缺血性组织的细胞疗法的制作方法

专利名称：缺血性组织的细胞疗法的制作方法
技术领域：
本发明涉及采用由血液分离的单核细胞治疗缺血性病症和疾病(特别是心肌、脑部和肢体缺血)的领域。本发明涉及基于单核细胞谱系细胞富集的治疗性细胞群的治疗手段、组合物以及它们的制备方法。本发明还涉及采用上述治疗手段和组合物治疗或防止缺血症或以其他方式促进组织血流灌注和侧支血管形成的增强的方法。在一个方面中，采用单核细胞谱系细胞富集的单核细胞群来治疗心脏缺血和心绞痛。在另一个方面中，疾病为脑卒中，并且单核细胞是由人脐带血(HUCB)分离的。
背景技术：
心绞痛是由流向心肌的血液不足而引起的胸部疼痛或不适。在美国20岁以上的成年人中，心绞痛的患病数为9，100，000例。稳定型心绞痛为在强体力活动后或对象处于情绪压力时可以预计发生的心绞痛。稳定型绞痛在美国45岁以上的成年人中的患病数(不包括相对应的心肌梗塞)为500，000例。参见Rosamond等Circulation 117(4) e25(2008)。
目前的疗法包括阿司匹林；β阻断剂(例如，卡维地洛、心得安、阿替洛尔)；硝酸甘油(用于急性病缓解)；血管扩张剂，如钙通道阻断剂(例如，硝苯地平(心痛定)和阿洛地平)；单硝酸异山梨酯和尼可地尔；If通道抑制剂(例如，伊伐布雷定)、ACE抑制剂、 斯达汀和雷诺嗪(Ranexa)。然而，这些疗法通常仅治疗疼痛，而不防止疼痛复发，并且并不是所有患者都对这种治疗方式有反应。目前正采用CD34干细胞进行临床试验以治疗难治愈性心绞痛，其目的是采用干细胞生成新的血管，从而防止疼痛复发。然而，这种治疗方式尚未证实是安全、有效的。因此，需要心绞痛(特别是难治愈性心绞痛)的长期治疗方案。
治疗患有难治愈性心绞痛的患者是复杂的，并且需要多学科方法。目前的疗法包括阿司匹林；β阻断剂(例如，卡维地洛、心得安、阿替洛尔)；硝酸甘油(用于急性病缓解)；血管扩张剂，如钙通道阻断剂(例如，硝苯地平(心痛定)和阿洛地平)；单硝酸异山梨酯和尼可地尔；If通道抑制剂(例如，伊伐布雷定)、ACE抑制剂、斯达汀和雷诺嗪 (Ranexa)。此外，这些疗法通常涉及穷举式用药法，其尝试多种不同的用药方案以及组合， 以减轻疼痛。然而，这些疗法通常仅治疗疼痛，而不防止疼痛复发，并且并不是所有患者都对这种治疗方式有反应。
除了药物疗法以外，还可以用介入方法治疗心绞痛，所述介入方法例如为经皮腔内冠状动脉成形术或冠状动脉旁路搭桥(CABG)手术，但是这些疗法由于多种因素而不能用于一些心绞痛患者，所述因素例如为不利的管状解剖床、冠状动脉较薄、近端或扩散冠状病变等。美国心脏协会2002对于可供选用的其他疗法的指南中的建议包括手术激光经心肌血管再生术(IIa类)、增强体外反搏术和脊髓刺激(nb类)。
新的治疗方式正在研究之中，包括使用干细胞群。多个研究人员对于证明在心肌梗塞的情况下使用含有骨髓单核干细胞的部分使心脏组织再生方面已经迈出了第一步。这些研究已经观察到(i)梗塞后心肌层的再生；(ii)减小了梗塞大小；以及(iii)通过人骨髓细胞使得心脏蛋白重新表达。通过对这些预先研究的随访，几个小组已经证明了得自骨髓的间质细胞在不同的试验模型中的再生潜力，其结果主要基于它们的肌源性潜力和血管源潜力。
已经开展了临床试验(主要是对急性心肌梗塞患者和经冠状动脉内输送干细胞) 来研究自体细胞移植对于增强心脏修复的安全性和效力。然而，这些试验产生了相互抵触的结果，而没有得到在研究设计与细胞群或输送之间具有差异的明显依据。
对于缺血性心脏组织，一些临床试验已经至少证实了得自骨髓的单核胞的安全性，其中有效程度不一。在这些研究中，最主要的输注技术是经心肌内输注干细胞-经心内膜输注或经心外膜输注。
在难治愈性心绞痛情况下，一些小组已近主要采用骨髓单核细胞(BMMC)进行了临床试验，这些试验主要采用BMMC单独治疗或者与CABG结合进行治疗。
例如，Hamano等通过经心外膜方法将BMMC与CABG结合注入到具有相关缺血性心肌症的5个“无选择”患者中。结果表明，在三个患者中注射区域的心肌血流灌注发生客观增加。然而，该研究受困于伴随CABG的效果，而BMMC的治疗效果仍然不清楚。
其他的研究人员已经报道了经心肌内注射BMMC的初始研究情况，该研究在点机械标测系统(N0GATM系统)采用经经皮导管输送BMMC。总的来说，这些非随机化研究已经证明，直接将BMMC转移至缺血心肌层在一些患有难治愈性心绞痛的患者(而不是全部)中改善了症状和运动能力，并且增加了心肌血流灌注和功能。大多数这些研究登记的是患有缺血性心肌症的“无选择”患者。
近年来，已经报道了通过在严重的冠心病内经心肌内注射BMMC而进行的第一例前瞻随机化试验(PR0TECT-CAD试验)。该研究显示了在研究组中运动时间、左室射血分数和负荷诱导的心肌缺血状况得到显著改善。
Losordo等进行了 I/IIa期、双盲、随机化、安慰剂对照的给药剂量逐渐增加的临床试验，其通过对难治愈性心绞痛心肌内注射自体CD34+干细胞而进行。与施用安慰剂的对照对象相比，包括绞痛频率、硝化甘油使用、运动时间和CCSAC级别在内的效力参数显示出有利于⑶34+细胞治疗患者的倾向。
因此，对于“无选择”心绞痛患者，使用得自骨髓的单核肝细胞的临床研究已经显示出一些心肌血流灌注改善效果，至少改是改善了心室功能。多数这些研究都纳入了患有缺血性心肌症的患者，其中所述患者具有中等至严重的左室流血分数(LVEF)抑制。然而， 目前尚未有基于治疗细胞(即，单核细胞或中胚层干细胞)的疗法能够可靠地在多数或全部治疗患者中减轻疼痛或改善血流灌注。
约5至15%的患有慢性冠状动脉疾病的患者表现出严重的心绞痛，其不能通过常规治疗手段的组合进行控制，所述治疗手段包括多个系列的药物疗法优化治疗、经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)和冠状动脉旁路搭桥(CABG) (35，37)。严重的心绞痛通常导致生活质量的严重下降。对于“无选择”难治愈性心绞痛患者的症状缓解方法是复杂、困难的过程。根据美国心脏协会指南的可供选用的其他疗法(11，14)均至多提供了中等的效果，其中所述其他疗法例如为手术激光经心肌血管再生成、体外反搏术和脊髓刺激(9，26，31，妨)。绝大多数难治愈性心绞痛患者(75% )都保持了左心室功能，其死亡率低于一般的冠心病群体(36，M)，并且该患者群正在迅速增加。
细胞疗法(具体为自体骨髓细胞移植)已经发展为一种用于心脏再生的新治疗方案。一些假设性机理阐释涉及肝细胞的肌源性和血管源性潜力，并且通过旁分泌效果激活固有祖细胞生长0，15-17，22，48，49，52)。虽然已经在动物模型中证实了心肌组织的再生以及同时发生的梗塞区域的减少(7，33)，但是将这些结果专用到人体仍然存在很多不确定性，从而使得BMMC移植用于心脏组织再生成为一种实验方法，而不是用于临床实践的治疗标准。
另一方面，难治愈性心绞痛患者可以受益于细胞疗法，主要是在血管再生方面。当考虑细胞疗法作为用于人类患者的治疗方案时，这些血管生成效果被研究者认为是非常重要的⑶。
在多个临床前研究中报道了血管生成效果(8，28，33，48)。与阴性对照小鼠相比， 移植有c-kit骨髓(BM)细胞的心脏观察到血管再生的改善00)。在急性心肌梗塞之后，小鼠BM细胞移动进入血液循环使得肌细胞和血管结构再生(39)。使用相似的方案在非人类灵长类动物内的最近研究表明，BM治疗的动物的局部血流灌注得到改善，从而显示了潜在的血管生成效果(30)。BM细胞移植的这种效果可能归因于旁分泌效果，其中血管发生通过多种生长因子的局部释放而增加，所述生长因子例如为血管内皮生长因子以及得自基质细胞的因子-1等(8，48)。
在包括难治愈性心绞痛患者(其接受了得自骨髓细胞的肝细胞或BMMC)的临床研究中，观察到症状和运动能力以及心肌血流灌注的改善(4，6，8，12，13，19，21，41，53，55， 56，59)。Beeres等( 通过在患有难治愈性心绞痛的25个患者内心肌内注射自体BMMC 而进行了试验，该试验显示出对心绞痛症状和心肌血流灌注的长期有益效果。Losordo等 (34)通过对难治愈性心绞痛患者心肌内注射自体⑶34+干细胞，从而进行了 I/IIa期、双盲、随机化、安慰剂对照的剂量逐渐增加的临床试验，从而证实了 CD34+细胞治疗的患者除了加拿大心血管协会绞痛分级(CCSAC)改善以外，还显示出运动时间增加的倾向。van Ramshorst等(58)通过对难治愈性心绞痛患者心肌内注射骨髓细胞而进行了随机化的对照试验，其中短期的随访(3至6个月)表明与安慰剂组相比，心肌血流灌注得到中等改善。
