专利名称：稳定的淀粉样beta单体和寡聚体的制作方法
技术领域：
本发明涉及抵抗原纤维形成(fibrillogenesis)的单体的和寡聚的淀粉样beta 肽，它们作为抗原或筛选试剂用于治疗阿尔茨海默氏病(Alzheimer’ s disease)和其它与 蛋白错误折叠有关的疾病。
背景技术：
阿尔茨海默氏病(AD)是与老化有关的神经变性疾病，特征是，淀粉样前体蛋白 (APP)裂解产生的淀粉样- β (Αβ)蛋白的不可溶淀粉样沉积物发生累积(Blermow，K.，et al. ,Lancet 368 :387-403(2006)).因蛋白错误折叠引起的疾病有多种，AD是其中之一，另 有多达22种其它已知疾病如帕金森病(Parkinson’ s disease)和II型糖尿病(Dobson， C. Μ. , Protein Pept. Lett. 13 :219-227 (2006))。目前针对AD和大多数其它蛋白错误折 叠疾病都尚无有效疗法，部分原因是，对于这些沉积物是否有毒性以及如何导致毒性仍不 明了。事实上，虽然不可溶的淀粉样沉积物以前被认为导致AD，但最近的关注点已从其转 移到将可溶性A β寡聚种类视作毒性因子(Haass，C. and Selkoe D.J.，Nature Reviews Mol. Cell. Biol. 8 :101-112(2007))。此外，抗Αβ寡聚体的构象依赖性抗体(如多克隆 All抗体)已被发现与除了 Αβ以外的其它寡聚种类发生反应，提示蛋白错误折叠疾病 虽然涉及不同的蛋白，但这些毒性结构是共有的(Glabe，C.G.，Trends Biochem. Sci. 29 讨2巧47(2004))。因此，全球的很多研究都集中在为了药物筛选和免疫的目的分离和鉴定 这类可溶性寡聚体。但无论单体还是寡聚体性质的Aβ蛋白都高度倾向于进一步聚集形 成原纤维(frbril)。这种原纤维化是自发成核依赖性聚合反应，其反应速率对肽浓度敏感 (Lomakin, A.，et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 1125-1129 (1996)) 故而，原纤维的 形成严重制约了寡聚体制剂的寿命，以及它们所能保持的浓度。AD中涉及的野生型Αβ蛋白是在> ΙΟΟμΜ的浓度极具原纤维化倾向的肽。低 浓度(>2(^11至< ΙΟΟμΜ)时，所述蛋白倾向于缓慢寡聚(寡聚体都是含有多个单体的 可溶性结构)然后再进展成惰性纤维状态。这种寡聚状态最近被指认为神经毒性剂，并因 此被视为参与 AD 之中的毒性种类(Haass，C.，and Selkoe, D. J.，Nature Reviews Mol. Cell. Biol. 8 :101-112(2007)).在生理条件下产生这些毒性结构的通用方法涉及，4°C 将20-100 μ M肽溶液在细胞培养基(F-U)中保温或在缓冲盐溶液中保温数日(Lambert， Μ. P.，et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95 :6448-6453 (1998) ；Stine, W. B.，et al.， T. Biol. Chem. 278 11612-11622 (2003)) 0因成核率和延伸率严重依赖于肽浓度(Lomakin， Α.，et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :1125-11 (1996))，肽浓度增加超过 100 μ M 将 有损寡聚体制剂的稳定性。在传统观点所认识的淀粉样原纤维装配中，核触发的聚合和寡 聚结构甚至被认为是同类型的。寡聚体制剂因此一旦形成其寿命将非常有限且不可预料 (聚集成核是自发事件)。在4°C的稀释溶液ΟΟμΜ-25μΜ)中，Aβ (42)寡聚体制剂一般 仅稳定Mh，Ai3 (40)寡聚体制剂可能能稳定一周。在较少稀释的溶液(> ΙΟΟμΜ)中，Αβ 蛋白的不溶性大大下降。因而，在药物筛选实验中，原纤维化过程是重大缺陷，需要在相对 较高浓度稳定蛋白。
