专利名称：区分酵母菌株和/或测定酵母菌株的遗传稳定性的新颖方法及其使用的制作方法
技术领域：
本发明涉及区分酵母菌株的方法和测定酵母菌株的遗传稳定性的方法，以及这些方法的使用和实施这些方法的试剂套件。
背景技术：
酵母菌的鉴定在多个领域是重要的，包括从临床感染和食品污染物的鉴定到控制商业上用于生产啤酒、葡萄酒、蒸馏物、醇基生物燃料以及食品的酵母菌，所述食品生产指例如面包制作、酱油生产或天然补充剂和益生菌的生产。这些应用中的每个应用都需要一种或多种特定类型的酵母菌，并且选择和控制用于每种工序中的酵母菌对于产物的质量与一致性是极其重要的。
用于特定工序的酵母菌的一致性对于该工序所产生的产物的质量是具关键性的， 因此制造商竭尽全力地控制所使用的酵母菌。例如，在酿造业中，公司使用专有的酵母菌株，将特定品牌所具有的特征给予其每一产物。因此，以无污染的纯净形式保存和使用这些专有的酵母菌株是至关重要的。
为保持酵母菌的完整性，通常在高度控制的条件下把酵母菌主样本贮存在被称为库的设施内。万一实际使用的该批酵母菌证实被污染，这就提供了标准的酵母菌源。用于发酵的酵母菌通常从小样本的增殖而获得，然后将其在新鲜时或干燥后用于重新构建和以后的使用。
在增殖过程中，酵母菌有可能改变其特征或受到污染。尽管培殖箱中的生长条件是受到高度控制的，确保了可引起突变的任何应激被保持在最小且受到污染的风险很小， 但是也不能完全地消除突变和污染。可使用不同的生产方法从培殖箱连续性抽样并将其用于发酵，或将一次发酵的成批增殖酵母菌移走、保存并用于后来的发酵。显然，酵母菌在全发酵法的过程期间突变或受到污染比在受控增殖期间突变或受到污染的可能性更大，但两种方法都有一些风险。在两种情况下都重要的是确保用于发酵的酵母菌是对的酵母菌并且其不含污染物。
各种酵母菌不同的程度通常是很小的，其鉴定非常困难，而现有的方法太慢，无法有助于发酵的日常监测。
目前，使用了多种技术来验证酵母菌株的一致性；然而，这些技术是费时的，并且不能被大多数例如酿造厂的使用酵母发酵的生产商，例如酿造厂内部运用。尤其与酿造业有关，在酿造师开始在发酵系统中使用酵母菌株之前就知道该菌株的验证研究结果并不常见。因此，发酵可在识别到任何污染或错误之前已在进行，这具有很大的风险。这清楚意味着成本的显著提高。在例如其他酒精饮料的生产中，还有在生物燃料的生产中的其他发酵工序都存有类似情况。
发明内容
因此，需要有将允许用于发酵系统的酵母菌株在使用之前被快速验证的酵母菌鉴定方法。
按照第一方面，本发明提供了测定样本中的酵母菌株的方法，其包括 -从样本中的酵母菌获得核酸； -将所述核酸进行两个或更多靶序列的筛查，其中所述核酸中的靶序列至少其中之一包括酵母线粒体DNA中的某基因的整体或部分，或与酵母线粒体DNA中的某基因相关的侧翼区。
-从筛查结果断定样本中的酵母菌株。
优选地，使用PCR (聚合酶链式反应)来实施本发明的筛查步骤，以扩增从酵母菌样本获得的核酸中的所述两个或更多靶序列(如存在)。优选地，使用针对各所述靶序列的引物或引物对来进行所述PCR。优选地，对于每一个所筛查的靶序列都使用引物对。所述 PCR可为实时PCR。可以解离曲线来测定是否扩增了正确的产物。
或者，可利用一个或更多的探针来测定有否存在着所述两个或更多的靶序列。可将所述一个或更多的探针标记。
优选地，通过探测有否存在着来自PCR反应的扩增产物来断定核酸样本中有否存在着靶序列。这种探测可利用凝胶电泳法做到。当测定有否存在着某特定靶序列时，除了考虑有否存在着扩增产物，亦可考虑所述扩增产物的大小和/或序列。
优选地，在本发明的方法中，所述靶序列至少其中之一包括至少一个非线粒体基因的整体或部分，或者包括与至少一个非线粒体基因相关的侧翼区。
所述非线粒体基因和/或其侧翼区可为编码选自包括酵母细胞壁相关的蛋白、与糖类代谢相关的蛋白、线粒体相关蛋白以及与酵母应激有关的转录因子和蛋白的群组中的蛋白的基因。
在本发明的一个实施例中，仅需要把线粒体基因和/或其侧翼区用作靶序列。例如，能够仅基于其线粒体DNA把用来生产麦酒(ale)的酵母与用来生产储藏啤酒(lager) 的酵母相区别。同样，能够仅基于所述线粒体DNA中的靶序列把很多野生酵母从各种酵母区别出来。然而，对于另外一些酵母菌株来说，优选的是还使用染色体基因和/或其侧翼区来区别菌株。例如区别各种的储藏啤酒酵母菌株。
本发明的方法可使用多组适合不同酵母菌株的PCR引物或探针。各组引物或探针可包括被设计成能扩增酵母核酸中两个或更多靶序列的引物，其中所述靶序列中至少其中之一是在所述酵母线粒体DNA中。各组引物或探针可包括被设计成能探测酵母核酸中两个或更多靶序列的的探针，其中所述靶序列中至少其中之一是在所述酵母线粒体DNA中。优选地，各组引物或探针包括针对酵母核酸中三个或更多、四个或更多、五个或更多、六个或更多、七个或更多、八个或更多、九个或更多、十个或更多等等靶序列的引物或探针。
本发明的方法可利用不同菌株之间的基因排序/位置的差异。
进行所述酵母发酵工序的制造商通常会知道应使用何种酵母以及可能存在的污染物为何，因而能够将本发明的方法修改以适合筛查这些菌株。可能存在的污染物通常是制造厂中使用的其他菌株和/或野生酵母。
野生酵母可出现在所述工序或产物中并导致变质，其种类的例子包括毕赤酵母 (Pichia)属、有孢汉逊酵母(Hanseniaspora)属、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces)属、
7假丝酵母(Candida)属和德克酵母/酒香酵母(Dekkera/Brettanomyces)属。
用于生产葡萄酒的酵母菌株的种类包括来自酵母(Saccharomyces)属的菌株，尤其是酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
用于生产乙醇(生物燃料)的酵母菌株的种类包括来自通常用于糖浆发酵的酿酒酵母，以及可用于纤维素发酵的克鲁弗氏酵母(Kluyveromyces cellobiovorus)的菌株。
用于生产啤酒的酵母菌株包括酿酒酵母，其为一种用于生产麦酒型啤酒(麦酒) 的所谓“顶部发酵”酵母或麦酒酵母菌株。
麦酒酵母菌株可选自UNYC7 (酿酒酵母)、UNYC8 (酿酒酵母)、UNYC9 (酿酒酵母)、 UNYClO (酿酒酵母)、NCYC 1119(酿酒酵母)、NCYC 2593 (酿酒酵母)和KSl (酿酒酵母) 或其相互之间的任何组合。
储藏啤酒酵母菌株包括卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、德Hl维森啤酒 (Weihenstephan)的WiM或者酿酒酵母和贝酵母(Saccharomyces bayanus)的杂交种，所有这些用于生产储藏啤酒型啤酒(储藏啤酒)的酵母被称为“底部发酵”酵母。
储藏啤酒酵母菌株也可选自UNYC3 (酿酒酵母(巴斯德酵母))、UNYC4 (酿酒酵母 (巴斯德酵母))、UNYC5 (酿酒酵母(巴斯德酵母))、UNYC6 (酿酒酵母(巴斯德酵母))、 UNYC2 (酿酒酵母)、UNYCl (卡尔斯伯酵母)和NCYC1116 (卡尔斯伯酵母)或其相互之间的任何组合。
相比起生产储藏啤酒的菌株，生产麦酒的酵母菌株通常更加稳定，并且更易区别。 这可能是由于生产麦酒的菌株就进化而言，是更加古老的。
优选地，本发明的方法允许在一个样本中鉴定两、三、四、五、六、七、八、九、十个或更多的酵母菌株。
将酵母，尤其是酿造酵母区分、鉴定和表征(characterising)的传统方法是以生长中的酵母的生化、形态和生理条件以及发酵特征例如絮凝为基础的。这些方法实施起是费时的(需要几天至一周)并且所提供的结果经常是非结论性的或不完整的。例如，目前为了测定特定啤酒的发酵过程中所存在着的酵母菌株，酿造师会采取酿造中的啤酒(储藏啤酒或麦酒)或者用于特定发酵的增殖培养物的样本，并把样本交给实验室，接着实验室会用样本中的酵母栽培其培养物，然后进行一系列的“是/否”测试来测定所述酵母的某些表型。从所述“是/否”测试的结果可断定酵母菌株。
尽管近来已经利用分子技术来区分啤酒样本中的酵母菌株，但这些技术利用酵母菌株在倍性、染色体长度多态性或序列差异上的不同来区别不同的酵母菌株(斯马特 KA(2007)发酵过程中的酿酒酵母基因组和全基因组表达以及蛋白质组图谱。酵母。电子版比印刷版先发行)。通常，所使用的分子技术包括限制性片段长度多态性(RFLP)(海蒙德， J(2002)酿造微生物学中的酵母遗传学。克鲁沃学术出版社多德雷赫特，荷兰；67-113 ； 米登，P (1990)酿造学会志96 =195-200)、靶向HIS4和LEU2的基因特异性探针(彼得森M B (1985)嘉士伯研究通讯50 =263-272)以及脉冲场凝胶电泳(PFGE)(凯西G P、普林格尔A T和厄得曼P A(1990)美国酿造化学家协会志48:100-106)。所有这些技术需要分子方法上专业详尽的知识，从而经常会以相当高的成本外包给第三方供应商。此外，这些方法都是耗时的，并且由于需要花费时间才得到结果，因此所提供的数据是回溯的，也就是，如果酵母菌株出现问题，就会太迟而无法停止和重新开始例如酿造工序中的发酵。
本发明提供了快速且准确的方法来测定样本中的酵母菌株。优选地，能够在少于约对小时，优选地少于约18小时，优选地少于约12小时之内实施所述方法。优选地，能够无需高级专业技术人员和昂贵的实验设备而可以实施到所述方法。所述方法可在很多应用中有用。例如，在酿造业中，为了保证最后产物的质量，需要在发酵过程中保持同样的酿造酵母菌株。如果酵母菌株或酵母菌株的平衡在发酵过程中改变，则生产出的啤酒质量可能会降低。因此，能够快速地测定存在于发酵期间任一阶段的酵母是重要的。