通过在以前的难治愈性心绞痛试验中观察最低程度的左心室改善以及临床反应， 表明在人体内的骨髓干细胞移植的主要作用是促进心肌血管再生，而不是单纯的肌生成。 在这种情况下，血管再生能够通过唤醒或恢复冬眠心肌层而确实地改善左心室功能，但是程度有限，如这些试验和一些元分析证明的那样(1，32，44)。
以前的临床前研究和临床研究已经支持了干细胞疗法对于心肌层组织再生的可行性、安全性和有效性，并且涵盖了表现为从急性心肌梗塞到慢性缺血心脏病在内的一系列诊断疾病的患者(33)。
此处最大的问题在于将实验室结果转化为医院常规治疗手段。研究设计、干细胞和单核细胞制备以及灌注技术的差别已经显示出某些潜力，但是不同研究的总体数据并不一致(43)。
在全世界，心血管疾病(其被认为是头五种非传染性疾病之一)感染了约5000万人，从而导致每年约550万人死亡。在这5000万人中，脑卒中大致占4000万人。
与心绞痛一样，脑卒中是缺血占很大作用的另一种病症。脑卒中是发达国家死亡的第三诱因，并且承担成人残疾的主要诱因。目前，仅存在一种可供利用的治疗方案。心血管疾病损害认知和运动功能，并且改变免疫系统。本研究集中于脑卒中的病理生理学，并且开发了新的细胞疗法(人脐带血(HUCB)细胞)。在早期研究中，该细胞疗法显示出明显改善了运动机能障碍，并且减小了梗塞大小。免疫/炎性反应在脑卒中后大脑损害的发展过程中作用尚未完全理解。在缺血性事件之后，引起免疫反应，使得嗜中性粒细胞、T细胞、 B细胞、自然杀伤细胞以及小神经胶质细胞涌入梗塞的半球内，并且导致相同的这些免疫细胞在外周血内的变化。本研究探测了 HUCB注射的有益效果是否能够由特定细胞群产生。
脑卒中治疗包括两种类型预防和急性处理。预防处理目前涉及抗血小板剂、抗凝集剂、手术疗法、血管成形术、生活方式调节和医疗调节。通常使用的抗血小板剂为阿司匹林。采用抗凝集剂似乎没有统计学意义。手术疗法似乎对于特定的亚组是有效的。血管成形术仍然是一种实验方法，其中没有充分的数据以供分析。生活方式调节包括戒烟、有规律的运动、饮食调节、限制钠摄入和控制饮酒。医学调节包括服药降低血压、降低胆固醇、控制糖尿病和控制循环问题。
急性处理治疗涉及采用溶解血栓剂、神经保护、氧化氟碳营养乳(OFNE)疗法、神经灌注、GPIIb/IIIa血小板抑制剂疗法和康复/物理疗法。
溶解血栓剂诱导或引起血栓溶解，并且最通常使用的药剂为组织纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)。重组t-PA(rt-PA)通过溶解(裂解)堵塞血流的凝块而有助于重新建立大脑循环。重组t-PA为有效的治疗剂，但是具有极短的治疗窗；它必须在疾病发作3小时内施用。重组t-PA还必须在施用治疗之前进行CT扫描，从而进一步缩短了可供利用的时间量。GenetechPharmaceuticals公司制造了 ACTIV ASE ,并且目前是rt-P A的唯一来源。
神经保护剂为最大程度地降低缺血级联反应的作用的药物，并且包括(例如)谷氨酸拮抗剂、钙拮抗剂、阿片制剂拮抗剂、GAB A-A拮抗剂、钙蛋白酶抑制剂、激酶抑制剂和抗氧化剂。几个对急性缺血脑卒中的临床试验正在进行中。由于溶解血栓剂和神经保护剂具有凝块-破碎和脑部保护的互补功能，因此以后的急性治疗方法最可能包括溶解血栓剂和神经保护剂的组合。然而，如溶解血栓剂一样，大多数神经保护及需要在脑卒中发生后6 小时内施用才会有效。
氧化氟碳营养乳(OFNE)通过脑脊液向脑部输送氧和营养。神经灌注是这样一种实验方法，其中富有氧的血液改变途径通过脑部，以作为最大程度地降低缺血性脑卒中的损害的途径。GPIIblIIIa血小板抑制剂疗法抑制血小板上的糖蛋白GPIIb/IIIa受体凝集或团聚。康复/物理疗法必须在脑卒中的早期开始，然而，它们不能改变脑部损害。康复的目的是改善功能，使得脑卒中存活者尽可能变得独立。
虽然一些急性治疗方法在临床试验中显示出潜力，但是在Cleveland进行的研究表明，只有1.8%的具有脑卒中症状的患者接受了 t-PA治疗(Katz an IL等，2000 JAMA, 283 :1151-1158)。t_PA是上述急性脑卒中治疗方法中最常用的，但是据估计，接受任何新的“有效”急性脑卒中治疗的患者数目低于10%。这些统计数据清楚地表明需要在脑卒中发生M小时以后的急性脑卒中治疗方法。
对于这些急性治疗方法(Le.，t-PA)，施用时间是关键的。最近的研究已经表明 42%的患者在达到医院之前需要等待长达M小时，其中在脑卒中后到达医院的平均时间为6小时。t-PA已经显示出增强了接受该疗法的113例患者的恢复，但是由FDA委托的一项最新研究(采用Alteplase逆转脑卒中的标准治疗)发现，有多次都违背了 3小时治疗窗，从而导致治疗无效。除了康复疗法以外，其余的急性治疗方法仍然处于临床试验阶段， 并且在美国(特别是农村地区)尚未广泛利用，其中所述农村地区可能不具备具有所需神经学专家和急救人员的大型医疗中心，因此可能在有些时候实现任何上述脑卒中诊断和治疗的新方法受到限制。
在美国，脑卒中的花费超过430亿美元，包括直接和间接的花费。直接花费占总量的约60%，并且包括住院费用、医生费用和康复费用。这些费用通常在头三个月达到 15，000美元/患者，然而，在约10%的病例中，花费超过了 35，000美元。间接的费用构成其余部分，并且包括脑卒中受害者的生产力损失以及家庭成员护理者的生产力损失(参见神经疾病和脑卒中国立研究所，NIH)。
在美国，每年发生约750，000例脑卒中，其中约1/3是致命的。在其余患者中，约 1/3中度受损，并且1/3严重受损。缺血性脑卒中占这些脑卒中病例的80%。
随着婴儿高峰潮出生的人老龄化，脑卒中患者的总数也随之显著增加。脑卒中的风险随年龄而增加。在55岁之后，患有脑卒中的风险每十年加倍，其中约40%的个体在80 岁时患脑卒中。此外，患有二次脑卒中的风险随着时间推移而增加。在第一次脑卒中之后 5年时患有二次脑卒中的风险为25-40%。由于预期随着婴儿高峰潮出生的人达到其黄金年龄而超过65岁的人群增加，因此这部分市场的规模会显著增加。此外，对有效治疗方法的需求会明显增加。
考虑到不能有效地减轻脑卒中的损害相应，因此必须开发新的治疗策略，以便随着脑卒中的病理级联反应发展就最大程度地减少初始神经创伤以及修复脑部损害。
已经提出移植单核细胞作为治疗脑卒中的手段。由于难于有效地治疗患有脑卒中的患者，因此本领域内需要增强脑卒中治疗效果的方法。
新血管形成是在组织受损时的炎性反应以及随后的修复级联反应的完整过程。单核细胞/巨噬细胞在炎性过程中具有重要作用，包括血管再生以及通过发挥杀菌剂和免疫调节活性而产生的防御机制。目前的研究已经证明，补充的单核细胞/巨噬细胞有助于在缺血性组织、肿瘤和慢性炎症中调节血管再生。在新血管形成以后随后的组织再生方面，与其他任何肝细胞相比，单核细胞/巨噬细胞由于具有以下显著优点而对细胞疗法而言具有高度吸引力，所述优点例如为非致癌性、非致畸性、没有伦理争议、多种分泌功能(包括促血管形成因子和生长因子)以及容易自发捕集。除了诸如骨髓或外周血等成人来源之外， 脐带血(UCB)也可以为自体或异体的单核细胞/巨噬细胞的潜在来源。特别是，UCB单核细胞由于因素而被认为是首要候选体快速的可行性、低的免疫排斥性、和多种杀伤作用(如由于独特的免疫和炎性未发育成熟性而产生的抗炎反应)以及促血管形成能力。单核细胞 /巨噬细胞的一般特性和潜力可供用于细胞疗法，特别关注的是新血管形成得自UCB的单核细胞。