本发明旨在通过提供形成稳定寡聚体的工程化A β肽来克服这些问题。此前尚无人报道稳定的A β发夹结构，也无人报道仅含A21C/A30C 二硫键、无其它 复杂半胱氨酸的A β肽。US 2006/0018918披露了 A β异构体，其是基于仅凭考虑A β的一 级结构，并且出于稳定A β的非天然构象以便用作疫苗的目的，而对所有Ser和Ala进行多 重半胱氨酸替换。A21C和A30C突变是与另外三种或四种发生在位置Ala2，Ser8, Ser26, 和Ala42的半胱氨酸突变体一起获得的。这些Αβ异构体的氧化产生由15种可能的同工 型组成的混合物，它们有不同的分子内二硫键，其中仅3种可能的同工型包含A21C/A30C 二 硫键，但总是与其它二硫键组合。此前文献报道的A β肽二硫键突变体是L17C/U4C，L17C/M35C，和L17C/ V36C(Shivaprasad, S. and Wetzel, R.，Biochemistry 43 :153-15317 (2004)) 这些突变 都是非保守替换。而且，这些突变都是特意为研究原纤维结构中Leul7靠近Leu34，Met35， 和Val36的程度而生成的。Siivaprasad和W^tzel提供信息表明，这三种突变经历原纤维 形成时具有的延迟时间(lag times)与还原型突变(突变后的残基是半胱氨酸)和氧化 型突变(突变后的残基是胱氨酸)的几乎相同。这些作者还公开了其它同为非保守替换 的二硫键突变体，即 V18C/L34C，F19C/A30C, F19C/I32C，和 F19C/L34C(Wetzel，R.，etal.， Biochemistry 46 1-10 (2007)) 这些突变被发现与 L17C/L34C，L17C/]\05C，和 L17C/V36C 突变体有相似的行为。因此，所有此前公开的关于Αβ蛋白的二硫键突变体都被证实易于 聚集成稳定性与野生型肽产生的原纤维相似的原纤维。L17C/L34C, L17C/M35C, L17C/V36C, V18C/L34C, F19C/A30C, F19C/I32C，和F19C/L34C突变体的这些氧化型衍生物都原纤维化， 因为它们与 Hoyer 等(Hoyer，W. et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 :5099-5104(2008)) 提供的发夹结构不兼容，但它们与目前已知的Αβ-肽原纤维结构相容，在这种结构中，两 个 β -链彼此背靠背堆积(参见 Petkova，Α. Τ.，et al.，Biochemistry 45 :498-512)。Aβ 寡聚体制剂见 WO 2007/005358, WO 2007/005359, WO 2007/142320 和 WO 2004/067561。这些文献描述的寡聚体制剂已用分子间交联剂(W02007/005358)，非生理 ρΗ(在WO 2007/005359中是ρΗ 9)和/或添加剂(W02007/005359中称40%甘油或TFE在 37°C使寡聚体稳定;WO 2007/142320中是GMl神经节苷脂；WO 2004/067561中是SDS)获 得。发明概述本发明提供共价约束(covalently constrained)的单体和寡聚形式Aβ A21C/ A30C肽，它们抵抗原纤维的形成。本发明的肽经大小排阻层析(size exclusion chromatography, SEC)，远紫外⑶(指示螺旋结构)，和NMR(也是指示螺旋样结构)测定， 保留了其野生型的大多数特性。