本发明提供了通用的定制菌株检验方法，其能够提供用于酵母发酵业例如酿造业中的酵母菌株的可靠的质量保证。例如，本发明能够为专有的酿造酵母提供明确并且重复性好的的区分。
本发明在经济上的重要性可以酿造业为例示。通常，啤酒经常在大型“发酵容器” 中以几千升的批次在四或五天内酿造好。任一特定容器可代表逾100，000英镑的昂贵投资，这强调了确保使用正确的酵母菌株在经济上的重要性。此外，酿造厂可能具有有限的生产能力并可能仅能够酿造有限的数量，即每年50批上下的啤酒。因此，如果一桶/批啤酒中的酵母是不对的而产生的啤酒不是一流质量的话，则会有很大的经济损失，并且实际上就会限制酿造厂的生产能力。本发明的一个优点是其允许在生产过程的任一阶段，例如一天或甚至几小时后，快速鉴定特定批次的酵母。如有必要，能够接着停止并丢弃所述发酵或停止所述发酵并添加正确菌株的酵母。
本发明的第一方面的方法可在从发酵过程中获得的样本上实施，例如用于生产啤酒的样本。
或者，可在开始发酵前使用本发明的方法，以在使用所述酵母或把其供应到制造场所来进行增殖和发酵之前提供菌株验证数据。
本方法也可在酵母增殖之后但未被用来给发酵反应接种之前在该样本上实施。
本发明的方法可用来保证用于任何发酵工序中的酵母的质量，可在任何使用中的阶段检验酵母。关于酵母发酵所产生的产物，在其生产过程中对酵母的质量控制至少有三个方面；第一、保证在发酵中实际使用的是正确的酵母，第二、进行检验以确保没有被野生或不想要的酵母污染，第三、检查在增殖或发酵过程中所添加的酵母中是否有任何可能引入异味或抑制性能的遗传漂变。
可使用本发明的方法鉴定出供初期生长的菌株已经是正确的选择。由于在标记时和供应中有可能发生相当基本的错误，所以这是重要的。在该阶段，需要提供能阳性鉴定想要的酵母菌株的途径。能够通过筛查仅能在某种菌株中发现的一个或更多靶核酸序列而调整本发明的方法以适合特定个别的菌株。
质量控制的第二方面是在发酵过程中监测污染。当在发酵中出现野生酵母时(也就是在不受控制的方式下所添加的任何酵母)，就能产生污染，野生酵母可能产生于自然环境中大范围的酵母源。通常，污染酵母是发酵厂使用的其他偶然“逃脱”并进入所述发酵的菌株或者是存在于大气中或由员工带入的其他变质酵母。能够通过使用针对所述菌株所独有的核酸序列的引物而使本发明的方法适合筛查想要的菌株以及可能存在的污染物。
质量控制的第三方面是鉴定遗传漂变，其可能发生在延长的增殖过程中或发酵过程中。能够通过应激，例如提升酒精浓度或温度来诱发遗传漂变，所述应激导致基因序列产生变化，该变化可能非常小，但在最后产物的味道或酵母的性能方面可能是关键的。此外， 能够将本发明的方法设计成来筛查允许这种不稳定性被看得见的靶序列。
能够使用本发明的方法去满足质量控制的所有三个方面。
如果通过在发酵过程中使用本发明的方法而在样本中探测到不合需要的酵母菌株，则可停止发酵过程。如适当，可接着使用正确的酵母菌株重新开始发酵过程。或者，如果通过使用本发明的方法而鉴定出在所述发酵中的酵母菌株不是优选的菌株，则可做出将所生产的产物用于替代产物中的决定。例如，在啤酒发酵的情况下，如果发现在发酵过程中的酵母不是优选的菌株，则所生产的啤酒可用于不同的品牌，也许是用于次一级的品牌。如果鉴定出正确/预定的酵母菌株，则制造商能对最后产物将如预期一样有信心。
用于本发明的方法的样本可为液体、浆体或固体。可从储用培养物、增殖培养物、 在发酵开始之前的发酵混合物、在发酵过程中的发酵混合物或发酵产物提取所述样本。所述样本可为最初从发酵获得的细胞培养物或打算用于发酵的细胞培养物。可直接从所述样本提取核酸或可在提取核酸之前培养所述样本。
用于本发明的任何方法的核酸可通过从所述样本中的酵母细胞提取核酸而获得。 可就地回收所述核酸，或者可使用第三方的服务将其从样本提取。
所提取的核酸可包括全细胞抽提物，或者其可为纯化或部分纯化的核酸。使用的核酸可为来自酵母的总核酸，或者其可为基因组DNA和/或线粒体DNA和/或上述两者的混合物。
用于本发明的方法的线粒体DNA的靶序列可包括选自以下组别的基因C0B、C0X1、 C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VAR1和RPMl的至少部分和/或任何位于这些基因的两侧或分隔这些基因的非编码序列，或其相互之间的任何组合。
CYC3、CYC1和CYC2是参与编码线粒体内膜周边蛋白(mitochondrial peripheral inner membrane proteins)的基因。
所述靶序列可包括一个或更多的酵母基因的整体或至少部分，该酵母基因选自下列组别IlR基因、DAN基因、FLO基因、ECM基因、BUD基因、KEL基因、MNT基因、SED基因、 MEL 基因、SUC 基因、ATF 基因、GST 基因、GAL 基因、MAL1-4、CYC1、CYC2、CYC3、CBPl、CBP2、 CBP3、CBP4 和 CBT1,以及线粒体基因 COB、COX 1、C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VARl 和 RPMl 和/或上述基因的侧翼区。
所述IlR基因可包括选自IlRl、TIR2和TIR4组别的基因或其相互之间的任何组口 O 所述DAN基因可包括选自DANl、DAN2、DAN3和DAN4组别的基因或其相互之间的任何组合。
所述TIR和DAN基因编码酿酒酵母在缺氧期间表达的九种蛋白细胞壁甘露糖蛋白，即 DANl、DAN2、DAN3、DAN4、TIRl、TIR2、TIR3 和 TIR4。
所述ECM基因可包括选自下列组别的基因ECMl、ECM2、ECM3、ECM4、ECM5、ECM6、 ECM7、ECM8、ECM9、ECM10、ECM11、ECM12、ECM13、ECM14、ECM15、ECM16、ECM17、ECM18、ECM19、 ECM20、ECM21、ECM22、ECM23、ECM24、ECM24、ECM26、ECM27、ECM28、ECM29、ECM30、ECM31、 ECM32、ECM33和ECM34，或其相互之间的任何组合。
所述ECM基因编码细胞外基质蛋白。
10 来自酿酒酵母的ECM33 (TOR078W)编码糖基化磷脂酰肌醇(GPI)连接的蛋白。 如果将该基因破坏，则细胞表现出对温度敏感的生长缺陷以及对氧化应激的超敏反应。 ECM34 (YBR043W)编码未知功能蛋白，但该基因位于次端粒序列内，朝向端粒。
所述FLO基因可包括选自下列组别的基因FLO1、FL05、FL08、FL09,FL010和FLO11， 或其相互之间的任何组合。
Flo基因编码凝集素样细胞表面蛋白，所述蛋白通过与其他细胞表面上的甘露糖糖链结合而把细胞聚集成“絮凝物”。这种细胞的絮凝是依赖钙的和无性的，并由营养限制激发。这个过程对于酵母的酿造特性是非常重要的。
所述BUD1、BUD2、BUD3等基因编码参与选择萌芽位置并且是酵母细胞的轴向萌芽所需的蛋白。
所述KEL1、KEL2和KEL3基因编码适当的细胞融合和细胞形态化所需的蛋白。
所述MNT1-4基因编码参与0-糖基化的蛋白。
所述SED基因包括SED1-6。SEDl编码与转译核糖体相关的应激性的结构性 GPI-细胞壁糖蛋白。它还在线粒体基因组的维护上具有假定(putative)的作用。SED2编码内质网的糖基化整合膜蛋白。SED3编码参与0-甘露糖基化和蛋白糖基化的蛋白。SED4 编码与整合内质网膜相关的蛋白。SED5编码在内质网和高尔基复合体之间的膜泡运输所需的蛋白。SED6编码与麦角留醇生物合成途径相关的酵母留醇至表留醇的蛋白。
使用本发明的方法中与酵母细胞壁相关的序列的优点是细胞壁相关DNA序列是多态的。该多态性提供了亲缘关系密切的酵母菌株之间的明显差别，并允许利用这些基因中的靶序列精确而可重复地区别菌株。
与酵母代谢相关的核酸中的靶序列可包括任何基因、操纵子、启动子的整体或部分或任何基因、操纵子、启动子的侧翼区，其与酵母细胞代谢的作用或维护，或者跟酵母细胞代谢，优选为底物代谢相关的蛋白的表达有关。所述核酸中的靶序列可为一个或更多的酵母基因的至少部分和/或酵母基因的侧翼区，该酵母基因选自以下组别MEL基因、SUC基因、ATFl、ATF2、GSYl、GSY2 禾Π GAL1—10。
所述MEL基因可包括任何选自以下组别的基因MELl、MEL2、MEL3、MEL4、MEL5、 MEL6、MEL7、MEL8、MEL9和MELlO，或其相互之间的任何组合。
所述MEL基因编码蜜二糖分解代谢性转化为葡萄糖和半乳糖所需的分泌出来的 α-半乳糖苷酶。所有储藏啤酒酵母菌株都能够利用蜜二糖。
所述SUC基因可包括选自以下组别的基因SUC1、SUC2、SUC3、SUC4、SUC5和SUC7， 或其相互之间的任何组合。
所述SUC基因编码转化酶，其为一种蔗糖水解酶。这种酶也被称作蔗糖酶、β -呋喃果糖苷酶或果糖苷酶，在蔗糖代谢中起着重要的作用。转化酶催化了二糖的蔗糖水解为果糖和葡萄糖，并催化了三糖的棉子糖水解为果糖和蜜二糖。除SUC2外，所有SUC基因都位于次端粒序列内。
ATFl和ATF2是编码参与脂类和留醇代谢的蛋白的基因；其负责发酵过程中绝大部分的挥发性乙酸酯的生产。
GSYl和GSY2是编码参与糖原合成的蛋白的基因。
GAL1-10是编码参与半乳糖代谢的蛋白的基因。
与代谢，尤其是底物代谢相关的靶序列具有的优点是所述方法着重于各菌株能够代谢何种底物，其直接反映出酵母发酵的最后产物将会为何。能够基于酵母菌株能利用何种底物来区分酵母菌株。
CYCl、CYC2、CYC3、CBPl、CBP2、CBP3、CBP4 和 CBTl 基因编码与线粒体相关但不由线粒体基因组编码的蛋白。
CYC3、CYCl和CYC2是参与编码线粒体外周内膜的基因。
