专利名称：一种醋酸钙不动杆菌及其在降解十溴联苯醚中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物应用领域，具体涉及醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticusDB-3)及其在降解十溴联苯醚中的应用。
背景技术：
十溴联苯醚(BDE2209或DeBDE)是市场上需求量最大的一类多溴联苯醚，作为一 种溴系阻燃剂(brominated flame retardants，BFRs)，广泛用作耐冲击性聚苯乙烯、聚酯、 聚酰胺、纺织品和电子产品的添加剂。近年来，十溴联苯醚的需求不断的增加，据统计，1999 年全世界对BDE2209的需求量占对多溴联苯醚总需求量的81%，2001年为83%。到2001 年为止，我国阻燃剂总产量约为1.5X105t，而BDE2209的销售量已达1. 35X 104t。全球自 然环境中十溴联苯醚含量呈显著增长态势。溴代阻燃剂具有难溶于水，长距离迁移能力，难 以生物降解等理化特点。多溴联苯醚同时具有明显的生物蓄积特性，生理上表现出致癌性、 神经毒性、内分泌干扰毒性、免疫功能紊乱致使性等危害。十溴联苯醚排放到环境中后，经 光解、高温分解、生物及微生物降解等过程，会转化为多溴二苯并二噁英、多溴二苯并呋喃 以及低溴代的联苯醚，这些降解物更容易进入生物体，也引起更强的毒性作用。环境中存在 的十溴联苯醚已逐渐成为一种生态安全威胁。因此，必须发掘可以高效、安全降解十溴联苯 醚的方法。生物降解是利用自然界存在的微生物分解物质，对环境不会造成负面影响。目前 报道的具有十溴联苯醚降解能力的菌株，包括有White rot fungi, Rhodococcus jostii RHAl和Burkholderia xenovorans LB400等，但是它们降解速率很低，功能不强。因此，发 掘可以高效、安全降解十溴联苯醚的功能菌株具有重要的意义。到目前为止，没有报道不动杆菌属(Acinetobacter)的菌株具有降解十溴联苯醚 的能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus DB-3)及其在降解十溴联苯醚中的应用，该醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus DB-3)能够高效、安全降解十溴联苯醚，不会产生多溴二苯并二噁英、多溴 二苯并呋喃以及低溴代的联苯醚等高毒性的二次污染物。本发明的Acinetobacter calcoaceticus DB-3是从广东汕头贵屿河床底泥分离、 纯化得到的该菌的理化参数如下1、菌体的形态特性a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，Acinetobacter calcoaceticusDB-3菌株为革兰氏阴性，球杆状，菌体大小为1 1. 5 μ mX 1. 5 2. 5 μ m微 米，无芽孢。
b.在LB固体培养基平板上培养24h后，菌落形态为圆形，光滑不透明，菌落直径为 1. 5-2. 0 毫米。2> Acinetobacter calcoaceticus DB—3 白勺SHt牛寺个生Acinetobacter calcoaceticus DB-3 菌株的生长温度 20_40°C, pH 范围 6-9，好氧 生长，氧化酶阴性，接触酶阳性。3> Acinetobacter calcoaceticus DB—3 白勺:11#牛寺|1 :对 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 的 16S rRNA 测序，BLAST 比对发现， 白勺 Acinetobacter calcoaceticus DB—3 白勺 16S rRNA ^ ^lJ % Acinetobacter
calcoaceticus BWIl^^tt^WiXi^Wffi^ii,Acinetobacter johnsonii DSM
6963的序列相似性为84%。综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列结果，本发明的Acinetobacter calcoaceticusDB-3 应归属醋酸 丐不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus),命名为 Acinetobacter calcoaceticusDB-3。本发明人通过实验证实本发明的Acinetobacter calcoaceticus DB-3具有十溴 联苯醚脱溴能力，对十溴联苯醚具有较强的降解能力。本发明的Acinetobacter calcoaceticus DB-3菌株对十溴联苯醚具有较强的降 解能力，能对十溴联苯醚脱溴，而产生游离的溴离子。因此十溴联苯醚经过该菌生物降解处 理后不会产生多溴二苯并二噁英、多溴二苯并呋喃以及低溴代的联苯醚等高毒性的二次污 染物。所以可以将该菌株用于环境中治理十溴联苯醚污染，从而为化工污泥或废水中十溴 联苯醚的处理提供一种低成本、高效率不发生二次污染的十溴联苯醚降解菌。本发明的Acinetobacter calcoaceticus DB-3 于 2009 年 11 月 27 日，保藏于中 国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址中国武汉市武汉大学)，其保藏编号为CCTCC NO =M 209287。
