专利名称：起因于hpv的癌细胞的检测方法、组织是否为重度不典型增生以上阶段组织的判断方法及 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种起因于HPV的癌细胞的检测方法、组织是否为重度不典型增生以 上阶段组织的判断方法及其所用引物对和试剂盒。
背景技术：
人类乳头状瘤病毒(Human papillomavirus，以下称“HPV”)是一种以双链闭环 DNA为基因组的病毒，容易诱发增生性病变。HPV分类为100多种亚型。已知HPV的亚型的 共同区域有编码非结构性蛋白质的El区、E2区、E4区、E5区、E6区和E7区、编码外壳蛋白 质的Ll区和L2区以及LCR。HPV的DNA从宫颈癌和宫颈部不典型增生的病变部位以及口腔癌和咽喉癌的组织 检出。因此，感染HPV被认为是宫颈癌、口腔癌和咽喉癌的风险因素之一。多数情况下感染 HPV的方式都是从感染开始一定时间后HPV从细胞自然消失的一过性感染。然而，HPV感染 中有5 10%的感染为HPV不消失、引起宫颈癌的持续性感染。在宫颈组织诊断中，宫颈部位不典型增生作为癌细胞产生的前期阶段，根据上皮 内出现异型细胞的程度分为轻度、中度及重度三个阶段的不典型增生。从重度不典型增生 再进一步恶化，宫颈部位不典型增生病变为癌细胞出现在上皮内的阶段。宫颈部位不典型 增生还进一步进展为癌细胞局限于上皮内的“上皮内癌”以及癌细胞从上皮扩展到皮下组 织的“微小浸润扁平上皮癌”和“浸润扁平上皮癌”。轻度不典型增生或中度不典型增生的病变基本上都不进行治疗，只观察进展。然 而放纵重度不典型增生的前驱病变不治疗，病变很可能会进展为浸润癌，因此对于诊断为 重度不典型增生的受检者大多实施手术等治疗。因此，判断受检者病变是否为重度不典型 增生或比此更严重的阶段对于决定受检者的治疗方法是十分重要的。高等真核生物的染色体DNA中，构成DNA的碱基中胞嘧啶的第5位会被甲基化。高 等真核生物中的DNA甲基化作为抑制基因信息表达的机构发挥其作用。近年来，有报告显 示在基因组DNA中有无HPV甲基化与癌症的发病有着非常密切的关系。比如，专利文献1中记载，当患者宫颈部位的细胞中所含HPV的E6区和LCR未甲 基化时，宫颈癌细胞的存在会得到更强的显示。然而，未甲基化的E6区和LCR有时会从宫 颈癌细胞以外的细胞中检测出来。因此，很难仅通过确认E6区和LCR的甲基化状态就从患 者宫颈部位的细胞中精确地检测出起因于HPV的癌细胞。非专利文献1中记载，在宫颈癌中，HPV-18的Ll区虽然甲基化程度很高，但LCR和 E6区却未甲基化。在此，非专利文献1是先决定用与HPV-18基因组DNA相应的亚硫酸氢盐 处理后的核酸的碱基序列，再确认其甲基化状态。然而，这种通过决定碱基序列来确认DNA 甲基化的方法费时且操作烦琐。很难从采自受检者的试样中简便地检测出起因于HPV的癌 细胞。非专利文献1 Tolga Turan et al.，病毒学(Virology) 349 (2006) 175-183
4
专利文献1 特表2006-522607号公报
发明内容
本发明的目的之一是提供一种精确、简便地检测出起因于HPV的癌细胞的方法。 本发明的另一目的是提供一种能够精确、简便地判断组织是否为重度不典型增生以上阶段 的组织。本发明还提供一种能够精确、简便地检测出起因于HPV的癌细胞和判断组织是否 处于重度不典型增生以上阶段的引物对。8口，本发明涉及(1) 一种起因于HPV的癌细胞检测方法，包括以下步骤(A)从受检者细胞中制备含有DNA的试样；(B)使上述步骤(A)获得的试样中所含DNA中的非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基， 获取转换试样；(C)用上述步骤(B)获得的转换试样、第一引物和第二引物以由第一引物杂交部 位到第二引物杂交部位之间连续的碱基序列构成的核酸为扩增对象进行核酸扩增反应，其 中第一引物与HPV的L1区或L2区中有CpG部位的碱基序列中由存在于CpG部位以外的胞 嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交，第二引物与HPV的LCR或E6区中有CpG 