单核细胞/巨噬细胞的一个关注功能是促进与炎性反应相关的血管再生。血管再生(或新血管形成)炎性过程的主要因素，包括随后的修复级联反应[Simderkotter， 1994 #4]。在炎性反应早期，循环的单核细胞渗入至组织内[BOSCO，2008 #3]。最初，相邻的内皮细胞和炎性细胞通过释放一系列的粘附和趋化性材料而调节通过血管壁的单核细胞[Baggiolini，2000 #9 ；Imhof，2004 #2 ；Bosco, 2008 #3]。由于正常和受损组织之间的趋化性和氧梯度，渗入的单核细胞移动并且汇集在患病组织的低氧和/或坏死核内，随后分化为组织巨噬细胞。单核细胞/巨噬细胞倾向于聚集的代表性病理组织如下实体瘤、心肌或心脏梗塞、慢性关节炎或动脉粥样斑块的滑液关节、细菌感染部位和愈合的伤口 [Baggiolini，2000 #9 ；Murdoch, 2004 #1 ；Bosco，2008 #3 ；Mantovani，2002 #15](图 1)。
在巨噬细胞由单核细胞分化出之后，已知组织内的巨噬细胞以极化群的形式(Ml 禾口M2 亚组)存在[Mantovani ,2004 #67 ；Sica, 2006 #16 ；Mantovani，2004 #67 ；Mantovani， 2002 #15]。Ml极化巨噬细胞为产生促炎细胞因子的有效炎性细胞并且吞噬抗原，而M2巨噬细胞调节炎性反应并且有助于血管再生和组织修复[Mantovani，2004 #67 ;Sica，2006 #16 ；Mantovani,2004 #67 ；Mantovani, 2002 #15]。有意思的是，在巨噬细胞的基因表达过程中，伤口愈合早期的Ml和M2组合在后期转变为主要为M2基因[DeOnarine，2007 #68]。 在伤口愈合过程的早期，Ml巨噬细胞产生清洁伤口和微生物残骸和/或受损主体组织的直接炎性反应，而M2巨噬细胞则同时启动组织修复和血管再生。在Ml清洁几乎结束的后期阶段，主要是M2巨噬细胞发挥其作用，即组织再生(包括血管再生)[Deonarine,2007#68]。 聚集证据表明补充的单核细胞/巨噬细胞有助于调整和调节缺血性组织、肿瘤和慢性炎症 (如关节炎和动脉粥样硬化)中的新血管形成。
发明概述 本发明通过提供用于治疗缺血(其优选的例子为心绞痛和脑卒中)并且用于改善血流灌注的方法和组合物而实现了这些长期的要求，所述方法和组合物治疗潜在的缺血症，或者本发明实现了改善血流灌注而非由上述病症引起的疼痛的需求，并且提高了基于治疗性细胞的疗法对上述病症的效力的可靠性。
由成单核细胞(骨髓(BM)内的造血干细胞前体)产生的单核细胞在血流内循环， 然后渗入到身体的组织内。在组织内，单核细胞根据它们的解剖学位置而分化成各种类型的定居巨噬细胞，例如，在皮肤内为Langerhans细胞，在肝脏内为Kupffer细胞，在骨内为破骨细胞、在中枢神经系统内为小神经胶质细胞，在肺内为肺泡巨噬细胞，并且在滑液关节内为滑液 A 型细胞(Bosco 等，2008，Gordon，2003，Imhof■和 Aurrand-Lions，2004，Murdoch 等，2004，Sunderkotter等，1994)(

图1)。单核细胞/巨噬细胞能够通过以下方式进行噬菌作用利用介体(如抗体)或包被微生物的互补成分，或者借助于识别抗原的具体受体直接结合抗原(内吞作用)。此外，单核细胞/巨噬细胞能够通过被称为抗体介导的细胞毒性的免疫系统应答而杀死由抗原感染的主体细胞(Nathan，1987，Sunderkotter等，1994)。 此外，它们为既能够刺激免疫活性、又抑制免疫活性的独特免疫调节细胞，包括对T细胞的抗原呈递并且控制多种细胞因子和生长因子的分泌(Bosco等，2008，Murdoch等，2004， Paulnock等，2000)。总之，单核细胞/巨噬细胞通过杀死抗原(包括噬菌作用和细胞毒性) 以及免疫调节(Bosco，等，2008，Paulnock等，2000)而在天生防御系统中起到主要作用。
心绞痛和脑卒中为其中患者需要改善的血流灌注的代表性缺血性病症。在这方面，本发明部分地实现了确立用于治疗心绞痛、脑卒中和其他形式的缺血的新的独特方法的需求。其中需要改善的血流灌注的其他缺血性病症也类似地需要改善的疗法。
在一个实施方案中，所述方法包括对需要治疗的个体施用单核细胞，其中所述单核细胞在具体确定为提供治疗效能的量和时间点的条件下以系统方式被施用给个体。
本发明的一个方面包括治疗对象内的缺血的方法，包括将单核细胞谱系细胞富集的治疗性细胞群注入对象的缺血性组织内。在某些实施方案中，缺血为心脏缺血，并且缺血性组织为心脏的心肌层。本发明的另一个方面包括改善对象内血流灌注的方法，包括 将单核细胞谱系细胞富集的治疗性细胞群注入到需要改善的血流灌注的对象内。在某些实施方案中，组织为心脏的心肌层。本发明的又一方面涉及治疗对象内的心绞痛的方法，包括将单核细胞谱系细胞富集的干细胞群注入到对象的心肌层内。在上述任意方面的实施方案中，所述方法包括注射单核细胞谱系细胞富集的治疗性细胞群内的IO7个单核细胞谱系细胞。上述的方面和实施方案还可以包括通过以下方式将单核细胞群注入心肌层内的实施方案，所述方式为至少两次独立的注射、至少三次独立的注射、至少四次独立的注射、至少五次独立的注射、至少十次独立的注射、至少12次独立的注射、至少30次独立的注射、至少40 次独立的注射、至少50次独立的注射、至少60次独立的注射、至少70次独立的注射、至少 80次独立的注射、至少90次独立的注射和至少100次独立的注射。上述的方面和实施方案还可以包括其中注射量为0. 05ml至0. 3ml或约0. 2ml的实施方案。上述的方面还可以包括单核细胞谱系细胞富集的治疗性细胞群相对于对象为自体细胞群或异体细胞群实施方案。上述的方面和实施方案还可以包括其中治疗性细胞群为单核细胞群的实施方案。上述的方面和实施方案还可以包括其中在注射步骤之前，进行选自以下步骤中的步骤的实施方案利用富集单核细胞谱系细胞的方法分离干细胞；在富集单核细胞谱系细胞的条件下培养治疗性细胞群以及将单核细胞谱系细胞加入到治疗性细胞群中。
本发明的另一方面包括可注射治疗工具，包括能够将所测定注射量的输送至缺血性组织内的设施，其中所述设施为包括治疗剂的贮存器，并且所述治疗剂包含单核细胞谱系细胞富集的治疗性细胞群。在一个实施方案中，治疗性细胞群为单核细胞群。上述的方面和实施方案还可以其中单核细胞谱系细胞富集的治疗性细胞群包含至少IO7个单核细胞谱系细胞的实施方案。
附图简述 图1示出在细胞治疗过程之后6个月，经心肌内注入的单核细胞的数量(细胞数目χ 10~6，x-轴)与心肌血流灌注改善状况(％，y轴)之间的比较。该图示意性示出单核细胞注入数量与心肌血流灌注改善状况之间的相关性，并且具有统计学意义(P < 0. 05,FD =6)。
图2示出在细胞治疗过程之后6个月，经心肌内注入的单核细胞的数量(χ-轴) 与心肌血流灌注改善状况(％，y轴)之间的比较。该图示出血流灌注的改善是由注入的细胞、而不是由针或液体灌注的物理冲击引起的，因为在心肌血流灌注和注入次数之间没有观察到明显的相关性(p = n. s ；FD = 6)。
图3示出CCSAC在18个月随访期间的变化。图中的各线表示登记入ReACT内的一个患者，以及在18个月随访期间的相应CCSAC改善。χ轴表示CCSAC级别(数字4表示难治愈心绞痛，并且数字0表示无疼痛)。y轴便表示患者随访月份。左侧的表格表示在3个月、6 个月、12个月和18个月随访时的CCSAC改善。相对于基线而言；如果ρ < 0. 0125 (0. 05/4)(Bonferroni相关性)，则心绞痛级别的变化具有统计学意义。
图4示出由负荷Tecnecium闪烁扫描法评价的心肌缺血区域在12个月随访时的变化。图中的各线表示登记入ReACT内的一个患者，以及在12个月随访期间的相应闪烁扫描心肌缺血区域的改善状况。X轴表示闪烁扫描心肌缺血区域的比例。y轴表示患者的随访月份(仅在6月份和12月份评价闪烁扫描分析)。右下栏侧的表格示出6月份和12月份随访时的闪烁扫描心肌缺血区域的改善的单边Wilcoxon检验统计分析。相对于基线而言；如果P < 0. 0125 (0. 05/4) (Bonferroni相关性)，则闪烁扫描心肌缺血区域的改善的变化具有统计学意义。