CBPU CBP2、CBP3和CBP4是编码与COB mRNA (信使RNA)相互作用并在其稳定性和转译方面起着作用的线粒体蛋白的基因。
CBTl编码参与将线粒体COB蛋白加工的蛋白。
所述两个或更多的靶序列可选自一个或更多的下列基因的整体或部分或下列基因的侧翼区C0B、RPM1、ATP9、VAR1、C0X1、C0X2、C0X3、ATP6、ATP8、TIR4、MELl、FLOl、SUC3 和SUC5。优选地，所述靶序列至少其中之一包括一个或更多的下列基因的整体或部分或下列基因的侧翼区C0B、RPM1、ATP9、VARl、COXl、C0X2、C0X3、ATP6 和 ATP8。
在本发明的任何使用到PCR来探测所述靶序列的方法中，可使用一个或更多的寡核苷酸引物。所述引物或探针可与所述靶序列互补或反向互补。所述一个或更多的引物或探针可与一个或更多的基因的部分或一个或更多的基因的侧翼区互补或反向互补，所述基因选自下列组别包括TIR基因，例如TIR1、TIR2、TIR4 ；DAN基因，例如DAN1、DAN2、DAN3和 DAN4 ；ECM 基因，例如 ECMl、ECM2、ECM3、ECM4、ECM5、ECM6、ECM7、ECM8、ECM9、ECMlO、ECMl 1、 ECMl 2 ECMl3, ECM14、ECMl5, ECM16、ECMl7, ECM18、ECM19、ECM20、ECM21、ECM22、ECM23、 ECM24、ECM24、ECM26、ECM27、ECM28、ECM29、ECM30、ECM31、ECM32、ECM33 和 ECM34 ；FLO 基因， 例如 FLO1、FL05、FL08、FL09,FL010 和 FLOll ； BUDl ；BUD2 ；BUD3 等等；KELl ；KEL2 ；KEL3 和 MNT1-4，或其相互之间的任何组合。
所述引物或探针可与一个或更多的基因的部分序列或所述一个或更多的基因的侧翼区互补或反向互补，所述基因选自下列组别包括MEL基因，例如MELl、MEL2、MEL5 和 MEL6 ；SUC 基因，例如 SUC1、SUC2、SUC3、SUC4、SUC5 和 SUC7 ；ATFl ；ATF2 ；GSYl ；GSY2 和 GAL1-10，或其相互之间的任何组合。
所述引物或探针可与一个或更多的基因的部分序列或一个或更多的基因的侧翼区互补或反向互补，所述基因选自下列组别包括CYCl、CYC2、CYC3、CBPl、CBP2、CBP3、CBP4 和CBTl，或其相互之间的任何组合。
所述引物或探针可与酵母线粒体DNA的部分序列，例如一个或更多的线粒体基因的部分或一个或更多的线粒体基因的侧翼区互补或反向互补。所述线粒体基因可选自下列组别包括COB、COXU C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VARl和RPMl，或其相互之间的任何组合。
本发明的方法可使用与酵母线粒体DNA的部分序列互补或反向互补的一个或更多的引物或探针，该酵母线粒体DNA的部分序列是例如一个或更多的线粒体基因的部分或一个或更多的线粒体基因的侧翼区，其中所述线粒体基因优选地选自下列组别包括COB、 COXl、C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VARl和RPMl，连同与一个或更多的以下基因的部分序列或一个或更多的以下基因的侧翼区互补或反向互补的一个或更多的引物或探针，所述基因选自下列组别包括 MEL 基因，例如 MEL1、MEL2、MEL3、MEL4、MEL5、MEL6、MEL7、MEL8、MEL9和 MELlO ；MAL1-4、SUC 基因，例如 SUC1、SUC2、SUC3、SUC4、SUC5 和 SUC7 ；ATFl ；ATF2 ；GSYl ； GSY2 ；GAL1-10、TIR 基因，例如 TIR1、TIR2、TIR4 ；DAN 基因，例如 DAN1、DAN2、DAN3 和 DAN4 ； ECM 基因，例如 ECMl、ECM2、ECM3、ECM4、ECM5、ECM6、ECM7、ECM8、ECM9、ECMlO、ECMl 1、ECMl2、 ECMl3, ECM14、ECMl5, ECM16、ECMl7, ECM18、ECM19、ECM20、ECM21、ECM22、ECM23、ECM24、 ECM24、ECM26、ECM27、ECM28、ECM29、ECM30、ECM31、ECM32、ECM33 禾口 ECM34 ；FLO 基因，例如 FL01、FL05、FL08、FL09、FL010 和 FLOll ；BUDl ；BUD2 ；BUD3 等等；KELl ；KEL2 ；KEL3 ；MNT1-4 ； CYCl ；CYC2 ；CYC3 ；CBPl ；CBP2 ；CBP3 ；CBP4 和 CBTl 或其相互之间的任何组合。
优选地，本发明的方法使用与酵母线粒体COB基因序列的部分序列或酵母线粒体 COB基因的侧翼区互补或反向互补的一个或更多的引物或探针，连同与MEL1、SEDU SUC5、 SUC3、FL011、FLOl、TIRl、TIR2和TIR4基因的部分序列或这些基因的侧翼区互补或反向互补的一个或更多的引物或探针。优选地，这些引物或探针使得储藏啤酒和麦酒的酵母菌株区别开来。
所述引物或探针可包括选自SEQ ID NOs :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、39、41、42 和43，或其相互之间的任何组合的序列，或者与SEQ ID NOs :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 38、39、41、42和43的序列的序列一致性为至少80%、85%、90%、95%、98%或更高的序列。
所述引物可包括引物对，其可包括正向引物SEQ ID NO :1和反向引物SEQ ID NO: 3，或与SEQ ID NOs :1和/或3的序列的序列一致性为至少80%、85%、90%、95%、98%或更高的序列，并且该序列产生的PCR产物与引物SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :3所产生的PCR 产物相同。优选地，引物对SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :3对于麦酒酵母菌株是有特异性的。
所述引物可包括储藏啤酒引物对，其可包括正向引物SEQ ID NO :1和反向引物SEQ ID NO :4，或与SEQ ID NOs 1和/或4的序列的序列一致性为至少80%、85%、90%、95%、 98%或更高的序列，并且该序列产生的PCR产物与引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 4所产生的PCR产物相同。优选地，引物对SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3对于储藏啤酒酵母菌株是有特异性的。
本发明的方法可与一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多、五个或更多、六个或更多、七个或更多、八个或更多、九个或更多、十个或更多的引物对SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2,SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 禾口 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 禾口 SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9 禾口 SEQ ID NO :10、SEQ ID N0:11 和 SEQ ID NO 12,SEQ ID N0:13 禾口 SEQ ID NO 14,SEQ ID N0:15 禾口 SEQ ID N0:16、 SEQ ID NO :17 禾口 SEQ ID NO 18,SEQ ID N0:19 禾口 SEQ ID NO 20、SEQ ID N0:21 禾口 SEQ ID NO 22,SEQ ID N0:23 禾口 SEQ ID NO 24、SEQ ID NO :31 禾口 SEQ ID NO 26、SEQ ID N0:32 禾口 SEQ ID NO :28、SEQ ID NO 29 和 SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 25 和 SEQ ID NO :28、SEQ ID NO 28 和 SEQ ID NO 29,SEQ ID NO 27 和 SEQ ID NO 33,SEQ ID NO 34 和 SEQ ID NO :6、 SEQ ID N0:35 禾口 SEQ ID NO 36、SEQ ID N0:38 禾口 SEQ ID NO 39、SEQ ID NO :41 禾口 SEQ ID NO 42以及SEQ ID NO 41和SEQ ID NO 43或者与所列SEQ ID NOs的序列的序列一致性为80 ^^85%, 90^^95^^98%或更高的序列一起使用，并且其中所述序列产生的PCR产物与所指定的SEQ ID NOs的引物所产生的PCR产物相同。