因为原纤维化步骤被阻断，本发明的Αβ肽依据浓度被分 群为数种具有螺旋结构(coil-structure)的低分子量寡聚体(从SEC洗脱下来的最大约 42kDa的蛋白)，以及具有β -结构的高分子量寡聚体(从SEC洗脱下来的约75_85kDa和 170kDa的蛋白)。而且，通过对浓缩的蛋白溶液加热，获得了 6nm宽、通常30nm长的野生型 样原原纤维(protofibrilIar)结构。具有β -结构的高分子量寡聚体由All多克隆抗体 识别。发明简述本发明提供单体的和寡聚的Αβ肽，其空前地抵抗原纤维形成。
为防止聚集副反应耗竭浓缩的单体和寡聚体A β肽库，本发明人设计了共价约束 的Αβ肽。本发明的这些Aβ肽在野生型Aβ (40) (SEQ ID NO :1)或Αβ (42) (SEQ ID NO 2)肽的位置21和30被半胱氨酸替换，产生分子内二硫键连接的Αβ (40)A21C/A30C(SEQ ID NO :3)和Αβ (42)A21C/A30C(SEQ IDNO :4)肽(图ΙΑ)。这些氨基酸替换有效阻断了能 引起淀粉样变(amyloidosis)的构象转换，该机制的一种假设示于
图1B，所述转换还允许 分出数个寡聚态群体，包括具有被认为是毒性种类的结构的高分子量寡聚体。本发明 的Αβ肽形成潜在的毒性寡聚状态，其与野生型Aβ肽所产生的状态相似，具有与野生型寡 聚体相同的远紫外(far-UV)圆二色谱(circular dichroism, CD)，它们也结合All抗体， 并形成具有野生型形状的原原纤维(protofibri)。经大小SEC、远紫外⑶光谱、和1N异核 单量子相干(heteronuclear single quantum coherence, HSQC)核磁共振(NMR)谱测定， 本发明Αβ肽的非寡聚的螺旋状态仍保留野生型模样。由于本发明的肽中有约束性二硫键(constraining disulphide bond)，无需其它 稳定寡聚体的方法，包括(i)非生理(升高)PH以增加这些肽的排斥力，(ii)用添加剂，包 括2，2，2-三氟乙醇(TFE)，十二烷基硫酸钠(SDS)，甘油，或GMl神经节甘脂形式的细胞膜 糖脂，来诱导寡聚结构，(iii)添加阴离子以筛选电荷由此增加稳定性，和(iv)当用上述 (i)-(iii)之一或数项制得寡聚体时，用分子间交联使所述寡聚体共价稳定。本发明的Αβ 肽实际上是首例在生理条件下形成稳定寡聚体的Aβ肽，这是通过阻止原纤维化步骤获得 的。而且，避免了对寡聚制剂进行长时间保温而结果不可预料，因为本发明的Αβ肽可以纯 化并快速浓缩成寡聚状态。一方面，本发明提供包含与SEQ ID NO :4的氨基酸17-21对应的氨基酸序列LVFFC 的肽，以及与SEQ ID NO 4的氨基酸30-36对应的氨基酸序列CIIGLMV。本发明的肽还在对 应于SEQ ID NO 4的Cys21和Cys30之间包含二硫键。在本发明一优选方面，所述肽通过 将含有氨基酸序列LVFFC的肽与含有氨基酸序列CIIGLMV肽经分子间二硫键连接而获得。 在本发明更优选方面，所述两种肽是单个肽链的组成成分，其在Cys21和Cys30之间有二硫 键。此外，氨基酸序列LVFFC与氨基酸序列CIIGLMV通过含4-20个氨基酸，如6-16个，优 选7-12个，或更优选8-10个氨基酸，如9个氨基酸的肽来融合。本发明还提供所述肽的变 体，其中一或多个，如1，2，3，4，5个，或优选1或2个氨基酸被保守取代而替换，一或多个， 如1，2，3，4，5个，或优选1或2个氨基酸被删除，或一或多个，如1，2，3，4，5个，或优选1或 2个氨基酸被插入。优选地，融合肽包含与SEQ ID NO :4的氨基酸22- 对应的氨基酸序列 EDVGSNKG。