间导致世界范围内超过五千万人 死亡。当前，新亚型出现的风险或者动物中特有的亚型向人传播的风险总是存在。特别受 到关注的是高致病性形式的禽流感(也称作“鸟流感”)，据报道其已经在全世界若干国家 爆发。在许多情形下，该禽流感可在48小时内导致接近100%的死亡率。据推测，1997年 在香港首次鉴定的禽流感病毒(H5N1)向其它亚洲国家和欧洲的传播与野生鸟类的迁徙模 式有关。目前对抗人中流感的方法是每年接种疫苗。疫苗通常是预测为即将到来之“流感 季节”强势毒株(dominant strain)的几种毒株的组合。所述预测由世界卫生组织来协调 完成。一般而言，每年生产的疫苗剂量数不足以接种全世界的人群。例如，加拿大和美国获 得足以免疫其约三分之一人口的疫苗剂量，而欧盟仅有17%的人口可接种疫苗。很显然，在 世界范围的流感大流行到来时，目前全世界的流感疫苗生产不能满足需求。即使所需的年产量在给定年份中可以某种方式实现，然而强势毒株每年都在变化，因此在一年的低需求 时间大量储备是不切实际的。经济地、大规模地生产有效流感疫苗是政府和私营企业等非 常关心的。用于疫苗中的病毒储液是在受精的蛋中生产的。收获病毒颗粒，为了得到灭活病 毒疫苗，通过去污剂破坏进行灭活。减毒活疫苗由适于在低温下生长的流感病毒制备，这意 味着在正常体温下所述疫苗的毒力减弱。这样的疫苗在美国被批准用于5 49岁的个体。 全病毒灭活疫苗是通过化学试剂灭活而变为无害的，并且其已在胚蛋或哺乳动物细胞培养 物中生产。所有这些类型的疫苗都显示出一些特定的优点和缺点。全病毒来源之疫苗的一 个优点是这种疫苗所引起的免疫类型。通常，裂解型疫苗诱导强的抗体应答，而由全病毒制 得的疫苗诱导抗体(体液)应答和细胞应答。尽管功能性抗体应答是与疫苗诱导之保护作 用相关的获批标准，然而越来越多的证据表明T细胞应答对流感免疫也很重要，其还可为 老年人提供更好的保护。为了诱导细胞免疫应答，开发了由全病毒制得的疫苗。由于流感毒株(例如H5m) 的高致病性，因此在BL3+设备中生产这些疫苗。对于高致病性流感毒株(例如H5N1)来 说，为了降低流感毒株的致病性、使其无毒且更容易在胚蛋或哺乳动物细胞培养物中生产， 一些制造商对血凝素的基因序列进行了修饰。另一些人还使用重排列(reassortant)流感 株，其中血凝素和神经氨酸酶蛋白的基因序列被克隆进高产量、低致病性的流感供体株(A/ PR/8/34 ；Quan F_S等，2007)中。尽管这些方法可产生有用的疫苗，但是它们不能提供以满 足正常年份全球需求的所需规模来大量、低成本及快速生产疫苗的解决方法，并且当大流 行到来时几乎必然地不能满足需求。利用该反向遗传技术，还可能需要对HA蛋白的基因序列进行突变以使其无毒。就 高致病性流感株而言，全病毒疫苗的生产需要防护(confinement)程序或者所得疫苗不与 循环病毒的基因序列完全匹配。在减毒活疫苗的情形中，仍存在所施用的疫苗可与来自宿 主的流感病毒重组而产生新流感病毒的风险。尽管该方法保持了抗原表位和翻译后修饰，但是该方法存在许多缺点，包括由于 使用全病毒而引起的污染风险以及取决于病毒株的可变的产量。亚最佳水平的保护可由以 下原因导致由于将病毒引入蛋中而引起的病毒遗传异质性。其它缺点包括为了获得蛋而 进行大量计划，由于在纯化中使用的化学品引起的污染风险以及生产时间长。此外，对蛋中 蛋白质过敏的人可能不适于接种所述疫苗。在大流行的情形中，裂解型疫苗的生产受到需要使毒株适于在蛋中生长以及所得 产量不同的限制。尽管此技术用于生产季节性疫苗已使用了多年，但是它很难在合理的时 间范围内响应于大流行，并且世界范围的生产能力有限。为了避免使用蛋，已经在哺乳动物细胞培养物中(例如在MDCK或PERC. 6细胞等 中)生产流感病毒。另一种方法是反向遗传方法，其中通过用病毒基因转化细胞来生产病 毒。然而，这些方法也需要使用全病毒以及精准的方法和特定的培养环境。已开发了几种作为候选重组流感疫苗的重组产物。这些方法关注A型流感病毒HA 和NA蛋白的表达、制备以及纯化，包括利用杆状病毒感染的昆虫细胞(Crawford等，1999 ； Johansson, 1999)、病毒载体和DNA疫苗构建体(Olsen等，1997)来表达这些蛋白质。流感病毒感染的特异性是公知的。简言之，感染循环是从病毒体表面HA蛋白与含有唾液酸的细胞受体(糖蛋白和糖脂)结合开始的。NA蛋白介导对唾液酸受体的处理，病 毒穿入细胞则取决于HA依赖性受体介导的内吞作用。在含有流感病毒体的内化内涵体的 酸性界限内，HA蛋白发生构象变化，这导致病毒与细胞膜融合，病毒脱壳以及M2介导的从 核衣壳相关核糖核蛋白(RNP)释放Ml蛋白，Ml蛋白迁移到细胞核内用于病毒RNA合成。抗 HA蛋白的抗体通过中和病毒感染性来预防病毒感染，而抗NA蛋白的抗体介导其对病毒复 制早期步骤的作用。Crawford等(1999)公开了流感病毒HA在杆状病毒感染的昆虫细胞中的表达。 所表达的蛋白质被描述为能够预防由禽类H5和H7流感亚型引起的致命性流感疾病。 Johansson等(1999)教导了杆状病毒表达的流感病毒HA和NA蛋白在动物中诱导了优于常 规疫苗所诱导之应答的免疫应答。杆状病毒表达的马流感病毒血凝素的免疫原性和效力可 与同源DNA候选疫苗相比较(Olsen等，1997)。总之，这些数据表明，使用多种实验方法以 及在不同动物模型中，可利用重组HA或NA蛋白诱导针对流感病毒攻击的高度保护。由于先前的研究已显示表面流感病毒糖蛋白HA和NA是用于诱导针对流感病毒之 保护性免疫的主要靶标，并且Ml提供了用于流感病毒之细胞免疫的保守性靶标，所以新的 候选疫苗可作为蛋白质大分子颗粒(例如病毒样颗粒(VLP))包含这些病毒抗原。作为疫 苗产品，VLP提供了如下优点比亚基或重组抗原具有更强的免疫原性，能刺激体液和细胞 免疫应答(Grgacic和Anderson，2006)。此外，含有这些流感抗原的颗粒可展示出构象表 位，其诱导针对多种流感病毒株的中和抗体。生产用于疫苗目的的非感染性流感病毒株是避免发生意外感染的一种方法。作为 替代，已研究出用作培养病毒之替代物的病毒样颗粒(VLP)。VLP模拟病毒衣壳的结构，但 缺少基因组，因此不能复制或提供二次感染的机会。一些研究表明，使用哺乳动物表达质粒或杆状病毒载体，重组流感病毒蛋白在细 胞培养物中自组装成 VLP (Gomez-Puertas 等，1999 ；Neumann 等，2000 ；Latham 和 Galarza， 2001)。Gomez-Puertas等(1999)公开了流感病毒VLP的有效形成取决于几种病毒蛋白质 的表达水平。Neumann等(2000)建立了基于哺乳动物表达质粒的系统，其用于完全从克隆 cDNA产生感染性流感病毒样颗粒。Latham和Galarza (2001)报道了在用共表达HA、NA、M1 和M2基因的重组杆状病毒感染的昆虫细胞中形成流感病毒VLP。这些研究表明，流感病毒 体蛋白质可在真核细胞中共表达后进行自组装。Gomez-Puertas等(2000)教导，除了血凝素(HA)以外，流感病毒的基质蛋白(Ml) 对于VLP从昆虫细胞出芽也是必需的。然而，Chen等(2007)教导了 Ml可能不是VLP形成 所需的，并观察到Ml和VLP的有效释放需要存在HA和由NA提供的唾液酸酶活性。NA切割 产生VLP之细胞表面上的糖蛋白的唾液酸，并将VLP释放到介质中。Quan等(2007)教导了在杆状病毒表达系统(昆虫细胞)中产生的VLP疫苗诱导 针对某些流感病毒株(A/PR8/34(Hmi))的保护性免疫。经观察，Quan所研究的VLP从质 膜出芽，并被认为具有合适的大小和形态，与在哺乳动物系统(MDCK细胞)中得到的相似。PCT 公开 W0 2004/098530 和 W0 2004/098533 教导了在培养的转化 NT-1 (烟草) 细胞中表达新城疫病毒HN或禽流感病毒A/火鸡/威斯康星/68 (H5N9)。包含植物细胞培 养物所表达多肽的组合物可在兔和鸡中诱发不同的免疫应答。包膜病毒可在从感染细胞“出芽”时获得脂质包膜，并且从质膜获得膜，或者从内
6部细胞器的质膜获得膜。流感病毒颗粒和VLP从宿主细胞的质膜出芽。例如，在哺乳动物 或杆状病毒细胞系统中，流感病毒从质膜出芽(Quan等，2007)。已知仅有少数包膜病毒感 染植物(例如，番茄斑萎病毒属(Topovirus)和弹状病毒属(Rhabdovirus)的成员)。在已 知的植物包膜病毒中，它们的特征在于从宿主细胞的内膜出芽，而不是从质膜出芽。虽然已 在植物宿主中产生了少数的重组VLP，但是它们均非源自质膜，于是提出了这样的问题—— 是否可以在植物中生产质膜来源的VLP(包括流感病毒VLP)。目前的流感病毒VLP生产技术依赖于多种病毒蛋白质的共表达，这种依赖性代表 了这些技术的缺点，这是因为在全世界大流行和每年流行的情形中，响应时间对于疫苗接 种来说是至关重要的。例如，依赖于表达一种或很少病毒蛋白且不需要表达病毒非结构蛋 白的更为简单的VLP生产系统对加快疫苗的开发来说是有必要的。为了保护全世界人口免于患流感并且击退将来的大流行，疫苗生产商需要开发有 效的、快速的生产疫苗制剂的方法。目前使用受精的蛋生产疫苗不能满足需求，并且生产过 程长。

发明内容
本发明的一个目的是提供改进的流感病毒样颗粒(VLP)。本发明提供了核酸，其包含编码来自包膜病毒之抗原的核苷酸序列，所述核苷酸 序列与在植物中有活性的调控区有效连接。所述抗原可以是流感病毒血凝素(HA)。所述HA可包含天然或非天然的信号肽；所述非天然的信号肽可以是蛋白质二硫 键异构酶信号肽。所述核酸编码的HA可以是A型流感病毒、B型流感病毒或者是A型流感病毒的亚 型，其选自包含机、!12、!13、!14、!15、!16、!17、!18、!19、!110、!111、!112、!113、!114、!115 和 H16 的组。 在本发明的一些方面中，由所述核酸编码的HA可来自A型流感病毒，并选自包含H1、H2、H3、 H5、H6、H7 和 H9 的组。本发明还提供了在植物中生产流感病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括a)将与在植物中有活性的调控区有效连接的、编码来自包膜病毒之抗原(例如流 感病毒血凝素(HA))的核酸导入植物或其部分中，以及b)在允许表达所述核酸的条件下培养所述植物或其部分，从而产生VLP。所述方法还可包括收获所述植物以及从所述植物组织中纯化或分离VLP的步骤。所述方法还可在导入步骤(步骤a)中包含含有编码一种或多种伴侣蛋白之核苷 酸序列的核酸。所述一种或多种伴侣蛋白可选自包含Hsp40和Hsp70的组。本发明包括上述方法，其中在导入步骤(步骤a)中，所述核酸可在植物中瞬时表 达或在植物中稳定表达。此外，可使用体积排阻色谱对VLP进行纯化。根据本发明的另一方面，提供了在植物中生产流感病毒样颗粒(VLP)的方法，其 包括提供了包含如下核酸的植物或植物部分，所述核酸包含与在植物中有活性的调控区有 效连接的、编码来自包膜病毒之抗原的核苷酸序列，并在允许表达所述核酸的条件下培养 所述植物或其部分，从而产生VLP。所述方法还可包括收集植物以及从植物组织中纯化或分离VLP的步骤。