优选地，使用两个或更多的下列引物对SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :3、SEQ ID NO: 1 和 SEQ ID NO :4,SEQ ID SEQ ID NO :5 禾口 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :17 禾口 SEQ ID N0:18、 SEQ ID NO :19 禾口 SEQ ID NO 20、SEQ ID N0:21 禾口 SEQ ID NO 22、SEQ ID N0:23 禾口 SEQ ID NO 24,SEQ ID NO :31 禾口 SEQ ID NO 26、SEQ ID N0:32 禾口 SEQ ID NO 28、SEQ ID N0:29 禾口 SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 25 和 SEQ ID NO :28、SEQ ID NO 35 和 SEQ ID NO :36、SEQ ID N0:38 禾口 SEQ ID NO 39、SEQ ID N0:41 禾口 SEQ ID N0:42 以及 SEQ ID N0:41 禾口 SEQ ID NO: 43，或者与所列SEQ ID NOs的序列的序列一致性为至少80 %、85 %、90 %、95 %、98 %或更高的序列，并且其中所述序列产生的PCR产物与所指定的SEQ ID NOs的引物所产生的PCR产物相同。
所述弓I物可包括麦酒弓I物对和储藏啤酒引物对。
用于本发明的方法的引物可包括引物组，所述引物组可包括针对酵母基因组DNA 的引物对，连同一对或更多的针对线粒体DNA的引物对。用于本发明的方法的探针可包括探针组，所述探针组可包括针对酵母基因组DNA的一些探针，连同一个或以上针对线粒体 DNA的探针。可使用引物和探针的混合物。
所述引物或探针可对于特定酵母菌株是有特异性的。
所述引物或探针可包括一对对照引物和/或一个或更多的对照探针。所述对照引物可被设计成扩增受检验的不同酵母菌株所共有的DNA靶区。所述对照引物可包括带有 SEQ ID NO :1的序列的正向引物和带有SEQ ID NO :2的序列的反向引物。所述一个或更多的对照探针可被设计成能探测受检验的不同酵母菌株所共有的一个或更多的DNA靶区或序列。
所述对照引物的好处是其保证PCR扩增是成功的并且反应/检验条件是正确的。
术语“侧翼区”可指基因的编码区上游或下游约1000、500、300、100、50或25个核苷酸的DNA区域。侧翼区可包括基因之间和/或之内的内含子。
除测定样本中存在着何种酵母菌株外，了解所述酵母的稳定性也是重要的。已知酵母会连续多代都突变，并最终因经历太多突变而导致表现不同，实际上一经发酵就会产生不同的产物。这能对发酵反应的产物的质量具有显著影响。如果酵母的突变导致发生表型改变，通常这发生在酵母处于应激状态并且出现被称为小菌落(小菌落突变)的细胞时， 则酵母被定义为是不稳定的。可在显微镜下鉴定这些突变体。这些突变体是普遍的并且其缺乏线粒体DNA，结果就降低了所述酵母的性能。例如，如果小菌落突变体出现在啤酒的发酵中，啤酒的味道就会受到影响，从而降低产品的价值。而且，小菌落突变体生长缓慢，从而减慢发酵反应。
按照本发明的另一方面，本发明提供了测定样本中的酵母菌株的遗传稳定性的方法，包括 -从样本中的酵母获得核酸； -将所述核酸进行两个或更多的靶序列的筛查，其中所述核酸中的靶序列至少其中之一包括酵母线粒体DNA中的某基因的整体或部分，或与酵母线粒体DNA中的某基因相关的侧翼区，或者位于染色体的次端粒区的某基因的整体或部分或与位于染色体的次端粒区的某基因相关的侧翼区； -从筛查结果断定所述酵母菌株在遗传方面是否稳定。
14 次端粒区指接近端粒的染色体区域。在酵母属中，端粒区长约350个碱基对。优选地，次端粒区中的基因与染色体的端部相距至少约500个碱基对。
将会理解到的是，很多根据所述发明的第一方面，尤其是根据优选地使用PCR来实施所述发明、何时能实施所述方法、所述样本的性质、所述核酸的提取方法以及所述发明的低实施难度而论述的优选特征，都能够应用在这一方面。
测定样本中酵母菌株的遗传稳定性的方法可包括使用实时PCR(RT-PCR)来测定所述酵母中的基因的相对的mtDNA(线粒体DNA)的拷贝数。基因的mtDNA拷贝数的相对减少，(或低的基因的mtDNA拷贝数)，可显示所述酵母变得不稳定或所述酵母是不稳定的可能性增大。mtDNA中的C0X2基因的缺乏或缺失(deletion)可显示酵母是不稳定的可能性。 已知的是，ACTl基因中的拷贝数保持无显著变化，可相对于例如ACTl基因中的拷贝数来测定所述mtDNA的拷贝数。
测定样本中酵母菌株的遗传稳定性的方法可包括使用解离曲线来测定产物性质以及观察针对两个或更多的靶序列的弓I物或探针的杂交性质。
所述RT-PCR或解离曲线可使用任何选自SEQ ID NO :46、47、48或49的一个或更多的引物。所述RT-PCR可使用引物对SEQ ID N0:48和49。所述RT-PCR可把引物对SEQ ID NO 46和47用作对照物。
本发明的优点是能迅速而准确地测定酵母菌株的稳定性。例如，本发明能为专有的酿酒酵母提供在遗传方面已经变得或正在变得不稳定并不应再被用于发酵过程中的显示，该显示是明确并且重复性好的。传统上，酿造师在最后的酿造过程检验所酿造的啤酒， 如果由于酵母突变太大(变得不稳定)而导致啤酒不合标准，则该批啤酒就会被丢弃或被便宜卖掉。酿造厂因而亏本。有利的是，本发明允许在酵母被用于随后批次的酿造之前或在酿造过程中验证该酵母的稳定性。
使用酵母发酵的制造商可通过定期更换酵母来尝试预先阻止酵母出现缺乏稳定性的情况，然而，因为可能会不必要地丢弃在遗传方面稳定的酵母，所以这是不理想的。本发明的好处是在酵母开始突变时但在该突变未足以影响产物质量之前鉴定到该酵母。因此，仅在必要时才需更换酵母。
优选地，按照本发明这一方面的方法是预报性质的，并且能被用于显示酵母何时变得不稳定。为了让酵母因基因组不稳定而产生的表型改变表现出来，需要破坏线粒体DNA 的全部拷贝。酵母通常带有20个线粒体，必须把全部破坏才看得到表型改变。通过使用本发明这一方面的方法作定期筛查，能够在破坏开始出现时并在表型改变出现之前看得到该破坏。因此，能够在基因组受的破坏影响到产物之前更换酵母。优选地，本发明的方法进一步包括测定线粒体的拷贝数的步骤。能够一并使用靶序列的筛查结果和线粒体的拷贝数来预测酵母菌株是否在遗传方面变得不稳定。
术语“稳定”指酵母的遗传不稳定性。酵母核的某些区域中的DNA和/或线粒体 DNA由于缺失、重组或不合适的插入，而随着时间变得不稳定，并且能导致酵母出现不理想的形态和/或生理改变。在酵母菌株变得在基因方面不稳定及不适合其使用目的之前，仅能使用或重复使用该酵母菌株一段有限的时间或将其用于或重复用于有限次数的连续发酵。这种不稳定性的检测在经济上，尤其是对酿造业来说是重要的。
用于本发明这一方面的线粒体DNA的靶序列可包括选自下列组别包括C0B、C0X1、C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VAR1和RPMl的基因的至少部分和/或任何位于这些基因的两侧或分隔这些基因的非编码序列，或者其相互之间的任何组合。
用于本发明这一方面的次端粒DNA的靶序列可包括选自下列组别包括ECM34、 SUC1、SUC3、SUC4、SUC5、SUC7、MAL1、MAL2、MAL3、MAL4、MEL2、MEL3、MEL4、MEL5、MEL6、MEL7、 MEL8、MEL9和MELlO的基因的至少部分和/或任何位于这些基因的两侧或分隔这些基因的非编码序列，或者其相互之间的任何组合。
优选地，所述靶序列是在染色体I、VI、X或XI的次端粒区中。
本发明这一方面的方法可在PCR反应中使用一个或更多的引物或探针，其与酵母线粒体DNA的部分序列或酵母染色体的端粒区互补或反向互补。所述引物或探针可与一个或更多的以下基因的部分序列或以下基因的侧翼区互补或反向互补，以下基因为COB、 COXl、C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VARl、RPMl、ECM34、SUCl、SUC3、SUC4、SUC5、SUC7、MALI、 MAL2、MAL3、MAL4、MEL2、MEL3、MEL4、MEL5、MEL6、MEL7、MEL8、MEL9 和 MEL10。
所述引物或探针可包括选自SEQ ID NOs :5、6、15、16、25、26、27、28、四、30、31、32、 33、48和49的序列或其相互之间的组合，或者与SEQ IDNOs :5、6、15、16、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、48和49的序列的序列一致性为至少80%、85%、90%、95%、98%或更高的序列。
本发明这一方面的方法可与一个或更多的引物对SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6、 SEQ ID NO: 15 禾口 SEQ ID NO 16, SEQ ID N0:31 禾口 SEQ ID NO 26、SEQ ID N0:32 禾口 SEQ ID NO :28、SEQ ID NO 29 和 SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 25 和 SEQ ID NO :28、SEQ ID NO 34 和 SEQ ID NO 6,SEQ ID NO 48 禾Π SEQ ID NO :49 或者与所列 SEQ ID NOs 的序列的序列一致性为至少80%、85(%、90(%、95(%、98(%或更高的序列一起使用，并且其中所述序列产生的 PCR产物与所指定的SEQ ID NOs的引物所产生的PCR产物相同。
可根据本发明的方法的扩增产物的分子量和/或长度和/或数量和/或序列大体上与某标准的分子量和/或长度和/或数量和/或序列吻合，来断定酵母菌株是稳定的。所述标准可为来自所预期的菌株的DNA。