部位的碱基序列中由胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交；及(D)根据上述步骤(C)的核酸扩增反应结果，检测出起因于HPV的癌细胞；(2)上述(1)所述检测方法，其特征在于所述步骤(A)包括(a)混合含有表面活性剂的溶液和受检者细胞，获得混合物、(b)将上述步骤(a)获得的混合物进行离心分离，沉淀不溶物，获得上清、及(c)分取上述步骤(b)获得的上清；(3)上述(2)所述检测方法，其特征在于所述步骤(A)在步骤(a)和步骤(b)之间还有步骤(al)，在步骤(al)，对步骤(a) 获得的混合物进行物理处理，使DNA从细胞中游离，在所述步骤(b)将上述步骤(al)获得的产物进行离心分离，沉淀不溶物，获得上 清；(4) 一种判断组织是否处于重度不典型增生以上阶段的判断方法，包括以下步 骤(A)从受检者组织制备含有DNA的试样；(B)将上述步骤(A)获得的试样所含DNA中的非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基，获 取转换试样；(C)用上述步骤(B)获得的转换试样、第一引物和第二引物，以由第一引物杂交部 位到第二引物杂交部位之间的连续的碱基序列构成的核酸为扩增对象进行核酸扩增反应， 其中第一引物与HPV的L1区或L2区中有CpG部位的碱基序列中由存在于CpG部位以外的 胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交，第二引物与HPV的LCR或E6区有CpG 部位的碱基序列中由胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交；及(D)根据上述步骤(C)的核酸扩增反应结果判断组织是否处于重度不典型增生以 上阶段；
(5)上述(4)所述判断方法，其特征在于组织是宫颈部位的组织；(6) 一种引物对，这种引物对用于通过核酸扩增反应扩增在由非甲基化胞嘧啶转 换为其他碱基的HPV基因组DNA碱基序列构成的核酸中由第一引物杂交部位到第二引物杂 交部位之间的连续的碱基序列构成的核酸，该引物对包括第一引物，与HPV的L1区或L2区中有CpG部位的碱基序列中由存在于CpG部位 以外的胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交，第二引物，与HPV的LCR或E6区中有CpG部位的碱基序列中由胞嘧啶转换为其他 碱基的碱基序列构成的核酸杂交；(7)上述(6)所述引物对，其特征在于第一引物是一种与HPV的L1区中有CpG部 位的碱基序列中由存在于CpG部位以外的胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸 杂交的引物；(8)上述(6)所述引物对，其特征在于第二引物是一种与HPV的LCR中有CpG部 位的碱基序列中由胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交的引物；(9)上述(6)所述引物对，其特征在于其他碱基指尿嘧啶或胸腺嘧啶；(10)上述(6)所述引物对，其特征在于第一引物和第二引物均用于通过聚合酶 链式反应法(PCR)、链置换反应法、连接酶链式反应法(LCR)或转录扩增法扩增核酸；(11) 一种起因于HPV的癌症诊断用试剂盒，包括上述(6)所述引物对以及将核酸 中的非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基的非甲基化胞嘧啶诱变剂；(12)上述(11)所述诊断用试剂盒，其特征在于非甲基化胞嘧啶诱变剂是亚硫酸
氢盐；(13)上述(11)所述诊断用试剂盒，其特征在于起因于HPV的癌症为宫颈癌、口 腔癌或咽喉癌；(14) 一种不典型增生阶段诊断用试剂盒，其包括上述(6)所述引物对和将核酸中 的非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基的非甲基化胞嘧啶诱变剂。