本发明包括上述方法，其中在提供步骤后，导入这样的核酸，其包含与在植物中有 活性的调控区有效连接的、编码一种或多种伴侣蛋白的核苷酸序列；以及在允许表达所述 核酸的条件下培养所述植物或植物部分，从而产生VLP。所述一种或多种伴侣蛋白可选自包含Hsp40和Hsp70的组。本发明包括上述方法，其中在导入步骤(步骤a)中，所述编码HA的核酸在植物中 稳定表达。此外，可使用体积排阻色谱对VLP进行纯化。本发明还提供了病毒样颗粒(VLP)，其包含流感病毒HA蛋白以及一种或多种源自 植物的脂质。所述VLP的HA蛋白可以来自A型流感病毒、B型流感病毒或者是A型流感病毒HA 的亚型，其选自 HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 和 H16。在 本发明的一些方面中，所述HA来自A型流感病毒，并选自包含HI、H2、H3、H5、H6、H7和H9 的组。此外，本发明还涉及包含有效剂量之VLP的组合物，该VLP包含流感病毒HA蛋白、 一种或多种植物脂质以及可药用载体。本发明还涉及在植物中形成VLP的HA蛋白片段或部分。本发明还涉及包含具有植物特异性N-聚糖或经修饰N-聚糖之流感病毒HA的 VLP。所述VLP的HA蛋白可以来自A型流感病毒、B型流感病毒或者是A型流感病毒HA的 亚型，其选自 HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 和 H16。在本 发明的一些方面中，所述HA来自A型流感病毒，并选自包含HI、H2、H3、H5、H6、H7和H9的组。所述VLP可包含一种或多种亚型的HA蛋白，包括HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、 H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15或H16或者其片段或部分。含有这些HA蛋白的亚型的 实例包括A/新喀里多尼亚/20/99 (HlNl)、A/印度尼西亚/5/2006 (H5N1)、A/鸡/纽约 /1995、A/ 银鸥 /DE/677/88 (H2N8)、A/ 得克萨斯 /32/2003、A/ 绿头鸭 /MN/33/00、A/ 鸭 / 上海 /1/2000、A/ 针尾鸭 /TX/828189/02、A/ 火鸡 / 安大略 /6118/68 (H8N4)、A/ 琵嘴鸭 / 伊朗 /G54/03、A/ 鸡 / 德国 /Ν/1949 (H10N7)、A/ 鸭 / 英格兰 /56(H11N6)、A/ 鸭 / 阿尔伯达 /60/76 (H12N5)、A/ 鸥 / 马里兰 /704/77 (H13N6)、A/ 绿头鸭 /Gur jev/263/82、A/ 鸭 / 澳大 利亚 /341/83 (H15N8)、A/ 红嘴鸥 / 瑞典 /5/99 (H16N3)、B/Lee/40、C/ 约翰内斯堡 /66、A/ 波多黎各 /8/34 (Hmi)、A/ 布里斯班 /59/2007 (HlNl)、A/ 所罗门群岛 3/2006 (HlNl)、A/ 布 里斯班 10/2007 (H3N2)、A/ 威斯康星 /67/2005 (H3N2)、B/ 马来西亚 /2506/2004、B/ 佛罗里 达 /4/2006、A/ 新加坡 /1/57 (H2N2)、A/ 安微 /1/2005 (H5N1)、A/ 越南 /1194/2004 (H5N1)、 A/ 水鸭 / 香港 /W312/97 (H6N1)、A/ 马 / 布拉格 /56 (H7N7)、A/ 香港 /1073/99 (H9N2)。在本发明的一个方面中，所述HA蛋白可以是H1、H2、H3、H5、H6、H7或H9亚型。在另 一方面中，所述Hl蛋白可来自A/新喀里多尼亚Λ0/99 (HlNl)、A/波多黎各/8/34 (HlNl)、 A/布里斯班/59/2007 (HlNl)或A/所罗门群岛3/2006 (HlNl)株。所述H3蛋白可来自A/ 布里斯班10/2007 (H3N2)或A/威斯康星/67/2005 (H3N2)株。在本发明的又一方面中，所述 H2蛋白可来自A/新加坡/1/57(H2N2)株。所述Η5蛋白可来自A/安徽/1/2005 (H5m)、Α/ 越南/1194/2004 (Η5Ν1)或A/印度尼西亚/5/2005株。在本发明的一个方面中，所述Η6蛋 白可来自A/水鸭/香港/W312/97 (Η6Ν1)株。所述Η7蛋白可来自A/马/布拉格/56 (Η7Ν7)
8株。在本发明的一个方面中，所述H9蛋白来自A/香港/1073/99(H9N2)株。在本发明的又 一方面中，所述HA蛋白可来自可以是B型病毒的流感病毒，包括B/马来西亚/2506/2004 或B/佛罗里达/4/2006。来自Hl、Η2、Η3、Η5、Η6、Η7、Η9或B亚型的HA蛋白的氨基酸序列 的实例包括SEQ ID NO 48-59ο所述流感病毒HA蛋白可以是Η5(印度尼西亚)。本发明还提供了包含编码HA蛋白之序列的核酸分子。所述核酸分子还可包含 与所述编码HA蛋白之序列有效连接的一个或多个调控区。所述核酸分子可包含编码HI、 H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、B 或 C 亚型的序列。在本 发明的另一个方面中，由所述核酸分子编码的HA蛋白可以是HI、H2、H3、H5、H6、H7、H9或 B亚型。所述核酸分子编码的Hl蛋白来自A/新喀里多尼亚/20/99 (HlNl)、A/波多黎各 /8/34 (HlNl)、A/布里斯班/59/2007 (HlNl)或A/所罗门群岛3/2006 (HlNl)株。在本发明 的一个方面中，所述核酸分子编码的H3蛋白可来自A/布里斯班10/2007 (H3N2)或A/威斯 康星/67/2005 (H3N2)株。在本发明的又一方面中，所述核酸分子编码的H2蛋白可来自A/ 新加坡/1/57 (H2N2)株。所述核酸分子编码的H5蛋白可来自A/安微/l/2005(H5m)、A/ 越南/1194/2004 (H5N1)或A/印度尼西亚/5/2005株。在本发明的一个方面中，所述核酸 分子编码的H6蛋白可来自A/水鸭/香港/W312/97(H6m)株。所述核酸分子编码的H7蛋 白可来自A/马/布拉格/56 (H7N7)株。另外，所述核酸分子编码的H9蛋白可来自A/香港 /1073/99 (H9N2)株。所述核酸编码的B亚型HA蛋白可来自B/佛罗里达/4/2006或B/马 来西亚/2506/2004株。编码来自Hl、H2、H3、H5、H6、H7、H9或B亚型的这些HA蛋白的核酸 分子序列的实例包括SEQ ID NO 36-47和60-73。所述核酸序列可编码流感病毒HA蛋白H5 (印度尼西亚)。可与编码HA蛋白之序列有效连接的调控区包括在植物细胞、昆虫细胞或酵母细 胞中可操作的调控区。这样的调控区可包括质体蓝素调控区、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶 / 力口氧Bl (Ribulose 1, 5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase, RuBisCO) i周控区、卩十參录素 a/b结合蛋白(CAB)、ST-LS1、多角体蛋白调控区或gp64调控区。其它调控区包括5’ UTR、 3’UTR或终止子序列。所述质体蓝素调控区可以是苜蓿质体蓝素调控区；所述5’UTR、3’UTR 或终止子序列也可以是苜蓿序列。还提供了诱导对象中针对流感病毒感染之免疫的方法，该方法包括施用含有流感 病毒HA蛋白、一种或多种植物脂质和可药用载体的病毒样颗粒。所述病毒样颗粒可经口、 皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用给对象。本发明还涉及病毒样颗粒(VLP)，其包含源于选自流感病毒、麻疹病毒、埃博拉病 毒、马尔堡病毒和HIV病毒之病毒的一种或多种蛋白质，以及源于非唾液酸化宿主生产细 胞的一种或多种脂质。所述HIV蛋白可以是p24、gpl20或gp41 ；所述埃博拉病毒蛋白可以 是VP30或VP35 ；所述马尔堡病毒蛋白可以是Gp/SGP ；所述麻疹病毒蛋白可以是H蛋白或F 蛋白。另外，本发明涉及含有流感病毒HA蛋白和一种或多种宿主脂质的病毒样颗粒 (VLP) 0例如，如果宿主是昆虫，那么所述病毒样颗粒(VLP)可包含流感病毒HA蛋白和一种 或多种昆虫脂质，或者，如果宿主是酵母，那么所述病毒样颗粒(VLP)可包含流感病毒HA蛋 白和一种或多种酵母脂质。
