专利名称：Δ6去饱和酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。更具体地讲，本发明涉及编码Δ6脂肪酸去饱和酶的多核苷酸序列的鉴定以及这些去饱和酶在制备长链多不饱和脂肪酸[“PUFA”]中的用途。
背景技术：
人们正研究包括植物、藻类、真菌、原生藻菌(stramenopiIes)和酵母在内的多种不同宿主作为商业化多不饱和脂肪酸[“PUFA”]生产的手段。基因工程已经证明能够基本上改变一些宿主(甚至那些天然不能产生亚油酸[LA;18:2gj-6]和α -亚麻酸[ALA; 18:3 ω-3]脂肪酸)的天然能力以高水平的生产多种长链《-3/co-6PUFA。无论这是天然能力还是重组技术的结果，生产花生四烯酸[ARA;20:4co-6]、二十碳五烯酸[ΕΡΑ;20:5ω-3] 和二十二碳六烯酸[DHA ；22:6ω-3]可能都需要表达Δ6去饱和酶。迄今为止鉴定的大多数Δ6去饱和酶具有将LA转化成Y-亚麻酸WLA; 18:3ω-6]的基本能力，以及将ALA转化成十八碳四烯酸[STA ； 184ω-3]的次级活性。基于Δ 6去饱和酶可在例如ARA、EPA和DHA合成中起作用，已经投入相当大的努力鉴定和研究这些来自不同来源的酶。同样地，在公开文献(例如GenBank)和专利文献(例如美国专利5，968，809,7, 067，285、和7，335，476以及美国专利申请公布2006-0117414)中已经公开了多种Δ 6去饱和酶。连同Δ 5、Δ8和Δ 4去饱和酶一起，已知Δ 6去饱和酶是长链 PUFA “前端”去饱和酶(其中去饱和发生在先前存在的双键和脂肪酸酰基的羧基末端之间， 与甲基定向的去饱和相反)。这些去饱和酶特征在于三个组氨酸框[H(X)3_4H(SEQ ID NO 3 和 4)、H(X)2_3HH(SEQ ID N0:5 禾口 6)和 H/Q (X) 2_3HH(SEQ ID NO :7 和 8)]，以及是细胞色素 b5融合超家族的成员，因为它们在N末端具有融合细胞色素b5结构域，该结构域起到电子供体的作用。尽管编码Δ 6去饱和酶的基因是已知的，仍需要这些酶的附加种类，它们具有不同的酶特性，适于在多种宿主生物中的异源表达以用于生产ω-3/ω-6脂肪酸。申请人已经通过从红藻紫球藻(Porphyridium cruentum)中分离编码Δ 6去饱和酶的基因满足了所述需求。发明概述本发明涉及编码具有△ 6去饱和酶活性的多肽的新的遗传构建体，以及它们在藻类、细菌、酵母、类眼虫、卵菌、原生藻菌和真菌中的使用，用于产生PUFA。因此本文提供了分离的核酸分子，其包含编码Δ6去饱和酶的核苷酸序列，所述分离的核酸分子选自(a)编码如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的分离的核酸分子；(b)在以下杂交条件下与(a)杂交的分离的核酸分子0. IX SSC,0. 1% SDS,65°C并用2X SSC, 0. 1% SDS洗涤，随后用0. 1XSSC，0. 1% SDS洗涤；或者与(a)或(b)完全互补的分离的核酸分子。在第二实施方案中，本发明提供分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含编码至少471个氨基酸的Δ 6去饱和酶的第一核苷酸序列，所述去饱和酶基于BLASTP比对方法在与包含如SEQ ID NO 2所示的序列的多肽进行比较时具有至少80%的同一性；或包含第一核苷酸序列的互补序列的第二核苷酸序列。在第三实施方案中，本发明提供由本发明的核酸序列编码的多肽以及包含相同多肽的微生物宿主细胞。在第四实施方案中，本发明提供用于产生Y-亚麻酸的方法，该方法包括a)提供表达权利要求1或权利要求4的核酸序列的微生物宿主细胞；以及b)在产生Y-亚麻酸的条件下，在亚油酸源的存在下培养(a)的宿主细胞。在第五实施方案中，本发明提供用于产生十八碳四烯酸的方法，该方法包括a)提供表达权利要求1或权利要求4的核酸序列的微生物宿主细胞；以及b)在产生十八碳四烯酸的条件下，在α -亚麻酸的存在下培养(a)的宿主细胞。附图
简沭和序列表图IA和图IB示出了 ω-3和ω-6脂肪酸生物合成途径，并且当考虑下文对该途径的描述时应被视为一起。图2是两个保守区域的比对，这两个保守区域位于来自三角褐指藻 (Phaeodactylum tricornatum) (SEQ ID NO 37) ,^h^MM (Physomitrella patens) (SEQ ID NO 38)、地钱(Marchantia polymnorpha) (SEQ ID NO 39)、和高山被孢霉(Mortierella alpina) (SEQID NO 40)的△ 6 去饱和酶中；以及来自小眼虫(Euglena gracilis) (SEQID NO 41)的Δ 8去饱和酶中，使用LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.， Madison, WI)的MegAlign v6. 1程序进行比对。保守氨基酸的三个加框区域对应于七个简并引物。