图5 单核细胞和巨噬细胞为脐带血中用于修复大鼠内的中度冠动脉闭塞(MCAO) 后的脑部损伤的关键成分。A)在MCAO之后，身体同侧的大脑半球(特别是纹状体、海马状突起和皮层)内具有明显的损伤。MCAO 48小时后的HUCB治疗减小了病变大小，而从人脐带血(HUCB)部分中除去⑶14+单核细胞和巨噬细胞则消除了这种效果。B)在从HUCB中除去CD14+单核细胞和巨噬细胞时，MCAO后的梗塞体积增加至未治疗的MCAO大鼠的梗塞体积水平。⑶14缺失组的梗塞体积显著大于HUCB治疗组的梗塞体积。
图6 运动不对称性的登阶检验测量。A)在MCAO之后，残肢登的台阶数降低。HUCB 施用改善了该肢体的性能，而从HUCB部分中除去CD14+细胞(单核细胞和巨噬细胞)则使得这种恢复丧失。B)仅注射⑶14+HUCB细胞改善了患病前肢的运动功能。
图7 自发性活动由于施用⑶14+HUCB细胞而减少。在MCAO后，大鼠变得极度活跃。施用脐带血单核细胞和巨噬细胞将活动趋向正常水平(基线)降低，其体现为多个运动参数，包括A)水平活动B)在笼内移动的距离C)竖直活动(向后)以及D)逆时针转动。
图8:示出单核细胞/巨噬细胞个体发育的示意图。多能性干细胞在骨髓内分化为骨髓祖细胞或淋巴祖细胞。粒细胞-单核细胞祖细胞由骨髓祖细胞产生，然后分化为成髓细胞和成单核细胞。单核细胞由成单核细胞分化，随后由骨髓迁移至血液内。血液单核细胞在渗入组织后根据解剖学位置而分化为各种类型的定居巨噬细胞。另一方面，在炎性过程的早期，循环的单核细胞的补充和穿内皮迁移由一系列粘附和趋化性材料(由炎性细胞表达)增强。补充的单核细胞由于正常组织和受损组织之间的趋化性梯度和氧梯度而迁移，并且聚集在缺血症或实体瘤或慢性炎性疾病的炎性和低氧核内，然后分化为发生极化的补充巨噬细胞(Ml或M2亚组)。
发明详述 一般而言，本发明通过提供用于治疗缺血和改善血流灌注的方法和组合物而实现了上述的长期要求。优选的治疗方法为治疗心肌缺血和心绞痛。所述方法部分地取决于以下出乎意料的发现具有单核细胞谱系细胞的干细胞群的富集改善了目前利用基于肝细胞的疗法观察的效力的可靠性。
骨髓和源自骨髓的干细胞群为参与血管生成和炎性过程的广谱细胞因子的天然来源。
在血管再生的各个阶段，各种细胞因子被表达，所述细胞因子例如为肿瘤坏死因子-a (TNFa)、白细胞介素(IL)、干扰素-g (IFN_g)和巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)。这些细胞因子诱导平滑肌细胞表达间质性胶原酶和基质降解酶，这些酶进而降解局部胶原， 从而导致血管变薄，以及血管向外凸出。在血管内表达的细胞因子为炎性细胞的有效化学引诱物，从而诱导粘性分子在内皮上的表达以及它们的反配体在白细胞内的表达，促进血小板活性和血栓形成，并且抑制血栓溶解。
骨髓单核细胞或前单核细胞能够在趋化性刺激物作用下被激活，并且最终分化为巨噬细胞。巨噬细胞通过其分泌蛋白酶、生长因子、单核因子的能力以及血管生成过程的各个阶段的影响而在血管再生过程中起到重要作用，所述影响例如为局部细胞外基质的改变、诱导内皮细胞迁移或增殖，并且抑制血管生长以及形成分化的毛细血管。
缺血性疾病的病理生理学过程为某些组织区域内的血流灌注的减少。血流灌注不足的区域内的细胞缺乏足够的氧供应，因此不能执行其固有功能。在这种情况下，诱导血管再生能够通过增加氧的供应唤醒或补充冬眠细胞，从而改善组织功能。
标准的难治愈性心绞痛患者(其具有活性心肌层以及保留或轻度受抑制的左心室功能)为采用本发明的心肌内注射单核细胞谱系细胞富集的干细胞群的血管再生疗法的理想候选者。
我们启动了难治愈性心绞痛患者(其具有保留或轻度受抑制的左心室功能)的非随机化临床试验，并且采用心肌内注射BMMC作为唯一的疗法，以便增强通过血管再生心肌增强血流(骨髓肝细胞疗法的唯一明确的效果以及该患者群的独特具体需求)。
定义 如本文所用，术语“治疗性细胞群”可以为能够分化为中胚层谱系细胞的单核细胞群和干细胞群中的任一者或这两者。
术语患者“患者”在本文中用于描述采用本发明的细胞对其进行治疗的动物，优选为人类。对于治疗具体动物(如人类患者)所特有的那些感染、病症或疾病状态，术语患者是指该具体的动物。术语“捐献者”用于描述捐献用于患者内的脐带血或脐带血细胞的个体(动物，包括人类)。
术语“脐带血”在本文中用于表示由新生儿或胎儿(最优选新生儿)获得的血，并且优选表示由新生儿的脐带或胎盘获得的血。优选的是，脐带血由人的新生儿分离得到。采用脐带血作为单核细胞来源是有利的，因为其能够相对容易地获得，并且不会对捐献者造成创伤。与此形成对比的是，由捐献者收集骨髓细胞为创伤型过程。根据需要，脐带血细胞可以用于自体移植或异体移植。脐带血优选由脐带直接排出和/或用针从输送的胎盘的根部和扩张的静脉抽取，从而获得。如本文所用，术语“脐带血细胞”是指存在于脐带血内的细胞。在一个实施方案中，脐带血细胞为采用本领域的技术人员已知的方法从脐带血中进一步分离的单核细胞。在另一个实施方案中，脐带血细胞可以在施用给患者之前进一步分化。
术语“有效量”在本文中用于描述成分的浓度或量，所述成分例如为分化剂、脐带血细胞、前体细胞或祖细胞、特化细胞(如神经和/或神经元或神经胶质细胞)、血脑屏障渗透剂和/或有效产生期望结果或实现这些细胞向待治疗患者内的移植的其他试剂，所述期望结果包括将肝细胞和/或祖细胞分化为特化细胞(如神经细胞、神经元细胞和/或神经胶质细胞)，或者治疗神经疾病或其他病症，包括患者中枢神经系统的损害，如脑卒中、心脏病或事故受害。本发明的组合物可以用于实现组合物内的脐带血细胞的移植，以产生脑部或脊髓的有利变化或者所治疗疾病或病症的有利变化，无论所述变化为改善(如终止或逆转疾病或病症的恶化，减少神经不足或改善神经应答)还是完全治愈所治疗的疾病或病症。
术语“干细胞”或“祖细胞”在本文中可交换用于表示源自脐带血的干细胞和祖细胞。术语干细胞和祖细胞是本领域内已知的(例如，Stem cells Scientific Progress and Future Research Directions，由国立健康研究所制定的报告，2001年6月)。术语“神经细胞”为具有至少一种神经元或神经胶质表型指示的细胞，所述表型例如为染有一种或多种神经元或神经胶质标记，或者其分化为表现出神经元或神经胶质标记的细胞。可用于识别本发明的神经细胞的神经元标记的例子包括(例如)神经元特异性核蛋白、酪氨酸羟化酶、微管相关蛋白和钙结合蛋白等。术语神经细胞还包括作为神经前体细胞的细胞，所述神经前体细胞为分化成或变为最终表现出神经元或神经胶质标记的细胞的干细胞和/祖细胞，该术语包括最终分化为神经元和/或神经胶质细胞的多能性干细胞和/或祖细胞。为了本发明的目的，所有上述细胞和它们的子代均被称为神经细胞。神经干细胞为在机体的生命期间能够增增殖、表现出自我修复性或更新并且产生克隆相关神经后代的细胞。神经干细胞在发育过程中产生神经元、星细胞和少突细胞，并且能够置换成年人脑部中的多种神经细胞。为了本发明的目的，神经干细胞为神经细胞。术语“经细胞”和“神经元细胞”在本发明的多个方面中可互换使用。本发明的某些方面优选使用的神经细胞包括表现出一种或多种神经/神经元表型标记的那些细胞，所述标记例如为Musashi-1、Nestin、NeuN、III 类β -微管蛋白、GFAP、NF-L、NF-M、微管相关蛋白(MAP2)、S100、CNPase、磷脂酰肌醇蛋白聚糖(具体为磷脂酰肌醇蛋白聚糖4)、神经元穿透素II，神经元PAS 1、神经元生长相关蛋白43、神经突增生延伸蛋白、波形蛋白、Hu、互联蛋白、04、髓磷脂基础蛋白和多效蛋白等。
如本文所用，“干细胞”为得自胚胎、胎儿或成人的细胞，其在适当的条件下能够被培养数个轮次，而不会分化或死亡。此外，干细胞在适当的条件下能够分化为至少两种细胞类型。
如本文所用，“多能性干细胞”能够分化为属于不同胚层谱系(中胚层、内胚层和外胚层)的至少两种细胞类型，体内的所有细胞均由上述胚层谱系产生。多能性细胞可以得自胚胎。
“胚胎干细胞”为得自胚胎的干细胞、通常为得自被称为内细胞群的细胞群组的细胞，其为被称为胚泡的早期胚胎0至5天)的一部分。一旦从胚泡中取出，内细胞群可以被培养为任何其他干细胞。