本发明还涉及组合物，其包含两种或更多种流感毒株或亚型的VLP。所述两种或更 多种亚型或毒株可选自-Al新喀里多尼亚/20/99 (HlNl)、A/印度尼西亚/5/2006 (H5N1)、A/ 鸡 / 纽约 /1995、A/ 银鸥 /DE/677/88 (H2N8)、A/ 得克萨斯 /32/2003、A/ 绿头鸭 /MN/33/00、 A/ 鸭 / 上海 /1/2000、A/ 针尾鸭 /TX/828189/02、A/ 火鸡 / 安大略 /6118/68 (H8N4)、A/ 琵嘴 鸭 / 伊朗 /G54/03、A/ 鸡 / 德国 /Ν/1949 (H10N7)、A/ 鸭 / 英格兰 /56(H11N6)、A/ 鸭 / 阿尔 伯达 /60/76 (H12N5)、A/ 鸥 / 马里兰 /704/77 (H13N6)、A/ 绿头鸭 /Gur jev/263/82、A/ 鸭 / 澳大利亚 /341/83 (H15N8)、A/ 红嘴鸥 / 瑞典 /5/99(H16N3)、B/Lee/40、C/ 约翰内斯堡 /66、 A/ 波多黎各 /8/34 (HlNl)、A/ 布里斯班 /59/2007 (HlNl)、A/ 所罗门群岛 3/2006 (HlNl)、A/ 布里斯班 10/2007 (H3N2)、A/ 威斯康星 /67/2005 (H3N2)、B/ 马来西亚 /2506/2004、B/ 佛罗 里达 /4/2006,A/ 新加坡 /1/57 (H2N2)、A/ 安徽/1/2005 (H5N1)、A/ 越南/1194/2004 (H5N1)、 A/ 水鸭 / 香港 /W312/97 (H6N1)、A/ 马 / 布拉格 /56 (H7N7)或 A/ 香港/1073/99 (H9N2)。所 述两种或更多种亚型或毒株的VLP可以大致相等的量存在；或者，一种或多种亚型或毒株 可以占所存在毒株或亚型的大部分。本发明涉及诱导动物或靶标生物中针对流感病毒感染之免疫的方法，其包括施用 含有一种或多种VLP的有效剂量疫苗，所述VLP是利用非唾液酸化宿主(例如植物宿主、昆 虫宿主或酵母宿主)生产的。所述疫苗可经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施 用。所述靶标生物可选自人、灵长类、马、猪、鸟(禽)类、水禽、候鸟、鹌鹑、鸭、鹅、家禽、鸡、 骆驼、犬科动物、狗、猫科动物、猫、虎、豹、麝猫、水貂、石貂、雪貂、宠物、家畜、小鼠、大鼠、海 豹、鲸等。本发明提供了用于在能够生产VLP的合适宿主(例如植物、昆虫或酵母)中生产 含有来自不同流感毒株之血凝素(HA)的VLP的方法。在植物中生产的VLP含有植物来源 的脂质，在昆虫细胞中生产的VLP含有来自昆虫细胞质膜的脂质(通常称为“昆虫脂质”)， 在酵母中生产的VLP含有来自酵母细胞质膜的脂质(通常称为“酵母脂质”)。本发明还涉及包含如下核酸的植物、植物组织或植物细胞，所述核酸包含与在植 物中有活性的调控区有效连接的、编码来自包膜病毒之抗原的核苷酸序列。所述抗原可以 是流感病毒血凝素(HA)。所述植物还可包含这样的核酸，其包含与在植物中有活性的调控区有效连接的、 编码一种或多种伴侣蛋白的核苷酸序列。所述一种或多种伴侣蛋白可选自包含Hsp40和 Hsp70的组。与在昆虫细胞培养物中生产VLP相比，在植物中生产这些颗粒具有若干优点。植 物脂质可刺激特定免疫细胞并增强所诱导的免疫应答。植物的膜由脂质、磷脂酰胆碱(PC) 和磷脂酰乙醇胺(PE)组成，并且还含有植物以及某些细菌和原生动物所特有的鞘糖脂。鞘 脂类之所以不常见的原因是，它们不是甘油酯(例如PC或PE)，而是由与含有18个以上碳 的脂肪酸链形成酰胺连接的长链氨基醇组成。PC和PE以及鞘糖脂可结合哺乳动物免疫细 胞(例如抗原呈递细胞(APC)，如树突状细胞和巨噬细胞)和另一些细胞(包括胸腺和肝脏 中的B淋巴细胞和T淋巴细胞))中表达的⑶1分子(Tsuji M，.2006)。此外，除了植物脂 质的存在具有潜在的佐剂作用以外，植物N-聚糖促进抗原呈递细胞捕获糖蛋白抗原的能 力(Saint-Jore-Dupas，2007)也可能是在植物中生产VLP的优点。不希望受理论限制，预计由植物生产的VLP会比在其它生产体系中制得的VLP诱
10导出更强的免疫反应，并且与由活的或减毒的全病毒疫苗诱导的免疫反应相比，由这些植 物生产的VLP诱导的免疫反应会更强。与由全病毒制得的疫苗相比，VLP具有优势，这是因为它们无感染性，因此限制性 生物防范问题不再像使用感染性全病毒时那么重要，并且不是生产所必需的。由植物生产 的VLP的另一优点是，允许表达系统生长在温室或田间，从而具有更显著的经济效益并适 于扩大规模。另外，植物不含有参与合成唾液酸残基以及将唾液酸残基添加到蛋白质中的酶。 VLP的生产可以不需要神经氨酸酶(NA)，并且不需要共表达NA或者用唾液酸酶(神经氨酸 酶)处理生产细胞或提取物以确保在植物中生产VLP。根据本发明生产的VLP不包含已知与RNA结合的Ml蛋白。RNA是VLP制备物中的 污染物，其在VLP产品获得监管部门审批时是不期望的。所述发明内容不必然描述本发明的所有特征。


通过以下描述以及参考附图，本发明的这些和其它特征会更加明显，其中图IA显示根据本发明的一个实施方案用于表达来自A/新喀里多尼亚 /20/99 (HlNl)株之Hl的基于苜蓿质体蓝素之表达盒的序列(SEQ ID NO :8)。下划线标示 蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)信号肽。粗体显示用于克隆的 BglII(AGATCT)和SacI (GAGCTC)限制性位点。图IB显示流感病毒血凝素的功能结构域的 示意图。切割HAO后，HAl和HA2片段仍通过二硫桥结合在一起。图2A显示被组装用于表达来自A/新喀里多尼亚/20/99 (HlNl)株之HA的Hl亚 型的质粒540的示意图。图2B显示被组装用于表达来自A/印度尼西亚/5/2005 (H5N1)株 之HA的H5亚型的质粒660的示意图。图3显示来自产生血凝素Hl或H5的叶的蛋白质提取物的体积排阻色谱。图3A显 示Blue Dextran 2000 (三角形)和蛋白质(菱形)的洗脱模式。图3B显示在体积排阻色 谱(S500HR珠)后Hl (A/新喀里多尼亚/20/99 (HlNl))洗脱级分的免疫检测(Western印 迹；抗Hl抗体)。图3C显示H5的洗脱模式；Blue Dextran 2000 (三角形)和蛋白质(菱 形)。图3D显示在体积排阻色谱(S500HR珠)后H5 (A/印度尼西亚/5/2005 (H5N1))洗脱 级分的免疫检测(Western印迹；抗H5抗体)。图4A显示编码H1(A/新喀里多尼亚/20/99(Η1Ν1))Ν末端片段的序列(SEQ ID NO: 1)。图4B显示编码Hl (A/新喀里多尼亚/20/99 (HlNl)) C末端片段的序列(SEQ ID NO :2)。图5显示编码Hl (A/新喀里多尼亚/20/99 (HlNl))的HAO的全长序列(SEQ ID NO 28)。图6显示编码H5 (A/印度尼西亚/5/2005 (H5N1))的序列，其侧翼为紧邻起始ATG 上游的HindIII位点以及紧邻终止密码子(TAA)下游的SacI位点(SEQ ID NO :3)。图7A显示引物Plasto_443c的序列(SEQ ID NO :4)。图7B显示引物 SpHA(Ind)-Plasto. r 的序列(SEQ ID NO :5)。图 7C 显示引物 Plasto-SpHA (Ind). c 的序列 (SEQ ID NO :6)。图 7D 显示引物 HA(Ind)-Sac. r 的序列(SEQ ID NO :7)。图8A显示Hl (A/新喀里多尼亚/20/99 (HlNl))肽序列的氨基酸序列(SEQ ID NO 9)。图8B显示H5(A/印度尼西亚/5/2005(H5m))肽序列的氨基酸序列(SEQ ID NO: 10)。 粗体指示天然信号肽。图9显示A型流感病毒H7亚型的HA核苷酸序列(SEQ ID NO 11)。图IOA显示A型流感病毒HA的H2亚型核苷酸序列(SEQ ID NO 12)。图IOB显示 A型流感病毒HA的H3亚型核苷酸序列(SEQ ID NO :13)。图IOC显示A型流感病毒HA的 H4亚型核苷酸序列(SEQ ID NO :14)。图IOD显示A型流感病毒HA的H5亚型核苷酸序列 (SEQ ID NO: 15)。图IOE显示A型流感病毒HA的H6亚型核苷酸序列(SEQ ID NO: 16)。图 IOF显示A型流感病毒HA的H8亚型核苷酸序列(SEQ ID NO 17)。图IOG显示A型流感病 毒HA的H9亚型核苷酸序列(SEQ ID NO :18)。图IOH显示A型流感病毒HA的HlO亚型核 苷酸序列(SEQ ID NO :19)。图101显示A型流感病毒HA的Hll亚型核苷酸序列(SEQ ID NO 20)。图IOJ显示A型流感病毒HA的H12亚型核苷酸序列(SEQ ID NO 21)。图IOK显 示A型流感病毒HA的H13亚型核苷酸序列(SEQ ID NO :22)。图IOL显示A型流感病毒HA 的H14亚型核苷酸序列(SEQ ID NO 23)。图IOM显示A型流感病毒HA的H15亚型核苷酸 序列(SEQ ID N0:24)。图ION显示A型流感病毒HA的H16亚型核苷酸序列(SEQ ID NO: 25)。图100显示B型流感病毒的HA核苷酸序列(SEQ ID NO 26)。图IOP显示C型流感病 毒的HA核苷酸序列(SEQ ID NO 27)。图IOQ显示引物Xmal-pPlas. c的核苷酸序列(SEQ ID N0:29)。图 IOR 显示引物 SacI-ATG-pPlas. r 的核苷酸序列(SEQ ID NO :30)。图 IOS 显 示引物 SacI-PlasTer. c 的核苷酸序列(SEQ ID NO :31)。图 IOT 显示引物 EcoRI-PlasTer. r的核苷酸序列(SEQ ID NO 32)。图11显示本文使用的几种构建体的示意图。构建体660包含与质体蓝素启动子 (Plasto)和终止子(Pter)有效连接的编码HA之H5亚型(A/印度尼西亚/5/2005 (H5N1)) 的核苷酸序列；构建体540包含编码HA的Hl亚型(A/新喀里多尼亚/20/99 (HlNl))连 同苜蓿蛋白质二硫键异构酶信号肽(SP PDI)的核苷酸序列，并且其与质体蓝素启动子 (Plasto)和终止子(Pter)有效连接；构建体544被组装用于表达HA的Hl亚型(A/新喀里 多尼亚/20/99 (HlNl))，编码Hl的核苷酸序列与苜蓿蛋白质二硫键异构酶信号肽(SP PDI) 和GCMpII亮氨酸拉链(替代Hl的跨膜结构域和胞质尾)相组合并与质体蓝素启动子 (Plasto)和终止子(Pter)有效连接；用于表达流感A/PR/8/34之Ml编码区的构建体750 与烟草蚀纹病毒(tobacco etch virus, TEV)的5，UTR相组合，并与双35S启动子和Nos终 止子有效连接。图12显示使用抗H5 (越南)抗体对用构建体660转化的本塞姆氏烟草 (N. benthamiana)叶蛋白质提取物中的H5 (A/印度尼西亚/5/2005 (H5m))进行免疫检测 (泳道3)。使用来自流感病毒A/越南/1203/2004的市售H5作为检测的阳性对照(泳道 1)，用空载体转化的叶蛋白质提取物用作阴性对照(泳道2)。图13显示通过体积排阻色谱对血凝素结构进行表征。