专利名称：具有改善的底物特异性的pqq-依赖性葡萄糖脱氢酶的新变体的制作方法
技术领域：
本发明的主题是PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶(sPQQGDH)，它们的生产和鉴别方法， 编码根据本发明的sPQQGDH的基因，生产该基因的载体，以及包含根据本发明的葡萄糖脱 氢酶的葡萄糖传感器。
背景技术：
葡萄糖的酶测定在医学诊断中是非常重要的。这里，检测尿或血液中的葡萄糖以 诊断或监测代谢性疾病的进展是必需的。在糖尿病(也称为糖尿病)的情况中，每天可能 需要多次测定血糖浓度。这可以通过市场上绝大多数的计量器通过酶方法实现，在酶方法 中葡萄糖被氧化，由此得到的氢(2H+和2e_)进行电流分析定量(P. Vadgama, J. Med. Eng Technol. 5 [6]，293-298 (1981)，K. S. Chua 和 I. K. Tan，Clin. Chem. 24 [1]，150-152 (1978))。存在许多适合这种目的的各种酶，但是这些酶与各种辅助因子共同作用进行电子 的主要接收，并且还具有不同的生化性质诸如特异性、稳定性或转换率。酶的转换率通常以 活性单位(U)进行报道；在葡萄糖-氧化酶的情况中，比活性(U/mg)通常是指在确定的反 应条件下每分钟被1毫克酶氧化的以微摩尔计的葡萄糖的量。通常使用的酶为葡萄糖脱氢酶(⑶H)。在NAD(P)+-依赖性⑶H的情况中，辅助因 子为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或烟酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸(NADP+) (H. E. Pauly 和 G. Pfleiderer,Hoppe Seylers. Z. Physiol Chem. 356 [10]，1613-1623 (1975))，二 者均为相当不稳定的必须添加到反应中的化合物，因为它们不与酶结合。另一类葡萄糖脱氢酶含有作为电子受体与酶结合的吡咯并喹啉醌(PQQ)。已 经描述了这种类型中两种结构相互不同的葡萄糖脱氢酶膜锚定型，mPQQGDH (A. M Cleton-Jansen 等，J. Bacteriol. 170 [5]，2121-2125 (1988))，和较小的可溶型，sPQQ⑶H (A.M. Cleton-Jansen 等，Mol. Gen. Genet. 217 [2-3], 430-436 (1989))。由于后者的高 比活性、其对氧的不敏感性以及紧密地结合，其为稳定的辅助因子，为特别适合生产用于葡 萄糖测定的测试系统的酶。因此在许多商品化的血糖计量器中，使用这种酶，尽管与提到的 其他酶相比，这种酶显示更低的底物特异性。由于最后提到的限制，当然希望拥有具有更高 底物特异性的这种酶的变体。除了底物葡萄糖外，sPQQGDH还将其他糖转化为相应的内酯，优选二糖，其中还原 糖为葡萄糖，但也有其他还原糖。由于这种糖正常不存在于人的血液中，基于sPQQGDH的 酶测试通常得到对应于葡萄糖浓度的结果。然而，某些医学治疗包含施用物质，该物质的 一种分解产物为麦芽糖，麦芽糖被sPQQGDH氧化并且因此不希望地影响测量结果(T.G. Schleis, Pharmacotherapy 27 [9]，1313-1321 (2007))。在诊断方法中或者作为药物的佐 剂施用木糖和半乳糖时，测定这些糖自身。因此以适当的方式抑制sPQQGDH的辅助活性是 有意义的。
在文献以及在专利说明书中，描述了许多通过引入突变来改善sPQQGDH的底物特 异性的尝试(S. Igarashi等，Biomol. Eng 21 [2],81-89 (2004))。为此，在酶的催化位 点(EP1666586A1)以及在其他位点(US7132270B2)的区域内的单个氨基酸通过定向诱变被 其他氨基酸取代，或者通过插入来插入单个氨基酸(EP1367120A2)。此外，描述了各种突变 的组合(EP1666586A1，US7132270B2)。另外，已经描述了在sPQQGDH的一个位点插入两个氨 基酸的变体。然而，结果没有获得底物特异性的显著改善(W02006085509)。尽管存在这些结果，但仍然需要sPQQGDH的变体，因为至今还未描述过在与葡萄 糖足够高的反应性下能够充分识别葡萄糖和其他糖的变体。这里重要的是，更特别地，即使 在葡萄糖和其他糖的混合物的存在下，酶使葡萄糖浓度可靠地测定的能力。所描述的变体 没有充分地显示这种性质