具体实施例方式—,Acinetobacter calcoaceticus DB—3 胃_白勺^禾口f 胃UAcinetobacter calcoaceticus DB—3 胃_白勺^培养基基础盐培养基每升培养基中含有ΚΗ2Ρ042· 93g，Na2HP048. 87g，NH4Cll. Og, NaClO. 5g，MgS045g, CaCl2 · 2H200. 15g，微量元素盐溶液 2mL，余量为水。微量元素盐溶液每升微量元素盐溶液中含有Na2Mo0430mg，ZnCl250mg, CuCl2 · 2H2010mg, H3B0331mg, MnCl2 · 5H20 30mg, NiCl2 · 6H20 20mg, CoCl2 · 6H20 36mg，余量 为水。本发明的Acinetobacter calcoaceticus DB-3菌株是从广东汕头贵屿河床底泥 经过分离、纯化而得。其分离纯化方法如下取Ig河床底泥放在IOOml添加有十溴联苯醚2. Omg/L,乳酸钠1. Og/L,酵母抽提 物0. lg/L的基础盐培养基中富集培养。富集培养过程通过离子色谱监测培养液中溴离 子的浓度变化指示富集效果，富集培养是先在30°C，避光静置培养14天，监测出明显的溴
4离子释放，然后转接到含有十溴联苯醚2. Omg/L,乳酸钠2. Og/L,酵母抽提物0. 05g/L的 基础盐培养基里继续在30°C，避光静置培养14天。然后从上步富集培养的培养液里取混 合菌群液涂布到添加含有乳酸钠2. Og/L固体基础盐培养基(含有20g/L琼脂)于30°C 温箱中进行培养，从中挑取优势单菌落进行脱溴降解筛选，纯化，最后获得Acinetobacter calcoaceticus DB-3 菌株。2、Acinetobacter calcoaceticus DB-3 菌株特征(1)菌体的形态特性a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，Acinetobacter calcoaceticusDB-3菌株为革兰氏阴性，球杆状，菌体大小为1 1. 5 μ mX 1. 5 2. 5 μ m微 米，无芽孢。b.在LB固体培养基平板上培养24h后，菌落形态为圆形，光滑不透明，菌落直径为 1. 5-2. O 毫米。(2)Acinetobacter calcoaceticus DB—3 白勺SHt牛寺个生Acinetobacter calcoaceticus DB-3 菌株的生长温度 20_40°C, pH 范围 6-9，好氧 生长，氧化酶阴性，接触酶阳性。(3)Acinetobacter calcoaceticus DB—3 白勺:11#牛寺|1 :具体方法参考分子克隆实验指南(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。H明白勺 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 j^^j^^i^iiL 采用 DNA 小量提取方法提取 Acinetobacter calcoaceticus DB-3 细菌总 DNA，采 用16S rRNA通用引物27F和1522r扩增其16S rRNA基因，将PCR产物直接测序，其序列如 SEQ ID NO. 1所示，将获得的16S rRNA基因序列输入GenBank，通过BLAST程序对数据库 中的所有序列进行比较分析，结果发现本发明Acinetobacter calcoaceticus DB-3的16S rRNA基因序列与Acinetobacter calcoaceticus已有模式菌株具有较高的相似性，其中与 Acinetobacter johnsoniiDSM 6963 的序列相似性为 84%。综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列结果，本发明的Acinetobacter calcoaceticusDB-3 应归属醋酸 丐不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus),命名为 Acinetobacter calcoaceticusDB-3。本发明的Acinetobacter calcoaceticus DB-3 于 2009 年 11 月 27 日，保藏于中 国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址中国武汉市武汉大学)，其保藏编号为CCTCC NO =M 209287。实施例一Acinetobacter calcoaceticus DB-3对浓度为10mg/L的十溴联苯醚的脱溴降解 试验降解基础培养基配方每升培养基中含有蛋白胨lg，酵母抽提物0.5g， KH2P042. 93g,Na2HP048. 87g, NH4Cl 1. Og, NaCl 0. 5g，MgS045g，CaCl2 · 2H20 0. 15g，余量为水。1、配制含十溴联苯醚10mg/L的降解实验培养基在1 OOml三角瓶中添加300mg/L用二氯甲烷溶解的十溴联苯醚储存液Iml，避光待 二氯甲烷挥发，然后在三角瓶中添加30ml降解基础培养基，摇勻后得到30ml降解实验培养基。