利用S-500HR通过凝胶过滤 分离来自产生H5 (A/印度尼西亚/5/2005 (H5N1))、H1 (A/新喀里多尼亚/20/99 (HlNl))、可 溶性Hl或Hl以及Ml之各生物质的蛋白质提取物。还对市售的玫瑰花结形式的Hl (A/新 喀里多尼亚/20/99 (HlNl))进行分级分离(Hl玫瑰花结)。图13A显示用于分析相对蛋白 质含量的洗脱级分(相对蛋白质水平——显示生物质分级分离的标准蛋白质洗脱模式)。 标出了 Blue Dextran 2000 (2MDa标准参照物)的洗脱峰。图13B显示通过使用抗H5 (越南)抗体(针对H5)时行免疫印迹用于分析洗脱级分中的血凝素存在情况。图13C显示用 于分析针对Hl之抗A型流感病毒抗体的洗脱级分。图13D显示用于分析针对可溶性Hl之 抗A型流感病毒抗体的洗脱级分。图13E显示用于分析针对Hl玫瑰花结之抗A型流感病 毒抗体的洗脱级分。图13F显示用于分析针对H1+M1之抗A型流感病毒抗体的洗脱级分。图14显示通过蔗糖梯度离心浓缩流感病毒H5 (A/印度尼西亚/5/2005 (H5N1))结 构以及对血凝素浓缩级分进行电子显微镜检查。图14A显示由蔗糖密度梯度离心得到的级 分的表征。通过利用抗H5(越南)抗体进行免疫印迹(上图)分析每一级分中H5的存在 情况及其相对蛋白质含量和血细胞凝集能力(曲线图)。图14B显示来自蔗糖梯度离心的 合并级分17、18和19的负染色透射电子显微镜检查。比例尺表示lOOnm。图15显示流感病毒H5 VLP的纯化。图15A显示澄清步骤和胎球蛋白亲和纯化步骤 中用考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析蛋白质含量。在澄清步骤中，泳道1，粗提物；泳道2，pH6 经调节提取物；泳道3，经热处理的提取物；泳道4，经DE过滤的提取物；在胎球蛋白亲和纯 化步骤中，泳道5，加样；泳道6，穿透液(flowthrough)；泳道7，洗脱(10倍浓缩)。图15B 显示对纯化的H5 VLP样品的负染色透射电子显微镜检查。比例尺表示lOOnm。图15C显示 放大的经分离H5VLP以显示结构细节。图15D显示利用考马斯染色的还原型SDS-PAGE (泳 道A)以及利用针对来自A/越南/1203/2004毒株(H5N1)的HA产生的兔多克隆抗体进行 的Western印迹(泳道B)显示的H5VLP产物。图16显示A型流感病毒(A/新喀里多尼亚/20/99 (HlNl)血凝素(HA)基因全长 cds 的核苷酸序列。GenBank 登录号 AY289929 (SEQ ID NO :33)。图17显示紫花苜蓿(Medicago sativa)的蛋白质二硫键异构酶mRNA的核苷酸序 列。GenBank 登录号 Zl 1499 (SEQ ID NO :34)。图18显示A型流感病毒(A/波多黎各/8/34 (HlNl))区段7全长序列的核苷酸序 列。GenBank 登录号 NC_002016. 1 (SEQ ID NO 35)。图19显示正染色透射电子显微镜所观察的产生H5之组织的VLP累积定位。CW 细胞壁，ch 叶绿体，pm 质膜，VLP 病毒样颗粒。比例尺表示lOOnm。图20显示在用植物生产的流感病毒H5 VLP (A/印度尼西亚/5/2005 (H5m))或重 组可溶性H5(A/印度尼西亚/5/2005 (H5W))接种的Balb/c小鼠中加强后14天诱导的血 清抗体应答。图20(A)通过肌内注射免疫的小鼠的抗体应答。图20(B)通过鼻内施用免 疫的小鼠的抗体应答。测量针对失活的H5W全病毒(A/印度尼西亚/5/05)的抗体应答。 GMT:几何平均效价。数值是每组中五只小鼠的终点效价倒数的GMT(In)。短线表示平均偏 差。与重组可溶性H5相比，*p < 0.05。图21显示在用植物生产的流感病毒H5 VLP (A/印度尼西亚/5/2005 (H5m))或重 组可溶性H5(A/印度尼西亚/5/2005 (H5W))接种的Balb/c小鼠中加强后14天的血细胞 凝集抑制(hemagglutination inhibition，HAI)抗体应答。图21 (A)通过肌内注射免疫 的小鼠的抗体应答。图21(B)通过鼻内施用免疫的小鼠的抗体应答。使用失活的H5W全 病毒(A/印度尼西亚/5/05)测量HAI抗体应答。GMT 几何平均效价。数值是每组中五只 小鼠的终点效价倒数的GMT(In)。短线表示平均偏差。与重组可溶性H5相比，*p< 0.05， **p < 0· 01。图22显示佐剂对Balb/c小鼠中VLP免疫原性的作用。图22 (A)明矾对通过肌内
13注射免疫之小鼠的作用。图22(B)壳聚糖对通过鼻内施用免疫之小鼠的作用。使用失活的 H5N1全病毒(A/印度尼西亚/5/05)测量HAI抗体应答。GMT 几何平均效价。数值是每组 中五只小鼠的终点效价倒数的GMT(In)。短线表示平均偏差。与相应的重组可溶性H5相 比，*p < 0. 05。图23显示施用H5VLP (A/印度尼西亚/5/2005 (H5N1))的抗体应答。图23 (A)通 过肌内施用接种的小鼠加强后30天的抗印度尼西亚/5/05免疫球蛋白同种型。数值是每 组中五只小鼠的终点效价倒数的GMT(lo&)。使用失活H5m(A/印度尼西亚/5/2005)全 病毒作为涂覆剂进行ELISA。短线表示平均偏差。与相应的重组可溶性H5(A/印度尼西亚 /5/2005 (H5N1))相比，*p < 0. 05，**p < 0. 001。图23(B)针对失活全病毒(A/印度尼西 亚/5/2005 (H5W)和A/越南/1194/04 (H5N1))的抗体效价。所有组均与阴性对照具有统 计学差异。图24显示初次剂量后14天后(第2周)、加强后14天(第5周)或加强后30天 (第7周)，用H5VLP (A/印度尼西亚/5/2005 (H5N1))免疫的Balb/c小鼠针对同源失活全 病毒(A/印度尼西亚/5/05)的抗体效价。GMT:几何平均效价。数值是每组中五只小鼠的 终点效价倒数的GMT(In)。与重组可溶性H5相比，*p < 0. 05。图25显示来自用H5VLP(A/印度尼西亚/5/2005(H5m))免疫的Balb/c小鼠加强 后30天的血清抗体的体外交叉反应性。(A)针对失活全病毒的抗体效价。(B)针对多种失 活全病毒的血细胞凝集抑制效价。数值是每组中五只小鼠的终点效价倒数的GMT(In)。短 线表示平均偏差。所有组均与阴性对照具有统计学差异。与相应的重组可溶性H5相比，*p < 0. 05。所有小于10的数值被赋予任意值5 (其In值为1. 6)，并认为其是阴性的。图26显示由植物生产的H5 VLP (A/印度尼西亚/5/2005 (H5m))的效力。(A)用 1000倍LD5C1(4. 09 X IO6CCID50)的流感毒株A/土耳其/582/06 (H5m)攻击后小鼠的存活率。
(B)攻击后免疫小鼠的体重。数值是存活小鼠的平均体重。图27显示植物来源的流感病毒VLP的来源。(A)纯化的流感病毒VLP的极性 脂质组成。将包含在相当于40 μ g蛋白质中的脂质从上述VLP中提取出来，通过HP-TLC 进行分离，并与从高度纯化的烟草质膜(PM)中分离的脂质的迁移模式进行比较。脂质缩 写如下D⑶G，双半乳糖二酰甘油；gluCER，葡萄糖神经酰胺；PA，磷酸；PC，磷脂酰胆碱； PE，磷脂酰乙醇胺；PG，磷脂酰甘油；PI，磷酯酰肌醇；PS，磷脂酰丝氨酸；SG，类固醇糖苷 (Steryl-glycoside)。(B)纯化的流感病毒VLP的中性脂质组成。将包含在相当于20 μ g蛋 白质中的脂质从上述VLP中提取出来，通过HP-TLC进行分离，并与谷固醇的迁移进行比较。
(C)对纯化的VLP、来自烟草叶的高度纯化PM(PMl)和BY2烟草细胞的高度纯化PM(PMby2)中 质膜标志物质子泵ATP酶(PMA)进行免疫检测。在每一泳道中加入18 μ g蛋白质。图28显示克隆774的DraIII至SacI位点之间的序列——A/布里斯班 /59/2007 (HlNl)的核苷酸序列(SEQ ID NO :36)。所述编码序列的侧翼是在5，端以DraIII 限制性位点起始的质体蓝素调控区，以及3’端的终止密码子和SacI位点。限制性位点用 下划线标出；ATG以粗体表示并用下划线标出。图29显示克隆775的DraIII至SacI位点之间的序列——A/所罗门群岛 3/2006 (HlNl)的核苷酸序列(SEQ ID NO :37)。所述编码序列的侧翼是在5，端以DraIII 限制性位点起始的质体蓝素调控区，以及3’端的终止密码子和SacI位点。限制性位点用
14下划线标出；ATG以粗体表示并用下划线标出。图30显示克隆776的DraIII至SacI位点之间的序列——A/布里斯班 10/2007 (H3N2)的核苷酸序列(SEQ ID NO :38)。所述编码序列的侧翼是在5，端以DraIII 限制性位点起始的质体蓝素调控区，以及3’端的终止密码子和SacI位点。限制性位点用 下划线标出；ATG以粗体表示并用下划线标出。图31显示克隆777的DraIII至SacI位点之间的序列——A/威斯康星 /67/2005 (H3N2)的核苷酸序列(SEQ ID NO :39)。所述编码序列的侧翼是在5，端以DraIII 限制性位点起始的质体蓝素调控区，以及3’端的终止密码子和SacI位点。限制性位点用 下划线标出；ATG以粗体表示并用下划线标出。图32显示克隆778的DraIII至SacI位点之间的序列——B/马来西亚/2506/2004 的核苷酸序列(SEQ ID NO :40)。所述编码序列的侧翼是在5’端以DraIII限制性位点起始 的质体蓝素调控区，以及3’端的终止密码子和SacI位点。限制性位点用下划线标出；ATG 以粗体表示并用下划线标出。图33显示克隆779的DraIII至SacI位点之间的序列——B/佛罗里达/4/2006 的核苷酸序列(SEQ ID NO :41)。所述编码序列的侧翼是在5’端以DraIII限制性位点起始 的质体蓝素调控区，以及3’端的终止密码子和SacI位点。限制性位点用下划线标出；ATG 以粗体表示并用下划线标出。图34显示克隆780的DraIII至SacI位点之间的序列——A/新加坡/1/57 (H2N2) 的核苷酸序列(SEQ ID NO :42)。所述编码序列的侧翼是在5’端以DraIII限制性位点起始 的质体蓝素调控区，以及3’端的终止密码子和SacI位点。限制性位点用下划线标出；ATG 以粗体表示并用下划线标出。