图3是pY109#l的质粒图谱。根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描述和附带的序列描述形成了本申请的一部分。下面的序列遵循37C. F. R. § 1. 821-1. 825( “对包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”(“Requirements for Patent Applications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules”))，并且符合世界知识产权组织(World Intellectual Property Organization) (WIPO) ST. 25标准(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(规则5. 2和 49. 5(a-bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的 208 节和附录 C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C. F. R. § 1. 822中所列出的规定。SEQ ID NO :1至50是表1中鉴定的ORF编码基因、蛋白质(或它们的部分)、引物或质粒。^ 1核酸和蛋白质SEQ ID号总汇
权利要求
1.分离的核酸分子，其包含编码Δ6去饱和酶的核苷酸序列，所述分离的核酸分子选自(a)编码如SEQID NO 2所示的氨基酸序列的分离的核酸分子；(b)在以下杂交条件下与(a)杂交的分离的核酸分子0.IX SSC, 0. 1% SDS，65°C，并且用2X SSC, 0. 1 % SDS洗涤，随后用0. IX SSC, 0. 1 % SDS洗涤；或者，与(a)或(b)完全互补的分离的核酸分子。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其中至少227个密码子经密码子优化以在耶氏酵母属中表达。
3.权利要求1的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自SEQIDNO :1和SEQ ID NO46。
4.分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含编码至少471个氨基酸的Δ6去饱和酶的第一核苷酸序列，所述酶基于BLASTP比对方法在与具有如SEQ ID NO :2所示的序列的多肽进行比较时具有至少80%的同一性；或包含第一核苷酸序列的互补序列的第二核苷酸序列。
5.编码如SEQID N0:2所示的Δ 6去饱和酶的多肽。
6.嵌合基因，其包含可操作地连接至少一种调控序列的权利要求1或4中任一项的分离的核酸分子。
7.包含权利要求1或权利要求4的分离的核酸序列的微生物宿主细胞。
8.权利要求7的微生物宿主细胞，其中所述微生物宿主细胞选自酵母、藻类、细菌、类眼虫、原生藻菌、卵菌和真菌。
9.权利要求8的微生物宿主细胞，其中所述细胞是选自被孢霉属(Mortierella)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、和裂殖壶菌属(Schizochytrium)的属的成员。
10.权利要求8的微生物宿主细胞，其中所述细胞是含油的酵母。
11.权利要求10的微生物宿主细胞，其中所述含油酵母是选自下组的属的成员耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属 (Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。
12.—种生产Y-亚麻酸的方法，所述方法包括a)提供表达权利要求1或权利要求4的核酸序列的微生物宿主细胞；以及b)在产生Y-亚麻酸的条件下，在亚油酸源的存在下培养(a)的宿主细胞。
13.—种生产十八碳四烯酸的方法，所述方法包括a)提供表达权利要求1或权利要求4的核酸序列的微生物宿主细胞；以及b)在产生十八碳四烯酸的条件下，在α-亚麻酸源的存在下培养(a)的宿主细胞。
14.根据权利要求12或13中的任一项的方法，其中a)所述分离的核酸分子具有选自SEQID NO 1和SEQ ID NO 46的核酸序列；并且b)所述宿主细胞是解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。
全文摘要
本发明涉及Δ6去饱和酶，它具有将亚油酸[“LA”；18:2ω-6]转化成γ-亚麻酸[“GLA”；18:3ω-6]和/或将α-亚麻酸[“ALA”；18:3ω-3]转化成十八碳四烯酸[“STA”；18:4ω-3]的能力。公开了包含此类编码Δ6去饱和酶的片段的分离核酸片段和重组构建体、以及使用这些在含油酵母中的Δ6去饱和酶制备长链多不饱和脂肪酸[“PUFA”]的方法。
文档编号C12N15/53GK102171345SQ200980139225
公开日2011年8月31日 申请日期2009年7月30日 优先权日2008年8月1日
发明者H·张, N·S·亚达夫, Q·朱, Z·薛 申请人:纳幕尔杜邦公司