可根据所述扩增产物的分子量和/或长度和/或数量和/或序列与所述标准的分子量和/或长度和/或数量和/或序列大体上不吻合，来断定酵母菌株是不稳定的。可根据未能产生扩增产物来断定酵母菌株是不稳定的。
按照本发明的另一方面，本发明提供了包括一个或更多的寡核苷酸的组合物，所述寡核苷酸带有选自 SEQ ID NOs :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、39、41、42、43、46、47、48 和 49的序列，或者与所列SEQ ID NOs的序列的序列一致性为至少80%、85%、90%、95%、 98%或更高的序列。
按照另一方面，本发明提供了测定样本中的酵母菌株的试剂套件，其包括针对酵母核酸中两个或更多的靶序列的两个或更多的引物或探针，其中所述引物或探针至少其中之一为针对酵母线粒体DNA中的基因中的靶序列，或针对酵母线粒体DNA中的基因的侧翼区。
按照又一方面，本发明提供了测定样本中的酵母菌株的稳定性的试剂套件，其包括针对酵母核酸中两个或更多的靶序列的两个或更多的引物或探针，其中所述引物或探针
16至少其中之一为针对酵母线粒体DNA中的基因中的靶序列或在染色体次端粒区的基因中的靶序列，或针对酵母线粒体DNA中的基因的侧翼区或在染色体次端粒区的基因的侧翼区。
本发明的试剂套件可适合与PCR —起使用。
按照本发明的试剂套件进一步包括PCR试剂。所述PCR试剂可为DNA聚合酶、DNA 聚合酶辅因子、PCR缓冲液以及一个或更多的脱氧核苷酸-5’ -三磷酸其中的一个或更多。
优选地，按照本发明的任一方面的引物或探针包括12至60个核苷酸，更优选的是 15至45个核苷酸。
用于本发明的引物或探针被选定为分别与将被扩增或探测的各特定序列的不同的链“大体上互补”。这意味着所述引物或探针必须能充分地与其各自的链互补以与其各自的链杂交，从而形成想要的杂交产物，并且其中可用DNA聚合酶延伸所述引物。在优选和最实用的情况下，所述引物或探针具有与靶核酸的精确的互补性(exact complementarity) 0 所述试剂套件还可包括试剂套件的使用说明，例如，所述说明可包括使用的PCR 条件和/或使用的核酸样本和/或引物和/或其他试剂的量。
如果样本包含特定酵母菌株，或如果酵母菌株是稳定或不稳定时，所述试剂套件还可包括所预期的扩增产物的大小细节。这可通过代表性的电泳凝胶的图表或图像来给出ο 所述试剂套件还可包括对照弓I物或对照探针。
可在混合物中提供或分开提供所述PCR引物和/或PCR试剂。可在混合物中提供或分开提供两个或更多的探针。
所述试剂套件可包括对照核酸样本和引物，其被用于确保PCR条件是正确的。所述试剂套件可包括对照核酸样本和探针，其被用于确保探针的杂交和/或探测条件是正确的。
所述试剂套件可包括更多用于探测任何PCR扩增产物的试剂。
所述试剂套件还包括关于如何从样本中提取核酸并将其用于分析的说明。所述试剂套件还可包括有助于提取核酸的试剂。
测定样本中酵母菌株的试剂套件可包括针对下列基因的一个或更多或其侧翼序列的引物或探针C0B、COXl、C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VARl和RPMl，或其相互之间的任何组合。所述试剂套件可同样或替代性地包括针对一个或更多的酵母基因的整体或至少部分的一个或更多的引物或探针，所述酵母基因选自下列组别包括所述IlR基因、所述DAN 基因、所述FLO基因、所述ECM基因、所述BUD基因、所述KEL基因、所述MNT基因、所述SED 基因、所述MEL基因、SUC基因、所述ATF基因、所述GST基因、所述GAL基因、MAL1_4、CYC1、 CYC2、CYC3、CBP1、CBP2、CBP3、CBP4和CBT，或者其相互之间的任何组合。
所述试剂套件可包括一个或更多的引物或探针，其选自SEQ ID NOs :1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、38、39、41、42 和 43，或其相互之间的任何组合，或者与 SEQIDNOs :1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、38、39、41、42 和 43 的序列的序列一致性为至少 80% ,85% ,90 % ,95 % ,98% 或更高的序列。所述试剂套件可包括一个或更多的引物对的引物对SEQ ID NO :1和SEQ IDNO :2、SEQ ID NO 1 禾口 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 1 禾口 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 禾口 SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11 禾口 SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13 和 SEQ ID NO :14、SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO :16、SEQ ID NO: 17 禾口 SEQ ID NO 18, SEQ ID NO: 19 禾口 SEQ ID NO 20、SEQ ID N0:21 禾口 SEQ ID NO :22、 SEQ ID N0:23 禾口 SEQ ID NO 24、SEQ ID N0:31 禾口 SEQ ID NO 26、SEQ ID N0:32 禾口 SEQ ID NO :28、SEQ ID NO 29 和 SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 25 和 SEQ ID NO :28、SEQ ID NO 28 和 SEQ ID NO 29 和 SEQ ID NO 27 和 SEQ ID NO 33、SEQ ID NO 35 和 SEQ ID NO 36、SEQ ID N0:38 禾口 SEQ ID NO 39、SEQ ID NO :41 禾口 SEQ ID NO 42 以及 SEQ ID NO :41 禾口 SEQ ID NO :43，或者与所列SEQ ID NOs的序列的序列一致性为至少80%、85%、90%、95%、98%或更高的序列，并且该序列产生的PCR产物与所指定的SEQ ID NOs的引物所产生的PCR产物相同。优选地，两个或更多的下列引物对用于所述试剂套件中SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 1 禾口 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 禾口 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 17 禾口 SEQ ID NO :18、SEQ ID NO 19 和 SEQ ID NO :20、SEQ ID NO 21 和 SEQ ID NO :22、、SEQ ID NO 23 和 SEQ ID NO :24、SEQ ID NO 31 禾口 SEQ ID NO :26、SEQ ID NO 32 禾口 SEQ ID NO :28、SEQ ID N0:29 禾口 SEQ ID NO 30、SEQ ID N0:25 禾口 SEQ ID NO 28、SEQ ID N0:35 禾口 SEQ ID NO: 36. SEQ ID NO :38 禾口 SEQ ID NO 39、SEQ ID N0:41 禾口 SEQ ID N0:42 以及 SEQ ID N0:41 禾口 SEQ ID NO :43或者与所列SEQ ID NOs的序列的序列一致性为至少80%、85%、90%、95%、 98%或更高的序列，并且其中所述序列产生的PCR产物与所指定的SEQ ID NOs的引物所产生的PCR产物相同。
在测定样本中酵母菌株的稳定性的试剂套件中，可提供针对一个或更多的下列基因或其侧翼序列的引物或探针COB,COXUC0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VARl、RPMl、ECM34、 SUC1、SUC3、SUC4、SUC5、SUC7、MAL1、MAL2、MAL3、MAL4、MEL2、MEL3、MEL4、MEL5、MEL6、MEL7、 MEL8、MEL9 和 MELlO。
所述试剂套件可包括一个或更多的引物或探针，所述引物或探针带有选自SEQ ID NOs :5、6、15、16、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、46、47、48 和 49 的序列或其相互之间的任何组合的序列，或者与 SEQ ID NOs :5、6、15、16、25、26、27、28、四、30、31、32、33、34、46、 47,48和49的序列的序列一致性为至少80%、85%、90%、95%、98%或更高的序列。
所述试剂套件可包括一个或更多的引物对SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :6、SEQ ID NO: 15 禾口 SEQ ID NO 16, SEQ ID N0:31 禾口 SEQ ID NO 26、SEQ ID N0:32 禾口 SEQ ID NO :28、 SEQ ID N0:29 禾口 SEQ ID NO 30、SEQ ID N0:25 禾口 SEQ ID NO 28、SEQ ID N0:34 禾口 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 46和47以及SEQ ID NO 48和49，或者与所列SEQ ID NOs的序列的序列一致性为至少80%、85%、90%、95%、98%或更高的序列，并且其中所述序列产生的PCR 产物与所指定的SEQ ID NOs的引物所产生的PCR产物相同。