图35显示克隆781的DraIII至SacI位点之间的序列——A/安徽/1/2005 (H5N1) 的核苷酸序列(SEQ ID NO :43)。所述编码序列的侧翼是在5’端以DraIII限制性位点起始 的质体蓝素调控区，以及3’端的终止密码子和SacI位点。限制性位点用下划线标出；ATG 以粗体表示并用下划线标出。图36显示克隆782的DraIII至SacI位点之间的序列——A/越南 /1194/2004(H5N1)的核苷酸序列(SEQ ID NO :44)。所述编码序列的侧翼是在5，端以 DraIII限制性位点起始的质体蓝素调控区，以及3’端的终止密码子和SacI位点。限制性 位点用下划线标出；ATG以粗体表示并用下划线标出。图37显示克隆783的DraIII至SacI位点之间的序列——A/水鸭/香港/ W312/97(H6N1)的核苷酸序列(SEQ ID NO :45)。所述编码序列的侧翼是在5，端以DraIII 限制性位点起始的质体蓝素调控区，以及3’端的终止密码子和SacI位点。限制性位点用 下划线标出；ATG以粗体表示并用下划线标出。图38显示克隆784的DraIII至SacI位点之间的序列——A/马/布拉格 /56 (H7N7)的核苷酸序列(SEQ ID NO :46)。所述编码序列的侧翼是在5，端以DraIII限制 性位点起始的质体蓝素调控区，以及3’端的终止密码子和SacI位点。限制性位点用下划 线标出；ATG以粗体表示并用下划线标出。图39显示克隆785的DraIII至SacI位点之间的序列——A/香港/1073/99 (H9N2) 的核苷酸序列(SEQ ID NO :47)。所述编码序列的侧翼是在5’端以DraIII限制性位点起始的质体蓝素调控区，以及3’端的终止密码子和SacI位点。限制性位点用下划线标出；ATG 以粗体表示并用下划线标出。图40A显示由克隆774 (A/布里斯班/59/2007 (HlNl))翻译的多肽的氨基酸序列 (SEQ ID N0:48)。克隆774的开放阅读框从图28中所示的ATG开始。图40B显示由克隆 775 (A/所罗门群岛3/2006 (HlNl))翻译的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :49)。克隆775 的开放阅读框从图29中所示的ATG开始。图41A显示由克隆776 (A/布里斯班/10/2007 (H3N2))翻译的多肽的氨基酸序列 (SEQ ID N0:50)。克隆776的开放阅读框从图30中所示的ATG开始。图41B显示由克隆 777 (A/威斯康星/67/2005 (H3N2))翻译的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :51)。克隆777 的开放阅读框从图31中所示的ATG开始。图42A显示由克隆778 (B/马来西亚Λ506/2004)翻译的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO: 52)。克隆778的开放阅读框从图32中所示的ATG开始。图42B显示由克隆779 (B/ 佛罗里达/V2006)翻译的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :53)。克隆779的开放阅读框从 图33中所示的ATG开始。图43A显示由克隆780(A/新加坡/1/57(H2N2))翻译的多肽的氨基酸序列(SEQ ID Ν0:54)。克隆780的开放阅读框从图34中所示的ATG开始。图43Β显示由克隆781 (A/ 安微/1/2005 (H5W))翻译的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :55)。克隆781的开放阅读框 从图35中所示的ATG开始。图44A显示由克隆782 (A/越南/1194/2004 (H5N1))翻译的多肽的氨基酸序列 (SEQ ID N0:56)。克隆782的开放阅读框从图36中所示的ATG开始。图44B显示由克隆 783(A/水鸭/香港/W312/97(H6m))翻译的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :57)。克隆783 的开放阅读框从图37中所示的ATG开始。图45A显示由克隆784(A/马/布拉格/56(H7N7))翻译的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO: 58)。克隆784的开放阅读框从图38中所示的ATG开始。图45B显示由克隆785 (A/ 香港/1073/99 (H9N2))翻译的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :59)。克隆785的开放阅读 框从图39中所示的ATG开始。图46显示在体积排阻色谱之后对由植物生产的VLP的7-17洗脱级分进行免疫检 测(Western印迹)。BlueDextran的洗脱峰(级分10)用箭头标出。显示了血凝素亚型 HI、H2、H3、H5、H6和H9。在级分7_14中检出血凝素，其对应于VLP洗脱物。图47显示来自年度流行毒株的一系列血凝素之表达的免疫印迹分析。将针对表 达来自不同流感病毒株之HA (标示于免疫印迹上部)的植物的10 μ g和20 μ g叶蛋白质提 取物分别加至泳道1和2中。图48A显示来自潜在大流行毒株的一系列H5血凝素之表达的免疫印迹分析。将 10 μ g和20 μ g蛋白质提取物分别加至泳道1和2中。图48B显示来自选定流感毒株的H2、 H7和H9血凝素之表达的免疫印迹分析。将10 μ g和20 μ g蛋白质提取物分别加至泳道1 和2中。图49显示来自利用AGL1/660农杆菌渗入的烟草(Nicotiana tabacum)叶之蛋白 质提取物中A/印度尼西亚/5/2005毒株H5的免疫印迹。对两株植物(植物1和植物2) 进行渗入，并将10 μ g和20 μ g提取自各植物的可溶性蛋白质分别加至泳道1和2中。
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图50显示血清抗体的体外交叉反应性。用植物生产的流感病毒H5VLP (A/印度尼 西亚/5/2005 (H5m)) (A)第一次免疫后14天以及(B)第二次加强后14天，雪貂血清中的 血细胞凝集抑制(HI)效价。使用下述失活H5W全病毒测量HAI抗体应答Al火鸡/ 土耳 其/1/05、A/越南/1194/04、A/安微/5/05以及同源株A/印度尼西亚/5/05。数值是每组 中五只雪貂的终点效价倒数的GMT(Iog2)15斜条一A/印度尼西亚/6/06 (进化枝2. 1.3)； 方格图案一A/火鸡/ 土耳其/1/05 (进化枝2. 2)；白柱一A/越南/1194/04(进化枝1)；黑 柱一A/安微/5/05。标出了响应者。短线表示平均偏差。图51显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO :60)，其含有苜蓿质体蓝素启动子和 5，UTR、来自A/印度尼西亚/5/2005 (构建体#660)的H5的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素 3’ UTR和终止子序列。图52显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO :61)，其含有苜蓿质体蓝素启动子和 5，UTR、来自A/新喀里多尼亚/20/1999 (构建体#540)的Hl的血凝素编码序列、苜蓿质体 蓝素3’ UTR和终止子序列。图53显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO :62)，其含有苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、来自A/布里斯班/59/2007 (构建体#774)的Hl的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素 3’ UTR和终止子序列。图54显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO :63)，其含有苜蓿质体蓝素启动子和 5’UTR、来自A/所罗门群岛/3/2006 (HlNl)(构建体#775)的Hl的血凝素编码序列、苜蓿质 体蓝素3’ UTR和终止子序列。图55显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO :64)，其含有苜蓿质体蓝素启动子和 5，UTR、来自A/新加坡/1/57(H2N2)(构建体#780)的Η2的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素 3’ UTR和终止子序列。图56显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO :65)，其含有苜蓿质体蓝素启动子和 5，^^、来自々/安微/1/2005 015附)(构建体#781)的Η5的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素 3’ UTR和终止子序列。图57显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO :66)，其含有苜蓿质体蓝素启动子和 5，UTR、来自A/越南/1194/2004(Η5Ν1)(构建体#782)的Η5的血凝素编码序列、苜蓿质体 蓝素3’ UTR和终止子序列。图58显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO :67)，其含有苜蓿质体蓝素启动子和 5，UTR、来自A/水鸭/香港/W312/97 (Η6Ν1)(构建体#783)的Η6的血凝素编码序列、苜蓿 质体蓝素3’ UTR和终止子序列。图59显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO :68)，其含有苜蓿质体蓝素启动子和 5，UTR、来自A/香港/1073/99 (Η9Ν2)(构建体#785)的Η9的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝 素3’ UTR和终止子序列。