相应地，本发明的肽优选包含与SEQ ID NO :4的氨基酸17-36对应的氨基酸序 列LVFFCEDVGSNKGCIIGLMV，以及所述肽的变体，其中一或多个，如1，2，3，4，5个，或优选1或 2个氨基酸被保守取代而替换，一或多个，如1，2，3，4，5个，或优选1或2个氨基酸被删除， 或一或多个，如1，2，3，4，5个，或优选1或2个氨基酸被插入。还更优选地，本发明的肽包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列1-40，全长氨基酸序列 SEQ ID NO :4，以及所述肽的变体，其中一或多个，如1，2，3，4，5个，或优选1或2个氨基酸 被保守取代而替换，一或多个，如1，2，3，4，5个，或优选1或2个氨基酸被删除，或一或多 个，如1，2，3，4，5个，或优选1或2个氨基酸被插入。本发明的肽还可在对应于氨基酸22 (SEQ ID NO 5)的位置包含甘氨酸取代，或者
6对应于氨基酸22 (SEQ ID NO 6)的位置包含谷氨酰胺取代，或在对应于氨基酸22 (SEQ ID NO 8)的位置包含赖氨酸取代。本发明的肽还可在对应于氨基酸23 (SEQ ID NO 7)的位置 包含天冬酰胺取代。本发明的肽还可在对应于SEQ ID NO :4中氨基酸35的位置包含甲硫 氨酸亚砜(methionine sulphoxide)残基。而且，本发明的肽可包含(a) —或多个末端氨基酸被马来酰亚胺化 (maleimidated) ； (b) 一或多个末端氨基酸被半胱氨酸化(cysteinylated) ； (c)所述肽的 羧基末端被酰胺化，即羧基末端的游离COOH被转变成CONH2 ；和/或所述肽的氨基末端被乙 酰化，即氨基末端的游离NH2基团被转变成酰胺CH3CONH-(AcNH-)。本发明的肽可通过化学 合成制得，或通过重组DNA技术制得。保守取代是指，一个氨基酸用具有相似极性和疏水性质的氨基酸取代。具有所述 相似性质的氨基酸分组的实例见表1。保守取代还可包括用非常规氨基酸进行取代。非常 规氨基酸包括，但不限于，表1的括号中的例子，其中，PL是指吡咯赖氨酸(pyrrolysine)， DA是指脱氢丙氨酸(dehydroalanine)，NL是指正亮氨酸(norleucin)，SC是指硒代半胱氨 酸(selenocysteine)，HC 是指高半胱氨酸(homocysteine)，CL 是指瓜氨酸(citrulline)， OR是指鸟氨酸(ornithine)。表1.
权利要求
1.肽，包含与SEQID NO 4的氨基酸17-21对应的氨基酸序列L-V-F-F-C以及与SEQ ID NO :4的氨基酸30-36对应的氨基酸序列C-I-I-G-L-M-V，还在对应于SEQ ID N0:4之氨 基酸21和30的半胱氨酸残基之间有二硫键，或所述肽的变体，其中1，2，3，4，或5个氨基酸 被保守取代替换，1，2，3，4，或5个氨基酸被删除，或1，2，3，4，或5个氨基酸被插入。
2.权利要求1的肽，包含与SEQID NO 4的氨基酸17-36对应的氨基酸序列L-V-F-F-C-E-D-V-G-S-N-K-G-C-1-1-G-L-M-V,或所述肽的变体，其中1，2，3，4，或5个氨基酸被保守 取代替换，1，2，3，4，或5个氨基酸被删除，或1，2，3，4，或5个氨基酸被插入。
3.权利要求2的肽，包含与SEQID NO 4的氨基酸1_40对应的氨基酸序列，或所述肽 的变体，其中1，2，3，4，或5个氨基酸被保守取代替换，1，2，3，4，或5个氨基酸被删除，或1， 2，3，4，或5个氨基酸被插入。
4.权利要求2的肽，包含氨基酸序列SEQID而4，或所述肽的变体，其中1，2，3，4，或 5个氨基酸被保守取代替换，1，2，3，4，或5个氨基酸被删除，或1，2，3，4，或5个氨基酸被插 入。