图1为HPV基因结构的简要说明图。图2为植入SiHa细胞的HPV16的基因组DNA中甲基化CpG部位和非甲基化CpG 部位的模式图。图3为电泳图，显示了用实施例1、比较例1和比较例2的各引物对和由正常组织 试样及癌组织试样制备的各分析用试样进行核酸扩增后的扩增产物的结果。图4为植入C4-1细胞的HPV18的基因组DNA中甲基化CpG部位和非甲基化CpG 部位的模式图。图5为显示用实施例1的引物对和从手术摘取试样及活检试样制备的各分析用试 样进行核酸扩增后扩增产物的结果的电泳图。图6为显示来源于手术摘取试样的HPV18的基因组DNA中甲基化CpG部位和非甲 基化CpG部位的模式图。图7为显示来源于手术摘取试样的HPV58的基因组DNA中甲基化CpG部位和非甲 基化CpG部位的模式图。
图8为显示来源于活检试样的HPV58的基因组DNA中甲基化CpG部位和非甲基化 CpG部位的模式图。
具体实施例方式本发明的引物对包括第一引物和第二引物，第一引物与HPV的L1区或L2区中有 CpG部位的碱基序列(也称“第一碱基序列”)中由存在于CpG部位以外的胞嘧啶转换为其 他碱基的碱基序列(也称“第二碱基序列”)构成的核酸杂交，第二引物与HPV的LCR或E6 区中有CpG部位的碱基序列(也称“第三碱基序列”)中由胞嘧啶转换为其他碱基的碱基 序列(也称“第四碱基序列”)构成的核酸杂交，此引物对用于通过核酸扩增反应扩增由与 HPV的基因组DNA相应的非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸中由第一 引物杂交部位到第二引物杂交部位之间连续的碱基序列构成的的核酸。上述第二碱基序列 是通过转换第一碱基序列构成的核酸而形成的核酸的碱基序列，除存在于CpG部位以外的 胞嘧啶转换为其他碱基外，均与第一碱基序列对应。上述第四碱基序列是转换由第三碱基 序列构成的核酸后形成的核酸的碱基序列，除全部胞嘧啶转换为其他碱基外，均与第三碱 基序列相对应。本发明的引物对具有一大特征就是含有第一引物和第二引物，其中第一引物与 HPV的L1区或L2区有CpG部位的碱基序列中由存在于CpG部位以外的胞嘧啶转换为其他 碱基的碱基序列构成的核酸杂交，第二引物与HPV的LCR或E6区有CpG部位的碱基序列中 由胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交。起因于HPV的癌细胞中所含HPV基因组DNA的L2区或L1区的CpG部位的胞嘧啶 被甲基化，且LCR或E6区中的CpG部位胞嘧啶未甲基化。因此，将本发明的引物对用于核 酸扩增反应，可以特异性地扩增由与造成癌变的HPV的基因组DNA相应的非甲基化胞嘧啶 转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸。以此，使用本发明的引物对可以精确、简便地检测 出起因于HPV的癌细胞。因此，使用本发明的引物对也可以精确、简便地诊断宫颈癌、口腔 癌及咽喉癌。存在于重度不典型增生以上阶段的病变部位的HPV基因组DNA，其L2区或L1区的 CpG部位的胞嘧啶甲基化，且LCR或E6区中的CpG部位胞嘧啶未甲基化。因此，将本发明的 引物对用于核酸扩增反应，可以特异性地扩增由与存在于重度不典型增生以上阶段的病变 部位的HPV基因组DNA相应的非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸。因 此，使用本发明的引物对可以精确、简便地诊断不典型增生的阶段。而且，使用本发明的引 物对可以精确、简便地判断组织是否处于重度不典型增生以上阶段。另外，本说明书中所谓起因于HPV的癌细胞指因感染HPV而癌变的细胞和有很高 癌变风险的细胞。更具体而言，所谓起因于HPV的癌细胞指引起宫颈癌、口腔癌或咽喉癌症 状的感染HPV细胞、宫颈癌细胞、口腔癌细胞或咽喉癌细胞。在本说明书中，所谓“重度不典型增生以上阶段”指日本妇产科学会根据“宫颈癌 处置规则1997”的分类，分类为“重度不典型增生”或比此更严重的阶段-“上皮内癌”、“微 小浸润扁平上皮癌”或“浸润扁平上皮癌”的阶段。一旦判断组织病变为这些阶段的病变， 受检者几乎都需要手术等治疗，因此，判断病变是否处于重度不典型增生以上阶段在临床 上非常重要。另一方面，比“重度不典型增生”轻的病变分类为“上皮无异常”、“轻度不典型增生”或“中度不典型增生”。病变在此阶段，受检者几乎都不必实施特别的治疗，仅观察其进展。在本说明书中，所谓“异常细胞”指异型细胞和癌细胞。