图60显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO :69)，其含有苜蓿质体蓝素启动子和 5，UTR、来自A/布里斯班/10/2007(Η3Ν2)的Η3的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3，UTR 和终止子序列。图61显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO :70)，其含有苜蓿质体蓝素启动子和 5，UTR、来自A/威斯康星/67/2005(Η3Ν2)的Η3的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3，UTR和终止子序列。图62显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO :71)，其含有苜蓿质体蓝素启动子和 5，UTR、来自A/马/布拉格/56 (H7N7)的H7的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3，UTR和终 止子序列。图63显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO :72)，其含有苜蓿质体蓝素启动子和 5，UTR、来自B/马来西亚/2506/2004的HA的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3，UTR和终 止子序列。图64显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO :73)，其含有苜蓿质体蓝素启动子和 5’ UTR、来自B/佛罗里达/4/2006的HA的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’ UTR和终止子 序列。图65显示A/新喀里多尼亚/20/99 (HlNl)(由SEQ ID NO :33编码)、A/布里斯班 /59/2007 (HlNl) (SEQ ID NO 48)、A/ 所罗门群岛 /3/2006 (HlNl) (SEQ ID NO 49)的 HA 与 SEQ ID NO 9的共有氨基酸序列(SEQ ID NO :74)。Xl (第3位)是A或V ;X2 (第52位) 是D或N;X3(第90位)是K或R;X4(第99位)是K或T ;X5(第111位)是Y或H;X6(第 145位)是V或T ;X7 (第154位)是E或K ;X8 (第161位)是R或K ;X9 (第181位)是 V或A;X10(第203位)是D或N ;X11(第205位)是R或K ;X12 (第210位)是T或K; X13 (第225位)是R或K ；X14 (第268位)是W或R ；X15 (第283位)是T或N ；X16 (第 290位)是E或K ；X17 (第432位)是I或L ；X18 (第489位)是N或D。图66显示由SEQ ID NO 33编码的Hl (新喀里多尼亚)(AAP34324. 1)的氨基酸序 列(SEQ ID NO 75)。图67显示由SEQ ID NO 35编码的Hl (波多黎各)(NC_0409878. 1)的氨基酸序列 (SEQ ID NO 76)。图68显示828#表达盒之一部分(从PacI (启动子上游)至AscI (紧邻NOS终止 子下游))的核酸序列。CPMV HT 5’ UTR序列与经突变ATG用下划线标出。ApaI限制性位 点(紧邻待表达之蛋白质(在该情形中为C5-1 κ轻链)编码序列的ATG上游)。图69显示663#构建体之一部分(从HindIII(在多克隆位点中，质体蓝素启动子 的上游)至EcoRI(紧邻质体蓝素终止子的下游))的核酸序列。下划线标示H5(来自A/ 印度尼西亚/5/2005)编码序列与PDI SP融合。图70显示787#构建体之一部分(从HindIII(在多克隆位点中，质体蓝素启动子 的上游)至EcoRI(紧邻质体蓝素终止子的下游))的核酸序列。下划线标示Hl (来自A/ 布里斯班/59/2007)编码序列与PDI SP融合。图71显示790#构建体之一部分(从HindIII(在多克隆位点中，质体蓝素启动子 的上游)至EcoRI(紧邻质体蓝素终止子的下游))的核酸序列。下划线标示H3(来自A/ 布里斯班/10/2007)编码序列与PDI SP融合。图72显示798#构建体之一部分(从HindIII(在多克隆位点中，质体蓝素启动子 的上游)至EcoRI(紧邻质体蓝素终止子的下游))的核酸序列。下划线标示HA(来自B/ 佛罗里达/4/2006)编码序列与PDI SP融合。图73显示580#构建体之一部分(从PacI (35S启动子上游)至AscI (紧邻NOS 终止子下游))的核酸序列。下划线标示Hl (来自A/新喀里多尼亚/20/1999)编码序列与
18PDI SP融合。图74显示685#构建体之一部分(从PacI (35S启动子上游)至AscI (紧邻NOS 终止子下游))的核酸序列。下划线标示H5 (来自A/印度尼西亚/5/2005)编码序列。图75显示686#构建体之一部分(从PacI (35S启动子上游)至AscI (紧邻NOS 终止子下游))的核酸序列。下划线标示H5(来自A/印度尼西亚/5/2005)编码序列与PDI SP融合。图76显示732#构建体之一部分(从PacI (35S启动子上游)至AscI (紧邻NOS 终止子下游))的核酸序列。下划线标示Hl (来自A/布里斯班/59/2007)编码序列。图77显示733#构建体之一部分(从PacI (35S启动子上游)至AscI (紧邻NOS 终止子下游))的核酸序列。下划线标示Hl (来自A/布里斯班/59/2007)编码序列与PDI SP融合。图78显示735#构建体之一部分(从PacI (35S启动子上游)至AscI (紧邻NOS 终止子下游))的核酸序列。下划线标示H3 (来自A/布里斯班/10/2007)编码序列。图79显示736#构建体之一部分(从PacI (35S启动子上游)至AscI (紧邻NOS 终止子下游))的核酸序列。下划线标示H3(来自A/布里斯班/10/2007)编码序列与PDI SP融合。图80显示738#构建体之一部分(从PacI (35S启动子上游)至AscI (紧邻NOS 终止子下游))的核酸序列。下划线标示HA (来自B/佛罗里达/4/2006)编码序列。图81显示739#构建体之一部分(从PacI (35S启动子上游)至AscI (紧邻NOS终 止子下游))的核酸序列。下划线标示HA(来自B/佛罗里达/4/2006)编码序列与PDI SP融合。图82显示编码Msjl的核酸序列(SEQ ID NO :114)。图83显示1 850#构建体之一部分(从HindIII (在多克隆位点中，启动子上游) 至EcoRI (紧邻NOS终止子的下游))的核酸序列。下划线标示HSP40编码序列。图84显示1 860#构建体之一部分(从HindIII (在多克隆位点中，启动子上游) 至EcoRI (紧邻NOS终止子的下游))的核酸序列。下划线标示HSP70编码序列。图85显示1 870#构建体之一部分(从HindIII (在多克隆位点中，启动子上游) 至EcoRI (紧邻NOS终止子的下游))的核酸序列。HSP40编码序列用下划线加斜体标示， HSP70编码序列用下划线标示。A) 1-5003位核苷酸；B) 5004-9493位核苷酸。图86显示构建体R472的示意图。图87显示使用来自苜蓿蛋白质二硫键异构酶之信号肽的HA的表达的免疫印迹分 析。将获得自3株单独植物的20 μ g叶蛋白质提取物加至SDS-PAGE，而对于Hl (A/新喀里多 尼亚Λ0/99 (HlNl)来说使用5 μ g。所示对照(同源毒株的失活全病毒(whole inactivated virus, WIV))以5或20 μ g被掺入经模拟渗入的植物中。a)来自A/新喀里多尼亚/20/99 之Hl的表达，b)来自A/布里斯班/59/2007之Hl的表达，c)来自A/布里斯班/10/2007 之H3的表达，d)来自A/印度尼西亚/5/2005之H5的表达，e)来自B/佛罗里达/4/2006 之HA的表达。箭头表示对应于HAO的免疫条带。SP WT 天然的信号肽，PS PDI 苜蓿PDI 信号肽。图88显示通过对叶蛋白质提取物进行免疫印迹分析来对HA表达策略进行比较。使用基于质体蓝素或基于CPMV-HT的盒产生HA。对于CPMV-HT而言，还比较了野生型HA信 号肽与来自苜蓿PDI的信号肽。对于所分析的HA亚型来说，将20yg的蛋白质提取物加样 至SDS-PAGE，而对于Hl (新喀里多尼亚)来说加样5yg蛋白质。a)来自A/新喀里多尼亚 /20/1999之Hl的表达，b)来自A/布里斯班/59/2007之Hl的表达，c)来自A/布里斯班 /10/2007之H3的表达，d)来自A/印度尼西亚/5/2005之H5的表达，e)来自B/佛罗里达 /4/2006之B型的表达。箭头表示对应于HAO的免疫条带。包含用于HA表达之特异性载体 的特异性农杆菌属菌株在泳道上方示出。图89显示当与HSP40和HSP70共表达时HA累积的免疫印迹。Hl (新喀里多尼亚) (AGL1/540)和H3(布里斯班)(AGL1/790)单独表达或者与AGL1/R870共表达。通过对来 自经渗入叶的蛋白质提取物进行免疫印迹分析来评估HA累积水平。毒株A/新喀里多尼亚 /20/99或布里斯班/10/2007的失活全病毒(WIV)用作对照。