“成人干细胞”为由成人(即非胚胎组织)分离的干细胞。所有成人干细胞通过数轮培养均能够产生自身的相同拷贝。这种性能被称为“自更新”。成人干细胞在适当的条件下通常产生祖细胞或前体细胞，其然后分化或发育为具有特征形状或特定功能的成熟细胞，例如，构成细胞壁的细胞。成人干细胞可以由多种组织分离，所述组织例如为脑部、 骨髓、骨膜、外周血、血管、骨骼肌、皮肤和结缔组织的上皮细胞、角膜、牙齿的牙髓、肾脏、肝脏、胰腺和脂肪组织。
术语“施用”或“给予”在本说明书中被用于描述本发明的细胞(如由脐带血获得的脐带血细胞或由脐带血细胞获得的进一步分化的细胞)被输送给患者以进行治疗的过程。以多种方式施用本发明的细胞，所述方式包括(但不限于)肠胃外方式(该术语表示静脉内和动脉内途径以及其他合适的肠胃外途径)、胸内方式、心室内方式、脑组织内方式 (包括脊髓、脑干或运动皮层)、脑池内方式、颅骨内方式、纹状体内方式和黑质内方式等，这些方式允许本发明的细胞迁移到需要的最终目标位置。本发明的细胞可以以完整脐带血或其一部分的形式(该术语包括其单核细胞部分或单核细胞的一部分，包括高浓度的干细胞或祖细胞)施用。可以在不使用动员剂或分化剂治疗的情况下(“未经治疗”，即不进行进一步治疗以促进脐带血样品中的细胞分化)使用本发明的组合物，或者在用分化剂或其他试剂治疗后再使用本发明的组合物，其中所述其他试剂引起脐带血样品内的某些干细胞和/或祖细胞分化为表现出分化表型的细胞，如神经元和/或神经胶质表型)。
可以以系统方式施用单核细胞，或者将单核细胞施用至目标解剖位置，从而使细胞在该细胞所遇到的生理信号的作用下分化(例如位置特异性分化)。或者，细胞可以在施用至患者之前发生体外分化。
施用方式通常取决于所治疗的疾病或病症，并且可以优选借助于肠胃外途径(例如静脉内)、通过施用至脑脊液或通过直接施用至脑内的患病组织内而进行施用。例如，在阿尔兹海默氏病、亨廷顿疾病和帕金森病的情况下，优选的施用途径为直接移植至纹状体 (caudate cutamen)，或者直接移植至黑质(帕金森病)。在肌萎缩病(Lou Gehrig氏病) 和多种硬化症的情况下，优选的施用方式为通过脑脊液。在溶酶体贮积症的情况下，优选的施用途径为借助于静脉内途径或通过脑脊液。在脑卒中的情况下，优选的施用途径取决于脑卒中的位置，但是可以直接施用至患病组织内(其可以采用MRI或其他成像技术容易地确定)，或者全身式施用。在本发明优选的实施方案中，用于治疗个体脑卒中后的施用途径为通过静脉内或动脉内施用而进行全身式施用。
术语“植入”和“移植”在整个说明书中以同义的方式被用于描述本发明的细胞被输送至期望细胞表现出有利效果的位置的过程，所述有利效果例如为修复中枢神经系统的损害(其可以减轻由损害导致的认知或行为缺陷)，治疗神经变性疾病或治疗由脑卒中、心血管疾病、心脏病、物理损害或创伤或基因损害或脑部和/或脊髓的环境损害(例如，其由事故或其他活动导致)引起的神经损害的影响。本发明的细胞还可以通过上述的任何施用方式被输送至体内的远端位置，然后依赖于细胞迁移而到达合适的区域，以实现移植。优选的是，将细胞与血脑屏障渗透剂共同施用。
术语“非肿瘤性”是指细胞不产生赘生物或肿瘤的情况。用于本发明的干细胞和 /或祖细胞优选不形成肿瘤或癌症。
术语“神经变性疾病”在本文中被用于描述这样的疾病，其由中枢神经系统的损害导致，并且该损害能够通过移植本发明的神经细胞至脑部和/或脊髓的受损区域而得到减轻和/或缓解。可以采用本发明的神经细胞和方法治疗的示例性神经变性疾病包括(例如)帕金森病、亨廷顿疾病、肌萎缩病(Lou Gehrig氏病)、阿尔兹海默氏病、Rett综合症、 溶酶体贮积症(“白质体病”或神经胶质/脱髓鞘病，例如，如文献R)lkerth，J. Neuropath. Exp. Neuro.，1999年9月，58 :9所述的那些)，包括Sanfilippo综合症、戈谢病、泰_萨克斯病(β_己糖胺酶缺乏症)、其他遗传疾病、多硬化症、由缺血、事故、环境损伤等导致的脑部受损或创伤、脊髓受损、共济失调和酒精中毒。此外，本发明还可以用于减轻和/或消除对患者内的脑卒中或心脏病的中枢神经系统的影响，所述影响由所述患者内的脑部位置缺乏血流或缺血导致，或者由对脑部和/或脊髓的物理损害导致。神经变性疾病还包括神经发育障碍，其包括(例如)孤独症和相关的神经疾病，如精神分裂症等。
术语“基因疗法”在本说明书的全文中被用于描述将新的基因信息转移和稳定的插入值细胞内，以治疗疾病或病患。外源基因被转移至细胞内，该细胞增殖从而在细胞群内扩散新的基因。脐带血细胞或祖细胞为在分化之前或分化为神经细胞表型之后的基因转移的目标。本发明的脐带血干细胞或祖细胞可以用异源核苷酸序列进和可操作地连接的启动子进行基因修饰，所述启动子驱动异源核苷酸序列的表达。核苷酸序列可以编码所关注的各种蛋白或肽。由基因修饰细胞产生的基因产物可以在体外捕集，或者细胞可以用作体内输送基因产物的载体(即基因疗法)。
单核细胞谱系细胞 以下书面说明对实施本发明的多个方面提供给了示例性的(但不是限制性的)的方法和指导。
在本文中讨论的各种细胞和细胞群可以通过多种方式表征，所述方式包括(例如)生长特性(例如，细胞群加倍能力、加倍时间、传代至衰老)、染色体组型分析(例如，正常染色体组型、母系或出生谱系)、流量细胞技术(例如，FACS分析)、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(例如，检测抗原决定基)、基因表达图谱(例如，基因芯片阵列、聚合酶链式反应(例如，逆转录酶PCR、实时PCR和常规PCR))、蛋白阵列、蛋白分泌(例如，通过血浆凝块分析或PDC调理基质的分析，例如通过酶联免疫吸附分析(ELISA))、混合淋巴细胞反应 (例如，由PBMC的刺激测量)和/或本领域内已知的其他方法。
分离的细胞或细胞群可以用于启动或接种用于本发明的细胞培养物。可以将这种分离的细胞或细胞群转移至灭菌的组织培养容器内，该容器未包被或包被有细胞外基质或配体，如昆布氨酸、胶原(天然、变性或交联的胶原)、凝胶、纤维连接蛋白和其他细胞外基质蛋白。可以在能够维持细胞生长的任何培养基内培养细胞。上述培养基的例子(本领域内的技术人员可以根据细胞或细胞群的类型以及本领域技术人员可供利用的任何其他培养基而适当选择)包括DMEM(高或低葡萄糖)、高级DMEM、DMEM/MCDB 201、Eagle基础培养基、Ham' s FlO 培养基(FlO)、HamF-12 培养基(F12)、Iscove 改造的 Dulbecco-17 培养基、间质干细胞生长培养基(MSCGM)、DMEM/F12、RPMI 1640和CELL-GR0-FREE。培养基可以根据细胞或细胞类型而适当地补充一种或多种成分，包括(例如)牛血清蛋白(FBS)、马血浆(ES)、人血浆(HS)、β-巯基乙醇(BME或2-ΜΕ)、一种或多种生长因子(例如，源自血小板的生长因子(PDGF)、外皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、类胰岛素生长因子-I(IGF-I)、白细胞抑制生长因子(LIF)和红细胞生长素 (EPO))；氨基酸，包括L-谷氨酸和L-缬氨酸；以及一种或多种抗生素和/或控制微生物污染的抗真菌剂(如盘尼西林G、硫酸链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素，其单独使用或以组合方式施用)。可以将细胞以允许细胞扩增的密度进行接种。
基于细胞或细胞类型选择最合适的培养基、培养基制备和细胞培养技术的方法是本领域内已知的，并且在多个来源有所描述，所述来源包括文献Doyle等，(eds. )，1995， CELL &TISSUE CULTURE :LAB0RAT0RYPR0CEDURES, John Wiley & Sons，Chichester ；以及Ho 禾口 Wang(eds.)，1991，ANIMAL CELL BI0REACT0RS, Butterworth-Heinemann, Boston。