5.权利要求2-4之一的肽，在对应于SEQID NO 4中氨基酸22的位置包含甘氨酸取代。
6.权利要求1-5之一的肽，在对应于SEQID NO :4中氨基酸35的位置包含甲硫氨酸 亚砜残基取代。
7.权利要求1-6之一的肽，其中(a)一或两个末端氨基酸被马来酰亚胺化；(b)一或两个末端氨基酸被半胱氨酸化；(c)N-端氨基酸被乙酰化；和/或(d)C-端氨基酸被酰胺化。
8.权利要求1-7之一的肽，经化学合成制得。
9.权利要求1-7之一的肽，经重组DNA技术制得。
10.抗体，与权利要求1-9之一的肽特异性反应。
11.鉴定适于治疗阿尔茨海默氏病的化合物的方法，包括应用权利要求1-9之一的肽。
12.选择结合蛋白的方法，包括应用权利要求1-9之一的肽。
13.权利要求1-9之一的肽在制备药物组合物方面的用途，所述药物组合物打算用于 免疫接种以预防性或治疗性处理阿尔茨海默氏病，任选与佐剂联用。
14.药物制剂，包含治疗有效量的权利要求1-9之一的肽，任选与佐剂联用。
15.用于哺乳动物，包括人，抗阿尔茨海默氏病的免疫接种的疫苗，包含权利要求1-9 之一的肽，任选与佐剂联用。
16.用于哺乳动物，包括人，抗阿尔茨海默氏病的免疫接种的疫苗，包含治疗有效量的 权利要求10所述抗体。
17.对患阿尔茨海默氏病或面临患阿尔茨海默氏病的风险的哺乳动物，包括人，进行预 防性或治疗性处理的方法，其中将治疗有效量的权利要求1-9之一的肽给予该哺乳动物。
18.对患阿尔茨海默氏病或面临患阿尔茨海默氏病的风险的哺乳动物，包括人，进行预 防性或治疗性处理的方法，其中将治疗有效量的权利要求10的抗体给予该哺乳动物。
19.对患阿尔茨海默氏病或面临患阿尔茨海默氏病的风险的哺乳动物，包括人，进行预防性或治疗性处理的方法，其中将治疗有效量的权利要求11的化合物给予该哺乳动物。
20.对患阿尔茨海默氏病或面临患阿尔茨海默氏病的风险的哺乳动物，包括人，进行预 防性或治疗性处理的方法，其中将治疗有效量的权利要求12的结合蛋白给予该哺乳动物。
21.非人转基因动物，表达编码淀粉样前体蛋白(APP)的核苷酸序列，其包含A21C/ A30C突变。
22.权利要求21的非人转基因动物，所述APP是突变的人APP，其包含A21C/A30C突变。
23.权利要求22的非人转基因动物，所述APP是蛋白SEQID NO :11。
24.非人转基因动物，表达编码Aβ肽的核苷酸序列，其包含A21C/A30C突变。
25.权利要求对的非人转基因动物，其中的淀粉样-beta肽选自SEQID N0:3，SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :7，SEQ ID NO :8，SEQ ID NO 9 禾口 SEQ ID NO :10。
26.权利要求21-25之一的非人转基因动物，选自脊索动物(chordateanimal)。
27.权利要求沈的非人转基因动物，是转基因小鼠。
28.多肽，是包含A21C/A30C突变的APP。
29.权利要求28的多肽，是突变的人APP，其包含A21C/A30C突变。
30.权利要求四的多肽，是SEQID NO 110
31.核苷酸序列，编码权利要求1-9和观-30之一的多肽。
32.表达系统，包含权利要求31的核苷酸序列。
全文摘要
本发明提供了抵抗原纤维形成的单体的和寡聚的淀粉样beta肽异构体，以及它们作为筛选试剂或抗原在治疗阿尔茨海默氏病和其它与蛋白错误折叠有关的疾病的方法和药物制剂中的用途。本发明还提供了表达修饰的淀粉样前体蛋白或淀粉样beta肽的转基因动物。
文档编号A61P25/28GK102065881SQ200980122412
公开日2011年5月18日 申请日期2009年4月14日 优先权日2008年4月14日
发明者安德斯·桑德伯格, 托雷夫·哈德 申请人:Mivac发展股份公司