具体实施例方式本发明涉及病毒样颗粒的生产。更具体而言，本发明涉及含有流感病毒抗原的病 毒样颗粒的生产。下面的描述是优选的实施方案。本发明提供了含有编码来自包膜病毒的抗原(例如流感血凝素(HA))之核苷酸序 列的核酸，其与在植物中有活性的调控区有效连接。此外，本发明提供了在植物中生产病毒样颗粒(VLP)的方法。所述方法包括将编 码抗原并与在植物中有活性之调控区有效连接的核酸导入所述植物或其部分中，以及在允 许所述核酸表达的条件下培养所述植物或其部分，从而产生VLP。VLP可由流感病毒制得，然而，VLP还可由其它质膜来源的病毒制得，包括但不限 于麻疹病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒和HIV。本发明包括可感染人的所有类型流感病毒的VLP，包括例如但不限于非常流行的 A型(HlNl)亚型(例如A/新喀里多尼亚/20/99 (HlNl) )、A/印度尼西亚/5/05亚型(H5N1) (SEQ ID NO 60)以及较不常见的 B 型(例如 SEQ ID NO :26，图 100)、C 型(SEQ ID NO :27， 图10P)以及从其它流感病毒亚型得到的HA。本发明中其它流感病毒亚型的VLP还包括例 如 A/布里斯班/59/2007 (Hmi ； SEQ ID NO :48)、A/所罗门群岛/3/2006 (Hmi ； SEQ ID NO: 49)、A/ 新加坡/1/57 (H2N2 ；SEQ ID NO 54)、A/ 安徽 /1/2005 (H5N1 ；SEQ ID NO 55)、A/ 越 Fl/1194/2004 (H5N1 ；SEQ IDNO :56)、A/水鸭 / 香港/W312/97 (H6N1 ;SEQ ID N0:57)、A/香 港/1073/99 (H9N2 ；SEQ ID NO 59)、A/ 布里斯班/10/2007 (H3N2 ；SEQ ID NO 50)、A/ 威斯 康星 /67/2005 (H3N2 ；SEQ ID NO :51)、A/ 马 / 布拉格 /56 (H7N7 ；SEQID NO 58)、B/ 马来西 亚/2506/2004 (SEQ ID NO 52)或 B/佛罗里达/4/2006 (SEQ ID NO :53)。本发明还涉及感染其它哺乳动物或宿主动物的流感病毒，所述哺乳动物或宿主动 物为例如人、灵长类、马、猪、鸟类、禽类、水禽、候鸟、鹌鹑、鸭、鹅、家禽、鸡、骆驼、犬科动物、 狗、猫科动物、猫、虎、豹、麝猫、水貂、石貂、雪貂、宠物、家畜、小鼠、大鼠、海豹、鲸等。可在质膜来源的病毒中表达的其它抗原的非限制性实例包括HIV的衣壳蛋白 P24 ；包膜蛋白gpl20、gp41 ；结构蛋白VP30和VP35 ；丝状病毒(例如埃博拉病毒或马尔堡 病毒)的Gp/SGP(糖基化内膜蛋白)，或副粘病毒(例如麻疹病毒)的H蛋白以及F蛋白。
本发明还包括但不限于从细胞质膜获得脂质包膜的流感病毒来源的VLP，所述 VLP蛋白在所述细胞中表达。例如，如果VLP在基于植物的系统中表达，那么VLP可从该细 胞的质膜获得脂质包膜。一般而言，术语“脂质”是指脂溶性的(亲脂性的)天然分子。更具体地，该术语 还用于指脂肪酸及其衍生物(包括甘油三酯、甘油二酯和甘油单酯以及磷脂)以及其它脂 溶性的含固醇的代谢物或固醇类。磷脂连同糖脂、固醇和蛋白质是所有生物膜的主要组分。 磷脂的实例包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油等。固 醇的实例包括动物固醇(例如胆固醇)和植物固醇(例如谷留醇)以及固醇糖苷。已经在 多种植物中鉴定了超过200种的植物固醇，最常见的有菜油固醇、豆固醇、麦角固醇、菜子 固醇、Δ-7-豆固醇、Δ-7-燕麦固醇、胡萝卜固醇(daunosterol)、谷固醇、24-甲基胆固醇、 胆固醇或β-谷固醇。本领域技术人员应当理解，细胞质膜的脂质组成可随细胞或获得细 胞之生物体的培养或生长条件而变化。细胞膜通常包含脂双层以及各种功能的蛋白质。在脂双层中可发现局部浓缩的特 定脂质，称为“脂质筏”。不希望受理论限制，脂质筏可在内吞和胞吐作用、病毒或其它感染 原的进入或逸出、细胞间信号转导、与细胞或生物体的其它结构组分(例如细胞内和细胞 外基质)相互作用中起重要作用。针对流感病毒，本文所用的术语“血凝素”或“ΗΑ”是指存在于流感病毒颗粒外部 的糖蛋白。HA是同三聚体I型膜糖蛋白，通常含有信号肽、HAl结构域和ΗΑ2结构域，所述 ΗΑ2结构域含有C端的跨膜锚定位点以及小的胞质尾(图1Β)。编码HA的核苷酸序列是 公知的并且是可获得的，参见例如BioDefence Public Health base (流感病毒；参见URL biohealthbase. org)或美国国立生物技术信息中心(参见URL :ncbi. nlm. nih. gov)，其均 通过引用并入本文。术语“同三聚体”或“同三聚体的”表示寡聚体由三个HA蛋白分子形成。不希望受 理论限制，HA蛋白是作为约75kDa的单体前体蛋白(HAO)合成的，其在表面处组装成长形 的三聚体蛋白。在三聚化发生之前，前体蛋白在保守的活化切割位点(也称为“融合肽”) 处被切割成2条通过二硫键连接的多肽链——HAl和HA2 (包含跨膜区)。HAl区段的长度 可以为328个氨基酸，HA2区段的长度可以为221个氨基酸。尽管该切割对于病毒感染性 可能是重要的，但是其对于蛋白质三聚化却不是必需的。HA插入宿主细胞的内质网(ER)膜 内，信号肽切割和蛋白质糖基化是共翻译事件。正确的HA重折叠需要蛋白质糖基化以及形 成6个链内二硫键。HA三聚体在顺式-和反式-高尔基体复合物内组装，跨膜结构域在三 聚化加工中起作用。经菠萝蛋白酶处理的HA蛋白(缺少跨膜结构域)的晶体结构显示在 流感毒株之间具有高度保守的结构。还已明确，HA在感染过程中发生重大的构象变化，这 需要将前体HAO切割成2条多肽链(HAl和HA2)。HA蛋白可被加工(即包含HAl和HA2结 构域)，或者可以不进行加工(即包含HAO结构域)。本发明涉及包含跨膜结构域并包含HAl和HA2结构域的HA蛋白的用途，例如所述 HA蛋白可以是ΗΑ0，或是包含HAl和HA2的经加工HA。所述HA蛋白可用于利用植物、植物 细胞或表达系统生产或形成VLP。本发明的HA可得自任意亚型。例如，HA可以是HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、 H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16亚型或B型流感病毒。本发明的重组HA还可包含基
21于本领域公知的任意血凝素序列的氨基酸序列——参见例如BioDefence Public Health base (流感病毒；参见URL:bi0healthbase.0rg)或者美国国立生物技术信息中心(参见 URL :ncbi. nlm. nih. gov)。此外，HA可基于从一种或多种新发现的或新鉴定出的流感病毒 中分离出的血凝素的序列。本发明还包括VLP，其包含得自一种或多种流感病毒亚型的HA。例如，VLP可包含 来自以下亚型的一种或多种HA :H1 (由SEQ ID NO :28编码)、H2 (由SEQ ID而12编码)、 H3 (由 SEQ ID NO 13 编码)、H4 (由 SEQ ID NO 14 编码)、H5 (由 SEQ ID NO 15 编码)、 H6(由 SEQID NO :16 编码)、H7(由 SEQ ID NO :11 编码)、H8 (由 SEQ ID N0:17 编码)、 H9(由 SEQ ID NO :18 编码)、H10(由 SEQ ID NO :19 编码)、H11(由 SEQ ID NO :20 编码)、 H12 (由 SEQ ID NO 21 编码)、H13 (由 SEQ ID NO 27 编码)、H14 (由 SEQ ID NO 23 编码)、 H15 (由 SEQ IDNO 24 编码)、H16 (由 SEQ ID NO 25 编码)或 B 型流感病毒(由 SEQ IDNO 26编码)，或其组合。来自一种或多种流感病毒亚型的一种或多种HA可以在植物或昆虫细 胞内共表达，以确保所述一种或多种HA的合成导致形成含有得自一种或多种流感病毒亚 型之HA组合的VLP。对HA之组合的选择可通过由VLP制得之疫苗的目的用途来确定。例 如，用于接种鸟类的疫苗可包含HA亚型的任意组合，而用于接种人的VLP可包含一种或多 种HI、H2、H3、H5、H7、H9、H10、Ni、N2、N3和N7亚型。然而，也可根据接种用途来制备其它 HA亚型的组合。因此，本发明涉及含有一种或多种HA亚型的VLP，例如两个、三个、四个、五个、六 个或更多HA亚型。本发明还提供了编码血凝素的核酸，当其在植物中表达时形成VLP。示例性核酸可包含来自选定流感病毒亚型毒株的血凝素的核苷酸序列。例如， A(HlNl)亚型例如A/新喀里多尼亚/20/99 (HlNl) (SEQ IDNO :33)、A/印度尼西亚/5/05亚 型(H5N1)(包含构建体#660 ；SEQ ID NO 60)以及较不常见的B型(例如SEQ ID NO :26， 图100)和C型(SEQ IDNO :27，图10P)，以及从其它流感病毒亚型获得的HA。本发明中其 它流感病毒亚型的VLP还包括例如A/布里斯班/59/2007 (H1N1 ；SEQ IDNO 36)、A/所罗 门群岛 /3/2006 (H1N1 ；SEQ ID NO 37)、A/ 新加坡 /1/57 (H2N2 ；SEQ ID NO 42)、A/ 安微 /1/2005 (H5N1 ；SEQ ID NO :43)、A/越南/1194/2004 (H5m ;SEQ ID NO :44)、A/水鸭 / 香 港 /W312/97 (H6N1 ；SEQID NO 45)、A/ 香港 /1073/99 (H9N2 ；SEQ ID NO 47)、A/ 布里斯班 /10/2007 (H3N2 ；SEQ ID NO 38)、A/ 威斯康星 /67/2005 (H3N2 ；SEQ ID NO 39)、A/ 马 / 布 拉格 /56 (H7N7 ；SEQ ID NO 46)、B/ 马来西亚 /2506/2004 (SEQ IDNO 40)或 B/ 佛罗里达 /4/2006(SEQ ID NO 41)。血凝素的正确折叠对蛋白质稳定性、多聚体形成、VLP形成和HA之功能(血细胞 凝集能力)等流感病毒血凝素特性可以是重要的。蛋白质折叠可受一个或多个因素影响， 包括但不限于蛋白质序列，蛋白质相对丰度，细胞内拥挤程度，可与折叠的、部分折叠的或 未折叠的蛋白质结合或瞬时缔合的辅因子的利用度，一种或多种伴侣蛋白的存在情况等。热休克蛋白(Hsp)或应激蛋白是伴侣蛋白的实例，其可参与多种细胞过程包括蛋 白质合成、细胞内运输、防止错误折叠、防止蛋白质凝集、蛋白质复合物的组装和去组装、蛋 白质折叠以及蛋白质解聚。