可以通过在含有至少一种促进细胞扩增的因子的确定生长培养基(根据所应用的细胞或细胞群而适当选择)内培养，从而使用于本发明的细胞和细胞群扩增。所述至少一种因子包括(例如)烟酰胺；TGF-β家族的成员，包括TGF-β 1、2和3 ；成骨蛋白(ΒΜΡ-2、 ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-6、ΒΜΡ-7、BMP-IU BMP-12和BMP-13)、血清血蛋白；成纤维细胞生长因子家族的成员、源自血小板的生长因子-AA和源自血小板的生长因子-BB ；血小板富集血浆；胰岛素生长因子(IGF-I、IGF-II)；生长分化因子(GDF-5、GDF-6、GDF-8、GDF-10, GDF-11)；胰高血糖素类肽-I和胰高血糖素类肽-II (GLP-I和GLP-II) ；GLP-I和GLP-II模拟体；毒蜥外泌肽-4 ；维甲酸；甲状旁腺激素；胰岛素；孕酮；抗蛋白酶肽；氢化可的松；乙醇胺；β 巯基乙醇；外皮生长因子(EGF)；胃分泌素I和II ；铜螯合剂，如三亚乙基五胺；福斯高林； 丁酸钠；活化素；β动物纤维素；noggin ；神经元生长因子；nodal ；胰岛素/转铁因子/硒 (ITS)；肝细胞生长因子(HGF)；角化细胞生长因子(KGF)；牛垂体提取物；胰岛新生相关蛋白(INGAP)；蛋白酶体抑制剂；notch通路抑制剂；sonic hedgehog抑制剂或它们的组合。或者，可以通过在调理的培养基内进行培养从而使适用于本发明的细胞扩增，所述调理的培养基为限定的细胞培养基，其中使细胞群生长，以允许细胞将可溶的因子释放至培养基内， 使得调理的培养基包含用于所关注细胞或细胞群的适当可溶因子。在某些实施方案中，从培养基内取出细胞，而所产生的可溶性因子仍然保留在其中。然后，可以将这种培养基用于支持不同的细胞或细胞群。
在单核细胞谱系的造血期间，造血干细胞首先分化为常规的骨髓祖细胞，然后分化为成髓细胞。在分化为成髓细胞之后，细胞然后分化为成单核细胞。成单核细胞是适当地作为单核谱系细胞的一部分的第一细胞，因为其被用于分化为单核细胞。成单核细胞分化为前单核细胞。前单核细胞然后分化为单核细胞。单核细胞然后经历单核细胞发生，而分化为巨噬细胞或骨髓树突细胞。因此，单核细胞谱系细胞包括从成单核细胞直至单核细胞发生过程中的所有细胞类型。
成单核细胞对于本领域技术人员而言可以容易地识别。成单核细胞的直径为12 至20微米。其核与细胞质的相对体积比为4 1至3 1，并且如大多数成骨髓细胞一样， 成单核细胞具有圆形至椭圆形的具有微细染色质结构的核。核可以为中心的或同心的，并且其可以表现出凹陷或折叠的迹象。细胞质为粒状的，中度至轻度嗜碱性的，并且通常具有稠密染色的外周和突出的核周区。
单核细胞同样容易地为本领域的技术人员所识别。成单核细胞的直径通常为13 至25微米之间。单核细胞为较大的循环的噬菌性白血细胞，其具有单一的、较大的、平滑的、明确的椭圆形或肾形核。细胞质的较大区域都具有许多用于处理外来材料的内部囊泡， 并且包含微细的、噬天青细胞质粒子。单核细胞通常在血流内循环约1至3天，然后迁移到全身的其他组织内(如肺和肝脏)。在迁移到其他组织内之后，单核细胞进单核细胞发生行作用，从而根据单核细胞所迁移入的组织类型而成为不同类型的巨噬细胞。前单核细胞与单核细胞类似，但是前单核细胞的核比成熟单核细胞更规则，并且其核与细胞质的比例较尚ο 单核细胞谱系细胞可以采用本领域内可用的任何方法从多种来源分离。其例子包括骨髓、外周血和脐带血。除了通过直接从对象分离而获得单核细胞谱系细胞以外，还可以干细胞(包括但是不限于造血干细胞)分化而获得单核细胞谱系细胞。
单核细胞群 单核细胞群可以由多种来源分离。其一个例子为以下的实施例证明的密度梯度 (从1. 0g/L至1. lg/L，优选为1. 077g/L)。其他例子包括骨髓、外周血和脐带血。除了通过直接从对象分离而获得单核细胞谱系细胞以外，还可以干细胞(包括但是不限于造血干细胞)分化而获得单核细胞谱系细胞。
干细胞群 适合用于本发明的方法的干细胞群可以由以下的任意组织获得，所述组织可以提供能够分化为至少细胞类型的中胚层谱系的肝细胞。
源自骨髓的干细胞为两种研究最多的成人干细胞。目前，目前，这种源自骨髓的肝细胞在临床上用于通过移植而为骨髓补充各种血液和免疫成分。目前有两种在骨髓中发现的主要类型的干细胞造血干细胞(HSC或CD34+细胞)，其能够分化为所有类型的血液和免疫细胞，以及基质(间质)干细胞(MSC)，其通常被认为形成骨骼、软骨、肌肉和脂肪。然而，这两种类型的原子骨髓的干细胞均被证实具有比以前认为的更强的塑性。
本领域的技术人员可以利用分离和培养肝细胞的任意手段，因为有几种方法是公知的。例如，造血干细胞可以由含有丰富供应的该细胞的脐带血获得。由脐带血分离的造血干细胞和由骨髓或外周血分离的造血干细胞在用于移植时行为基本相同。此外，胎盘和骨髓为间质干细胞的优异来源。类似地，能够分化为中胚层谱系细胞的肝细胞已经由脂肪组织获得(但是明显不如源自骨髓的间质干细胞那么具有塑性)，并且干细胞也可以存在于其他组织内。
还可以利用结合特异于干细胞的标志物的抗体(例如，SH2，SH3和SH4-参见美国专利No. 5，486，359和5，837，539)从多种组织内分离干细胞，或者通过利用结合特异于不期望的细胞的标志物的抗体分离干细胞，所述不期望的细胞例如为CD4+和CD8+(T细胞)、 CD45+(panB细胞)、GR_1 (粒细胞)和Iad细胞(分化的抗原呈递细胞)。这种方法的例子可参见于文献 Izaba 等，I. Exp. Med. 176-16931702 (1992)。
造血干细胞可以类似地由多种来源获得，所述来源包括脐带血、骨髓和动员的外周血。可以通过抗体亲和方法对造血干细胞进行纯化(例如，利用结合特异于造血细胞的⑶34的抗体)。利用上述抗体分离细胞的亲和柱分离方法可见于Ho等，Stem Cells 13 (suppl. 31 :100-105(1995)。还可见于文献 Brenner，Journal of Hematotherapy 2 7-17(1993)。间质肝细胞的亲和纯化以及培养扩增的方法也是公知的(例如，参见美国专利No. · 5，486，359和5，837，539)。上述分离方法的其他例子在美国专利No. 6，087，113、美国专利 No. 6，261，549、美国专利 No. 5，914，262、美国专利 No. 5，908，782 和 US20040058412 中有所教导。
单核细胞谱系细胞富集的治疗性细胞群 治疗性细胞群可以通过可供本领域技术人员利用的任意方法富集。一个例子包括分离干细胞群，然后选择由于分离而使得单核细胞富集的那些细胞群。该方法基本如以下的实施例所示，不同之处在于在利用单核细胞群之后再进行测定。可以容易地对这些实施例进行改造，使得在利用之前测量单核细胞的富集情况，然后选择具有充分的富集的那些细胞群和/或对这些细胞群进行进一步富集。由于干细胞群和单核细胞群包括能够被诱导而分化为单核谱系细胞的细胞，因此一种富集方法包括添加一种或多种合适的因子，以诱导细胞群的分化(其为本领域内的技术人员所知)。富集的其他例子包括添加一种或多种细胞因子或其他生长因子，以促进单核谱系细胞比细胞群内的非单核细胞谱系细胞更快地分化或生长；和/或添加一种或多种因子，以选择性地抑制非单核细胞谱系细胞的细胞分化和生长。最后，可以将独立获得或培养的单核细胞谱系细胞加入到治疗性细胞群内。实施例 以下的实施例示出了本说明书公开的方法和组合物的代表性用途。 _4] _仿丨丨 通过标准密度梯度进行骨髓单核细胞的制备(从1. Og/L至1. lg/L，优选为 1. 077g/L)。在以下的实施例2中讨论的细胞制备具有不同量的单核细胞谱系细胞。
