专利名称：Lysinibacillus fusiformis DB-1菌及其在降解十溴联苯醚中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物应用领域，具体涉及Lysinibacillus fusiformis DB-1菌及其 在降解十溴联苯醚中的应用。
背景技术：
十溴联苯醚(BDE2209或DeBDE)是市场上需求量最大的一类多溴联苯醚，作为一 种溴系阻燃剂(brominated flame retardants，BFRs)，广泛用作耐冲击性聚苯乙烯、聚酯、 聚酰胺、纺织品和电子产品的添加剂。近年来，十溴联苯醚的需求不断的增加，据统计，1999 年全世界对BDE2209的需求量占对多溴联苯醚总需求量的81%，2001年为83%。到2001 年为止，我国阻燃剂总产量约为1.5X105t，而BDE2209的销售量已达1. 35X 104t。全球自 然环境中十溴联苯醚含量呈显著增长态势。溴代阻燃剂具有难溶于水，长距离迁移能力，难 以生物降解等理化特点。多溴联苯醚同时具有明显的生物蓄积特性，生理上表现出致癌性、 神经毒性、内分泌干扰毒性、免疫功能紊乱致使性等危害。十溴联苯醚排放到环境中后，经 光解、高温分解、生物及微生物降解等过程，会转化为多溴二苯并二噁英、多溴二苯并呋喃 以及低溴代的联苯醚，这些降解物更容易进入生物体，也引起更强的毒性作用。环境中存在 的十溴联苯醚已逐渐成为一种生态安全威胁。因此，必须发掘可以高效、安全降解十溴联苯 醚的方法。生物降解是利用自然界存在的微生物分解物质，对环境不会造成负面影响。目前 报道的具有十溴联苯醚降解能力的菌株，包括有White rot fungi, Rhodococcus jostii RHA1和Burkholderia xenovorans LB400等，但是它们降解速率很低，功能不强。因此，发 掘可以高效、安全降解十溴联苯醚的功能菌株具有重要的意义。到目前为止，没有报道Lysinibacillus fusiformis属的菌株具有降解十溴联苯 醚的能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种Lysinibacillus fusiformis DB-1及其在降解十溴联 苯醚中的应用，该Lysinibacillus fusiformis DB-1能够高效、安全降解十溴联苯醚，不会 产生多溴二苯并二噁英、多溴二苯并呋喃以及低溴代的联苯醚等高毒性的二次污染物。本发明的Lysinibacillus fusiformis DB-1是从广东汕头贵屿河床底泥分离、纯 化得到的该菌的理化参数如下(1)菌体的形态特性a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，Lysinibacillus fusoiformis DB-1菌株的细胞为革兰氏阳性，短杆状，菌体大小为0. 7 0. 8X 1. 8 2. 5 微米，两极鞭毛。
b.在LB固体培养基平板上培养24h后，菌落形态为圆形，微红色，菌落直径为 1.5-2. 4毫米。芽孢椭圆或圆形，极生或中生。(2)理化特性Lysinibacillus fusiformis DB-1 菌株的生长温度 15_40°C，pH 范围 6-9. 5，严格 好氧生长，氧化酶阳性。(3) 16SrRNA 鉴定对Lysinibacillus fusiformis DB-1 的 16sRNA 测序，其序列如 SEQ ID NO. 1 所 示，BLAST比对发现，本发明的菌株与Lysinibacillus fusiformis已有模式菌株具有较高 的相似性，其中与Bacillus fusiformis DSM 2898T的序列相似性为97%。综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列结果，本发明Lysinibacillus fusiformis DB-1 应归属 Lysinibacillus fusiformis,命名为 Lysinibacillus fusiformis DB_1。本发明人通过实验证实本发明的Lysinibacillus fusiformis DB-1具有十溴联 苯醚脱溴能力，对十溴联苯醚具有较强的降解能力。本发明的Lysinibacillus fusiformis DB-1菌株对十溴联苯醚具有较强的降解 能力，能对十溴联苯醚脱溴，而产生游离的溴离子。因此十溴联苯醚经过该菌生物降解处理 后不会产生多溴二苯并二噁英、多溴二苯并呋喃以及低溴代的联苯醚等高毒性的二次污染 物。所以可以将该菌株用于环境中治理十溴联苯醚污染，从而为化工污泥或废水中十溴联 苯醚的处理提供一种低成本、高效率不发生二次污染的十溴联苯醚降解菌。本发明的Lysinibacillus fusiformis DB-1 于 2009 年 11 月 27 日，保藏于中 国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址中国武汉市武汉大学)，其保藏编号为CCTCC NO :M 209285。