这样的伴侣蛋白的实例包括但不限于Hsp60、Hsp65、Hsp70、 Hsp90、HsplOO、Hsp20_30、HsplO、Hspl00-200、HsplOO、Hsp90、Lon, TF55、FKBP、亲环蛋白(CyCl0philin)、ClpP、GrpE、泛素、钙联接蛋白(calnexin)和蛋白质二硫键异构酶。参见， 例如 Macario, A. J. L. , Cold Spring HarborLaboratory Res. 25 :59_70· 1995 ；Parsell, D. Α. & Lindquist, S. Ann. Rev. Genet. 27 :437_496 (1993)；美国专利 No. 5，232，833。在一些 实例中，特定组的伴侣蛋白包括Hsp40和Hsp70。Hsp70的实例包括来自哺乳动物细胞的Hsp72和Hsc73、来自细菌特别是分 枝杆菌(如麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)禾口牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(例如 BaciHe-Calmette Guerin，本 文中称为Hsp71))的DnaK。来自大肠杆菌、酵母和其它原核生物的DnaK、以及来自真核生物 (例如拟南芥)的BiP和Grp78 (Lin等，2001 (Cell Stress and Chaperones 6:201-208))。 Hsp70的一个具体实例是拟南芥Hsp70(由SEQ ID NO: 122或SEQ ID NO :123编码)。Hsp70 能够特异性地结合ATP以及未折叠多肽和肽，从而参与蛋白质折叠和解折叠以及参与蛋白 质复合物的组装和去组装。Hsp40的实例包括来自原核生物(例如大肠杆菌和分枝杆菌)的DnaJ以及来自 真核生物(例如苜蓿(Frugis 等，1999. Plant MolecularBiology 40:397-408))的 HSJ1、 HDJl 和 Hsp40。Hsp40 的一个具体实例是紫花苜蓿(M. sativa)MsJl(由 SEQ ID NO :121、 123或114编码)。Hsp40在蛋白质折叠、耐热性和DNA复制等细胞活动中作为分子伴侣起作用。在各Hsp中，Hsp70及其辅伴侣蛋白(co-chaperone) Hsp40与合成完成前还在翻 译的新合成多肽的稳定性相关。不希望受理论的限制，Hsp40与未折叠(新生或新转移的) 多肽的疏水片区结合，因而有利于Hsp70-ATP复合物与该多肽的相互作用。ATP水解导致多 肽、Hsp70和ADP之间形成稳定的复合物并释放Hsp40。Hsp70_ADP复合物与多肽之疏水片 区的缔合阻止其与其它疏水片区相互作用，并防止不正确折叠以及与其它蛋白质形成凝集 体(综述见于 Hartl，FU. 1996. Nature381 :571_579)。同样不希望受理论限制，随着重组蛋白质表达系统中蛋白质的产生增加，重组蛋 白质表达的拥挤效应可能导致由于错误折叠之多肽发生降解导致的重组蛋白质的凝集和/ 或累积减少。天然的伴侣蛋白能够有利于低水平重组蛋白质的正确折叠，然而当表达水平 增加时，天然伴侣蛋白可变为限制因素。经农杆菌渗入之叶中血凝素的高水平表达可导致 血凝素多肽在胞质溶胶中累积，而与一种或多种伴侣蛋白(例如Hsp70、Hsp40或者Hsp70 及Hsp40两者)可提高表达该多肽之细胞的胞质溶胶中的稳定性，因而减少错误折叠或凝 集之血凝素多肽的水平，并增加作为稳定血凝素(其呈现允许发生血细胞凝集和/或病毒 样颗粒形成的三级和四级结构特征)之多肽累积物的数目。因此，本发明还提供了在植物中生产流感病毒VLP的方法，其中将编码流感病毒 HA的第一核酸与编码伴侣蛋白的第二核酸共表达。所述第一核酸和第二核酸可在同一步骤 中导入植物，或者可先后导入植物。本发明还提供了在植物中生产流感病毒VLP的方法，其 中所述植物包含所述第一核酸，所述第二核酸随后被导入。本发明还提供了包含编码一种或多种流感病毒血凝素之核酸以及编码一种或多 种伴侣蛋白之核酸的植物。已提出，在流感病毒血凝素表达和/或分泌过程中加工N端信号肽(SP)序列对折 叠过程起作用。术语“信号肽” 一般是指通常见于血凝素多肽N端的短(约5 30个氨基酸)氨基酸序列，其可指导新翻译之多肽转运至特定细胞器或者辅助多肽特定结构域的定 位。血凝素的信号肽将该蛋白质的转运靶向至内质网中，并已提出其辅助新生血凝素多肽 相对于近N端结构域之膜锚定结构域的定位，以辅助成熟血凝素的切割和折叠。除去信号 肽(例如，通过信号肽酶)可需要精确的切割以及去除信号肽以提供成熟血凝素——这一 精确切割可取决于若干因素中的任意因素，包括信号肽的一部分还是全部、切割位点侧翼 的氨基酸序列、信号肽的长度，或者这些因素的组合，并且并非所有因素均适用于任一给定 序列。信号肽可以是所表达之血凝素天然存在的，或者重组血凝素包含来自第一流感病 毒类型、亚型或毒株的信号肽，而其余部分来自第二流感病毒类型、亚型或毒株。例如，HA亚 型HI、H2、H3、H5、H6、H7、H9或B型流感病毒的天然信号肽可用于在植物系统中表达HA。信号肽还可以是非天然的，例如来自结构蛋白或非流感病毒之病毒的 HA，或者来自植物、动物或细菌多肽。示例性信号肽是苜蓿蛋白质二硫键异构酶 (PDISP)(登记号Zl 1499的32-103位核苷酸；SEQ ID NO :34 ；图17 ；氨基酸序列 MAKNVAIFGLLFSLLLLVPSQIFAEE)。本发明还提供了包含天然或非天然信号肽的流感病毒血凝素以及编码此类血凝 素的核酸。流感病毒HA蛋白在分子量、等电点、大小、聚糖成分等方面表现出一系列相似之 处和不同之处。各种血凝素的物理化学性质可用于区分在植物、昆虫细胞或酵母系统中表 达的HA，并且当多于一种HA在单一系统中共表达时其可具有特殊用途。所述物理化学性质 的实例示于表1中。
2权利要求
核酸，其包含与在植物中有活性之调控区有效连接的编码流感血凝素(HA)的核苷酸序列。
2.权利要求1的核酸，其中所述HA包含天然或非天然的信号肽。
3.权利要求2的核酸，其中所述非天然的信号肽是蛋白质二硫键异构酶信号肽。
4.权利要求1的核酸，其中所述HA是A型流感病毒、B型流感或者是A型流感的亚型， 其选自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 H16。
5.权利要求1的核酸，其中所述HA来自A型流感，选自H1、H2、H3、H5、H6、H7*H9。
6.在植物中生产流感病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括a)将权利要求1的核酸导入所述植物或植物部分中，以及b)在允许所述核酸表达的条件下培养所述植物或植物部分，从而生产VLP。
7.权利要求6的方法，其中在所述导入步骤(步骤a)中，所述核酸在该植物中瞬时表达。
8.权利要求6的方法，其中在所述导入步骤(步骤a)中，所述核酸在该植物中稳定表达。
9.权利要求6的方法，其还包括以下步骤c)收获所述宿主并纯化所述VLP。
10.权利要求6的方法，其中在所述导入步骤(步骤a)中，包含编码一种或多种伴侣蛋 白之核苷酸序列的第二核酸被导入所述植物中。
11.权利要求10的方法，其中所述一种或多种伴侣蛋白选自Hsp40和Hsp70。
12.在植物中生产流感病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括a)提供包含权利要求1之核酸的植物或植物部分，以及b)在允许所述核酸表达的条件下培养所述植物或植物部分，从而生产所述VLP。
13.包含权利要求1之核酸的植物。
14.权利要求13的植物，其还包含含有与在植物中有活性之调控区有效连接的编码一 种或多种伴侣蛋白的核苷酸序列的核酸。
15.权利要求14的植物，其中所述一种或多种伴侣蛋白选自Hsp40和Hsp70。
16.病毒样颗粒(VLP)，其包含流感病毒血凝素(HA)蛋白以及一种或多种源自植物的 脂质。
17.权利要求16的病毒样颗粒(VLP)，其中所述HA是A型流感、B型流感或者是A型 流感的亚型，其选自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 H16。
18.权利要求17的VLP，其中所述HA来自A型流感，其选自HI、H2、H3、H5、H6、H7和H9。
19.组合物，其包含有效剂量的权利要求16之VLP以及可药用载体。
20.诱导对象中针对流感病毒感染之免疫的方法，其包括施用权利要求16的病毒样颗粒。
21.权利要求20的方法，其中所述病毒样颗粒经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内 或皮下施用给对象。
22.病毒样颗粒(VLP)，其包含具有植物特异性N-聚糖或经修饰N-聚糖的流感病毒HA。
23.权利要求22的病毒样颗粒(VLP)，其中所述HA是A型流感、B型流感或者是A型 流感的亚型，其选自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 H16。
24.权利要求23的VLP，其中所述HA来自A型流感，其选自HI、H2、H3、H5、H6、H7和H9。
25.组合物，其包含有效剂量的权利要求22之VLP以及可药用载体。
26.诱导对象中针对流感病毒感染之免疫的方法，其包括施用权利要求25的组合物。
27.权利要求26的方法，其中所述组合物经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮 下施用给对象。
全文摘要
本发明提供了在植物或植物部分内合成流感病毒样颗粒(influenzavirus-like particle，VLP)的方法。所述方法包括在植物中表达流感HA并通过体积排阻色谱进行纯化。本发明还涉及包含流感HA蛋白和植物脂质的VLP。本发明还涉及编码流感HA的核酸以及载体。所述VLP可用于配制流感疫苗，或者可用于充实现有的疫苗。
文档编号C12N7/01GK101978066SQ200980109781
公开日2011年2月16日 申请日期2009年1月12日 优先权日2007年11月27日
发明者弗雷德里克·奥尔斯, 皮埃尔-奥列弗·拉瓦, 米凯莱·达吉斯, 索尼娅·特雷帕尼耶, 纳萨莉·兰德里, 路易斯-菲利普·韦齐纳, 马克-安德烈·德奥斯特, 马农·科图雷 申请人:麦迪卡格公司