通过利用Ficoll Paque PREMIUM (GE Healthcare)进行密度梯度分离，从而进行BMMC的制备。将35mL的骨髓血仔细地加入至IOml Ficoll/管内，不进行混合，从而保持完整的Ficoll表面张力。在9个管内重复上述过程，其中每个患者总共使用10管。 然后将这些管在350g、20°C的条件下离心40分钟(不减速)。在密度分离后，从这10个管中仔细地分离单核环(血浆/Ficoll界面)，并且悬浮于4个管内，向其中加入0. 9%盐水溶液，使得总管体积为45mL。将这4个管在400g、20°C的条件下离心10分钟，从而将细胞与残余的Ficoll分离。在废弃上清液之后，从所有管中收集单核细胞，并且合并于单一一个管(其含有总体积为40ml的0.9%盐水溶液)内。将单核细胞溶液再次在在400g、20°C 的条件下离心10分钟。再次废弃上清液，并且将细胞图悬浮于IOml的0. 9%盐水溶液内。 一旦细胞通过批次放行标准(包括无菌状态、活力和不存在内毒素)，然后通过良好控制规范(GMP)，并且进行适当的自动细胞计数之后，将细胞悬浮于0. 9%盐水以及20%自体血浆内，以保持细胞活力(自体血浆预先用0. 22μπι滤膜过滤，以除去污染细胞)，其最终浓度为 IxlO7个细胞/mL。将最终的单核细胞溶液通过100 μ m的滤膜，以除去细胞团聚物。
实施例2所注入的单核细胞数量与结果的相关性 以下的实施例提供由由本文所述的方法和组合物治疗的患者获得的数据。
我们的研究目的是评价专有设计的方案-难治愈性心绞痛细胞治疗方案(ReACT) 的安全性和效力，其中对特定的BMMC制剂进行了单一系列的多次心肌内注射，以作为用于这些患者的唯一手术疗法。
ReACT的设计符合良好生产规范(GMP)和FDA标准。
纳入该方案的患者需要患有难治愈性心绞痛，具有活性心肌层(通过负荷 Tecnecium闪烁扫描诊断)，没有左心室机能障碍(射血分数为至少45% )，并且不适合于心肌血管再生成(PTCA或CABG)。
8例难治愈性心绞痛患者纳入从2005年9月至2007年七月的本项研究。所有患者以前均进行过血管再生成手术一次G例患者)、两次(3例患者)或4次(1例患者)，而没有缓解心绞痛。患者的基线特征记载于表1中。
还纳入了另外4例难治愈性心绞痛患者，并且进行了 ReACT，但是要求同时进行冠状动脉旁路搭桥术，因此从该分析中排除。这些患者目前正在作为独立的小组进行随访。
难治愈性心绞痛患者定时来访位于巴西SSO Paulo市的S§0 Paulo医院(一家用于治疗冠心病的提供高等教育的周立大学医院)，并且这些患者纳入本研究中。研究方案 (ReACT)由我们当地的国家伦理委员会批准(CEP-EPM-0314/05)，并且所有患者均提交了书面的知情同意书。根据加拿大心血管协会绞痛分级(CCSAC)，难治愈性心绞痛患者被定义为患有功能性IV级心绞痛(安静时心绞痛)的患者，而不管是否进行了最大程度的医学治疗，并且这些患者不适合于常规的心肌血管再生成手术并且确认具有活性心肌层。由至少
20两名心脏病专家和2名心血管外科医生根据最近来访患者(6个月内)的管状动脉造影照片确认了患者不适合于进行血管再生成术(经皮或手术)。排除标准为(1)根据经胸超声心电图，左室射血分数(LVEF) < 45%； (2)根据心脏核成像测试不存在活性心肌层；(3)人免疫缺陷病毒(HIV)，A型、B型和C型肝炎病毒，人T细胞淋巴病毒(HTLV)或Chagas病的血清测试结果为阳性；(4)明显的心瓣膜疾病；( 透析中的慢性肾脏疾病；(6)滥用酒精和药物；(7)估计存活期< 5年的任何其他医学病症；(8)参与了以前的细胞治疗研究以及 (9)怀孕。
进行I/IIa期前景临床试验的一次性手术过程，其中骨髓单核细胞(根据实施例 1制备)经心肌内被注入到患有难治愈性心绞痛的患者(其具有正常或轻度受抑制的左心室功能)的多个注射点。患者的难治愈性心绞痛被严格地定义为加拿大心血管协会绞痛分级(CCSAC)的IV级，其经过完全优化的药理治疗，而没有任何医学或可能的介入过程(CABG 和PTCA)- “无选择”患者。
对于各患者，从其髂嵴内抽取总共IOOcc的骨髓，并且储存在含有浓度为80U. I.肝磷脂/ml的盐水溶液内。通过密度梯度法分离单核细胞，并且根据ReACT和良好生产规范(GMP)将其稀释至最终浓度为IO7个细胞/mL。进行细胞活力、总单核细胞数、白细胞差异计数和CD34+含量分析，以及好氧菌和厌氧菌微生物学分析。将进一步用于评价的样品储存。
通过左侧胸廓切开术以手术方式将一系列的多个细胞制剂注射到左心室心肌层内，注射条件如下0. 2mL(2xl06个细胞)/次注射，注射位置之间的距离为Icm并且心外肌膜注入深度为1cm。每个患者的注射次数(40至90)根据核成像测试、磁共振成像(MRI)、 闪烁扫描成像和左心室放大所确定的心肌层活性缺血区域的延伸程度而有不同。
膽 手术后48小时监测患者的心律。在手术后第3个月、6个月、12个月和18个月进行CCSAC临床评价。在基线以及第1、3、6和12个月时进行超声波心动图测试，并且在基线以及第6和12个月时进行心脏磁共振成像，以评价安全性。在基线以及手术过程第6和12 个月时进行核成像测试(Tecnecium负荷诱导的心肌层灌注扫描和MRI)，以评价心肌层缺血区域的比例。关于心脏缺血区域的客观分析(负荷闪烁扫描)，重要的是指出所有患者都被认为在细胞制剂注射之前，在由负荷Tecnecium闪烁扫描确认的那些具体左心室壁上具有100%的活性心肌缺血区域。这些可逆的心脏缺血区域被认为是基线，以与随后第6个和 12个月的闪烁扫描分析进行比较。仅在随访的第6和12个月进行闪烁扫描分析。
统计分析 采用Friedman非参数检验评价在随访第3、6和12个月时的CCSAC心绞痛级别的变化以及在随访第6和12个月时的心肌层缺血区域的变化。对于hoc后比较，采用具有 Bonferroni校正的Wilcoxon检验。通过Spearman检验评价结果(注射过程后的心绞痛级别和心肌层缺血区域)与注射次数之间的相关性。为了比较注射过程之前与注射过程之后 12个月时的超声波心动图上的左心室功能，采用Wilcoxon非参数检验。
如下详细所示，患者的心肌血流灌注的改善(或不改善)与单核细胞谱系细胞的剂量相关。接受最高数量的单核细胞谱系细胞的患者显示出心绞痛级别由IV降至 0(CCSAC)。
下表IA示出只接种重组蛋白或者接种重组蛋白与OMV的组合的人对象内的完全血清转化(滴定度彡1 4)结果。

权利要求
1.一种治疗对象内的缺血症的方法，包括将单核细胞谱系细胞富集的治疗性细胞群注入所述对象的缺血性组织内。
2.一种改善对象内的血流灌注的方法，包括将单核细胞谱系细胞富集的治疗性细胞群注入所述对象的需要改善血流灌注的组织内。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述缺血症为心脏缺血症，并且所述缺血性组织为缺血的心肌层。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述血流灌注为心脏血流灌注并且所述组织为心肌层。
5.一种治疗对象内的心绞痛的方法，包括将单核细胞谱系细胞富集的治疗性细胞群注入所述对象的心肌层内。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中注入所述心肌层中的富集的治疗性细胞群包含至少107个单核细胞谱系细胞。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其中以如下方式将所述单核细胞群注入所述心肌层内，所述方式为至少两次独立的注射、至少三次独立的注射、至少四次独立的注射、至少五次独立的注射、至少10次独立的注射、至少20次独立的注射、至少30次独立的注射或至少40次独立的注射。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述注射的量为0.05ml至0. 3mL·
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述注射的量为约0.2mL·
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述单核细胞谱系细胞富集的治疗性细胞群相对于所述对象为自体的。
11.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述单核细胞谱系细胞富集的治疗性细胞群相对于所述对象为异体的。