具体实施例方式一、Lysinibacillus fusiformis DB-1 菌株的分离和鉴定1、Lysinibacillus fusiformis DB-1 菌株的分离培养基基础盐培养基每升培养基中含有KH2P042. 93g，Na2HP048. 87g，NH4C1 1. Og, NaCl 0. 5g，MgS045g, CaCl2 2H20 0. 15g，微量元素盐溶液 2mL，余量为水。微量元素盐溶液每升微量元素盐溶液中含有Na2Mo0430mg，ZnCl250mg, CuCl2 2H2010mg, H3B0331mg, MnCl2 5H20 30mg, NiCl2 6H20 20mg, CoCl2 6H20 36mg，余量 为水。本发明的Lysinibacillus fusiformis DB-1菌株是从广东汕头贵屿河床底泥经 过分离、纯化而得。其分离纯化方法如下取lg河床底泥放在100ml添加有十溴联苯醚2. 0mg/L,乳酸钠1. 0g/L,酵母抽提 物0. lg/L的基础盐培养基中富集培养。富集培养过程通过离子色谱监测培养液中溴离子 的浓度变化指示富集效果，富集培养是先在30°C，避光静置培养14天，监测出明显的溴离 子释放，然后转接到含有十溴联苯醚2. 0mg/L,乳酸钠2. 0g/L,酵母抽提物0. 05g/L的基础 盐培养基里继续在30°C，避光静置培养14天。然后从上步富集培养的培养液里取混合菌群涂布到添加含有乳酸钠2. Og/L固体基础盐培养基(含有20g/L琼脂)中30°C温箱进行培 养，从中挑取优势单菌落进行脱溴降解筛选，纯化，最后获得Lysinibacillus fusiformis DB-1菌株。2、Lysinibacillus fusiformis DB-1 菌株特征(1)、菌体的形态特性a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，Lysinibacillus fusiformis DB-1菌株的细胞为革兰氏阳性，短杆状，菌体大小为0. 7 0. 8 X 1. 8 2. 5微 米，两极鞭毛。b.在LB固体培养基平板上培养24h后，菌落形态为圆形，微红色，菌落直径为 1.5-2. 4毫米。芽孢椭圆或圆形，极生或中生。(2)、Lysinibacillus fusiformis DB-1 主要的理化特性:Lysinibacillus fusiformis DB-1 菌株的生长温度 15_40°C，pH 范围 6-9. 5，严格 好氧生长，氧化酶阳性。3、Lysinibacillus fusiformis DB-1 主要的遗传特征具体方法参考分子克隆实验指南(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。本发明的Lysinibacillus fusiformis DB-1 分子分类地位采用DNA小量提取方法提取Lysinibacillus fusiformis DB-1细菌总DNA，采 用16S rRNA通用引物27F和1522r扩增其16S rRNA基因，将PCR产物直接测序，其序 列如SEQ ID NO. 1所示，将该序列输入GenBank，通过BLAST程序与数据库中的所有序列 进行比较分析，结果发现本发明Lysinibacillus fusiformis DB-1的16S rRNA基因序 列与Lysinibacillus fusiformis已有模式菌株具有较高的相似性，其中与Bacillus fusiformis DSM 2898T 的序列相似性为 97%。综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列比对结果，本发明Lysinibacillus fusiformisDB-1 应归属 Lysinibacillus fusiformis，命名为 Lysinibacillus fusiformis DB-1。该菌株Lysinibacillusfusiformis DB-1 于2009年 11 月 27 日，保藏于中国典型 培养物保藏中心(CCTCC，地址中国武汉市武汉大学)，其保藏编号为CCTCC NO :M 209285。二、实施例一Lysinibacillus fusiformis DB-1对浓度为10mg/L的十溴联苯醚的脱溴降解试 验降解基础培养基的配方每升培养基中含有乳酸钠2. 