按照另一方面，本发明提供了例如啤酒的发酵方法，其包括在发酵过程中的任何阶段实施本发明的方法。可在增殖前获得的酵母的样本、在增殖过程中或增殖后获得的样本、在发酵过程中的任何时刻获得的样本，或最后产物的样本上实施本发明的方法。
按照另一方面，本发明提供了例如在啤酒生产中的发酵方法，其包括在发酵过程中采集发酵混合物的样本、实施本发明的方法以测定存在着何种酵母或测定该酵母的遗传稳定性、根据结果决定是否继续进行发酵和/或是否更换酵母和/或是否把产物重新用作另一用途。
按照另一方面，本发明提供了分析含酵母的样本的的方法，其包括在所述分析中使用探针或引物； 其中如果酵母存在于所述样本中，则所述探针或引物能够与所供给的酵母的线粒体DNA杂交。
如在所述样本中再存在着另一种酵母，则所述探针或引物可能就不能与该酵母的线粒体DNA杂交。
所供给的酵母可为巴斯德酵母。另一酵母可为酿酒酵母。或者，所供给的酵母可为酿酒酵母。另一酵母可为巴斯德酵母。
按照本发明的任何方面的方法可被用来测定包含酵母的样本是否包含着不合需要的酵母。所述方法可被用来检查打算用于随后与酵母有关的发酵的样本的质量。所述方法可包括以下的步骤如质量合格，使用所述酵母进行发酵或如质量不合格，停止发酵的步马聚ο 按照另一方面，本发明提供了适合用于本发明的方法的探针或引物。
所述探针或引物可优先与巴斯德酵母的mtDNA杂交，或优先与酿酒酵母的mtDNA 杂交。
所述探针或引物的长度可为至少8个核苷酸。所述探针或引物的长度可为少于30 个核苷酸。
所述探针或弓I物可优先与任何选自COB,COXU C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VARl 和RPMl的基因杂交。所述探针或引物可优先与任何选自SEQ ID NO :37、40、44、45、50、51、 54、55、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71 和 72 的序列或其补体杂交。
所述探针或引物可优先与SEQ ID N0:50或SEQ ID NO :54，或者其补体杂交，并可选地不与SEQ ID N0:51或SEQ ID NO :55，或者其补体杂交。或者，所述探针或引物可优先与SEQ ID N0:51或SEQ ID NO :55，或者其补体杂交，并可选地不与SEQ ID NO 50或SEQ ID NO :54，或者其补体杂交。
所述探针或引物可优先与SEQ ID NOS :58、59或60中任何序列，或者其补体杂交， 并可选地不与SEQ ID NOS :61、62、63、64、65或66中任何序列，或者其补体杂交。或者，所述探针或引物可优先与SEQ ID NOS :61、62、63、64、65或66中任何序列，或者其补体杂交， 并可选地不与SEQ ID NOS :58、59或60中任何序列，或者其补体杂交。
所述探针或引物可优先与SEQ ID NOS 67或68中任何序列，或者其补体杂交，并可选地不与SEQ ID N0S:69、70、71或72中任何序列，或者其补体杂交。或者，所述探针或引物可优先与SEQ ID NOS :69、70、71或72中任何序列，或者其补体杂交，并可选地不与SEQ ID NOS 67或68中任何序列，或者其补体杂交。
所述探针或引物可优先与在图15A、16A、17或18中的任一图中星号(*)所显示的一个或更多的核苷酸位点的 SEQ ID NOS :50、51、54、55、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71或72中任何序列的部分，或者这些序列的补体杂交。例如，所述探针或引物可优先与图15A中星号所标记的核苷酸位点杂交，其包括SEQ ID NO 50的第147位核苷酸。
所称“杂交”可指在严格条件下杂交。术语“优先杂交”，或类似术语，是用来指相对于另一序列或靶区，引物或探针更可能与特定的序列或靶区杂交。优先杂交可在严格条
19件下决定。杂交的严格条件是指例如在PCR中，允许引物或探针进行杂交或者允许互补序列对彼此杂交的温度和缓冲液组分的条件，其中条件决定了具有某些一致性的序列是否能够彼此杂交。彼此不太相似的序列会在中度严格的条件下杂交。高度严格时杂交序列需完全相同，或几乎完全相同才能进行杂交。
本文中使用的术语“杂交”可指在技术人员可即时断定的中度至高度严格条件下的杂交。
测定样本中酵母菌株的遗传稳定性的方法可包括通过用限制酶消化酵母mtDNA 来筛查该酵母，所述限制酶专门切割鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸(G~C)之间的核酸，以提供RFLP (限制性片段长度多态性)图谱， 其中所述酵母核酸的RFLP图谱与来自非不稳定的酵母的已知的、保守的RFLP图谱比较，并且其中在RFLP图谱中所观察到的显著差异显示了酵母菌株是不稳定的。不稳定的酵母菌株可被另称为“小菌落突变体(petite mutant)”。
所述酵母核酸可包括全细胞DNA (包括mtDNA)，或mtDNA。
例如在用限制酶HaeIII或HinfI切割时，稳定的酵母菌株的保守的RFLP图谱可大体上匹配表4中所列的片段大小。
本文中本发明的任何方面的方法可用于酿酒。
本文中使用的“序列一致性”可指使用例如序列分析软件BLASTN或BLASTP (在 www, ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/可得)来比较两个序列。可使用BLASTN或BLASTP的默认参数来测定序列一致性。
会被理解的是，能以任何组合和任何数目的形式使用适用于本发明的一个方面或实施例的可选特征。而且，还能在适当时以任何组合和任何数目的形式把所述可选特征与本发明的任何其他方面或实施例一起使用。
现参考附图并仅通过例子来对本发明的实施例进行描述，在附图中 图1显示了所述TIR4基因的PCR扩增的电泳图谱。泳道1_WT (S288c)；泳道
2-UNYC3；泳道 3-UNYC2 ；泳道 4-NCYC1116 ；泳道 4UNYC1 ；泳道 5-UNYC7 ；泳道 6-UNYC8 ；泳道 7-NCYC1119 ；泳道 8-KS1 和泳道 9-NCYC2593 ； 图2显示了图1中所提取的条带的序列比对。弓丨物A+C和A+D的组合会把麦酒和储藏啤酒菌株区分开来。引物组合A+B用作对照物； 图3是表示所述酿酒酵母中的COB基因的示意图。黑色区域表示内含子。(F=正向引物，R=反向引物)； 图4显示了使用了引物Fl和Rl扩增的COB基因的电泳图谱。泳道l_WT(S^8c)； 泳道 2-UNYC3 ；泳道 3-UNYC2 ；泳道 4-NCYC1116 ；泳道 4UNYC1 ；泳道 5-UNYC7 ；泳道 6-UNYC7 ； 泳道 7-NCYC1119 ；泳道 8-KS1 和泳道 9-NCYC2593 ； 图5是酵母菌株巴斯德酵母和酿酒酵母的mtDNA序列的示意图。
图6显示了 MELl基因的电泳图谱。泳道1_WT (S288c)；泳道2-UNYC2 ；泳道
3-UNYC1；泳道 4-UNYC3 ；泳道 5-UNYC4 ；泳道 6-UNYC7 ；泳道 7-UNYC8 ；泳道 8-UNYC9 和泳道 9-UNYC10 ；
20 图7显示了 SUC3和SUC5基因的电泳图谱。泳道1_11Λ梯带泳道2_WT(S^8c)； 泳道 3-UNYC1 ；泳道 4-UNYC2 ；泳道 5-NCYC1116 ；泳道 6-ffT (S288c)；泳道 7-UNYC1 ；泳道 8-UNYC2 ；泳道 9-NCYC1116 ； 图8显示了 FLOl基因的电泳图谱。右侧和左侧泳道-11Λ梯带泳道1_WT (S^8c)； 泳道 2-UNYC1 ；泳道 3-UNYC2 ；泳道 4-NCYC1116 ； 图9显示了本文中所提及的所有基因的GenBank(基因序列数据库)登录号。
图10显示了所述COB基因的电泳图谱，以鉴定菌株UNYC2的小菌落突变体的基因组稳定性。从右到左-泳道1-11Λ梯带；泳道2-WT胶88c)；泳道3-UNYC1亲本菌株；泳道 4-UNYC1小菌落突变菌株；泳道5-UNYC2亲本菌株；泳道6-UNYC2小菌落突变菌株； 图11详细说明了一些位于次端粒的基因及其染色体位置。