发明内容
考虑到现有技术，因此本发明的目的是提供使可靠的葡萄糖测 定成为可能的葡萄 糖脱氢酶，即使在葡萄糖和其他糖的混合物的存在下。更特别地，本发明的目的是提供葡萄 糖脱氢酶，使用该葡萄糖脱氢酶可以在麦芽糖的存在下可靠地测定葡萄糖。此外，本发明的 目的是提供可以生产和鉴别这种葡萄糖脱氢酶的方法，在其他糖的存在下，更特别地在麦 芽糖的存在下，该葡萄糖脱氢酶特别适合用于葡萄糖的测定。现已惊奇地发现，在底物结合区域的范围内插入3-5个氨基酸的sPQQ葡萄糖脱 氢酶，与酶的原型相比显示改善的葡萄糖特异性。因此，本发明的主题是与酶的原型相比具有改善的葡萄糖特异性的SPQQ葡萄糖 脱氢酶，其特征在于，在底物结合区域的范围内插入3-5个氨基酸。可以通过所述的天然存在的野生型菌株通过诱变获得的基因编码根据本发明的 sPQQGDH，诸如醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus) LMD 79.41 (K. Kojima K.等，Biotechnology Letters 22,1343-1347 (2000))，以及不动杆菌(Acinetobacter) 属的其他菌株(P. J. Bouvet P.J.和 0·Μ· Bouvet, Res. Microbiol. 140 [8], 531-540 (1989))，更特别地具有增强的热稳定性的那些，诸如在EP1623025A1中描述的不动杆菌属 菌株。优选的菌株为EP1623025A1中描述的不动杆菌属菌株PT16、K0Z62、K0Z65、PTN69、 KG106、PTN26、PT15、KGN80、KG140、KGN34、KGN25 和 KGNlOO ；更特别优选的是菌株 K0Z65。为了能够获得根据本发明的sPQQGDH，密码子必须插入到对应于适合这种方式的 sPQQGDH基因中的底物结合位点的位置。许多sPQQGDH的空间结构是已知的并且储存于 公共数据库中(A. Oubrie 等，J. Mol. Biol. 289 [2]，319-333 (1999) ；A. Oubrie 等， EMBO J. 18 [19] ,5187-5194 (1999))。因此，可以估算各个氨基酸位置与结合底物的距 离。这种估算，例如，可能使用蛋白质的可视化程序，诸如由互联网上可以获得的软件程 Ιψ Cn3D(http//www. ncbi. ηlm. nih. gov/Structure/CN3D/cn3d. shtml)。 & Jf 的 X—身寸 线结构的序列是基于醋酸钙不动杆菌的sPQQGDH，其长度为455个氨基酸。更优选的来 自菌株K0Z65的sPQQGDH的原型具有456个氨基酸，就像鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的酶一样。在两种情况中，这样的原因是由于位置289之后其他的谷氨酰胺残 基。以下是与更短的、在X-射线结构中所用的sPQQGDH序列有关的各个氨基酸位置的细节， 所述sPQQGDH来源于菌株醋酸钙不动杆菌LMD 79.41。据报道位于那里的氨基酸在该位置前面的氨基酸的单字母密码中。距离底物不大于5埃的氨基酸区域，诸如，例如，位置076、0143、0168、￥343和各 自邻近的氨基酸残基，对于诱变而言是优选的。因此，3个或更多个氨基酸的插入可以，例 如，在一个特定的位置之前或之后出现，以便改变底物结合位点的空间结构。更优选的是在 位置Q168和L169之间的其他氨基酸的插入。在该位点具有插入的K0Z65的变体主要令人 惊奇地表现出，与葡萄糖相比大比例的显著降低的对麦芽糖的活性。特别优选的是在位置 Q168和L169之间具有表1所列的插入序列的sPQQGDH。作为比较，野生型显示于第一行中。 如表1所概述，根据本发明的sPQQGDH具有增加的底物特异性(更低的麦芽糖/葡萄糖比和 葡萄糖/麦芽糖混合物中更低的葡萄糖干扰值)。表 1:
SEQ ID起葡萄糖比Mfl: [U/ragj(IMO it, Κ:<·] W性的比HA (5 irt Il 萄ff!.++ S ill麦身糖》wl-GDH K02653000mo63514S-t -E10AYQ12407,45I45-20-E7AWL213110,5-45146-OS-EtAFV32366.55I46-I0-E4GYl43515J-93SIil-Of-GOAYV57J85.45I81-13-A12AFQ618813.7-15.75138-11-Λ 2AGRM7!Ol9 515.55152-21-EICLAVI16611.7-20.75I52-20-A7MGRFL953079S5.65381-05-C4VSTFF102649.51.2 i53S1-06-C12VSKNH(1229IO3.8 ‘53SI-0 -F!0SSRNH122039.54.25381-09-AllSGRIL134116.65.35386-08-D10VGRLT142726.45 75386-O-F10AERNY15IlO7,60.25386-19-09MESHN16EK8.27.853M-15-C8VGHVT172966,23.i5388-19-F3VGRYQIS1S87.34J
本发明的主题还进一步是用于生产和鉴别sPQQGDH的方法，所述sPQQGDH与野生型相 比显示增强的底物特异性。通过定域随机诱变，根据本发明的方法可以生成多种变体，该变 体在sPQQGDH序列的所需位点具有3个、4个、5个或更多个插入的氨基酸。将生成的酶进行底物特异性筛选，选择最好的变体。根据本发明的方法的特征在于，在第一步中生产载体，在该载体中在所需插入位 点之前和之后的合适序列区域已经被删除并且被该载体的独特限制位点所替代。在第二 步中向使用该限制性内切酶开放的载体-DNA中插入双链寡核苷酸序列，以便得到基因产 品，所述双链寡核苷酸序列通过PCR扩增生产并且除了载体中删除的序列外还含有所需的 插入，所述基因产品除了在所需位点的3个或更多个氨基酸的插入外，对于其氨基酸序列， 不含有其他改变。借助PCR由合成的寡核苷酸生产的待插入的双链片段含有3个或更多 个用于改变底物特异性的其他随机密码子，以及载体中删除的密码子。为此所选择的密 码子可以特别好地表达于E. coli.中。因此除了插入区域外，该核苷酸序列与K0Z65的 sPQQGDH-基因的核苷酸序列不同，而不是与氨基酸序列不同。使用3个其他氨基酸的插入时，8000个酶变体是可能的；在使用4个其他氨基酸 时，数量为160,000 ；和在使用5个其他氨基酸时，存在320万个变体。因此除了完全随机 的序列，诱变的寡核苷酸的合成可以利用，诸如在某些或所有位置含有对于每个待插入氨 基酸的简并密码子的序列。可以这样使用以便减少所有可能性的数量，避免终止密码子或 有利于特定位置的个别氨基酸。在根据本发明方法的第三步中，将以如上所述方式生产的重组载体转换到合适的 宿主细菌中，并且该宿主细菌在合适的生长培养基中增殖。由微生物克隆基因的方法和它 们在另外的宿主中的表达以及分离和改变核苷酸的技术是本领域技术人员已知的(参见， 例如，Molecular Cloning - A Laboratory Manual ；第 1 卷；Sambrook, J.禾口 Russel, D. W.；第3版，CSHL Press 2001)。培养微生物和从其中纯化重组体酶也是本领域已知的 (参见同上；第3卷)。在根据本发明方法的第四步中，测试菌落对各种糖的活性，由此鉴别出最好的。根 据本发明，本文不但完成了对各种糖的活性的测试，而且还完成了各种糖的干扰的测试。可以以比活性测定该活性，即，每时间单位通过确定量的酶转换的转换率。在葡萄 糖氧化酶的情况中，比活性(U/mg)通常是指在确定的反应条件下每分钟被1毫克酶氧化 的以微摩尔计的葡萄糖的量。相对于酶，葡萄糖通常是过量存在的，以便消除葡萄糖浓度对 反应速率的影响。通过随时间示踪试剂(Edukts)的分解或产物的形成确定转换率。随时 间示踪可以通过例如光度测定进行。为了确定反应速率和转换率，可以参考物理化学教科 书(例如，Peter Atkins, Physical Chemistry, W. H. Freeman & Co ；第 7 版，2002)。