0g/L，酵母抽提物0. lg/L， KH2P042. 93g, Na2HP048. 87g, NH4C11. Og, NaCl 0. 5g, MgS045g, CaCl2 2H20 0. 15g，余量为水。1、配制含十溴联苯醚10mg/L的降解实验培养基在100ml三角瓶中添加300mg/L用二氯甲烷溶解的十溴联苯醚储存液1ml，避光， 待二氯甲烷挥发，然后在三角瓶中添加30ml降解基础培养基，摇勻后得到降解实验培养基。即降解实验培养基的配方每升培养基中含有十溴联苯醚10mg，蛋白胨lg，酵母抽提物 0. 5g, KH2P042. 93g, Na2HP048 . 87g, NH4C1 1. Og, NaCl 0. 5g, MgS045g, CaCl2 2H20 0. 15g，余量为水。2、将本发明的Lysinibacillus fusiformis DB-1纯菌划LB板培养，然后从固体 LB平板上挑取单菌落接种到30ml降解实验培养基中，30°C，150转/分避光培养，培养48h 后，取培养液，利用离子色谱分析培养液中溴离子浓度，实验做三个平行样品。3、溴离子测定标准曲线的绘制及测定用18. 2mQ 的 mini-Q 无菌水分别配制 0. 00、100、250、500、750、1000 ii g/L 溴化 钠标准梯度溶液，用戴安ICS-1500型离子色谱进行色谱分析，分析柱AS19，分析样品量 50 u L，分析时间30min,具体数据如表1所示表 1 由此得出标准曲线方程y = 0. 0027x-0. 0027。x为溴离子浓度(单位P g/L)，y 为溴离子积峰面积(P S*min)。4、Lysinibacillus fusiformis DB-1 降解率的测定从三个平行样品中分别取2mL经过48h上述培养的培养液，用0. 22 y m的无菌 滤膜过滤，过滤液经过C18固相萃取小柱纯化，收集纯化液，取0. 5mL稀释到6mL后进行 戴安离子色谱分析，上样分析量为500 u L。按上述标准曲线方程计算，可得48h培养后 Lysinibacillusfusiformis DB-1 培养液中溴离子浓度分别为 717. 4 u g/L, 748. 7 u g/L, 726. 4 u g/L,平均值为 730. 8 u g/L。实施例二 Lysinibacillus fusiormis DB-1对浓度为lOmg/L的十溴联苯醚的脱溴降解试 验1、配制含十溴联苯醚10mg/L的降解实验培养基本实施例的降解实验培养基与实施例一的降解实验培养基相同。2、将本发明的Lysinibacillus fusiformis DB-1纯菌划LB板培养，然后从固体 LB平板挑取单菌落接种至30ml降解实验培养基中，于30°C，150转/分避光培养，培养60h 后，取培养液，利用离子色谱分析培养液中溴离子浓度，实验做三个平行样品。3、Lysinibacillus fusiformis DB-1 降解率的测定从三个平行样品中分别取2mL经过60h上述培养的培养液，用0. 22 y m的无菌滤 膜过滤，过滤液经过C18固相萃取小柱纯化，收集纯化液，取0. 5mL稀释到6mL后进行戴 安离子色谱分析，上样分析量为500 yL。根据实施例一的标准曲线方程计算，可得60h后 Lysinibacillusfusiformis DB-1 培养液中溴离子浓度分别为 1008. 8 u g/L, 859. 9 u g/L, 1025. 4 u g/L,平均值为 964. 7 u g/L。实施例三Lysinibacillus fusiformis对浓度为lOmg/L的十溴联苯醚的脱溴降解试验
1、配制含十溴联苯醚10mg/L的降解实验培养基本实施例的降解实验培养基与实施例一的降解实验培养基相同。2、将本发明的Lysinibacillus fusiformis DB-1纯菌划LB板培养，然后从固体 LB平板上挑取单菌接种至30ml降解实验培养基中，300C，150转/分避光培养72h后，取培 养液，利用离子色谱分析培养液中溴离子浓度，实验做三个平行样品。3、Lysinibacillus fusiformis DB-1 降解率的测定 从三个平行样品中分别取2mL经过72h上述培养的培养液，用0.22 μ m的无菌 滤膜过滤，过滤液经过C18固相萃取小柱纯化，收集纯化液，取0. 5mL稀释到6mL后进行 戴安离子色谱分析，上样分析量为500 μ L。按实施例一的标准曲线方程计算，可得72h后 Lysinibacillusfusiformis DB-1 培养液中溴离子浓度分别为 1141. 2μ g/L, 1397. 8μ g/L, 1214. 5 μ g/L,平均值为 1251. 