在此，所谓“异型细胞”指 虽然不是癌细胞，但确认有核肿大、核染质增量、核形不规则等核异常的细胞。如上所述，起因于HPV的癌细胞有L2区或L1区的CpG部位的胞嘧啶被甲基化、 LCR或E6区中的CpG部位胞嘧啶未甲基化的HPV基因组DNA。用使非甲基化胞嘧啶转换为 其他碱基的非甲基化胞嘧啶诱变剂对上述起因于HPV的癌细胞中所含HPV基因组DNA进行 处理时，L2区或L1区的CpG部位的胞嘧啶不转换为其他碱基，而LCR或E6区中的CpG部 位胞嘧啶转换为其他碱基。因此，使用本发明的引物对，可以让用非甲基化胞嘧啶诱变剂处 理的HPV基因组DNA中、L2区或L1区的CpG部位仍为由胞嘧啶和鸟嘌呤构成的二核苷酸 碱基序列，仅对LCR或E6区中的CpG部位胞嘧啶转换为其他碱基的核酸通过核酸扩增反应 进行扩增。在本发明的引物对中，第一引物与HPV的L1区或L2区有CpG部位的碱基序列中 由存在于CpG部位以外的胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交。第二引物与 HPV的LCR或E6区有CpG部位的碱基序列中由胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核 酸杂交。因此，使用本发明的引物对可以通过一次核酸扩增反应扩增经与癌变原因-HPV基 因组DNA中的DNA相应的经非甲基化胞嘧啶诱变剂处理过的核酸，其中所述DNA为至少包 括L2区或L1区的一部分及LCR或E6区的一部分的连续区DNA。HPV 是约 8kb 的环状 DNA 病毒。HPV 有 HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、 HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73、HPV82 等。HPV基因组如图1所示，有编码非结构蛋白质的早期基因的开放阅读框(E1区、E2 区、E4区、E5区、E6区及E7区)、编码外壳蛋白质的晚期基因的开放阅读框(L1区和L2区) 以及LCR的基因区。E1区是参与病毒基因组复制的区域。E2区是参与病毒转录调节的区 域。E5区、E6区及E7区参与癌变。E6区与癌抑制基因p53结合、编码促进p53分解的蛋 白质。E7区与癌抑制基因Rb结合、编码使Rb失活的蛋白质。L1区和L2区参与外壳形成。 LCR(Long control region，长调控区)参与调节病毒基因表达。一般来说，HPV感染、侵入细胞，则HPV的基因组DNA其中的CpG部位中一定CpG 部位的胞嘧啶被生物体内的DNA甲基化机构甲基化。其中，在宫颈癌细胞中的HPV中，如图 2所示，L1区和L2区中CpG部位的胞嘧啶被甲基化，LCR和E6区CpG部位的胞嘧啶未甲基 化。表1为感染HPV细胞中所含HPV基因组DNA的L1区和L2区以及LCR和E6区的 CpG部位的甲基化状态。在此，表1所示感染HPV细胞中感染HPV细胞2为起因于HPV的 癌细胞。表1中，“〇”表示CpG部位的胞嘧啶甲基化，“ X ”表示CpG部位的胞嘧啶未甲基 化。[表 1]
8
权利要求
一种起因于HPV的癌细胞的检测方法，包括以下步骤(A)从受检者细胞中制备含有DNA的试样；(B)使所述步骤(A)获得的试样中所含DNA中的非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基，获取转换试样；(C)用所述步骤(B)获得的转换试样、第一引物和第二引物以由第一引物杂交部位到第二引物杂交部位之间连续的碱基序列构成的核酸为扩增对象进行核酸扩增反应，其中第一引物与HPV的L1区或L2区中有CpG部位的碱基序列中由存在于CpG部位以外的胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交，第二引物与HPV的LCR或E6区中有CpG部位的碱基序列中由胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交；及(D)根据所述步骤(C)的核酸扩增反应结果，检测起因于HPV的癌细胞。