最初，分离各个菌落，使用葡萄糖作为底物进行酶试验(确定比活性)，使用第二 种糖例如麦芽糖作为底物进行第二酶试验。在对葡萄糖具有最高活性而同时对第二种糖 (例如，麦芽糖)具有最小活性的菌落的情况中，还测定了对葡萄糖和第二种糖(例如，麦芽 糖)的混合物的活性。这是因为其特别出现在对作为唯一底物的麦芽糖具有非常低的相对 反应性的某些变体的研究中，令人惊奇地，变体的这种性质并不总是伴有独立的性质，即当 葡萄糖和麦芽糖两种糖作为混合物存在时对葡萄糖和麦芽糖的可靠识别。这会导致存在于 该混合物中的葡萄糖浓度的高估和低估。因此在寻找用于测定测试样品中葡萄糖浓度的酶 中，对葡萄糖和其他糖的混合物的高葡萄糖特异性是至关重要的，或者换句话说，所讨论的 糖的尽可能低的干扰。糖的干扰通过由葡萄糖和干扰的糖的混合物测定的酶活性减去由相 同浓度的葡萄糖单独测定的活性，标准化至该葡萄糖活性进行计算(参见等式1)。
权利要求
1.可溶性吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶(SPQQGDH)，其特征在于，与不动杆菌 属的一种野生型菌株诸如，例如，醋酸钙不动杆菌(AcinetcAacter calcoaceticus) LMD 79.41的sPQQGDH相比，其在底物结合区域的范围内具有3_5个氨基酸的插入。
2.如权利要求1所述的sPQQGDH，其特征在于，插入位点距离底物结合区域不超过5埃。
3.如权利要求1或2所述的sPQQGDH，其特征在于，基于野生型醋酸钙不动杆菌LMD 79. 41的序列，插入位点在位置Q168和L169之间。
4.如权利要求1-3中任一项所述的sPQQGDH，其特征在于，其通过诱变由PT16、K0Z62、 Κ0Ζ65、ΡΤΝ69、KG106、ΡΤΝ26、ΡΤ15、KGN80、KG140、KGN34、KGN25、KGN100 系列的菌株产生。
5.如权利要求1-4中任一项所述的sPQQGDH，其具有3个氨基酸的插入，其中插入的氨 基酸在位置1具有A或G，在位置2具有Y、F或W，和在位置3具有Q、L、V或I。
6.如权利要求1-4中任一项所述的sPQQGDH，其具有4个氨基酸的插入，其中插入的氨 基酸在位置1具有A或G，在位置2具有G、D或L，在位置3具有R或A，和在位置4具有M 或V。
7.如权利要求1-4中任一项所述的sPQQGDH，其具有5个氨基酸的插入，其中插入的氨 基酸在位置1具有A、M、S或V，在位置2具有E、G或S，在位置3具有H、K、R、S或T，在位 置4具有F、H、I、L、N、V或Y，和在位置5具有F、H、L、N、Q、T或Y。
8.如权利要求1-4中任一项所述的sPQQGDH，其具有选自系列SEQID I-SEQ ID 18的 插入序列。
9.基因，其编码一种如权利要求1-8中任一项所述的蛋白质。
10.载体，其特征在于，其在插入位点的范围内具有一个唯一的限制位点，以便可以在 该位点插入编码如权利要求1-6中任一项所述的sPQQGDH的寡核苷酸序列。
11.如权利要求10所述的载体，其具有序列SEQID 27。
12.用于生产和鉴别如权利要求1-8中任一项所述的sPQQGDH的方法，其特征在于，在 第一步中生产在插入位点的范围内具有唯一的限制位点的载体，在第二步中将多种不同的 寡核苷酸序列插入载体中，在第三步中将这样获得的重组载体转化到宿主细菌中并使细菌 增殖，在第四步中筛选细菌产生的sPQQGDH，以便测定sPQQGDH对至少两种不同的糖的单独 活性以及至少一种糖与至少另一种糖的干扰作用，和在第五步中选择与未修饰的野生菌株 的sPQQGDH相比具有改善的底物特异性的那些sPQQGDH。
13.葡萄糖传感器，其包含权利要求1-8的sPQQGDH。
全文摘要
本发明涉及新的PQQ依赖性可溶性葡萄糖脱氢酶(sPQQGDH)，与野生型相比较而言，其具有增加的底物特异性，而且还涉及用于其生产和鉴别的方法。
文档编号C12Q1/00GK102076846SQ200980124063
公开日2011年5月25日 申请日期2009年6月17日 优先权日2008年6月26日
发明者欣德勒 M., 梅斯基斯 R., 科克 R., 莫尔勒 V., 韦歇尔 W. 申请人:拜尔技术服务有限责任公司