2 μ g/L序列表<110>广东省微生物研究所<120>Lysinibacillus fusiformis DB-1菌及其在降解十溴联苯醚中的应用<160>1<210>1<211>1460<212>DNA<213>Lysinibacillus fusiformis DB-I<400>1ccaggcgctc gctgtcagtc tcatcaccga gcactctgaa aaggagcttg ctcctttgac 60gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gcaacctacc ctatagtttg ggataactcc 120gggaaaccgg ggctaatacc gaataatctc ttttgcttca tggcaagaga ctgaaagacg 180gtttcggctg tcgctatagg atgggcccgc ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc 240tcaccaaggg gaccatgcgt agccgaactg agagggtgat cggccacact gggactgaaa 300cacggcccaa actcctacgg gagggagcag tagggaatct tccacaatgg gcgaaagcct 360gatggaacaa ccccccgtga gtgaagaagg gtttcggatc gtaaaactct gttgtaaggg 420aagaacaagt acagtagtaa ctgggtgtac cttgacggta ccttattaga aagccacggc 480taactacctg gcagcagccg cggtaatacg taagtggcaa gcgttgtccg gaattattgg 540gcgtaaagcg cgcgcaggcg gtcctttaag tctgatgtga aagcccacgg ctcaaccgtg 600gagggtcatt ggaaactggg ggacttgagt gcagaagagg aaagtggaat tccaagtgta 660gcggtgaaat gcgtagagat ttggaggaac accagtggcg aaggcgactt tctggtctgt 720aactgacgct gaggcgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaac 840gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg 900gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960ggtcttgaca tcccgttgac cactgtagag atatagtttc cccttcgggg gcaacggtga 1020caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080agcgcaaccc ttgatcttag ttgccatcat ttagttgggc actctaaggt gactgccggt 1140
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权利要求
一种Lysinibacillus fusiformis DB-1菌，其保藏号为CCTCC NOM 209285。
2.权利要求1所述的Lysinibacillusfusiformis DB-I菌在降解十溴联苯醚中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种Lysinibacillus fusiformis DB-1菌及其在降解十溴联苯醚中的应用。该菌于2009年11月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NOM 209285。该菌对十溴联苯醚具有较强的降解能力，能对十溴联苯醚脱溴，产生游离的溴离子。十溴联苯醚经过该菌生物降解处理后不会产生多溴二苯并二噁英、多溴二苯并呋喃以及低溴代的联苯醚等高毒性的二次污染物。可以将该菌株用于环境中治理十溴联苯醚污染，从而为化工污泥或废水中十溴联苯醚的处理提供一种低成本、高效率不发生二次污染的十溴联苯醚降解菌。
文档编号C12N1/20GK101864374SQ20101001923
公开日2010年10月20日 申请日期2010年1月5日 优先权日2010年1月5日
发明者孙国萍, 许玫英, 邓代永, 郭俊, 陈杏娟 申请人:广东省微生物研究所