2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述步骤(A)包括(a)混合含有表面活性剂的溶液和受检者细胞，获得混合物；(b)将所述步骤(a)获得的混合物进行离心分离，沉淀不溶物，获得上清；及(c)分取所述步骤(b)获得的上清。
3.根据权利要求2所述检测方法，其特征在于所述步骤(A)在步骤(a)和步骤(b)之间还有步骤(al)，即对步骤(a)获得的混合物 进行物理处理，使DNA从细胞中游离，在所述步骤(b)将所述步骤(al)获得的产物进行离心分离，沉淀不溶物，获得上清。
4.一种判断组织是否处于重度不典型增生以上阶段的判断方法，包括以下步骤(A)从受检者组织制备含有DNA的试样；(B)将所述步骤(A)获得的试样中所含DNA中的非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基，获取 转换试样；(C)用所述步骤(B)获得的转换试样、第一引物和第二引物，以由第一引物杂交部位到 第二引物杂交部位之间的连续的碱基序列构成的核酸为扩增对象进行核酸扩增反应，其中 第一引物与HPV的Ll区或L2区有CpG部位的碱基序列中由存在于CpG部位以外的胞嘧啶 转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交，第二引物与HPV的LCR或E6区有CpG部位的 碱基序列中由胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交；及(D)根据所述步骤(C)的核酸扩增反应结果，判断组织是否处于重度不典型增生以上 阶段。
5.权利要求4所述判断方法，其特征在于组织为宫颈部位的组织。
6.一种引物对，这种引物对通过核酸扩增反应扩增在由非甲基化胞嘧啶转换为其他碱 基的HPV基因组DNA碱基序列构成的核酸中由第一引物杂交部位到第二引物杂交部位之间 的连续的碱基序列构成的核酸，该引物对包括第一引物，与HPV的Ll区或L2区中有CpG部位的碱基序列中由存在于CpG部位以外 的胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交，第二引物，与HPV的LCR或E6区中有CpG部位的碱基序列中由胞嘧啶转换为其他碱基 的碱基序列构成的核酸杂交。
7.权利要求6所述引物对，其特征在于第一引物是一种与HPV的Ll区中有CpG部位的碱基序列中由存在于CpG部位以外的胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交的引物。
8.权利要求6所述引物对，其特征在于第二引物是一种与HPV的LCR中有CpG部位的碱基序列中由胞嘧啶转换为其他碱基的 碱基序列构成的核酸杂交的引物。
9.权利要求6所述引物对，其特征在于其他碱基指尿嘧啶或胸腺嘧啶。
10.权利要求6所述引物对，其特征在于第一引物和第二引物均用于通过聚合酶链式 反应法、链置换反应法、连接酶链式反应法或转录扩增法扩增核酸。
11.一种起因于HPV的癌症诊断用试剂盒，它包括权利要求6所述引物对和将核酸中的 非甲基化胞嘧啶转换为其他碱基的非甲基化胞嘧啶诱变剂。
12.权利要求11所述诊断用试剂盒，其特征在于非甲基化胞嘧啶诱变剂是亚硫酸氢盐。
13.权利要求11所述诊断用试剂盒，其特征在于起因于HPV的癌症为宫颈癌、口腔癌 或咽喉癌。
14.一种不典型增生阶段诊断用试剂盒，包括权利要求6所述引物对和将核酸中的非 甲基化胞嘧啶转换为其他碱基的非甲基化胞嘧啶诱变剂。
全文摘要
本发明提供一种能够精确、简便地检测起因于HPV的癌细胞、判断组织是否为重度不典型增生以上阶段组织的引物对、方法及其试剂盒。所用引物对包括第一引物和第二引物，其中第一引物与HPVL1区或L2区中有CpG部位的碱基序列中由在CpG部位以外的胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交，第二引物与LCR或E6区中有CpG部位的碱基序列中由胞嘧啶转换为其他碱基的碱基序列构成的核酸杂交。
文档编号C12Q1/68GK101978075SQ20098011019
公开日2011年2月16日 申请日期2009年3月18日 优先权日2008年3月21日
发明者岡智子, 梶田昌裕 申请人:希森美康株式会社