12.根据权利要求1-11任一项所述的方法，还包括在注射之前，进行选自下列步骤的步骤利用富集单核细胞谱系细胞的方法由样品分离所述治疗性细胞；在富集单核细胞谱系细胞的条件下培养治疗性细胞群以及将单核细胞谱系细胞加入到治疗性细胞群中。
13.根据权利要求1-12任一项所述的方法，其中所述治疗性细胞群为单核细胞群。
14.一种可注射治疗工具，包括能够将所测定注射量的治疗剂输送至缺血性组织内的设施，其中所述设施包括治疗剂的贮存器，并且所述治疗剂包含单核细胞谱系细胞富集的治疗性细胞群。
15.根据权利要求14所述的可注射治疗工具，其中所述治疗性细胞群为单核细胞群。
16.根据权利要求14-15任一项所述的可注射治疗工具，其中所述单核细胞谱系细胞富集的治疗性细胞群包含至少107个单核细胞谱系细胞。
17.一种由脐带血分离人单核细胞的方法，包括a)由所述脐带血获取单核细胞的样品；b)从步骤a)中选择并且分离所述样品中的所述人单核细胞。
18.一种制备包含由脐带血获得的人单核细胞的药物组合物的方法，包括a)由所述脐带血获取单核细胞的样品；b)从步骤a)中选择并且分离所述样品中的所述人单核细胞；c)将由步骤b获得的所述细胞与可药用的载体、添加剂或赋形剂组合。
19.一种由外周血分离单核细胞的方法，包括a)由所述外周血获取单核细胞的样品；b)从步骤a)中选择并且分离所述样品中的所述人单核细胞。
20.一种制备包含由外周血获得的人单核细胞的药物组合物的方法，包括a)由所述外周血获取单核细胞的样品；b)从步骤a)中选择并且分离所述样品中的所述人单核细胞；c)将由步骤b获得的所述细胞与可药用的载体、添加剂或赋形剂组合。
21.一种由骨髓分离单核细胞的方法，包括a)由所述骨髓获取单核细胞的样品；b)从步骤a)中选择并且分离所述样品中的所述人单核细胞。
22.—种制备包含由骨髓获得的人单核细胞的药物组合物的方法，包括a)由所述骨髓获取单核细胞的样品；b)从步骤a)中选择并且分离所述样品中的所述人单核细胞；c)将由步骤b获得的所述细胞与可药用的载体、添加剂或赋形剂组合。
23.根据权利要求18、20和22所述的方法，其中所述可药用的载体、添加剂或赋形剂选自包含下列物质的组
24.一种治疗患有神经变性疾病的人类患者的方法或者治疗神经损伤作用的方法，包括通过植入方式将所述患者的有效量的人单核细胞施用给所述患者。
25.一种治疗患有肌萎缩病的人类患者的方法，包括在不存在放射步骤或化疗步骤的情况下，通过植入方式将所述患者的有效量的人单核细胞施用给所述患者，其中所述放射步骤或化疗步骤被用于减少骨髓产生的造血细胞。
26.一种治疗患有神经变性疾病的人类患者的方法或者治疗神经损伤作用的方法，包括通过植入方式将所述患者的有效量的人单核细胞施用给所述患者。
27.一种治疗患有神经变性疾病的人类患者的方法或者治疗神经损伤作用的方法，包括在不存在放射步骤或化疗步骤的情况下，通过植入方式将所述患者的有效量的人单核细胞施用给所述患者，其中所述放射步骤或化疗步骤被用于减少骨髓产生的造血细胞。
28.一种治疗患有神经变性疾病的人类患者的方法或者治疗神经损伤作用的方法，包括通过植入方式将有效量的人单核细胞施用给所述患者。
29.一种治疗患有神经变性疾病的人类患者的方法或者治疗神经损伤作用的方法，包括在不存在放射步骤或化疗步骤的情况下，通过植入方式将有效量的人单核细胞施用给所述患者，其中所述放射步骤或化疗步骤被用于减少骨髓产生的造血细胞。
30.一种治疗患有神经变性疾病的人类患者的方法或者治疗神经损伤作用的方法，包括通过植入方式将根据权利要求2、4和6所述的方法获得的有效量的人单核细胞施用给所述患者。
31.根据权利要求M-30所述的方法，其中所述神经变性疾病选自包含下列疾病的组 帕金森病、亨廷顿疾病、艾尔兹海默氏病、肌萎缩病(ALS)、多硬化症(MQ、泰-萨克斯病 (β -己糖胺酶缺乏症)、Rett综合症、溶酶体贮积症、缺血症、脊髓损伤、创伤性脑受损、共济失调、酒精中毒、精神分裂症或孤独症。
32.根据权利要求M-30所述的方法，其中所述神经损伤的诱因选自包含下列因素的组脑卒中、心血管疾病、心脏病、物理受损、创伤、基因损伤或环境对脑部和/或脊髓的损害。
33.一种治疗患有循环疾病的人类患者的方法，包括通过植入方式将所述患者的有效量的人单核细胞施用给所述患者。
34.一种治疗患有循环疾病的人类患者的方法，包括通过植入方式将所述患者的有效量的人单核细胞施用给所述患者。
35.一种治疗患有循环疾病的人类患者的方法，包括在不存在放射步骤或化疗步骤的情况下，通过植入方式将所述患者的有效量的人单核细胞施用给所述患者，其中所述放射步骤或化疗步骤被用于减少骨髓产生的造血细胞。
36.一种治疗患有循环疾病的人类患者的方法，包括通过植入方式将有效量的人单核细胞施用给所述患者。
37.一种治疗患有循环疾病的人类患者的方法，包括在不存在放射步骤或化疗步骤的情况下，通过植入方式将有效量的人单核细胞施用给所述患者，其中所述放射步骤或化疗步骤被用于减少骨髓产生的造血细胞。
38.一种治疗患有循环疾病的人类患者的方法，包括通过植入方式将根据权利要求 18,20和22所述的方法获得的有效量的人单核细胞施用给所述患者。
39.一种治疗个体内受损组织的方法，包括a)确定所述个体内组织受损的位置；以及b)将有效量的人单核细胞施用至所述患者内组织受损的位置处或该受损的位置周围。
40.一种将细胞移植给需要该细胞的患者的方法，所述方法包括将有效量的人单核细胞施用给所述患者。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述患者处于病理状态。
42.根据权利要求所述的方法，其中所述病理状态与细胞死亡、细胞损失或细胞功能障碍有关。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述病理状态选自包含癌症、神经变性疾病、糖尿病和创伤的组。
44.根据权利要求41所述的方法，其中所述病理状态选自包含下列疾病的组灼伤、头部创伤、脊髓受损、脑卒中、心肌梗塞、关节病、帕金森病、阿尔兹海默氏病、亨廷顿疾病、妥瑞氏综合症、肌萎缩病、爱迪森病、垂体机能不全、肝功能衰竭、炎性关节炎、神经性疼痛、失明和听力损耗。
45.一种减轻接受细胞移植的人类患者内的移植物抗宿主病的方法，所述方法包括将有效量的人单核细胞给所述患者。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述患者处于病理状态。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述病理状态与细胞死亡、细胞损失或细胞功能障碍有关。
48.根据权利要求46所述的方法，其中所述病理状态选自包含癌症、神经变性疾病、糖尿病和创伤的组。
49.根据权利要求46所述的方法，其中所述病理状态选自包含下列疾病的组灼伤、头部创伤、脊髓受损、脑卒中、心肌梗塞、关节病、帕金森病、阿尔兹海默氏病、亨廷顿疾病、妥瑞氏综合症、肌萎缩病、爱迪森病、垂体机能不全、肝功能衰竭、炎性关节炎、神经性疼痛、失明和听力损耗。
50.根据权利要求M-30、33-40和45所述的方法，其中所述施用方式选自包含下列方式的组肠胃外施用(其包括静脉内施用或动脉内施用)、胸内施用、心室内施用、脑组织内施用、脑池内施用、颅骨内施用、纹状体内施用或黑质内施用。
51.根据权利要求M-30、33-40和45所述的方法，其中所述移植方式包括异体移植或自体移植。
全文摘要
本发明涉及用于治疗缺血性疾病和病症(特别是心肌缺血、CNS/脑部缺血和肢体缺血)的组合物和方法。更具体而言，本发明提供通过将由血液(包括脐带血、外周血或骨髓)获得的单核细胞施用给需要治疗过的患者而治疗疾病的方法，其中在具体确定为提供治疗效能的时间点，将所述药物施用给所述个体。在一个实施方案中，将细胞注入缺血性心肌层内以治疗心绞痛。
文档编号C12N5/071GK102186970SQ200980139421
公开日2011年9月14日 申请日期2009年9月14日 优先权日2008年9月12日
发明者P·R·萨柏格, N·霍斯尼, A·E·威林, A·因维蒂 申请人:克里奥普拉斯低温生物有限公司, 圣保罗联邦大学, 南佛罗里达大学