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即降解实验培养基的配方每升培养基中含有十溴联苯醚10mg，蛋白胨lg，酵母 抽提物 0. 5g, ΚΗ2Ρ042· 93g, Na2HP048 . 87g, NH4Cl 1. Og, NaCl 0. 5g, MgS045g, CaCl2 · 2H20 0. 15g，余量为水。2、将本发明的Acinetobacter calcoaceticus DB-3纯菌划LB板培养，然后从固 体LB平板上挑取单菌落接种到30ml降解实验培养基中，30°C，150转/分避光培养，培养 48h后，取培养液，利用离子色谱分析培养液中溴离子浓度，实验做三个平行样品。3、溴离子测定标准曲线的绘制及测定用18. 2mΩ 的 mini-Q 无菌水分别配制 0. 00、100、250、500、750、1000 μ g/L 溴化 钠标准梯度溶液，用戴安ICS-1500型离子色谱进行色谱分析，分析柱AS19，分析样品量 50 μ L，分析时间30min,具体数据如表1所示表 1
溴化钠标准溶液浓度0. 0010025050075010001500测定溴离子浓度0. 00098. 68252. 45499. 82747. 761001. 291498. 65 由此得出标准曲线方程y = 0. 0027x-0. 0027。R2 = 1. 0, χ为溴离子浓度(单位 μ g/L)，y为溴离子积峰面积(μ S*min)。 4、Acinetobacter calcoaceticus DB-3对十溴联苯醚脱溴降解的测定
从三个平行样品中分别取2mL经过48h上述培养的培养液，用0. 22 μ m的无 菌滤膜过滤，过滤液经过C18固相萃取小柱纯化，收集纯化液，取0. 5mL稀释到6mL后 进行戴安离子色谱分析，上样分析量为500 μ L。按上述标准曲线方程计算，可得48h后 Acinetobactercalcoaceticus DB-3 培养液中溴离子浓度分别为 300. 0 μ g/L，227. 0 μ g/L， 257. 4 μ g/L,平均值为 261. 5 μ g/L。实施例二 Acinetobacter calcoaceticus DB-3对浓度为10mg/L的十溴联苯醚的脱溴降解 试验1、配制含十溴联苯醚10mg/L的降解实验培养基本实施例的降解实验培养基与实施例一的降解实验培养基相同。2、将本发明的Acinetobacter calcoaceticus DB-3纯菌划LB板培养，然后从固 体LB平板挑取单菌落接种至30ml降解实验培养基中，于30°C，150转/分避光培养，培养 60h后，取培养液，利用离子色谱分析培养液中溴离子浓度，实验做三个平行样品。3> Acinetobacter calcoaceticus DB—3 P華角军 白勺胃从三个平行样品中分别取2mL经过60h上述培养的培养液，用0. 22 μ m的无菌滤 膜过滤，过滤液经过C18固相萃取小柱纯化，收集纯化液，取0. 5mL稀释到6mL后进行戴 安离子色谱分析，上样分析量为500yL。根据实施例一的标准曲线方程计算，可得60h后 Acinetobactercalcoaceticus DB-3 培养液中溴离子浓度分别为 498. 3 μ g/L，420. 0 μ g/L， 389. 7 μ g/L,平均值为 436. 0 μ g/L。实施例三
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Acinetobacter calcoaceticus DB-3对浓度为10mg/L的十溴联苯醚的脱溴降解 试验1、配制含十溴联苯醚10mg/L的降解实验培养基本实施例的降解实验培养基与实施例一的降解实验培养基相同。2、将本发明的Acinetobacter calcoaceticus DB-3纯菌划LB板常规培养，然后 从固体LB平板上挑取单菌接种至30ml降解实验培养基中，30°C，150转/分避光培养72h 后，取培养液，利用离子色谱分析培养液中溴离子浓度，实验做三个平行样品。3> Acinetobacter calcoaceticus DB—3 P華角军 白勺胃从三个平行样品中分别取2mL经过72h上述培养的培养液，用0. 22 μ m的无 菌滤膜过滤，过滤液经过C18固相萃取小柱纯化，收集纯化液，取0. 5mL稀释到6mL后 进行戴安离子色谱分析，上样分析量为500yL。按实施例一的标准曲线方程计算，可 得 72hAcinetobactercalcoaceticus DB-3 培养液中溴离子浓度分别 % 701. 7 μ g/L, 550. 4 μ g/L, 653. 5 μ g/L,平均值为 635. 2 μ g/L。
权利要求
一种醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus DB 3)，其保藏号为CCTCC NOM209287。
2.权利要求1所述的醋酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus DB-3)在降解 十溴联苯醚中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus DB-3)及其在降解十溴联苯醚中的应用。该菌于2009年11月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NOM 209287。该菌对十溴联苯醚具有较强的降解能力，能对十溴联苯醚脱溴，产生游离的溴离子。十溴联苯醚经过该菌生物降解处理后不会产生多溴二苯并二噁英、多溴二苯并呋喃以及低溴代的联苯醚等高毒性的二次污染物。可以将该菌株用于环境中治理十溴联苯醚污染，从而为化工污泥或废水中十溴联苯醚的处理提供一种低成本、高效率不发生二次污染的十溴联苯醚降解菌。
文档编号C12N1/20GK101899404SQ20101001923
公开日2010年12月1日 申请日期2010年1月5日 优先权日2010年1月5日
发明者孙国萍, 许玫英, 邓代永, 郭俊, 陈杏娟 申请人:广东省微生物研究所