图12A显示了用于标准PCR中的引物位置的示意图，使用了引物IOFl和IORl来区分麦酒和储藏啤酒菌株。(注意在酿酒酵母(Sc)中，IORl引物并不存在)；图12B-通过用COXl基因的标准PCR来区分麦酒和储藏啤酒酵母菌株的电泳图谱。泳道1 大小的标记；泳道 2 ；S288C(WT)；泳道 3 =NCYCl 119 ；泳道 4 =NCYC 2593 ；泳道 5 :W34 UON ；泳道 6 LBYl ；泳道 7 :LBY2 ；泳道 8 =NCYCl 116 和泳道 9 =LBYll)。引物对 IOFl 和 IORl 是为 W34U0N 序列的线粒体基因组序列而设计的； 图13A显示了用于标准PCR中的引物位置的示意图，使用了引物COXlFl和10R5 来区分麦酒和储藏啤酒菌株；13B-通过用COXl基因的标准PCR来区分麦酒和储藏啤酒酵母菌株的电泳图谱。泳道1和10 =Ikb大小的标记；泳道2 ；S288C(WT)；泳道3 :W34 UON ； 泳道4 =LBYll ；泳道5 =LBYl ；泳道6 :LBY2 ；泳道7 :NCYC2593 ；泳道8 :ABY6和泳道9 阴性对照)。泳道2、7和8对应麦酒型菌株，泳道3-6对应储藏啤酒型菌株。引物对COXlFl和 10R5是为W34U0N序列的线粒体基因组序列而设计的； 图14A显示了用于实时PCR中的引物位置的示意图，使用了 COB基因来区分麦酒和储藏啤酒菌株；图14B显示了所述COB基因的扩增曲线；以及图14C显示了图14B的实时 PCR产物的解离曲线； 图15A 显示了酿酒酵母(Sc) (SEQ ID NO 50)和巴斯德酵母(Sp) (SEQ ID NO 51) 的COXl开放读码框(open reading frame)的序列比对。外显子边际以黑底线标注。序列差异以星号标明；图15B显示了酿酒酵母(Sc) (SEQ ID NO 52)和巴斯德酵母(Sp) (SEQ ID NO 53)的COXl开放读码框的转译的序列比对。外显子边际以黑底线标注。序列差异以星号标明； 图16A 显示了酿酒酵母(Sc) (SEQ ID NO 54)和巴斯德酵母(Sp) (SEQ ID NO 55) 的COB开放读码框的序列比对。外显子边际以黑底线标注。序列差异以星号标明；图16B 显示了酿酒酵母(Sc) (SEQ ID NO 56)和巴斯德酵母(Sp) (SEQ ID NO 57)的COB开放读码框的转译的序列比对。外显子边际以黑底线标注。序列差异以星号标明； 图17显示了 W34PUB、W34U0N禾口 LBYlIUON的区域A、B和C的序列比对，以鉴定序列差异从而研制区分菌株的引物。W34PUB “区域A” = SEQ ID NO :58、W34PUB “区域B” =SEQ ID NO :59、W34PUB “区域 C” = SEQ ID NO 60 ；W34U0N “区域 A” = SEQ ID NO :61、 W34U0N “区域 B”= SEQ ID NO :62、W34U0N “区域 C”= SEQ ID NO 63 ；LBYlIUON “区域 A” =SEQ ID NO 64,LBYlIUON “区域 B” = SEQ ID NO :65、LBY11U0N “区域 C” = SEQ ID NO
2166。序列差异以星号标明。数字是指W34PUB的序列登录号EU852811的数字。W34PUB和 W34U0N的全线粒体基因组序列是7057m3Ps ； 图18显示了 W;34PUB、W34UON和LBY11U0N序列的区域D和E的序列比对，以鉴定差异。LBYlIUON “区域 D”= SEQ ID NO :67、LBY11U0N “区域 E”= SEQ ID NO 68 ；W34U0N “区域 D”= SEQ ID NO :69、W34U0N “区域 Ε”= SEQ ID NO :70 ；W34PUB “区域 D”= SEQ ID NO 71、W34PUB“区域E”= SEQ ID NO :72。数字是指LBYlIUON的线粒体基因组序列。LBY11U0N 的全线粒体基因组序列是70579bps ； 图19显示了使用限制酶HaeIII来消化全部DNA之后的线粒体DNA限制图谱。泳道1和13 =Ikb DNA标记；泳道2 LBYlIUON ；泳道3至12从酿酒发酵提取的LBYlIUON的小菌落。箭头显示主导的小菌落的RFLP图谱； 图20显示了来自8株酵母菌株的部分C0X2序列的比对。1 ；贝酵母AF442211 (SEQ ID N0:73)。2 ；葡萄汁酵母 AY1303^(SEQ ID NO :74)。3 ；酿酒酵母 ef6397^ (SEQ ID NO: 75)。4 贝酵母 ef6397^(SEQ ID NO :76)。5 ；巴斯德酵母 _ef639727 (SEQ ID NO :77)。6; 卡尔斯伯酵母 AY1303^(SEQ ID NO :78)。7 ；巴斯德酵母 AF442212 (SEQ ID NO :79)。8 ；摩纳酵母(S. monacensis))AY130325(SEQ ID NO :80)。碱基对替换以方块标明。C0X2的正向和反向引物以下划线标出。
图21A显示了解离曲线；图21B显示了使用C0X2和ACTl的引物(表5)的实时 PCR产物的扩增曲线； 图22A和22B显示了使用限制酶HaeIII (图22A) HinfI (图22B)消化总DNA之后的线粒体DNA限制图谱。图22A-泳道1 =Ikb DNA标记；泳道2、3、56、7、8、9、11、12和13为酿酒小菌落。泳道4和10 =LBYlIUON ； 22B-泳道1 =Ikb DNA标记；泳道2 =LBYlIUON ；泳道3至8 小菌落的酿酒提取物(brewery isolates).箭头指示主导的小菌落的图谱； 图 23 显示了 LBYl IUON (SEQ ID NO :81)和 LBYl IUON 部分小菌落序列(SEQ ID NO: 82)的序列比对以鉴定差异。数字是指LBYlIUON线粒体基因组序列。
具体实施例方式例子 下列例子说明了多个引物组的研制，能按照本发明使用所述引物组快速而准确地鉴定用于酿酒的酵母菌株，从而为专有的用于酿酒的酵母提供明确并且重复性好的区分。
所显示的数据表明能使用很多基因，包括MELl基因，来区分麦酒和储藏啤酒酵母菌株。
所述数据还表明能使用mtDNA(线粒体DNA)来区分储藏啤酒和麦酒酵母菌株。为针对线粒体基因COB而设计引物，并鉴定出那些能被用来区分各种不同的用于酿酒的酵母菌株的引物。鉴定出一组寡核苷酸以准确地区分麦酒和储藏啤酒菌株。这是跨越COB基因的保守区的设计。
使用在诺丁汉大学酿酒酵母培养物集存库中可得的用于酿酒的酵母菌株来证实结果。
为设计特异性分子标记而鉴定出合适的靶位点 从诺丁汉大学内部培养物集存库选择十四种麦酒和储藏啤酒酵母菌株来研制用
22以区分各种用于酿酒的酵母菌株的引物t 该项研究使用的菌株 1. UNYCl卡尔斯伯酵母(储I耗啤酒) 2. UNYC2酿酒酉孝母(储藏啤酒) 3. UNYC3酿酒酉孝母(巴斯德酉孝母)(储扉戈啤酒) 4. UNYC4酿酒酉辑(巴斯德酉辑)(储扉戈啤酒) 5. UNYC5酿酒酉辑(巴斯德酉辑)(储扉戈啤酒) 6. UNYC6酿酒酉孝母(巴斯德酉辑)(储扉戈啤酒) 7. NCYCl116卡尔斯伯酵母(储I耗啤酒) 8. UNYC7酿酒酉孝母(麦酒) 9.UNYC8酿酒酉辑(麦酒) 10.UNYC9酿酒酉辑(麦酒) 11. UNYClO酿酒酉辑(麦酒) 12. NCYC 1119酿酒酉辑(麦酒) 13. NCYC 2593 酿酒酉辑(麦酒) 14. KSl酿酒酉孝母(麦酒) 15.野生型酿酒酵母(S^Sc)(用作对照物) 作为靶的核基因 分析在表1中显示的五个核基因的序列以鉴定跨越该基因组的多态的区域。如表 1中所示，为这些区域设计引物。
表1
23
权利要求
1.测定样本中的酵母菌株的方法，包括-从样本中的酵母获得核酸；-将所述核酸进行两个或更多靶序列的筛查，其中所述核酸中的靶序列至少其中之一包括酵母线粒体DNA中的某基因的整体或部分，或与酵母线粒体DNA中的某基因相关的侧翼区；-从筛查结果断定样本中的酵母菌株。
2.测定样本中的酵母菌株的遗传稳定性的方法，包括-从样本中的酵母获得核酸；-将所述核酸进行两个或更多的靶序列的筛查，其中所述核酸中的靶序列至少其中之一包括酵母线粒体DNA中的某基因的整体或部分，或与酵母线粒体DNA中的某基因相关的侧翼区，或者位于染色体的次端粒区的某基因的整体或部分或与位于染色体的次端粒区的某基因相关的侧翼区；-从筛查结果断定所述酵母菌株在遗传方面是否稳定。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中使用PCR来扩增所述两个或更多的靶序列来实施本发明的筛查步骤。
4.如权利要求3所述的方法，其中通过探测有否存在着来自PCR反应的扩增产物来断定核酸样本中有否存在着靶序列。
5.如任一前述权利要求所述的方法，其中能在少于M小时之内实施所述方法。
6.如任一前述权利要求所述的方法，其中在发酵过程之前、期间或之后取得所述样本。
7.如任一前述权利要求所述的方法，其中在从酿造过程获得的样本上实施所述方法。
8.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述样本是液体、浆体或固体。
9.如任一前述权利要求所述的方法，其中线粒体DNA的靶序列包括选自以下组别的基因C0B、C0X1、C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VAR1和RPMl的至少部分和/或任何位于这些基因的两侧或分隔这些基因的非编码序列，或者其相互之间的任何组合。
10.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述靶序列至少其中之一包括至少一个非线粒体基因的整体或部分，或与至少一个非线粒体基因相关的侧翼区。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述非线粒体基因和/或其侧翼序列是编码酵母细胞壁相关的蛋白和/或与糖类代谢相关的蛋白的基因。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述DNA靶序列可包括一个或更多酵母基因的整体或至少部分和/或酵母基因的侧翼区，所述酵母基因选自下列组别IlR基因、DAN基因、 FLO基因、ECM基因、BUD基因、KEL基因、MNT基因、SED基因、MEL基因、SUC基因、ATF基因、 GST 基因、GAL 基因、MAL1-4、CYC1、CYC2、CYC3、CBP1、CBP2、CBP3、CBP4 和 CBTl。
13.如任一前述权利要求所述的方法，如依据权利要求2，其中一个或更多的靶序列包括选自下列组别包括 COB、COXl、C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VARl、RPMl、ECM34、SUCl、 SUC3、SUC4、SUC5、SUC7、MAL1、MAL2、MAL3、MAL4、MEL2、MEL3、MEL4、MEL5、MEL6、MEL7、MEL8、 MEL9和MELlO的基因的至少部分和/或这些基因的任何侧翼区，或者其相互之间的任何组合。
14.如任一前述权利要求所述的方法，其中使用一个或更多的与所述靶序列互补或反向互补的寡核苷酸引物或探针来探测所述靶序列。
15.如权利要求14所述的方法，其中一个或更多的所述引物或探针包括选自SEQID NOS :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、39、41、42和43的序列，或其相互之间的任何组合，或者与 SEQ ID NOS :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、38、39、41、42 和 43 的序列的序列一致性为至少 80%、85%、90%、95%、98% 或更高的序列。
16.包括一个或更多的寡核苷酸的组合物，所述寡核苷酸带有选自包括SEQID NOS=U 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、38、39、41、42、43、46、47、48 和 49 的序列，或者所列序列的序列同源性为至少80%、85%、90%、95%、98%或更高的序列。
17.测定样本中的酵母菌株的试剂套件，包括针对酵母核酸中两个或更多的靶序列的两个或更多的引物或探针，其中所述引物或探针至少其中之一为针对酵母线粒体DNA中的基因中的靶序列，或针对酵母线粒体DNA中的基因的侧翼区。
18.测定样本中的酵母菌株的稳定性的试剂套件，包括针对酵母核酸中两个或更多的靶序列的两个或更多的引物或探针，其中所述引物或探针至少其中之一为针对酵母线粒体 DNA中的基因中的靶序列或染色体次端粒区中的基因中的靶序列，或针对酵母线粒体DNA 中的基因的侧翼区或染色体次端粒区中的基因的侧翼区。
19.按照权利要求17或18的试剂套件，其中所述试剂套件适合与PCR—起使用。
20.按照权利要求17至19的试剂套件，其进一步包括PCR试剂。
21.按照权利要求17至20中任一权利要求所述的试剂套件，其包括试剂套件的使用说明，所述说明包括PCR的使用条件。
22.按照权利要求17至21中任一权利要求所述的试剂套件，其包括一个或更多的所预期的扩增产物的大小的详细说明。
23.按照权利要求17至21中任一权利要求所述的试剂套件，其包括针对一个或更多的下列基因的整体或部分或下列基因的侧翼区序列的引物或探针，下列基因为COB、COXU C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VARl和RPMl，或其相互之间的任何组合。
24.按照权利要求17至23中任一权利要求所述的试剂套件，其包括一个或更多的针对一个或更多的酵母基因的整体或至少部分和/或其侧翼区的引物或探针，所述酵母基因选自下列组别包括所述IlR基因、所述DAN基因、所述FLO基因、所述ECM基因、所述BUD基因、所述KEL基因、所述MNT基因、所述SED基因、所述MEL基因、SUC基因、所述ATF基因、 所述 GST 基因、所述 GAL 基因、MAL1-4、CYC1、CYC2、CYC3、CBP1、CBP2、CBP3、CBP4 和 CBTl。
25.按照权利要求17至22中任一权利要求所述的试剂套件，其包括一个或更多的引物或探针，其选自 SEQ ID NOs :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、39、41、42 和 43，或其相互之间的任何组合，或者与 SEQID NOs :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、39、41、42 和 43 的序列的序列一致性为至少80%、85%、90%、95%、98%或更高的序列。
26.分析含酵母样本的方法，包括在所述分析中使用探针或引物；其中如果酵母存在于所述样本中，则所述探针或引物能够与所供给的酵母的线粒体DNA杂交。
27.按照权利要求沈所述的方法，其中如所述样本中再存在另一酵母，则所述探针或引物就不能与该酵母的线粒体DNA杂交。
28.按照权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所供给的酵母是巴斯德酵母或酿酒酵母。
29.按照权利要求2所述的方法，其中另一酵母是巴斯德酵母或酿酒酵母。
30.按照权利要求1至15以及沈至四中任一权利要求所述的方法，或按照权利要求 16所述的组合物，或按照权利要求17至25所述的试剂套件，用于测定含酵母样本是否包含着不合需要的酵母。
31.按照权利要求1至15以及沈至30中任一权利要求所述的方法，或按照权利要求 16所述的组合物，或按照权利要求17至25所述的试剂套件，其被用来检查打算用于随后与酵母有关的发酵的样本的质量。
32.按照权利要求31所述的方法，其包括以下的步骤如质量合格，使用所述酵母进行发酵或如质量不合格，停止发酵的步骤。
33.适合用于按照权利要求1至15以及沈至32中任一权利要求所述的方法的探针或引物。
34.如权利要求33所述的探针或引物，其中所述探针或引物优先与巴斯德酵母的 mtDNA杂交，或优先与酿酒酵母的mtDNA杂交。
35.如权利要求33或权利要求34所述的探针或引物，其中所述探针或引物优先与任何选自 C0B、C0X1、C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VARl 和 RPMl 的基因杂交。
36.如权利要求33至35中任一权利要求所述的探针或引物，其中所述探针或引物优先与任何选自 SEQ ID NO :37、40、44、45、50、51、54、55、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、 69,70,71和72的序列或其补体杂交。
37.如权利要求33至35所述的探针或引物，其中所述探针或引物优先与SEQID NO 50或SEQ ID NO :54，或者其补体杂交，并可选地不与SEQ ID N0:51，或SEQ ID N0:55，或者其补体杂交；或者，其中所述探针或引物优先与SEQ ID N0:51或SEQ ID NO :55，或者其补体杂交，并可选地不与SEQ ID N0:50或SEQ ID NO :54，或者其补体杂交。38.如权利要求33至35所述的探针或引物，其中所述探针或引物优先与SEQID NOS 58、59或60中任何序列，或者其补体杂交，并可选地不与SEQ ID NOS :61、62、63、64、65或 66中任何序列，或者其补体杂交，或者其中所述探针或引物优先与SEQ ID NOS :61、62、63、64、65或66中任何序列，或者其补体杂交，并可选地不与SEQ ID NOS 58,59或60中任何序列，或者其补体杂交。
38.如权利要求33至35所述的探针或引物，其中所述探针或引物优先与SEQID NOS 67或68中任何序列，或者其补体杂交，并可选地不与SEQ ID NOS :69、70、71或72中任何序列，或者其补体杂交，或者，其中所述探针或引物优先与SEQ ID N0S:69、70、71或72中任何序列，或者其补体杂交，并可选地不与SEQ ID NOS :67或68中任何序列，或者其补体杂交。
39.如权利要求2所述的方法，其进一步包括使用实时PCR(RT-PCR)来测定所述酵母中的基因的相对的mtDNA拷贝数。
40.如权利要求2所述的方法，其进一步包括通过用限制酶消化酵母mtDNA来筛查所述酵母，所述限制酶专门切割鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸(G~C)之间的核酸，以提供 RFLP (限制性片段长度多态性)图谱，其中所述酵母核酸的RFLP图谱与来自非不稳定的酵母的已知的、保守的RFLP图谱比较，并且其中在RFLP图谱中所观察到的显著差异显示了酵母菌株是不稳定的。
41.按照权利要求1至15J6至32、39和40中任一权利要求所述的方法，或按照权利要求16所述的组合物，或按照权利要求16至25中任一权利要求所述的试剂套件，或按照权利要求33至38中任一权利要求所述的探针或引物，是用于酿酒的。
全文摘要
本发明涉及测定样本中的酵母菌株的方法，包括从酵母中获得并筛查核酸以得到靶序列，其中所述靶序列包括酵母线粒体DNA中的基因的整体或部分，或与酵母线粒体DNA中的基因有关的侧翼区；从筛查结果断定所述样本中的酵母菌株。本发明还提供了测定样本中的酵母菌株的遗传稳定性的方法，其中所述核酸中的一个靶序列包括酵母线粒体DNA中的某基因的整体或部分，或与酵母线粒体DNA中的某基因相关的侧翼区，或者位于染色体的次端粒区的某基因的整体或部分，或与位于染色体的次端粒区的某基因相关的侧翼区；并且从筛查结果断定所述酵母菌株在遗传方面是否稳定。
文档编号C12Q1/68GK102186988SQ200980139098
公开日2011年9月14日 申请日期2009年7月27日 优先权日2008年7月26日
发明者凯瑟琳·安妮·斯马特, 提西拉·提伦及卡·维马拉塞纳, 莎拉·米歇尔·尼科尔斯 申请人:诺丁汉大学